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Relación Dosis/Respuesta y Ensayos de Toxicidad en

Animales

Liz María Vega VillalobosII Semestre 2009

Toxicología

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Relación Dosis/Respuesta:Individual o Graduada

Es el espectro de los efectos tóxicos y las características de la exposición unidas en una relación correlativa.

Existen 2 tipos de relaciones:

• Individual (r/ de un organismo individual a ≠ D del químico)

• Cuantal (distribución de r/ individuales a ≠ D en una población)

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Relación Dosis/Respuesta:Individual o Graduada

• Pero para la mayoría de agentes químicos másde un efecto resulta trasla administración

• ¿Por qué?

• ¡existen múltiplesdianas en diferentes tejidos !

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Relación Dosis/Respuesta Cuantal

• Cuantal: es la respuesta del “Todo o Nada”

• En una población, un individuo “responde o no responde”

• En el eje Y está la fracción de población que responde y en el eje X el rango de dosis administradas

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Relación Dosis/Respuesta Cuantal

Estimados estadísticos de la exposición al tóxico:

• ED50 “Effective Dose” o Dosis Efectiva al 50%

• Si muerte es el punto final de medida a la ED50

se le llama LD50 de “Lethal Dose”

• Es un valor marginal de peligro ya que por ejemplo no refleja el riesgo al medio ambiente

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Relación Dosis/Respuesta Cuantal

• Curva con forma de campana de Gauss conocida como distribución de frecuencias normales

• La razón de esto son las diferencias individuales en r/ hacia los químicos (idiosincrasia)

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Individuos Hipersusceptibles Resistentes

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Relación Dosis/Respuesta Cuantal

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Risk Analysis, Vol. 18, No. 6, 1998

“critical effect size”(CES)

Relación Dosis/Respuesta Cuantal

La dosis efectiva mínima a un químico que evoca r/ de “todo o nada” es llamada Dosis Umbral

(no es experimental → extrapolada)

• Si el # de individuos respondedores a cada dosis consecutiva se suman juntos, se obtiene la relación D/R acumulativa

• Cuando se han usado un buen # animales por dosis se obtiene una curva D/R sigmoidea

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Relación Dosis/Respuesta Cuantal

• Se puede convertir el % de r/ a unidades de desviación de la media (normal equivalent deviations NEDs)

• La NED de 50% es 0 + 5 (p/ evitar -); la NED +1 se equipara con 84.1% de r/.

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Esta conversión de unidades es llamada probit units de la contracción probability unit

Relación Dosis/Respuesta Cuantal• La Pendiente de las

curvas puede ser obtenida

• A con pendiente más plana requiere cambios mayores en la dosis para observar cambios en la r/

• Mientras B con pendiente más empinada requiere pequeños cambios

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Relación Dosis/Respuesta: Alometría

• Alometría: campo de estudio que examina las relaciones entre el peso corporal y otros parámetros físicos y biológicos como la tasa de metabolismo basal, frecuencia cardiaca, flujo de sangre, etc

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La relación entre área superficial y el peso corporal entre las especies de mamíferos es: AS = 10.5*(peso en g)0.67

(0.030)

Cálculo de Probit Manual y en SPSS

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Forma de la curva Dosis/Respuesta

• Nutrientes esenciales en forma de U (vit y minerales)

• Deficiencia - Homeostasis -Toxicidad

• Ej: Vit A (tox. hepática y def. fetales) y Vit C

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Hormesis:sustancias no

nutricionales

pueden dar

efectos

estimulatorios

benéficos a D

bajas, pero a D

altas producen

efectos

adversos

Ej: la radiación y

el alcohol

Forma de la curva Dosis/Respuesta

• Umbral: D bajo la cual la probabilidad de una r/ individual es cero (depende del #)

• Es muy difícil establecer un Umbral de “no efectos”

• Para carcinogénesis se habla de un Umbral Aparente llamado NOAEL del Ingles “no observable adverse effect level”

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Forma de la curva Dosis/Respuesta• Varia con el tiempo de exposición

al tóxico

• Las pendientes a D bajas y a D altas son muy ≠ por la disposición del químico

• Razones de las inflexiones agudas en la Curvas D/R:

Saturación de las vías de biotransformación, de los sitios de unión a proteínas o receptores y supresión de cofactores intracelulares

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Forma de la curva Dosis/Respuesta• NAPQI = N-acetil-p-

benzoquinoneimina (metabolito hepatotóxico)

• Destoxificado por conjugación intracelular con glutatión

• A D altas se consume el glutatión hepático y se acumula NAPQI que causa toxicidad hepática fatal

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N Engl J Med 359;3 july 17, 2008

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Supuestos de la relación D/R

1. La respuesta es debida al químico administrado

2. La magnitud de la r/ es relacionada con la dosis

La 2nda subyace de 3 supuestos:

a) Existe un sitio diana molecular con el que interactúa el químico para iniciar la r/

b) La producción y el grado de la respuesta son relacionados con la concentración del químico en el sitio diana

c) La concentración en el sitio está relacionada con la D administrada

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3. Existen métodos cuantificables con precisión significativa para expresar la toxicidad

Supuestos de la relación D/R

• Si no hay mecanismo de acción se toman medidas de toxicidad claras de “biomarcadores relacionados a los efectos” (effects-related biomarkers)

• Químicos nuevos →Toxicidad Aguda D Única → diseño de estudio cuidadoso, disciplinado, observación comportamental y fisiológica detallada →animal intacto por 14 días, luego análisis histológicos de los principales órganos

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Ej: ALT y AST en daño hepático

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Evaluación de la relación D/R

• ED = Dosis Efectiva

• TD = Dosis Tóxica

• LD = Dosis Letal

• Paralelismo como sugerencia de identificación del mecanismo

• Pruebas que respalden cada caso en particular

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Evaluación de la relación D/R

• Índice Terapéutico (Therapeutic Index)

• TI = TD50/ED50

• Márgenes de Seguridad y Exposición (Margin of safety)

• MOS = TD1/ED99

• Índice de Cronicidad (Chronicity index)

• CI = TD50 1D/TD50 90DDonde D es dosis

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TIA = 1,18 TIB = 5 Seguridad Relativa

¿Y qué pasa con las pendientes?

CIA = 1 CIB = 90

Grado de Acumulación

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Evaluación de la relación D/R

• Potencia vs. Eficacia

• A > B; potencia además contempla el rango de D en el que↑ la r/

• A = B y C < D; eficacia máxima contempla el límite superior de r/

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Potencia Eficacia máxima

Variación en las Respuestas Tóxicas

Se debe a 3 componentes principales:

I. Toxicidad selectiva

II. Diferencias de especie

III. Diferencias individuales

• Toxicidad selectiva: el químico produce daño en una clase de ser viviente sin dañar la otra forma de vida aunque ambas existan en íntimo contacto

• “Uneconomic form” (indeseable)

• “Economic form” (deseable)

• Ej: Los Antibióticos (sulfonamidas y PABA)

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Variación en las Respuestas Tóxicas

• Diferencias de especie: diferencias cualitativas y cuantitativas en la r/ a sustancias químicas pueden ocurrir entre especies diferentes

• Ej: Ratones (10 mil ppb) ↑ resistencia a hepatocarcinomas por la Aflatoxina B respecto a ratas (15 ppb)

• Diferencias individuales: pueden ocurrir por sutiles diferencias genéticas

• Diferencias hereditarias en un gen (más de 1% de la población) se llaman Polimorfismos Genéticos y son los responsables de las reacciones idiosincráticas

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Ensayos de Toxicidad Descriptiva en Animales

• Existen 2 principios subyacentes a estos ensayos:

1. Los efectos producidos por un componente en animales de laboratorio, (bien calificados) son aplicables a humanos

2. La exposición de animales experimentales a químicos en D altas es un método válido y necesario para descubrir riesgos en humanos

• Pruebas de Toxicidad Aguda

• Pruebas de Irritación dérmica y ocular

• Pruebas de Sensibilización

• Pruebas de Toxicidad Sub-Aguda

• Pruebas de Toxicidad Sub-Crónica

• Pruebas de Toxicidad Crónica

• Pruebas de Toxicidad sobre el Desarrollo y la Reproducción

• Mutagenicidad

• Bioensayos de Oncogenicidad

• Evaluación de Neurotoxicidad

• Evaluación de Inmunotoxicidad

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Ensayos de Toxicidad Descriptiva en Animales

