Regulación de la expresión génica de los operones ...Molecular del Hospital Ramón y Cajal, bajo...
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5306060827 JOSE MARIA GOMEZ GOMEZ REGULACION DE LA EXPRESION GENICA DE LOS OPERONES MICROGNA B17 y C7 POR EL LOCUS CROMOSOMICO hns DE Escherichia cali. Director: Dr. Felipe Moreno Jefe de la Unidad de Genética Molecular del Hospital Ramón y Cajal. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Biológicas UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Madrid, 1993 N j7§ (4t 1)
Transcript of Regulación de la expresión génica de los operones ...Molecular del Hospital Ramón y Cajal, bajo...
5306060827
JOSEMARIA GOMEZ GOMEZ
REGULACION DE LA EXPRESIONGENICA DE LOS OPERONESMICROGNA B17 y
C7 POR EL LOCUS CROMOSOMICOhns DE Escherichiacali.
Director: Dr. Felipe Moreno
Jefede la Unidadde GenéticaMolecular del HospitalRamóny Cajal.
Departamentode Bioquímica y BiologíaMolecular
FacultaddeCienciasBiológicas
UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID
Madrid, 1993
N
j7§ (4t 1)
Memoria que paraoptar al grado de
Doctor en CienciasBiológicas presenta
JoséMaría GómezGómez
Madrid, Noviembrede 1993.
V Bt del Director de la Tesis:
Dr. Felipe Moreno Herrero.
Jefe de la Unidad de GenéticaMolecular.
Hospital Ramóny Cajal.
AGRADECIMIENTOS
El trabajo presentadoen estamemoriaha sido realizadoen la Unidad de Genética
Moleculardel HospitalRamóny Cajal, bajo ladireccióndel Dr. Felipe Moreno,al quequiero
agradecersu continuo esfuerzopor encarrilarmeten el mundo de la genéticabacteriana.
Deseoagradecera la Dra PalomaBoschel haberencaminadomis pasosal laboratoriodel Dr.
Moreno,despuésde haberterminadomis estudiosde licenciatura.Al Ministerio de Educación
y Cienciaporhabermeconcedidounabecade Formaciónde PersonalInvestigadorquefacilitó
la realizaciónde estetrabajo.
Desearíamostrartambiénmi agradecimientomás sinceroa la siguientespersonas:
A la Dra.ConcepciónHernándezporsu ayudatanto a nivel moral comoexperimental
mostradaen los momentosmáscríticos de la realizaciónde estaTesis Doctoral.
Al Dr. Ignaciodel Castillo,sin la ayudadelcualestamemoriaposiblementeno hubiera
visto la luz.
Al Dr. JesúsBlázquezpor su continuoafectoy comprensiónmostradosa lo largo de
todoslos añosque he permanecidoen el laboratorio.Nuestrascontinuascharlas,discusiones
y algún queotro trabajoexperimentalsirvieronparamantenerun buen espíritucientífico.
A J. E. GonzálezPastor, por su participaciónen la realización de alguno de los
experimentosdescritosen estamemoria,asícomoen la elaboraciónde algunade sus figuras.
A Olga Mayo, la extrechacolaboracióncientífica y humanaque nos unió durantela
realización de cierto trabajo experimentalajeno a la realización de esta Tesis Doctoral
permaneceráparasiempreen mi memoria.
A la Dra. W del CarmenRodríguezpor su profundaamistady comprensióndurante
los añosmásdurosy “excéntricos’ quepaséen el laboratorio.
A Eladio Velascopor su gran amistady cariñomostradodurantetodos estosaños.
Recuerdocon nostalgialos díasde paz y tranquilidadpasadosen su pueblo de Otonesde
Benjumea.
A Rosado Baquero y MadeleineBouzon por su amistad y el haber soportado
estoicamentemis duros días cuánticos.
A Ana Valero, CarmenMartín y ConchaVidal, su amistady ayuda técnica,que
permitieronque el trabajoexperimentaldescritoen estaTesissepudierallevar a cabo.
Al Dr. JuanPedroGonzálezKirchner. Fue el contactocon él durantelos estudiosde
licenciaturalo que permitió que mis pasosseencaminaranpor la sendade la investigación.
Su profunda y sinceraamistaddurante los once añosque han transcurridodesdeque nos
conocimosha sido fuentede satisfaccióny de conocimiento.
A MartaSáinzde la Mazapor su amistad,la cual se ha ido incrementandodesdequc
nos conocimos.
A AntonioAlonsodel Hierro, por la pacienciamostradadurantela elaboraciónde gran
partede las figuras presentadasen estamemoria.
A todos los restantesmiembros del laboratorio del Dr. Moreno que pasarono
permanecenen el mismo, su amistad ha permitido que mi estanciafuera mucho más
agradable.
A todos los residentesdc la INDIMA que me han apoyadomoralmentedurantelos
añosque ha duradola realizaciónde estaTesis Doctoral.
A María, Man Luz y al Dr. JoséClaudio Pérez—Díaz,su amistady comprensiónme
ha sido muy valiosadurantelos últimos tiempos.
Al Dr. FemandoBaquera.Las charlascientíficasmantenidascon él fueron fuentede
discusióny debate.
A mis padresy hermanaporsu decididoy continuadoapoyo,sin los cualesestetrabajo
no hubierasido posible.
A MIS PADRES Y
A MI HERMANA
Al igual que las moléculasprimitivas de DNA
incrementaronsu abundanciapor replicación,
una trayectoriadel falso vacíopudo inflarse
paraproducir una infinidad de universos,uno
de los cualespodríaserel Universoen el cual
nosotrosvivimos.
Alan Guth
La experienciareligiosacósmicaesla fuerzamás
poderosay noble que impulsa la investigacióncientífica.
Albed Einstein
El esfuerzopor entenderel Universoesuna de
las pocascosasque eleva la vida humanaun poco
por encimadel nivel de la farsa, y le confiere
un pocode graciaa la tragedia.
StevenWe¡nberg
El orgullo es la ruina de todo serhumano.Nuestro
objetivodeberíaser vivir sin orgullo. Uno tiene que
serhumilde anteel problema,si quiereserun buencientífico.
Alan Sandage
La cienciaesuna empresaesencialmenteanarquista,
el anarquismoteóricoes máshumanistay másadecuado
paraestimularel progresoque las alternativasbasadas
en la ley y el orden.
Paul Feyerabend
ÍNDICE
de produccióne
Pág.
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Las microcinas
1.2. La microcinaB17
1.2.1. El sistemade produccióndel antibiótico: determinantes
plasmídicosy cromosómicos
1.2.2. Regulaciónde la expresióngénicadel operónmcb
en faseestacionaria
1.2.2.1. Regulacióndel promotorPmcb
1.3. La microcinaC7
1.3.1. El sistemagenético
1.3.2. Regulaciónde la expresióndel
en faseestacionaria
1.4. Objetivosdel trabajo
2. MATERIALES
2.1. Estirpesbacterianas,plásmidosy bacteriófagos
2.2. Medios de cultivo
2.3. Antibióticos e indicadores
3. METODOS
3.1. Condicionesde cultivo
3.2. TécnicasGenéticasGenerales
3.2.1. Obtenciónde lisadosde fagos y transducción
el bacteriófagoPlvir
3.2.2. Mutagénesiscon el transposónTnlO
3.2.3. Conjugación
3.2.4.
3.3. Clonado
3.3.1.
3.3.2.
Técnicade sustituciónalélica
con el elementomini—Mud114042
Clonadodel alelo hns—9OnTnlO
Aislamientodel plásmidopGG500
inmunidad
operónmccABC
4
.6
.7
.9
.10
.11
12
15
16
16
16
20
21
21
con
.21
.21
... 22
.22
... 23
.23
23
3.4. Pruebasde producciónde microcinaC7 y B17 23
3.5. Pruebasde resistenciay/o inmunidada fagos
3.6. Ensayosenzimáticos
3.7. Técnicasde manipulaciónde DNA
3.8. Mapeo con nucleasaSí
4. RESULTADOS
4.1. Mutagénesisde la estirpeRYC15O(pMM500)con
cl transposónTnlO
4.1.1. Aislamientodel mutanteJMG89
4.1 .2. Caracterizaciónfenotípicadel mutanteJMGS9
4.2. Identificacióndel gen inactivadopor la inserciónTnlO
en el mutanteJMG89
4.2.1. Localizacióndel TnIO
24
24
25
26
28
29
29
30
32
32
4.2.2. Clonadodel TnlO y regionescromosómicasadyacentes:
localizaciónfísica dentrodel genhns
4.3. Efecto de la mutaciónhns—90::TnlOsobrela expresiónde una
.36
fusión mcbA—lacZ 38
4.4. Efecto de la mutaciónhns—90::TnlOy rpoS::Kansobrela
expresiónde una fusión tnccB—lacZ 40
4.5. Estudiodel sitio de iniciación de la transcripciónen el
promotorPinceen ausenciade H—NS y/o RpoS 41
4.6. Transcripcióndel promotorPince en contextohns crp 44
4.7. Aislamientode un fragmentocromosómicode unas19 Kb
que en alto númerode copiasreprimela expresiónde
una fusión mccB—lacZ 48
4.7.1. Aislamientodel plásmidopGG500 48
4.7.2. Localizacióndel fragmentocromosómicodel pGG500
en el mapafísico de E. colí 49
4.7.3. Identificación de un nuevolocus Cercanoal genbis:
efectodel mismo en la expresiónde la fusión mccB—lacZ . . .52
4.7.3.1.Construccióndel plásmido pGG800y análisis
de delecióne insercióndel mismo 55
4.7.4. Efecto del incrementodel númerode copiasde hns y
hnr en la expresiónde la fusión mccB—jaeZ a lo largo
del ciclo de crecimiento 57
4.7.5. Construcciónde un mutantecromosómicohnr—i ::Kan . . .60
4.7.5.1. Construccióndel plásmidopGGK200 60
4.7.5.2. Sustitucióndel alelo silvestrepor el alelo
mutantehnr—1::Kan 60
4.7.5.3. Localizaciónde la mutaciónhnr—1::Kan
en el cromosomade la estirpeJMG200 61
4.7.6. Efecto de las mutacioneshns—90::TnlOy hnr—1::Kan
sobrela expresiónde la fusión mnccB—lacZ 61
5. DISCUSION 65
5.1. La proteínaII—NS regulanegativamentela expresiónde
los operonesmcl’ y mccABC 66
5.1.1. El genhns y su producto 67
5.1.2. La proteínaH—NS y la regulacióndel promotor Pmcb . .. .71
5.1.3. La proteinaH—NS y la regulacióndel promotorPmcc . .. .72
5.2. Identificaciónde un nuevolocus, luir, que regula
negativamentela expresióndel operónmccABC 75
6. CONCLUSIONES 77
7. BIBLIOGRAFíA 80
ABREVIATURAS
Ap ampicilina
Cm cloranfenicol
Da dalton
D.O. densidadóptica
his histidina
Kb kilobases(kilo—par de bases)
kDa kilodalton
Km kanamicina
leu leucina
Nx ácidonalidíxico
ONPG orto—nitrofenil—9—D—galactósido
pro prolina
Sm estreptomicina
Te tetraciclina
thr treonina
Xgal 5—bromo—4—cloro—3—indolil-43—D—galactósido
1. INTRODUCCION
2
1.1.-LAS MICROCINAS.
