Regulación de la expresión génica · constante, en prácticamente todas las células de un...
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Regulación de la expresión génica Regulación del operon lac M. en C. J. Abraham León Domínguez
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Regulación de la expresión génica
Regulación del operon lac
M. en C. J. Abraham León Domínguez
¿Cuántos genes y proteínas tiene una célula?
El control de la síntesis de un producto génico en particulares conocido como regulación génica.
En muchos casos, la actividad génica es regulada a nivel detranscripción.
Tiene aprox.
4.6 millones de pares de
bases
Codifica
aprox. 4 700 genes
4 288 proteínas codificadas
Genoma Humano Genoma bacteriano
Los genes que codifican para productos génicos necesarios parael metabolismo básico celular se expresan a nivel más o menosconstante, en prácticamente todas las células de un organismo,es decir, se expresan de forma constitutiva o continua.
Genes constitutivos o housekeeping
Frente a los genes constitutivos se encuentran los genes que seexpresan solamente en determinadas situaciones y que, porconsiguiente, codifican para productos génicos que serequieren en determinado estado celular o, en respuesta acierta condición externa.
Genes regulados o adaptativos
Puntos de control de la expresión génica
• Re-arreglo del DNA
• Regulación transcripcional
• Procesamiento del mRNA
• Estabilidad del mRNA
• Control post-transcripcional
• Control traduccional
Nivel transcripcional
Los mecanismo de regulación caen dentro de dos categorías:
Regulación negativaRegulación positiva
Activaciónde la transcripción
Represión de la transcripción
Regulación positiva: en la regulación positiva la actividad
transcripcional se encuentra “apagada”. El inicio de la
transcripción es estimulado por la unión de una proteína que
activa la expresión de los genes, actúa como un activador.
Regulación negativa: en la regulación negativa la actividad
transcripcional se encuentra “encendida”. El “apagado” o
impedimento de la expresión de los genes ocurre por la unión
de una proteína que impide el inicio de la transcripción, actúa
como un represor.
Un sistema de regulación negativa puede ser inducible o
reprimible.
Transcripción inducible Transcripción reprimible
En presencia de una moléculapequeña llamada inductor, elrepresor pierde su capacidad de uniónal DNA, y la transcripción ocurre.
El represor no tiene actividad deunión al DNA por si solo, hasta que seune a una molécula pequeña llamadacorepresor. En este caso el represorse conoce como aporepresor.
Regulación génica del operon
El conjunto formado por el grupo de genes, el promotor, y lassecuencias adicionales implicadas en la regulación, sedenomina operon.
Promotor: región del DNA de unión para la RNA polimerasa.
Operador: región del DNA que es reconocida por la proteínarepresora. Precede a los genes estructurales y sobrelapa con laregión promotora.
Genes estructurales : genes involucrados en el metabolismo,transcritos como una unidad (mensajero policistrónico).
Gen regulatorio: codifica una proteína que regula latranscripción de los genes estructurales. Se une al operador.
El modelo del operon Lac
Muchos de los principios que regulan laexpresión génica fueron estudiados adetalle en E. coli, en respuesta almetabolismo del azúcar lactosa.
El desarrollo del concepto operon fueintroducido y estudiado por FrançoisJacob y Jacques Monod.
En 1960 publicaron un artículo en el quedemostraron que dos genes implicadosen el metabolismo de la lactosa estabanregulados coordinadamente medianteun elemento génico adyacente a ellos.
Metabolismo de la lactosa
El operon lac tiene 3 genes involucrados en el metabolismo dela lactosa: lacZ, lacY y lacA y, un gen que codifica para laproteína represora que regula la expresión de estos genes: lacI.
LacZ: codifica para la enzima β-galactosidasa, la cual rompe a lalactosa en galactosa y glucosa.
LacY: codifica para una lactosa permeasa, una moléculatransportadora requerida para la entrada de lactosa en lacélula.
LacA: codifica para la enzima transacetilasa, que transfiere ungrupo acetilo de Acetil-CoA a los azúcares galactósidos. Comotal, no participa propiamente en el metabolismo de la lactosa.
LacI: codifica para una proteína tetramérica que se une aloperador, impidiendo la expresión de los genes estructurales.Proteína represora.