• La Conferencia de Armonización Internacional(ICH) para el registro de productos farmacéuticos en humanos → lineamientos →

registro

• Nuevos químicos → estudios iniciales → cuidadosa evaluación química: pureza, estabilidad, solubilidad y otros factores fisicoquímicas

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Pruebas de Toxicidad Aguda

• Administración de D única

• Una o más rutas de administración

• Una o varias especies

• Hembras y machos adultos

• Ayuno la noche previa a la D

• Medidas de mortalidad, peso, conducta y alimentación

• Periodo de 14 días

• LD50 ahora se caracteriza más como un rango de magnitudes

• 6 a 9 animales por método de Bruce

• 40 a 50 tradicional

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Pruebas de Toxicidad Aguda

• La ICH (1991) elimina LD50 para fármacos (excep. pesticidas) por la alta variabilidad

• Objetivos:

a. Estimar la toxicidad intrínseca (LD50)

b. Informar órganos blanco y manifestaciones clínicas

c. Identificar diferencias de especies y susceptibilidad

d. Establecer reversibilidad de la r/ tóxica

e. Dar información para el diseño y la selección de D para estudios a largo plazo

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Pruebas de Toxicidad Aguda (TA)

• LC50 por exposición en el medio indicando el t (Ej: Peces-Agua)

• TA Dérmica:

• Sitio de aplicación afeitado

• Contacto ocluido en piel por 24 horas

• Limpieza al final y observación por 14 días (máx. 2g/Kg)

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• En TA la información más significativa viene de las observaciones clínicas y los exámenes postmortem del animal

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Pruebas de Irritación dérmica y ocular

• “Draize test” remoción del pelaje de la espalda

• 0.5 mL o 0.5 g sobre la piel cubierta con 4 parches de gaza (1 pulg2)

• 2 sitios con abrasión y 1 intacto durante 4 horas

• Instilación en un ojo (0.1 mL o 100 mg) para cada conejo

• Control ojo contra lateral

• Observaciones varias veces después de la aplicación

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Pruebas de Sensibilización

• Pruebas de hipersensibilidad tardía como el de Draize

• En Cobayos

• Aplicación tópica, intradérmica o ambas en una zona rasurada

• Múltiples administraciones en un periodo de 2 a 4 semanas

• Luego a 2 o 3 semanas del último tratamiento los animales son desafiados (↓ Conc.)

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Pruebas de Toxicidad Sub-Aguda

• Usadas para establecer las D de estudios Subcrónicos

• 3 o 4 D diferentes mezcladas en el alimento

• Ratas 10 por sexo; perros 3 o 4 por sexo

• Química clínica e histopatología son hechas después de 14 días de exposición

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Pruebas de Toxicidad Sub-Crónica

• Su duración usual es de 90 días

• Sus metas son: establecer el NOAEL e identificar y caracterizar los órganos específicos afectados después de la administración repetida

• Se obtienen también los “lowest observed adverse effect level” (LOAEL)

• Usualmente en 2 especies (rata y perro FDA; ratón para EPA) por la vía de exposición (oral)

• 3 D (1era alta; toxicidad <

10% muertes, 3era baja; sin efectos tóxicos aparentes y 2nda; intermedia)

• 10 a 20 roedores y 4 a 6 perros por sexo y D

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Pruebas de Toxicidad Sub-Crónica

• Solo animales saludables

• Alojamiento individual

• Administración en la dieta con razón de consumo y de cambio de peso

• Observación cuidadosa para signos de toxicidad 1 o 2 veces por día

• Registro de drogas → estudios Agudos y Subcrónicos deben estar completos antes que la compañía ponga una carpeta para IND (Investigational New Drug) en la FDA

• Si aprueban la IND (FDA), los estudios clínicos Fase I, II y III pueden comenzar al mismo tiempo que las pruebas de toxicidad crónica en animales

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Pruebas de Toxicidad Crónica