Las microcinas constituyen una familia de antibióticos peptídicos de bajo peso
molecularproducidospordiversasespeciesde enterobacterias.Fucrondescubiertasdurante
los estudiosencaminadosacaracterizarsustanciasantibióticasproducidaspormicroorganismos
intestinales,posiblementeimplicadasen los sucesivosdesplazamientosmicrobianos que
ocurrenen la flora intestinalhumana(Asensioet aL, 1976).Se definieroninicialmentecomo
aquellassustanciasproducidasporbacteriasGram—negativascapacesde pasaratravésde una
membranade celofán e inhibir el crecimientode una cepaindicadorade E.coli (Asensioa
aL,1976). Se distinguende las colicinas por su menor pesomolecular(menosdc 10 kDa) y
debido a que su síntesisno es inducida por las condicionesque disparanel sistema de
reparación5.0.5, sino que ocurredurantela entradade las célulasen la faseestacionariadel
crecimiento.
Estudios bioquímicos y de inmunidadcruzadade las cepasmicrocinogénicashan
permitidoclasificarlasen seisgrupos(A, B, C, D, E y II) (Baqueroy Moreno, 1984; Laviña
et aL, 1990). Los determinantesgenéticosde produccióne inmunidada las microcinasse
encuentrangeneralmenteen plásmidos(Baqueroy Moreno, 1984); sólo en el caso de la
microcinaH47 (grupoH) los determinantesgenéticosde produccióne inmunidadestánenel
cromosoma(Laviña a al., 1990; Gaggeroet al., 1993).
Otrassustanciasconactividadantibiótica,inicialmenteclasificadascomocolicinas,se
puedenincluir dentro del grupo de las microcinas:así, la sustanciaconocidacomocolicina
X esen realidadmicrocinaB17 (SanMillán et al., 1987); tambiénestañanincluidasdentro
de este grupo la colicina V (Kolter y Moreno, 1992) y la colicina G (J. Blázquez,
3
comunicaciónpersonal).
Hay quc dcstacarpor último que el estudio de las microcinas, inicialmente de
naturalezaecológica,seha ido ampliandoy diversificando,de tal maneraquehaservidocomo
modelode estudiode diferentesaspectosde la fisiología y genéticabacteriana:hapermitido
analizarlos determinantesgenéticos implicadosen la biosíntesisde pequeñasmoleculas
antibióticas,haservidode modeloparael análisisde la secreción,entraday modo de acción
de moléculas peptídicas,y ha facilitado el estudio de la base genéticaque subyacea la
producciónde las mismasen fase estacionariadel crecimiento.Esteestudio,actualmenteen
curso,puedeaportarluz a varios sucesosque ocurrenen estafase, uno de los periodospeor
comprendidosdcl ciclo de crecimientobacteriano.
1.2.- LA MICROCINA B17.
La microcinaB17 (MccBl7), representantede las microcinasdel grupo B, es un
antibiótico péptidicode 3200 Da, termoresistente,y no susceptiblea pHs extremos(llenero
y Moreno, 1986).
El estudio del modo de acción de la microcina B17 se ha efectuadomediante
aislamientoy caracterizaciónde mutantesde E.coli resistentesal antibiótico, lo que ha
permitidodefinir las vías deentraday el blancode accióndel mismo.
La entrada al interior celular estadafacilitada inicialmente por la porina de la
membranaexternaOmpF,puestoque mutantescromosómicosenompE(el gen estructural)
o enompR(gen reguladordel anterior) resistena concentracionesmoderadasde microcina
B17. El productocodificadoporel gensbmA,unaproteínalocalizadaen lamembranainterna,
4
estaría implicado en la importaciónfinal de la microcina BU al interior celular (Mayo y
Moreno,en preparación).Mutacionesen sbmi confierenresistenciatotal a la microcinaBU
(Laviña et aL, 1986).
Unavez dentrode las células, la microcina B17 ejercesu acciónbactericidaa través
de la inhibición de la síntesisdel DNA. Como consecuenciade esta inhibición se induceel
sistema8.0.8 de reparacióny despuésocurre la degradaciónmasivadel DNA (Herreroy
Moreno, 1986). El blanco de la acción intracelularde la microcinaBI 7 es la DNA girasa
(Vizán a al., 1991). El mecanismode acciónes similar al de otros antibióticos inhibidores
de la DNA girasatales como las quinolonas.Este grupo de sustanciasactúan sobre un
intermedio de reacción al que se denomina ‘complejo cortable” (cleavablecomplex). La
microcina MccBl7 es el primer antibiótico de naturalezapeptídica que muestratales
propiedades.
1.2.1.— El sistema de producción del antibiótico: determinantes plasmídicos y
cromosómicos.
La microcina B17 está producidapor cepas de E.coli que portan el plásmido
conjugativopMccBl7 de 70 Kb, presenteenuna o doscopiasporcélula y pertenecienteal
grupo de incompatibilidad IncFII (Baqueroet aL, 1978). Los determinantesgenéticosde
produccióne inmunidadal antibiótico se agrupanen un operónconstituidopor sietegenes
denominadosmcbABCDEFG(San Millán et al., 1985a y 1985b; Genilloud et aL, 1989)
(Figura 1.1A).
5
mcbA codificacl precursorde la microcinaB17, un polipéptidode 69 aminoácidosque
sufre un complicadoprocesamientopost—traduccionalpara rendir la moléculade MccBl7
madura.Tal procesamientoimplica unaseriede etapassecuencialesde modificaciónquímica
de naturalezadesconocida,plegamientoy escisiónendoproteolíticadel precursor, con la
consiguienteeliminaciónde los 26 residuosN—terminales(Davagninoet al., 1986; Yorgeyet
al., 1993). Recientementese ha descritoque la moléculamadura,de 43 aminoácidos,de los
cuales26 son residuosde glicina (60 %), tiene varios cromóforosunidos covalentemente
(Yorgey a al., 1993).
Los productos de los tres genes siguientes (mcbBCD) están implicados en la
produccióndel antibiótico,participandoenel procesosecuencialde maduración(modificación
y plegamiento)del productoprimariocodificadopor el genmebA (Yorgey et aL, 1993). La
inactivacióndecualquierade estosgenesconducea la ausenciade actividadantibiótica(San
Millán et aL, 1985ay 1985b).Sin embargo,aúnfaltapor asignarfuncionesespecíficasa cada
uno de sus productos. Recientemente,una alta homología de secuencia(80%) ha sido
encontradaentre McbC y TfxB, el producto del gen tfxB, el cual está implicado en la
produccióndel antibióticopeptídicobactericidaTrifolitoxina (TFX), producidopor laestime
T2Y deRhizobiumleguminosarum(Breil el aL, 1993). Estaobservaciónsugiereque ambos
péptidoscompartenuna etapasimilar enel procesode maduración.
La produccióndel antibiótico requieretambién el gen cromosómicopmbA, cuyo
producto, una proteína de 50 KDa, estaríaposiblementeimplicado en la maduracióndel
antibiótico,habiéndosesugeridoqueestafunciónpodríaconsistiren la escisióndel precursor
McbA parala eliminaciónde los 26 residuosN—terminalesdel precursorMcbA (Rodríguez—
6
Sáinza al., 1990).
Los genestncbEFGcodifican las funcionesde inmunidada la microcina B17. Dos
mecanismoscomplementariosson responsablesde la misma. El primero se debe a los
productosde los genesmcbEF. El análisisde la secuenciade aminoácidosdeducidade la
secuencianucleotídicaha indicadoque MebE seríauna proteínaintegral de la membranaci—
toplásmica,mientrasqueMcbFseríaposiblementeunaATPasa.ataobservaciónhapermitido
sugerirqueestasdosproteínasconstituiríanuna “bomba” situadaen la membranainternaque
estadaencargadadc exportaractivamentela microcinaa travésde la misma (Garrido a al.,
1988).
El otro sistemade inmunidadestaríamediadoporel productodel genmcbG,a través
de un mecanismoaún no determinado,aunquese ha sugeridoque podría consistiren una
protecciónmás directadel blancode la microcinaB17 (Garrido a aL, 1988).
1.2.2.— Regulaciónde la expresióngénicadel operónmcben faseestacionaria.
La producciónde lamicrocinaB17 tiene lugaren la faseestacionariadel crecimiento.
Esta producciónesunaconsecuenciade la expresiónde los genesmcben estafase del ciclo
de crecimiento.
La aplicaciónde la técnicade mapeoSí y el estudiode la expresiónde fusionesmcb—
JaeZhan permitidoestablecerque todos los genesmcl’ sontranscritosen la mismadirección
a partir del promotor Pmcb, que está localizado unas 60 pares de basesdelantedel gen
estructuralmcbA (Hernández—Chicoet al., 1986; Connelíet al., 1987; Genillouda al., 1989)
(Fig 1.iA).