Expresión inducible del operon
A) En ausencia de lactosa
En ausencia de lactosa, el producto génico de lacI (proteínarepresora) se une al operador y bloquea la unión de la RNApolimerasa, impidiendo la expresión de los genes estructurales deloperon.
Expresión inducible del operon
B) En presencia de lactosa
Una molécula inductora se une a un sitio específico delrepresor, provocándole un cambio conformacional que le llevaa perder afinidad por el operador, permitiendo a la RNApolimerasa su unión al promotor y la transcripción del operon.
El inductor de este sistema no es la lactosa propiamente dichasino un isómero de la misma llamado alolactosa.
La misma β-galactosidasa cambia a la lactosa en alolactosa.
La alolactosa es un ejemplo de un inductor fisiológico natural.
También existen inductores no metabolizables o inductoresgratuitos, como el IPTG, que permite inducir la expresión deloperon lac. Se ocupan en técnicas de clonación.
Análogos de la lactosa
La mayoría de estos compuestos son galactósidos derivados dela lactosa, donde la glucosa ha sido sustituida por algún radicalo grupo químico.
• IPTG (isopropil-β-D-tio-galactósido)
• Fenil-Gal (fenil-β-D-galactosa)
• ONPG (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido)
• X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido)
• Alolactosa
IPTG
Un inductor efectivo del operon lac y no metabolizable, que seusa a menudo experimentalmente, es el IPTG.
Es capaz de unirse al represor LacI, pero no es sustrato para laβ-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria.
Permite regular la expresión génica (inducción).
Fenil-Gal
Es un sustrato de la β-galactosidasa, pero no es un inductor deloperon, ya que es incapaz de unirse al represor LacI. Esto haceque las cepas bacterianas silvestres sean incapaces de crecercuando su única fuente de carbono es fenil-gal. Solo aquellosmutantes donde se encuentre ausente el represor LacI podráncrecer en esta fuente de carbono.
X-gal
Es otro sustrato de la β-galactosidasa que, al ser hidrolizado,
produce un compuesto (indoxil) que en contacto con el aire se
transforma en dicloro-índigo insoluble, el cual presenta un
inteso color azul.
En experimentos de clonación génica, es usado como indicador
de aquellas células que expresan la enzima β-galactosidasa.
Aquellas colonias que estén expresando la enzima se tornarán
de color azul más o menos intenso en función de la cantidad de
enzima que estén expresando.
Alolactosa
Es un isómero de la lactosa y es el verdadero inductor del
operon. Mientras que la lactosa tiene enlaces β-1,4, la
alolactosa posee enlaces β-1,6.
ONPG
Es otro sustrato de la β-galactosidasa que, al ser hidrolizado,
produce un compuesto (ortonitrofenol) que presente un
intenso color amarillo. El ONPG es muy utilizado en los ensayos
in vitro de β-galactosidasa, en los que se puede saber la
concentración de β-galactosidasa en función de la intensidad
de color amarillo, medida por absorbancia a 420 nm.
Regulación del metabolismo
Recordando…
En presencia de lactosa…
La glucosa es la principal fuente de energía y carbono en elmetabolismo celular.
Cuando la glucosa y lactosa están presentes en el medio, latranscripción del operon lac no esta activa, hasta que “toda laglucosa del medio ha sido consumida”.
Esta observación lleva a plantearun segundo nivel de regulación deloperon lac: modelo de represióncatabólica.
El efecto represor de la glucosa en la expresión del operon lac esindirecto, mediado por una molécula pequeña de AMPc y, unaproteína llamada proteína receptora de AMPc (CRP) o, tambiénconocida como proteína activadora de catabolito (CAP)
• AMPc: es un derivado del ATP,sintetizado por la enzima adenilatociclasa.
• CRP o CAP: proteína codificada por elgen crp. Se une al AMPc formando uncomplejo que sirve como activadortranscripcional.
• CAP-AMPc: activador transcripcional.Se une a una región del DNA presenterío arriba del promotor del operon lac.
Regulación positiva del operon lac
Aún en ausencia del represor, el promotor del operon lac noes muy fuerte, por lo que requiere la actividad de otrasproteínas.
Bajo AMPc
Alto AMPc
• En ausencia de CAP-AMPc, la RNA polimerasa se unedébilmente al promotor.