• Son similares a las P. Subcrónicas excepto por el periodo de exposición

• En roedores va de 6 meses a 2 años

• En otras especies usualmente 1 año, pero puede ser más

• La D más alta debe ser estimada como la D Máxima Tolerable (MTD)

• La MTD incluye la supresión ligera de la ganancia de peso, consideraciones fisiológicas, farmacocinéticas y urinarias del perfil de metabolitos

• Se prueban además ½ y ¼ de la MTD

• Se considera en estos estudios el Potencial Carcinogénico

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Pruebas de Toxicidad sobre el Desarrollo y la Reproducción

• Toxicología del desarrollo estudia los efectos adversos sobre el desarrollo del organismo durante cualquier momento de la vida

• Toxicología reproductiva estudia la ocurrencia de efectos adversos sobre los sistemas reproductivos masculinos y femeninos

• Ratas 2 o 3 por D (20 cada grupo)

• Machos 60 días y hembras 14 días antes de la copula hasta la lactancia (incluida la gestación)

• Se observa: % de embarazos, # de nacidos muertos, peso, crecimiento, sobrevivencia y condiciones generales durante las 3eras semanas de vida

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Pruebas de Toxicidad sobre el Desarrollo y la Reproducción

• La ICH da lineamientos según etapas

– Etapa A: Cópula y Concepción

– Etapa B: Concepción a Implantación

– Etapa C: Implantación a Cierre del paladar duro

– Etapa D: Cierre del paladar duro a termino del embarazo

– Etapa E: Nacimiento y Destete

– Etapa F: Destete a Madurez sexual

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Mutagenicidad

• Mutagénesis: habilidad de un químico para causar cambios en el material genético de las células y transmitir esos cambios en la división celular

• La P. in vitro de Salmonella typhimurium/

microsomas hepáticos de rata en un medio sin histidina

• Roedores ♂ expuestos a D única del compuesto

• Luego son apareados con dos hembras no tratadas, (1 día por sem) durante 8 semanas

• Las ♀ son matadas antes de llegar a término y tanto el # de embriones como el # de cuerpos lúteos son determinados

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Bioensayos de Oncogenicidad

• El potencial carcinogénico se ejecuta en ratas y ratones a lo largo de la vida de la especie (ratón 18 m a 2 a; rata 2 a 2.5 años)

• 60 ratas por grupo y por sexo para que sobrevivan 30 por D

• Exámenes patológicos gruesos y microscópicos son hechos a todos los animales

• La D usada es la MTD

• Ya existe un % basal de tumores en el grupo control

• La D diaria debe proveer 25 veces el ABC (AUC) que una D única humana produciría bajo condiciones terapéuticas (más que usar una MTD)

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Evaluación de Neurotoxicidad

• Neurotoxicidad: cambio adverso en la química, estructura o función del sistema nervioso seguido a la exposición de un agente químico

• Existen muchos sistemas in vitro como los de cultivo celular de neuronas y glia en los que se estudia neurotoxicidad, proliferación, migración, apoptosis, sinaptogenesis, etc (↓ #

animales, ↓ costo y ↑ adaptabilidad)

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Evaluación de Neurotoxicidad

• Irwin desarrollo una selección básica para función del comportamiento en ratones (Irwin, 1968) la cual ha sido refinada a una “batería observacional funcional” (FOB)

• La FOB también se usa para evaluar seguridad

• Los protocolos animales incluyen pruebas de función comportamental (alarma

auditiva, aprendizaje y memoria,

cambios en actividad motriz), exámenes neuropatológicos y morfológicos

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Evaluación de Inmunotoxicidad

• El sistema inmune nos defiende contra infecciones patógenas y ciertos tipos de cáncer

• Las alteraciones inmunológicas pueden presentarse como: hipersensibilidad, autoinmunidad o inmunosupresión

• Fallo en la r/ a infecciones, expresión de infecciones latentes, prolongados periodos de infección y la aparición de cáncer

• Evaluación de glóbulos blancos, glóbulos rojos, inmunoglobulinas y cambios de peso e histología en los órganos linfoides

• Por Ej: “Tormenta” de citoquinas como r/ a un anticuerpo monoclonal anti-CD28 (Fase I) que provocó a unos sujetos falla sistémica multiorgánica

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