7
Un segundopromotor P2, que está localizado dentro del gen mcbC, dirige la
transcripciónde mcbD y de los genessituadosdetrás,aunquela mayoríadc la transcripción
(80—90%) de los genesdistalesestádirigida a partir de Pmcb (Genillouda al., 1989).
1.2.2.1.— Regulacióndel promotorPmcb.
El promotorPmcb esun ejemplotípico de un grupode promotoresdenominadosco-
lectivamente“gearbox’, cuyo nivel de expresiónes inversamenteproporcionalal ritmo de
crecimiento (Vicente et aL, 1991). Estos promotores tienen una secuenciade DNA
característica,altamenteconservadadentrodel grupo, alrededorde las regiones—It) y —35 del
promotor(Vicente et al., 1990) (Fig 1.1A).
La expresióndel operónmcb a partir del promotor Pmcb tiene lugar cuandolos
cultivos entranen la faseestacionariadel crecimiento(Hernández—chicoetaL, 1986; Connell
et al., 1987). Los productosde variosgenescromosómicosregulanpositiva (OmpR, IHF) o
negativamente{MprA) estaexpresión.
La expresiónóptima del operónmcb en fase estacionaria,estimadaa partir de la
actividad~—galactosidasade fusionesmcb—lacZ,requiereel activadorOmpR. Esta proteína
de unión al DNA pertenecea la amplia familia de proteínasque constituyenel componente
reguladoren los sistemassensor—reguladorde procariotas,los cualesestánimplicadasen la
transmisiónde señalesambientalesal interiorcelular(StocketaL, 1990;ParkinsonS.J.,1993).
El par EnvZ—OmpR es un ejemplo típico de estafamilia. EnvZ (sensor)es una proteína
histidina quinasa(HPK)/fosfatasaque se encuentrasituadaen la membranainterna de la
célula.Dependiendode la osmolaridaddel medio, EnvZ controlalos nivelesde fosforilación
8
de OmpR (regulador). Según su estado de fosforilación, esta última proteína regula
diferencialmente,activandoo reprimiendo,la transcripciónde los genesque codifican las
pomasOmpC y OmpF(Mizuno y Mizushima, 1990).
El estudiode la expresiónde una fusión mcbA—lacZen contextodeficienteen OmpR,
así comodel efectode la deleciónde los presuntossitios de unión a OmpRen el promotor
Pmcb. (ver Figura1 .IA), han permitidoconcluir quePmcbestaríaorganizadoendosregiones
funcionales:una comprendidaentre las posiciones+1 y —54 que sería responsablede la
inducciónde Pmcben faseestacionaria,y otra situadaentre—54 y —166, requeridaparaque
OmpR ejerzasu efecto de activación(Fig 1.1A). Esteefectode activaciónrepercuteen un
aumentode los niveles de expresiónde mcbobtenidostanto en la fase exponencialcomo en
la fase estacionaria(Bohannona al., 1991).
El segundoreguladorpositivo de la expresión del operón mcb es el factor de
integracióndel huésped(IHF). Setratade unaproteínaheterodimérica(al», del tipo “histone—
like”, que se une a secuenciasespecíficasde DNA, induciendouna fuerte curvaturaen las
mismas.Este modo de unión al DNA le permiteparticiparen diversosprocesos,talescomo
la recombinaciónespecíficade sitio (integracióndel DNA del bacteriófagoX enel cromosoma
bacteriano);la transposición(IS), TnlO); la regulaciónde la expresióngénica tanto a nivel
transcripcionalcomopostransduccional;la replicación,y otros procesoscelulares(revisadoen
Friedman,1988; Freundlichet aL, 1992).
Mutacionesen los geneshimA y himD, los cuales codifican respectivamentelas
subunidadesa y ji del IHF, provocanun fuertedescensoen los nivelesde actividadde una
fusión mcbA—lacZ,anulandola inducciónen fase estacionaria.Este descensose acompaña
9
ademásde una fuertedisminuciónde la producciónde microcinaBU. Estosresultadoshan
sugeridola posibilidadde que IHF controledirectao indirectamentcla expresióndel operón
mcb(del Castillo, 1., TesisDoctoral).En la figura hA seseñalanlos posiblessitios de unión
de IHF a Pmcbque pudieranserutilizadosen la regulaciónde la expresiónde los genesmcl’.
Por último, un reguladornegativodel operón Pmcb es el productodel gen tnprA,
situadoen el minuto 57.5 del mapa genéticode E. cali. Fue identificado porque en alto
númerode copiasreducíala producciónde microcinaB17. Posteriormentesecomprobóque
esta reducciónse correlacionabacon la represiónde [a expresiónen fase estacionariade
fusionesmcb—lac tanto de operonescomo de proteínas(del Castilio 1. et aL, 1990). La
obtenciónde mutantesnulos(MprK), en los queseobservaunafuertedesrepresiónde dichas
fusionesa lo largode todo el ciclo de crecimiento,indicaque MprA esun reguladornegativo
de la transcripcióndcl operónmcb, a nivel del promotorPmcb(del Castillo et aL, 1991).
1.3.- LA MICROCINA C7.
La microcinaC7 (MccC7) es un heptapéptidoquetiene modificadoslos extremosN
y C terminales(García—Bustosa al., 1985). La microcinaC7 inhibe la síntesisdeproteínas
(García—Bustoset al., 1984). Recientementesehadeterminadoqueel residuode metionina
N—terminal se halla formilado, mientras que el residuo C—terminal (Asp) llevaría un
sustituyentecomplejo,encuyacomposiciónse encuentraun nucleótido.(J. L. San Millán y
J. E. González—Pastor,comunicaciónpersonal).
10
1.3.1.— El sistemagenéticode produccióne inmunidad.
La microcinaQ/ (MccC7) esproducidaporcélulasportadorasdel plásmidodc 43 Kb
pMccC7, pertenecienteal grupo de incompatibilidad IncX (Novoa et al., 1986). Los
determinantesgenéticosparala produccióne inmunidada la microcinaestáncontenidosen
un segmentode 6.5 Kb del pMccC7 (J. E. Gónzalez—Pastorcomunicaciónpersonal).Dentro
de este segmentose definieron originalmente por estudios de complementacióncuatro
regiones,a, fi, y y b (Novoae aL, 1986).Recientementeseha completadola determinación
de su secuencia,lo que ha permitido establecerel esquemade organizacióndel sistema
genéticomccrepresentadoen la figura 1.1B (González—PastorJ. E., comunicaciónpersonal).
Al examinar la secuenciade DNA inmediatamentedelantede la región a, se detectóun
cuadrodelecturaabierta(ORF) de 21 nucleótidosquecodificaunasecuenciade aminoácidos
casi idénticaa la del heptapéptidode la microcinaC7 (Asn envez deAsp en la posición 7).
Recientementeseha podido demostrarqueeste ORF esen realidadel gen estructuralde la
microcinaC7 (González—Pastora al., en preparación).En las regioneso. y y se encuentran
localizadoslos genesmccBy mccD,respectivamente,cuyosproductosestánimplicadosen la
produccióndel antibiótico.Por otra parte, en las regiones fi y ~ se encuentransituadoslos
genesmccC y mccE, respectivamente.MccC y MccE estarían implicados tanto en la
produccióncomo en la inmunidada la microcinaC7. Por último, MccF, productodel gen
mccF, solamenteconferiría inmunidadal antibiótico (Fig 1.1B).
III
1.3.2.— Regulaciónde la expresióndel operónmccABCen faseestacionaria.
Los genesmccABCconstituyenun opcrón cuya expresión tiene lugar en la fase
estacionariadel crecimiento (Fig 1.18). La transcripciónen esta fase estádirigida por el
promotorprincipal Pmccsituadoal principio del operón(González—Pastoret al., manuscrito
en preparación).Pincedirige la transcripciónde los genesproximalessituadosen las regiones
inicialmentedenominadasa y ji (mccABC),aunqueno seconocesi la transcripciónde los
genesmásdistalesdel operónse origina tambiénen Pince (Ng l.1B).
El promotorPinceesreguladopositivamenteporlos productosde los genescrp y rpoS
(appR). El gen crp codifica la proteínareceptorade AMPc (CRP, tambiénconocidacomo
CAP). La actividadde CRPestáreguladapor la concentraciónde AMPe, la cuala suvezestá
moduladapor la fuente de carbonoen la que las células crecen. Cuandolas células son
cultivadasen fuentesde carbonopobres,subela concentraciónde AMPe, que seune a CRP
produciendo un cambio conformacionalen la proteína, que le permite unirse a sitios
localizadosdentro o cercanosa los promotoresque controla, para activar o reprimir la
transcripción(Para revisión, de Crombruggheel aL, 1984; Botsford et al., 1992; Kolb et
aL,1993). Unamutaciónde delecióndel gencrp (Acrp—39) provocaque la expresióndeuna
fusión mccfi—lacZsea totalmente nula en fase estacionaria(González—Pastoret al., en
preparación).
El locusappR fue identificadooriginalmentecomoungenreguladorcuyoproductoera
necesariopara activar la expresiónen fase estacionariade appA, el gen estructuralde la
fosfatasaácida(AppA) (Touatieí aL, 1986).Mutacionesen appRprovocanun fuertedescenso
en los nivelesdeproducciónde la microcinaC7 y en la expresiónen faseestacionariade una
12
fusión mccB—lacZ(Díaz—Guerraet aL, 1989). Estos resultadossugeríanque AppR era un
activadorrequeridoparala expresiónóptima de los genesmcc en fase estacionaria.