• Esto lleva a bajos niveles de transcripción, debido a queno ocurre una interacción correcta entre la RNApolimerasa y el promotor.
• La presencia de CAP-AMPc y, su unión al promotor deloperon lac, causa un giro del DNA que facilita la unión dela RNA polimerasa al promotor, llevando a niveles altosde transcripción.
La glucosa regula los niveles de AMPc
Sin AMPc la proteína CAP no puede unirse al DNA y es inactiva.
A diferencia del represor, el cual regula negativamente el operonlac, la presencia del complejo CAP-AMPc regula positivamente laexpresión del operon.
Elección del mejor azúcar a metabolizar
a) Glucosa presente, lactosa ausente
¿Cómo actúa el operon en presencia o ausencia de glucosa y lactosa?
NO HAY TRANSCRIPCIÓN
Elección del mejor azúcar a metabolizar
b) Glucosa presente, lactosa presente
BAJOS NIVELES DE TRANSCRIPCIÓN
Elección del mejor azúcar a metabolizar
c) Glucosa ausente, lactosa ausente
NO HAY TRANSCRIPCIÓN
Elección del mejor azúcar a metabolizar
d) Glucosa ausente, lactosa presente
ALTOS NIVELES DE TRANSCRIPCIÓN
Resumen de respuestas de operon lac
Inducción de proteína recombinante
Antecedentes y experimento
M. en C. J. Abraham León Domínguez
OBJETIVOS:
• Conocer el fundamento de la inducción de síntesis deproteínas recombinantes en E. coli.
• Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa).
• Obtener la curva temporal de inducción de unaproteína recombinante.
• Interpretar el patrón electroforético de producción deuna proteína recombinante.
• Conocer las aplicaciones biotecnológicas de lasproteínas recombinantes.
Tecnología del ADN recombinante
ADN recombinante: molécula que proviene de la uniónartificial de dos fragmentos de ADN.
Tecnología del ADN recombinante: conjunto de técnicasque permiten aislar un gen de un organismo, para suposterior manipulación e inserción en otro organismo.
Clonación molecular
Etapas de la clonación
Herramientas de la tecnología del ADN recombinante
Expresión del gen clonado
Los vectores de expresión deben diseñarse para asegurarque el mRNA producido sea traducido de manera eficiente.
A menudo hay que realizar ajustes para asegurar unatraducción de alta eficiencia una vez que el gen se haclonado.
Por ejemplo:
• Si el gen clonado contiene intrones (gen eucariótico) nose sintetizará el producto proteico si el hospedador esprocariota.
• Los sitios de unión a ribosomas bacterianos no son losmismos para genes eucariotas.
• El uso codónico puede ser también un obstáculo.
Una vez producida la proteína también hay que tomar encuenta diversas consideraciones…
• Compartimento en el que la proteína se expresará¿necesita una secuencia señal?
• Si la proteína tiene puentes disulfuro, el huésped debeser capaz de formar los puentes disulfuro.
• Modificaciones post-traduccionales. El huésped debeser capaz de hacer estas modificaciones.
• La posible toxicidad de la proteína, utilizar un huéspedresistente.
Vector de expresión pET-24a(+)
Promotor T7
Promotor del bacteriófagoT7.
Se encuentra bajo el controldel operador de la lactosa.
Esto indica que la expresiónde la proteína recombinantepuede ser inducible.
El vector pET tiene la secuencia del promotor T7 y del LacOcerca de la secuencia del transgen
Y, ¿de donde proviene la T7 RNA polimerasa?
• Se utiliza una bacteria lisogénica BL21, en cuyocromosoma se ha insertado el gen que codifica la T7RNA polimerasa precedido del promotor del operon lac.
• La expresión de esta polimerasa esta controlada en unsistema que se puede inducir.
• La activación de la transcripción de la T7 RNApolimerasa es inducida por un inductor del operon lac,como el IPTG.
Sistema de expresión de T7 y, de la proteína clonada
• Esta polimerasa es tan activa que utiliza la mayoría delos precursores del RNA, de forma que los genes delhospedador quedan, en su mayoría sin transcribir y, portanto, la célula deja de crecer.
• El sistema de control T7 es muy eficaz para generarcantidades extremadamente grandes de una proteínade interés concreta.
En la práctica experimental
SDS-PAGE de la producción de proteína recombinante.