Las mutacionesen el locusappR,katF,nur,csi—2,hansido identificadascomoalélicas
de un gen conocido con cl nombre de rpoS (Lange y Hengge—Aronis, 1991). La alta
homologíade RpoS con los factoressigmasvegetativosde la RNA polimerasa(Mulvey y
Loewen,1989; Lonetto et al., 1992)habíapermitidosugerirque RpoS seríaun factor sigma
alternativoutilizado por la RNA polimerasaparala expresiónde genesexpresadosen la fase
estacionariadel crecimiento y/o en condiciones de deprivación de nutrientes (Lange y
Hengge—Aronis,1991).Recientementehasido demostrado,medianteestudiosde transcripción
in vitro, que el productodel gen rpoSes realmenteun factor sigmautilizado por la RNA
polimerasa,denominadoindistintamenteos o &~ (Tanakaa al ., 1993).
1.4.— OBJETIVOS DEL TRABAJO.
Como ya se ha comentadoen los párrafosanteriores,estudiospreviosrealizadosen
nuestrolaboratoriohabíanpermitido identificar variosgenescromosómicoscuyosproductos
están implicados en la regulaciónde la expresióndel operónmcb o del operónmcc. Sin
embargo,aún no se había identificado ningunafunción cromosómicacuya ausenciapor
mutaciónafectaraala veza la expresiónde ambossistemas.Dadoque la expresiónde los dos
operonesse induce en la fase estacionariadel crecimiento,era razonablehipotetizarque
existierangenesque controlaranla expresiónde ambossistemasdurantedichafase. Con el
objeto de identificar esoshipotéticosgenes, se procedióal aislamientode mutantespor
13
insercióndel transposónTnlO que tuvieranafectadastanto la producciónde niicrocina C7
como la expresiónde la fusión mcbA—lacZ.Los resultadosobtenidosse presentanen los
apartados4.1—4.6.
Por otra parte,consideramosinteresantebuscarpresuntosreguladoresnegativosde la
expresióndel operónmcc. Con esteobjetivo, seprocedióa donarfragmentosdel cromosoma
deE.colien un vectormulticopia.La ideasubyacenteerabuscargenes,en principio silvestres,
queen alto númerode copiasregulasennegativamentelaexpresióndeunafusiónmccB—lacZ.
Esta estrategiaha sido utilizadapreviamenteen nuestrolaboratorioparabuscarreguladores
negativosdel operónmcb,y ha permitido identificar el gen mprA (del Castillo et al., 1990)
(ver apartado1.2.2.1).Los resultadosde este trabajosepresentanen el apartado4.7.
14
A
Pmcb Uit sic D E E O
cC1G?G00000:TXXAGCCGTAGTG?SACATGCTCACAGCAACTGAAAGCOmoR
~
C7CkAccAAC:GATATTATTATTAAATATTTXAGAC0GGTACAAAT~AG
HiF-L________ (gearbox> ___________
- %IAAT’ATCATTGCAAAATA ?AGZrAATTACCSGCAAGTAACTAGTGTT
—135 —10
>t
8 C D E F
Fig 1.1.— A) Esquemade la organizaciónde los genesmcl’ (microcina B17>. Se representa
la secuenciade DNA del promotorPmcb y zonasadyacentes.Se hansubrayadolas regiones
—10 y —35, los posiblessitios de unión de las proteínasactivadorasOmpR(Genillouda aL,
1989; Bohannoneral., 1991) y IHE (del Castillo 1., Tesisdoctoral),así como la secuenciade
tipo “gearbox” (Vicente et aL, 1990). B) Esquemade la organizaciónde los genesmcc
(microcinaC7). El promotorPmcc dirige la transcripciónde los genesmccABC.
8Pmec
1
¡
1.>~Ys~Q
k.9
SS
2. MATERIALES
16
2.1.— Estirpesbacterianas,plásmidosy bacteriófagos.
Las estirpesbacterianas,plásmidosy bacteriófagosutilizadosen estetrabajosedescriben
en la Tabla 2.1.
2.2.— Medios de cultivo.
El medio rico LB (Luria—Bertani) y el medio mínimo M63, tanto sólidos (placas)como
líquidos, fueron preparadoscomosedescribeen Miller (1972).El mediomínimo líquido (por
litro) fue suplementadocon 10 ml de glucosa20%, 1 ml de vitaminaBí tmgIml, y 1 ml de
MgSO4 1M. El medioLBON fue preparadoomitiendoel NaCí de la composicióndescritapara
el LB. Los mediosPl y P75,utilizados parala preparaciónde los Usadosde Plvir y >370
respectivamente,asícomoel mediorico 2XTY, utilizadoparacultivarlaestirpe71—18, fueron
preparadossegúnMiller (1972).
2.3.— Antibióticos e indicadores.
Los antibióticos fueron utilizados a las siguientes concentracionesfinales (~tg/ml):
ampicilina (Ap), 40; kanamicina(Km), 30; cloranfenicol (Cm), 30; tetraciclina (Tc), 20
(generalmente)o 4 (para el donado del Tn1O con mini—Mud114042 (ver sección3.3);
bleomicina(ble), 15;estreptomicina(Sm),20.El indicadorS—bromo—4—cloro—3—indolil—fl—D—
galactósido(X—gal) fue añadidoa las placasa unaconcentraciónfinal de 50 ~gIml.
17
Lista de estirpesde E.coJi K12, plásmidosy bacteriófagosutilizados en estetrabajo.
Estirpes Genotipo/Fenotipo Fuentey /o Referencia
BM21
iMG89
JMG9()
JMG92
JMG93
JMG94
JMG96
JMG100
JMG1O2
JMGlO3
JMG1O4
JMG200
JMG300
JC7623
KL1 4
KL16
MC4100
pop3000
popl300l.6
RYC1000
RYC22
RYC1SO
SBS688
W3110
ZK126
W gyrA (>6)
RYC15O hns—90::TnlO(pMMS5O)
RYC15O hns—90::TnlO
pop3000hns—90::TnlO
KL16 hns—90::TnlO
KL14 hns—90::TnlO
po300l.6hns—90::TnlO
MC4IOO hns—90::TnlO
MC4100 rpoSzKan
JMG1O2hns—90::TnlO
8BS688hns—90::TnlO
MC4100hnr—J::Kan
JMG200hns—90::TnlO
F~ thr leu proA2 lacYl gal]? his
argE rpsL supEintí syl recB2l
recC22sbcBl5piV
Hfr thil reí]
Hfr thil reí]
F A(argF—lac)U169 araDl39 flbBS3Ol
fruA2S reJAl rpsLlSO rbsR
HfrH
MC4100malT::Mu cts
MC4lOO Arbs7recA56gyrA
F thr leuproA his4 argE thiA
gal xyl lacYrpsL gyrA
MC4100 >M,ct~t «mcbA—lacZ)37
MC4100 Acrp—39
P IiN(rrnD—rrnE)1
W3110 /4argF—lac)U169tna—2
Coleccióndel
Estetrabajo
Estetrabajo
Este trabajo
Estetrabajo
Estetrabajo
Estetrabajo
ate trabajo
Este trabajo
Estetrabajo
Estetrabajo
Estetrabajo
Este trabajo
Winanset al.
Coleccióndel
Coleccióndel
Laboratorio
(1985)
Laboratorio
Laboratorio
Coleccióndel Laboratorio
Coleccióndel Laboratorio
Coleccióndel Laboratorio
Coleccióndel Laboratorio
Coleccióndel laboratorio
Coleccióndel laboratorio
Coleccióndel Laboratorio
P. L. Boquet
Coleccióndel Laboratorio
Bohannoner al. (1991)
Tabla 2.1.
18
ZK126 rpoS::Kan
A(pro—lac)dii supE (F’
proAB ~ IacZAM1S)
Bohannona al. (1991)
Messing1983
Bacteriófagos Genotipo/Fenotipo Fuentey/o Referencia
Plvir
Tula
Kvír
480vir
>370
Ml3tgl3l
Plásmidos
pEG1O9
pDG25O
pMM5O1
pMMS5O
pMM833
pBR322
pACYC1S4
pUCiS
pUC4K
pKT254Q—Ap
b221 c1857c1178::TnlO0U0A261
lacZQ
Mud114042::phoA—proC
fusión génicamccB—lacZ;
replicón pMccBl7
pMccC7nTnSMccct ImmB17~
pBR322portandolos genesmccABCDE
pMccBl7::Tn5MccB17~ ImmB17~
replicónpMB1 Ap~ Ter
replicón piSA Cmr Tc’
Apr lacZ0 replicóncolEl
Apt plásmidoportadorde un cassette
de resistenciaa kanamicina(Kan)
plásmidoportadorde un cassettede
resistenciaa ampicilina (Ap’)
Colección
Colección
Colección
Colección
Colección
Colección
del Laboratorio
del Laboratorio
del Laboratorio
del Laboratorio
del Laboratorio
del Laboratorio
Groismanet al. (1984)
Díaz—Guerra
Novoaa aL
Novoaa aJ.
Coleccióndel
Coleccióndel
Coleccióndel
Coleccióndel
et aL (1989)
(1986)
(1986)
Laboratorio
Laboratorio
Laboratorio
Laboratorio
Pharmacia
Fellay er al. (1987)
Notasa la Tabla2.1.
1. La mutación rpoS::Kan se transfirió mediantetransduceiónPlvir desde la estirpe
ZK1000 a la estirpe MC41O{) para dar origen a la estirpe JMG1O2. La estirpe JMG1O2
mostrabados fenotiposcaracterísticosconferidospor mutacionesenel gen rpoS.
a) Deficienciaen la catalasaHPII (codificadaporel genkatE), la cual semanifiestaen
unaausenciade burbujeo(conrespectoal controlsilvestre(MC4100)despuésdedepositaruna
ZK1000
71—18
19
gota de I~l2O2 al 30 % sobreuna estríacrecidatoda la nocheen placasde LB (Bohannona
aL, 1991; Langey Henge—Aronis1991).
b) Disminución en la actividad fosfatasaalcalina(AppA) comparadacon la estirpe
MC4100 (Touati a aL, 1986; Lange y Henge—Aronis1991; Bohannoner al., 1991).
2. La transferenciade la mutaciónhns—90::TnlO a los distintos contextos(JMG1O2,
JMG1O4)fue realizadamediantetransducciónPlvir, seleccionándoselos transductantescomo
clonesTct.
3. El plásmidomonocopiapDG25Oportadorde la fusión mccB—JaeZ fue introducidoen
las estirpesJMGlO2, JMG1O3,JMG200 y JMG300 seleccionandolos transformantescomo
clonesresistentesal antibiótico bleomicina(a unaconcentraciónfinal en placade 15 gg/ml).
3. METODOS
21
3.1.— Condicionesde cultivo.
La incubaciónde los cultivos en medio líquido sellevó a caboenbañostermostatizados
con agitación. El crecimientode estos cultivos se siguió mediantemedidasde turbidez
(absorbanciaa óOOnm).
Paralos cultivos en medio sólido seutilizaron placasde petri, que seincubaronde 12 a
48 horasen estufastermostatizadas.
La temperaturade incubaciónfue parala mayorpartede las estirpesutilizadasde 37 “C.
Ocasionalmentese emplearonlas temperaturasde 30 0C y 42 0C en la manipulaciónde las
bacteriastermosensibles.
3.2.— TécnicasGenéticasGenerales.
3.2.1.— Obtenciónde lisadosde fagos y transduccióncon el bacteriófagoPlvir.
Parala preparaciónde lisados,así comoparala transduccióncon Plvir procedimossegún
los protocolosstandarddescritospor Miller (1972).Parala obtenciónde lisadosde los fagos
Tula y F8Ovir seprocediódel mismo modoque con el Plvir. Para la preparaciónde lisados
de Kvir se utilizó como medio de propagaciónP75 (Miller 1972) al que se le añadieron
SO4Mg2 (2OmM) y maltosa(0.4%).
3.2.2.— Mutagénesiscon el transposónTnlO.
En primer lugar preparamosun banco de insercionesTnlO sobre la estirpe silvestre
MC4100, mediante infección con el fago >370 (b221 c1857 c1178::TnlO0uoA26i)
seleccionandolas insercionescomo clonesTer resistentes.Sobreestepooí de insercionesse
22
preparóun lisado dePivir con el que seinfectó la cepaRYC1SO(pMM55O)obteniéndosede
estemodo aproximadamenteunos 3000 transductantes(APE Tcr ) a 30 0C en placasde LB
suplementadascon el indicadorX—gal.
3.2.3.— Conjugación.
Se mezclaronun cultivo de la estirpedonadora(Hfrs o células portadorasde plásmidos
conjugativos) con uno de la estirpe receptora (bacterias F9 en la proporción 1:10
(célula/célula). La incubación se efectuó sin agitación durante un tiempo variable,
normalmente60 minutos para la conjugacióncon plásmidos (pMM833 y pMMSO1). La
interrupciónde las conjugacionesJMG92 x BM21 y JMG93 x BM2I (Fig 4.2) fue llevadaa
cabomediantefuerteagitacióncon vortex.
3.2.4.— Técnicade sustituciónalélica (Winanset aL., 1985).
Estatécnicade sustituciónalélicasebasaen el empleo de la estirpeJC7623,portadora
de las mutacionesredB2l recC22 sbcCBl5(Tabla 2.1). La sustitucióndel alelo silvestre
cromosómicopor el alelo mutante (normalmenteportadorde una inserción que confiere
resistenciaa un antibiótico) tiene lugar medianterecombinaciónhomóloga.El alelo mutante
essuministradoen un plásmidoque seha linealizadopreviamente.Con esteDNA en forma
lineal se transforma la estirpe JC7623,seleccionándoselos transformantescomo clones
resistentesal antibiótico adecuado.
23
3.3.— Clonadocon cl elementominiMudII4O42 (Groismana al., 1984).
3.3.1— Clonadodel alelo hns—90::Tn¡O.
Se procediósegúnel métodode donado‘fin vivo” descritopor Groismanet aJ ., (1984).
El alelohns—90::TnlOfue transferidomediantetransducciónPtvir desdela estirpeJMG100
a lacepapop300l.6(pEGIO9). El plásmidopEG1O9portaun elementomini—Mud114042que
lleva el replicón piSA y el gen cat (Cm’) procedentesdel pACYCi84. Sc obtuvo un lisado
de Mu mediantetermoinduccióna partir de un transductanteTe1, Cm1 (JMG96). Con este
lisadoseinfectó la estirpepop300l.6.VariosclonesCm’ Tc’ (a unaconcentraciónfinal de Te
en placade 4~xg/ml) fueron obtenidosde la muducción.El DNA plasmídicode uno de ellos
(pGG300)fue purificado paraposterioranálisis.
3.3.2.— Aislamientodel plásmido pGGSOO.
Con un lisado de Mu obtenido mediante termoinducción a partir de la estirpe
pop300l.6(pEGI09)se infectó la estirpereceptorapop300l.6(pDG25O).Los muductantes
fueron selecionadoscomoclonesCm1 Kmr en placasde LB suplementadascon el indicador
X—gal a 37 0C.
3.4.— Pruebasde producciónde microcinaC7 y B17.
La producciónde las microcinasff17 y C7 seevaluómediantedetecciónde los halosde
antibiosis producidossobre un céspedde una estirpesensible(RYC1000). Se preparóun
céspedbacterianosembrandosobremedio mínimoM63, 0.1 ml deunasuspensiónde células
RYC1000.La adición de 3 ml de agarblandomínimocontribuyóa la distribuciónuniforme
24
de la suspensióncelular.A continuaciónseinocularonpor picadalos clonescuyaproducción
se deseabaprobar. Tras incubaciónde 12 horas, los clones productoresdel antibiótico
formaron halos claros de antibiosis debidosa la inhibición del crecimientode la estirpe
sensiblecausadaporel antibióticodifundidoa travésdel agar.El diámetrode los ba]osreflejó
cl gradode producción.
3.5.— Pruebasde resistenciay/o inmunidada fagos.
Paradeterminarla sensibilidadde las distintasestirpesbacterianasa un fagoseutilizó el
métododel “cross—streaking”.En el bordede placasde LB sedepositarongotas(100 vI) de
la suspensiónfágica (lOs u.f.p/ml), que seextendieronhastael extremoopuesto,colocando
laplacaenposiciónvertical. Las coloniasaprobarseestriabanperpendicularmentecruzando
la zonaimpregnadacon la suspensiónfágica. Las placasseincubarondurantetoda la noche
a 37 0C. En las placasasípreparadas,las estríassensiblescrecensolamentehastala zonacon
fago, las resistenteso inmunesmantienenun crecimientohomogéneoa lo largo de toda la
estría.
3.6.— Ensayosenz¡mñticos.
Los ensayoscuantitativosde f3—galactosidasafueronrealizadosutilizandoorto—nitrofenil—
ji—D—galactósido(ONPG) como sustratosegúnel procedimientodescritopor Miller (1972).
La actividadfosfatasaalcalinafue cuantificadasegúnel procedimientodescritoporMichaelis
et aL, (1983).
25
3.7.— Técnicasde manipulaciónde DNA.
Todaslasmanipulacionesestándartalescomopreparaciónde DNA plasmídico,digestiones
con enzimasde restricción,transformación,electroforesisengelesdeagarosay poliacrilamida
fueron hechascomosedescribeen Sambrooket aL, (1989).
Para la secuenciaciónde la mutación hns—90::TnlOse procedió según la siguiente
estrategia:un fragmento de 4,1 Kb BglII (constituido por aproximadamente2,2 Kb de la
regiónadyacenteal puntode insercióny por 1.9 Kb conteniendo¡a ISJORdel transposón,fue
purificado a partir del plásmido pGG300, y digerido con Sp/tI y PstI para obtenerun
fragmentode 1,6 Kb, que fue donadoen el vectorMl3tgl3l (segúnel protocolodescritopor
Messingel al., 1983)dandoorigenal fago recombinantepGG95O.
Las formasSS ( DNA de hebrasencilla)del pGG95Ofueron utilizadascomo molde en
la reacción de secuencia y como cebador se usó el oligonucleótido
5TCGCGAACCArVFGATCATAT Y, complementarioa la ISiOR del transposónTnlO. La
secuenciadel DNA fue determinadaporel métodode los didesoxinucleótidos(Sangerel al.,
1982)medianteel uso de la enzimaSequenase(segúnel protocolode los fabricantes).
La extraccióndel DNA genómicode la estirpe W3110 se realizó segúnel protocolo
descritopor Sambrookel al., 1989. Para la extraccióndel DNA genómico de las estirpes
MC4100 y JMG200 se procedió segúnel protocolodescrito por Alonso el al., 1993. El
marcajede las sondasse realizó por el método de “cebado al azarcon hexanucleótidos”
(Feinbergy Vogelstein,1983), o bien por la técnicade “nick transíation”(Sambrookel al.,
1989).Los Southernblots se realizaronsegúnlos protocolosdescritospor Sambrookel aL,
1989.
26
3.8.— Mapeocon nucieasaSI.
El oligonucícótido5’ CCAACAATCCACCGCFCCC3’ complementarioa la posición
(+120)situadadetrásdel inicio de la transcripcióndelpromotorPmcc(Gónzalez—Pastorel aL,
en preparación)fue marcadoen cl extremo Y con (y 32P)ATP utilizando la polinucicótido
quinasa del T4, según el protocolo descrito por Sambrookel aL, 1989. Este oligo fue
hibridado a DNA de hebra sencilla obtenido a partir del plásmido pMM11l (Fig 3.1)
(González—Pastor.,J.E. en preparación)y elongadocon el fragmento Klenow de la DNA
polimerasa1. Despuésde digerir con PsrI el producto de elongación, la hebra de DNA
sintetizaday marcadaen 5’ fue extraídade los geles de acrilamidaal 7% en condiciones
desnaturalizantes,e hibridadaa 50 jxg de RNA total extraído de cultivos de LB en fase
exponencialo estacionariade las estirpesque se indican en la Fig 4.6. Los productosde
hibridaciónfueron tratadoscon nucleasaSi y los heterodúplexde RNA—DNA resistentesa
la degradaciónfueronseparadosen gelesde poliacrilaniidaal 7% (Fig 4.6). Las condiciones
de hibridación y tratamientocon nucleasaSi fueron descritaspor Ausubel ci’ al., 1987.
Aproximadamente20 vg de RNA tratadofueron cargadosen cadapocillo.
27
genes mcc
EH
pMM 550
Tn 5(4.9>
pMMS5IJ :TnS(L.9)
IS 50(4.9>
9i,cc*mccA
1.2 Kb
P P
mccB
Fig 3.1.— Estructura del plásmido pMM111. El plásmido pMM5SO es un derivado del
pBR322, que lleva de los genesmccABCDE(Tabla2.1). El plásmidopMMSSO::TnS(4.9)es
un derivadodel pMMSSO con unainsercióndel transposónms localizadafuerade la región
dondese encuentranlos genesmcc. El plásmidopMM111 se construyómedianteel donado
de un fragmentoPsrI de 1,2 Kb procedentedel plásmidopMM55O::Tn5(4.9)en el únicositio
PstI del vectorMl3tgl3l.
E PB
P
HB=1~’
1 Kb
SOOpbP
pMM 111
4. RESULTADOS
29
4.1.— Mutagénesisde la estirpeRYC15O(pMMSSO)con el transposónTnlO.
La cepa RYC1SO contieneun profago lambda lisógeno que porta una fusión (de
proteínas)entreel primer gen del operónmcby el gen de la ji—galactosidasa(mcbA—lacZ).
El plásmido pMM5SO es un derivadode pBR322que porta los genesde producciónde la
microcina C7 (genesmeeABCDE—Novoaa al., 1986; González—Pastor.,comunicación
personal).Este plásmido fue introducido en RYC15O mediantetransformación,y la estirpe
resultante,RYC1SO(pMMS5O),fue mutagenizadacon el transposónTnlO como sedescribe
en Métodos (ver sección 3.2.2.). Nuestra intención era seleccionaraquellos mutantes
cromosómicospor insercióndel transposónTnlO que tuvieran afectadastanto la regulación
de la expresiónde la fusión tnebA—lacZcomo la producciónde microcina07.
4.1.1.— Aislamientodel mutanteJMGS9.
Las coloniasTer, Ap’ obtenidasen el experimentode mutagénesisseclasificaronen
los siguientesgrupos,atendiendoasu coloraciónen medioLB suplementadocon el indicador
X—gal:
a) Clonesde color azul claro, semejantesal control RYC15O(pMMSO),en los que la
insercióndel transposónTnlO no habíaafectadoa la expresiónde la fusión mcbA—lacZ.
b) Clonestotalmenteblancos;todoselloseranCmS, lo queindicabaquehabíanperdido
el profago lambda portador del gen cta (el producto del cual confiere resistenciaal
cloranfenicol)y de la fusiónmebA—laeZ, explicandodichaausenciala falta decolorenX—gal.
c) Un clon de pequeñotamañoquemostrabaun color azul intenso,lo queindicabaque
en el mismo la expresiónde la fusión mebA—jaeZ se encontrabafuertementeaumentada.
30
Dicho mutanterecibió el nombrede JMGS9.Cuandoensayamosla producciónde microcina
C7 en medio LB, se observóque el halo de antibiosis producidopor la estirpeJMG89 era
ligeramentemayor que el originadopor la estirpeisogénicasilvestreRYC15O(pMM55O), lo
que sugeríaque la producciónde mierocina07 estabaincrementadaen el mutante.
4.1.2.— Caracterizaciónfenotípicadel niutanteJMG89.
Paraverificar que la mutacióneraúnicamentedebidaa una insercióndel TnlO en el
cromosoma,sepreparóun lisadodelbacteriófagoPlvir sobrelacepaJMG89. Con estelisado
se transdujo de nuevo la estirpe parental RYC1SO(pMM5SO), y se seleccionaronlos
transductantesresistentesa tetraciclina.En todosellosobservamosquetantoel incrementoen
la actividadfl—galactosidasade la fusión mebA—laeZ, como el aumentode la produccióndc
microcina C7 se reproducían,indicando que una única inserción del transposónTnlO era
responsablede la mutaciónen la estirpeJMG89.
A continuaciónpasamosa caracterizaren detalle el efecto que la inserciónTnlO
aisladaen la estirpeJMG89 teníasobrela producciónde las microcinasC7 y B17. Por una
parte, dado que la inserciónTnlO provocabaun incrementoen la expresiónde la fusión
mebA—laeZ, queríamosverificar si esteefecto teníaalgunarepercusiónen la producciónde
microcina B17. Por otra parte, queríamosverificar que el incrementode producciónde
microcina C7 observadocon el plásmido multicopia pMMS5O se observabatambién con
plásmidosproductoresmonocopia. Para este propósito, la mutación TnlO fue transferida
mediantetransducciónPlvir desdeel mutanteJMG89 a la estirpeMC4100 paradar origen
ala estirpemutanteJMG100.Los plásmidospMM5O1 y pMM833 sonderivadosde inserción
31
TnS de los plásmidosmonocopiaproductoresde microcinaC7(pMccC7) o de microcina
B17(pMccBl7) respectivamente,los cualesportan los genesque codifican las funcionesde
produccióne inmunidada los antibióticos (mccABCDEFy mcbABCDEFG,respectivamente)
(ver Tabla2.1).Los plásmidospMM5O1 y pMM833 fueron introducidosindependientemente
por conjugación en las estirpes MC4100 y JMG100, dando origen a las estirpes
microcinogénicassilvestres MC4IOO(pMMSO1) y MC4100(pMM833), y a las mutantes
JMG100(pMM5O1)y JMGIOO(pMM833).
La capacidadde producciónde microcinaB17 de las cepassilvestrey mutantefue
ensayadaen medio mínimo M63. Se observóun significativo incrementodel tamañode los
halosdeantibiosisproducidospor la estirpeJMG100(pMM833)al compararloscon los desu
isogénicasilvestreMC4lOO(pMM833), indicandopor tantoqueel incrementode la expresión
de la fusión mebA—laeZobservadaen el mutanteJMG89secorrelacionabacon un incremento
en la producciónde mierocinaB17.
La capacidadde producciónde microcinaC7 de las estirpesMC4100(pMM5O1) y
JMG100(pMM5O1)fue ensayadaen medio LB. Este ensayoserealizóen medio completo
debidoa que la mutaciónTnlO queestamosestudiandoprovocadeficienciade crecimiento
en medio mínimo (ver más adelante).Observacionesno publicadasde nuestro laboratorio
indican que, en ausenciade crecimiento de las cepasmicrocinogénicas,la producciónde
microcinaC7 no selleva cabo.En contraste,la producciónde la microcinaB17 puedereali—
zarseen ausenciade crecimientode las cepasproductoras.Cuandolaproduccióndemicrocina
C7 fue ensayadaen medio completoLB, seobservóun significativo incrementodel tamaño
de los halosde antibiosis originadospor la estirpemutanteJMG100(pMM5O1)con respecto
32
a los halos producidos por la estirpe silvestre MC4100(pMMSOI). Este resultadoera
consistentecon los resultadosobtenidoscon el plásmido multicopia pMM5SO en la estirpe
original JMG89.
En el cursodel estudiodelmutanteJMG89seobservaronvariosfenotiposen principio
no relacionadoscon la producciónde las microcinasC7 y B17:
a) Tanto la estirpeJMG89 comola estirpe JMG100 producíancoloniasaltamente
mucoidesen placasde medio LB y crecíandeficientementeen placasde M63, con respecto
a sus controlessilvestresRYC15O(pMM5SO)y MC4lOO.
b) Las estirpesmutantesmostrabantambién resistenciasa fagos: eran totalmente
resistentesa Xvir y Tula y parcialmenteresistentesa ‘b80vir, segúnel método del “cross—
streaking” (ver Métodos).
Esta diversidadde fenotiposconferidospor la mutaciónTnlO en contextogenético
MC4100, indicabaque éstaafectabaa un locus que ademásde regular negativamentela
produccióndemicrocina07 y B17, regulabala expresiónde otros genesbacterianos.
4.2.— Identificación del gen inactivadopor la inserciónTnlO en el nrntante3MG89.
4.2.1.— Localizacióndel TnlO.
Para localizaren el mapagenéticoel Tu/O responsablede la mutaciónpresenteen la
estirpeJMGB9, utilizamos la técnicadel mapeoporconjugación.
Enprimer lugar,procedimosa transferirel TnlO(Tc’) mediantetransducciónvía Pívir
al cromosomade variasestirpesHfr (pop3000,KL16 y KL14), cuyosorígenesdetransferencia
semuestranen la Fig 4.1. Cadaunadelas cepasresultantes,a las quedenominamosJMG92,
33
JMG93 y JMG94, se conjugócon la estirpeRYC22. El análisis de los recombinantesThr~
Leut Sm’, Pro~ Sm’ e Hist Sm’ y Tc’ Sm’ parala presenciao ausenciade los marcadoresno
seleccionadossugirióqueel TnlO estabainsertadoentrelos marcadoresproAB (mm. 6) e his
(mm. 44) del mapade E. eoli (Fig. 4.1).
Para situar con más precisión el TnlO, realizamosexperimentosde conjugación
interrumpida,utilizando JMG92 y JMG93 como estirpesdonadoras,y BM21 comoestirpe
receptora(ver Métodos).En la figura 4.2 semuestrael númerode transconjugantesTe’ Nx’
en función de la duracióndel tiempode la conjugación.El cálculodel tiempo deentradadel
marcador(en nuestro caso, el determinantede resistenciaa tetraciclinadel TnlO) permite
posicionarlo sobre el mapa de ligamiento, cuyas unidadesbásicas,los minutos, fueron
definidasoriginalmenteen experimentosde conjugacióninterrumpida.El tiempo de entrada
del marcadorse calculaa partir del tiempo en que aparecenlos primerostranseonjugantes,
descontandoun periodo de cinco minutos (tiempo transcurridodesdeque las bacterias
donadoray receptorasc ponenen contactohastaque empiezala transferenciadel DNA).
Como se puede observar, en la conjugación JMG92 X BM21, los primeros
transconjugantesTc’ Nx’ aparecena los 35 minutosde comenzarla conjugación.El tiempo
de entradadel TnlO es, por tanto, 30 minutos.Puestoque el origen de transferenciadel Hfr
JMG92estáenel minuto 98 (Fig 4.1) y susentidode transferenciaesel horario,elTnlO debe
estarsituadocercanoal minuto 28 del mapagenético.
Por otra parte, los primerostranseonjugantesTe’ Nx’ aparecena los 38 minutos del
inicio de la conjugaciónJMG93 X BM21. Por tanto, el tiempode entradadel TnlO esde 33
minutos.Puestoque el origende transferenciadel Hfr JMG93 estáen el minuto 61 (Fig 4.1)
34
loo/othf Ieu
rpsú(739
KL14
KL1G
proA(61
Fig—4.1.— Origen y sentidode transferenciade los Hfrs KL14, KL16 y pop3000.Se indica
la localización de algunos de los marcadoresutilizados en nuestros experimentosde
conjugación.
pop3000
Ns
cyrA (44’)
(48.)
35
-i1m
M
ax
8c
1800
1300
-800
-350
-100
a:xza—
cci
1(tic
50 60de la conj~gacion
Fig. 4.2.— Representacióndel número de transeonjugantesTe’ Nx’ obtenidos a distintos
tiempos del inicio de la conjugación.
(@) conjugación:JMG92 x BM21
40017
o
300 e
1ci
It
0 10 20 30 40Tiempo (mm) despues del hdo
(O) conjugación:JMG93 x BM21
36
y su sentidode transferenciaesantihorario,esteresultadosituaríatambiénel TnlO alrededor
del minuto 28 del mapagenéticode E. cali.
4.2.2.— donadodel TnJO y regionescroniosómicasadyacentes:localizaciónfísicadentro
del gen Ints.
Simultáneamenteal mapeodel TriZO medianteexperimentosde conjugacióny como
aproximacióncomplementariadel mismo, procedimosa donar la regióncromosómicaque
conteníala inserciónTnlO, medianteel métodode donado iii vivo descritoporGroismana
al. (1984), que requiereel empleodel elementomini—Mudl14042 (ver Métodos). En este
experimento,seobtuvierondocemuductantesCmr Tc’. El DNA plasmídicode uno de ellos
(pGG300)fue purificadoy digeridoconvariasenzimasde restricción:BamHI, BglII, EcoRI,
HindIlI y PstI (digestionessimples y dobles). El mapa físico del segmentocromosómico
donadoen el pGG300SC muestraen la Fig 4.3. Parasituar el TnlO dentro del fragmento
donadonosservimosdel mapafísico del transposónpublicadopor Way et aL, 1984.
Dadoquesabíamospor los experimentosdeconjugacióninterrumpidaque el TnlO se
localizabaalrededordel minuto 28 del mapagenéticode E.coli, comparamosvisualmenteel
mapafísico del segmentocromosómicoque conteníael TnlO (Fig 4.3) con el mapaderes-
tricción para las enzimasBamHl, EcoRl,HindIII y PstI de la regióncomprendidaentre los
minutos25—30 de Koharaet al., 1987. Una perfectasimilitud fue encontradaentrenuestro
mapafísico y la regióncromosómicacomprendidaentrelas coordenadas1301—1311Kb del
mapa físico de Kohara a aL, que se correspondecon los minutos 27.1—27.4 del mapa
genético.Entre los genessituadosendichazonase encuentrael gen hns, el cual codifica la
37
1290 Kb1300Kb 131OKb l32OKb
nar (27.1 mii e4 __ ___ ___ ______ H
E
—- ___ juEZ — mi ___ EV~~2rurw LEJYi~±aj SI—~- ~
Pv
~EH P
1 KbU——-,
TnlC
~Eg
clhns
P~-Mzr pGG300
y3’ ACGOCGTOCGACTCGTGCAAATCGAAACCACGG5
A PRQA R KA 1< TO95 90 55
Fig. 4.3.— Estructurafísicadel fragmentocromosómicodonadoen elplásmidopGG300,con
la localizaciónde la inserciónTulO. La línea superiormuestralas coordenadasen Kb del
¡napafísico del cromosomade E.coli (Koharaet al., 1987). La localizaciónde la inserción
TnZO se muestramedianteuna flecha. La inserción interrumpe el codón que codifica la
arginina—90de la proteína ‘histone—like’ H—NS. La secuencianucleotídicadel genhns y la
de aminoácidosde H—NS, correspondena las publicadaspor Ponet al., 1988; Góranssonet
al., 1990. Símbolos:B, BamHI; BI, BglI; Bg, BglII; E, EcoRí;EV1 EcoRV; H, HindIII; K,
¡QrnI; P, PsrI; Pv, PvuII.
38
proteínaH—NS, unade lasproteínasbacterianassimilaresa histonas(hisrone—Jike)(Góransson
eát al., 1990; Hulton a’ al., 1990; May et al., 1990). Mutacionesen hns son altamente
píciotrópicas(veaseHígginset aL, 1990, pararevisión, y sección5.1.1).
La localizaciónfísica del TnlO dentrode la regióncromosómica(ver Fig 4.3) y la
píciotropía asociadaa su inserción, sugeríanque probablementeafectabaal gen hns. La
secuenciacióndel puntode inserción(ver Métodos)demostróque el TnlO estáefectivamente
insertadoen el genhns.La insercióninterrumpeel codónquecodificaparala arginina—90de
la proteína“histone—like” H—NS (Fig 4.3). La mutaciónrecibió el nombrede hns—90::TnlO.
4.3.— Efectode la mutaciónhns—90::TnlOsobrela expresiónde una fusión mcbA—IacZ.
La inserciónhns—90::TnlOfue aisladaporsucapacidaddeprovocarun incrementoen
en la intensidaddel color azul de las coloniasde la estirpeJMG89, con respectoa las de la
estirpesilvestre,en placasde LB—Xgal.
Con el objetode cuantificaresteefectoa lo largodel ciclo de crecimiento,transferimos
la mutaciónmediantetransducciónPivir a la estirpeRYC1SO,para dar origena la estirpe
JMG9O.
La actividad ~—galactosidasade la fusión mcbA—lacZ en las estirpesRYC15O y
JMG9O fue medidaa distintostiempos a lo largodel ciclo de crecimiento(Fig 4.4).
Como sepuedeapreciar,en la estirpecontrol (RYC15O) se observala característica
inducciónde la fusión en la faseestacionariadel crecimiento.En contraste,la estirpemutante
(JMG9O)muestraun desplazamientodel inicio de la inducciónde la fusión mcbA—lacZhacia
densidadesópticas (D.O.600nm) más bajas,cuando el cultivo aún estácreciendoen fase
Eeooso
66
39
o,
1)t
D
oo
~0‘o
0
o
Fig 4.4.— Efecto de la mutaciónhns—90::TnZOen la expresiónde la fusión mebA—JaeZ.Las
estirpesRYC15O y JMG9O fueron cultivadasen medio LB a 30 “C paraevitar la inducción
del profago lambda portador de la fusión. La actividad ~—galactosidasase determinéa
distintos tiempos del ciclo de crecimiento.Símbolos:(O) RYC1SO, (O) JMG9O. Símbolos
abiertos,D.O. 600nrn; cenados:actividad~3—galactosidasa.
2 4 6 8Tiempo(h)
-1
40
exponencial.
Esteresultadoindica, por lo tanto,que el productodel gen hns, la proteína‘ histona—
like’ U—NS, regulanegativamente,directao indirectamente,la expresióndel operónmcb,
durantela faseexponencialdel crecimiento.
4.4.— Efecto de lasmutacioneshns—90::TnlO y rpoS::Kan sobrela expresiónde la fusión
niccB—IacZ.
La mutación hns—90::TnlO aisladaen este estudio provocaun incrementoen la
producciónde microcina C7 (ver sección4.1.2). Para comprobarsi este incrementoen la
producciónse debía a un aumentoen la expresiónde los genesmcc, la estirpeJMG100
(MC4100hns—90::TnlO) fue transformadacon el plásmidomonocopiapDG25O,portadorde
la fusión mccB—laeZ (Díaz—Guerraet al., 1989; Gónzalez—Pastoret al., manuscritoen
preparación).
El aumentoen la intensidaddel color azul de las coloniasdeJMG100(pDG250)con
respectoa las de MC4100(pDG2SO)en placasde LB—Xgal, sugeríaque la mutaciónhns—
90::TnlOprovocaun incrementode laactividad~—galactosidasade la fusiónmccB—lacZ.Este
efectofue cuantificadoen medio líquido (Fig 4.5). En contextosilvestre,la expresiónde la
fusión mccB—lacZsufreuna fuerte inducciónal alcanzarlos cultivos la faseestacionaria.La
mutaciónhns—90::TnlO provocaun incrementode la actividad~—galactosidasade la fusión
mccB—lacZ a lo largo de todo el ciclo de crecimiento,desplazandola induccióndependiente
de fasehaciadensidadesópticasmásbajas(faseexponencial).
Comose mencionéen la Introducción,el productodel gen rpoS esrequeridoparala
41
óptima inducción del operónntecABC en fase estacionaria.Dado que la mutación luis—
90::TnlO provocabala desrepresiónde la fusión mccB—Jaez,nosplanteamosla posibilidad
de que en estecontextodeficiente en H—NS, la necesidadde RpoS para la expresiónde
mceABCen faseestacionariafuera suprimida. Paraverificar estahipótesisse construyó el
doble mutante(rpoS ¡¿nr) (véaseTabla 2.1).
La actividadt~—galactosidasade la fusión mceB—lacZen los diferentescontextosfue
medidaen LB a distintostiemposdel ciclo de crecimiento(Fig 4.5).
La introducción de la mutación rpoS::Kan reducea la décima parte el nivel de
inducciónsilvestrede la fusión mccB—lacZ,aunqueaún semantienela induccióndependiente
de fase decrecimiento.La introducciónde la mutaciónhns—90::TnlOen contextodeficiente
en RpoS restauralos niveles silvestres de expresión de la fusión mecB—JaeZ en fase
estacionaria.Esteresultadoindica que en un contextodeficiente en H—NS no serequiereel
productodel genrpoSparala expresiónde los genesmccABCen esta fasedel ciclo celular.
Estos resultadostomadosen conjuntosugierenque la proteína histona—like’ II—NS
se comportacomo un reguladornegativode la expresióndel operónmceABCa lo largo de
todo el ciclo de crecimiento.Por su parte,RpoS(crS) liberadadirectao indirectamenteesta
represiónen faseestacionaria,siendosólo necesarioparaalcanzarlamáximainducciónenesta
fase.
4.5.— Estudiodel sitio de iniciaciónde la transcripciónen el promotorPmcc enausencia
de H—NS y/o RpoS.
El productodel gen rpoSesun factor sigmaalternativode la RNA polimerasa(0S),
42
.r-6-~
c K2 3500-ost
1 32
-lz
1¡ ‘o
ti
:0
it.
.cZ
0 1 2 3 4 5 6 2Tiempo (h)
Fig 4.5.— Efecto de las mutacioneshns—90::TnlOy rpoS::Knnen la expresiónde la fusión
mccB—lacZ.Las estirpesMC4100 (rpoS~ hns~), JMG100 (rpoS~ hns—90::TnlO),JMG1O2
{rpoS::Kanhns~)y JMG1O3(rpoS::Kanhns—90::TnlO)portandoel plásmidopDG25Ocon la
fusión mccB—lacZfueron cultivadasa 37 0C, y la actividad~—galactosidasafue determinada
a distintos tiempos. Símbolos: MC4IOO (O), JMGIOO (O), JMGIO2 (A) y JMG1O3 (y).
Símbolosabiertos,D.O. bOOmn; cerrados:actividad~3—galactosidasa.
43
utilizado para la expresiónde genesen la faseestacionariadel crecimiento(Hengge—Aronis
a’ al., 1991; Tanakaa aL, 1993).Para explicar la supresióndel requerimientode RpoS(as)
para la expresiónde la fusión mccB—lacZen fase estacionaria,en bacteriasdeficientesen
H—NS, formulamoslas siguienteshipótesis:
1. La existenciade un promotoralternativoutilizado en contextorpoS ¡¿nf, distinto
al empleadoparatranscribirel operónmcc (Pmcc)encontextosilvestre.
2. La existenciade un únicopromotorPmccresponsablede la transcripcióndel operón
mcc en todos los contextos.
Para decidir entreambasposibilidades,determinamosel sitio de iniciación de los
transcritosdel operónmcc en los diferentescontextos,mediantela técnicade mapeocon la
nucleasaSI (ver Métodos).Además,estametodologíadebíapermitimos determinarsi el
efecto sobre la expresióndel operónmcc de las distintas mutaciones(rpoS::Kan ¡ hns—
90::TnlO) seproducea nivel transcripcional,ya que la fusión génicamccB—lacZempleada
en todos los estudiosde regulaciónesuna fusión de proteínas,y por lo tanto no es posible
excluir algun tipo de regulaciónpostranscripcional.
ComofuentedetranscritosespecíficosmccempleamoselplásmidopMM5O1 (plásmido
monocopiaportadordel operónmcc). Las cepasMC4100(pMMSO1),JMG100(pMM5O1),
JMG102(~pMM501) y JMG1O3(pMMSO1) fueron construidasintroduciendo el plásmido
pMMSO1 medianteconjugación.
Todaslas cepasfueroncultivadasen medioLB a37 0C. El RNA fue extraídoentonces
en fase exponencialo en faseestacionariay la apariciónde transcritosespecíficosmcc y el
inicio de los mismos fue seguidamediantemapeocon la nucleasaSi (ver Métodos).
44
Transcritosespecíficosmcc fueron detectadosen la cepas MC4IOO, JMG100 y
.IMG1O3 (líneas1—6, Fig 4.6) aunquela señalobtenidaera muy débil en la estirpeJMG1O2
(rpoS::Kan, línea ‘7). Estos resultadosestáncualitativamentede acuerdocon los resultados
obtenidosparala expresiónde la fusión mccB—lacZ(Fig 4.5). Además,todos los transcritos
seiniciabanen el mismo sitio (Fig 4.6), indicandoque un único promotor Pmccesutilizado
tanto en presenciacomoen ausenciade H—NS y RpoS.
La transcripcióndetectadaen tas estirpesJMG100 y JMG1O3 cuando los cultivos
alcanzanunaD.O.GOOnmde 2,3 (Fig 4.6 líneas3 y 5) esconsistentecon el patrónobservado
en la expresiónde la fusiónmccB—lacZ (Fig 4.5), confirmandoquela mutaciónhns—90::TnlO
provocauna inducciónmástempranadel promotor¡‘mcc. Estefenómenono parecedepender
de RpoSQfl,ya que se producetanto en contextorpoS~ como rpoS::Kan.
4.6.— Transcripcióndel promotor Pince en contexto hns—c,pÁ
Otro de los activadorespositivos requeridospara transcribir los genesmcc en fase
estacionariaesel productodel gen crp, el cualcodifica la proteínareceptoradel AMPe (CaP,
tambiéndenominadaCAP). Una mutaciónde deleciónen el gen crp (Acrp—39) anula la
expresión de la fusión mccB—lacZ en fase estacionaria (González—Pastoret al., en
preparación).Al igual que enel casoderpoS, nosplanteamosla posibilidad de que la muta-
ción hns—90::TnlOsuprimierala necesidadde CRPparatranscribir los genesrnccABC.Para
verificar esta hipótesisconstruimosel doble mutanteAcrp—39hns—90::TnlOen contexto
genéticoMC4100 (estirpeSBS688).
45
ACGT 1
IITAATATATATATCoATcaTA
—* T A—gp a c
TAOCATATTATAATATTACoII‘5.
23456789
Fig 4.6.— Determinacióndel sitio de iniciación de la transcripción en el operón mcc en diferentes
contextosgenéticos.El mismo oligonucicótido cebadorfue utilizado paralos experimentosde mapeo
con nucleasaSi (ver Métodos) y paralas reaccionesde secuencia mostradascomo referenciaa la
izquierdade la Fig 4.6. Las flechasindican los dos posiblessitios de iniciación de la transcripción.El
RNA fue extraídoa partir de las cepasque llevan el plásmidopMMSO1 (líneas 1—9) a unaD.O.óOOnm
de 2,3 (líneas1, 3, 5) o 4 (líneas2, 4, 6—9), o el plásmido pMM55O a D.O600nmde 4 (líneas10 y
11). Las autoradiografíasfueronexpuestasun día (líneas1—9) o tresdías(líneas10—li). MC4100 (hns~
rpoSj (línea 1 y 2>; .3M0103 (hns—90::TnlOrpcS::Kan)(líneas3, 4); JMG100 (hns—90::TnlOrpoS~)
(líneas 5 y 6); JMG1O2 (hns~ rpoS::Kan) (línea ‘7); SBS6BB (hns~ Acrp—39) (línea 8 y 10) y
JMGÍO4 (hns—90::TnlOAcrp—39)(línea9 y 11).
10 11
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46
La actividad ~—galactosidasade la fusión mccfi—JaeZen los distintos contextosse
muestraen la Tabla 4.1. Un ligero pero significativo incrementode O a 10 unidadesMiller
fue observadoen la estirpeJMG1O4,cuandolos cultivos alcanzanla fase estacionariatardía,
mientras que ningunaactividad tl—galactosidasapodía ser detectadaa partir de la estirpe
SBS688(zNcrp—39hns9en ningúnmomentode la curvade crecimiento(dehecholascolonias
de la estirpeJMG1O4(Acrp—39hns—90::TnlO)con el tiempo adquierencolor azul en placas
de LB—Xgal mientrasque las colonias de la estirpeSBS688 (Acrp—39hns~) permanecen
blancasconel tiempo en las mismascondiciones).
Cuando se realizó el experimentode mapeo con nucleasaSi, ningún transcrito
específicomcc fue detectadoa partir de las estirpesSBS688<pMMSO1)ó SBS688(pMMS5O)
despuésde 1 a 3 días de exposiciónde las autoradiografías(Fig 4.6, líneas 8 y 10). Sin
embargo,cuandoel RNA fue extraídode laestirpeJMG1O4(pMM550),transcritosespecíficos
¡ncc fueron detectadosduranteel mismo tiempo de exposición(Fig 4.6, línea 11).
De nuevoseobservabauna correlaciónentrela expresiónde la fusión mccB—lacZy
la presenciade transcritos mcc. Tomados en conjunto, estos datos indican que una
transcripciónresidualde los genesmcc, a partir del promotorPmcc, puedeserobtenidaen
contexto/xcrp—39 en ausenciade la proteínaH—NS.
47
Tabla 4.1.— Efecto de las mutacioneshns—9OnTnlO y Acrp—39 en la expresiónde la fusión
rnccfl—lacZ.
Actividad fl—galactosidasa (Unidades MilIer)a
Estirpe Genotipo relevante Faseexponencial Fase estacionaria
MC4100 tipo silvestre 86 2209
SBS688 hns~ Acrp—39 O O
JMGÍO4 hns—90::TnlO/xcrp—39 0 10
a Las estirpesMC4100, SBS688y JMGIO4 llevando el plásmido pDG2SO con la fusión
mccB—lacZfueron cultivadasa 37 0C y su actividadf3—galactosidasafue determinadaen la
faseexponencialy a las doshorasdespuésde entrar en la fase estacionaria.
48
4.7.— Aislamiento de un fragmento cromosómicode aproximadamente 19 Kb que en alto
número de copias reprime la expresión de una fusión mccB—lacZ.
Como estrategiaalternativapara la identificación de nuevosgenescuyosproductos
estuvieran implicados en la regulación de la expresión del operón mccABC en fase
estacionaria,realizamosuna búsquedade genesque en alto númerode copiasalteraranla
expresiónde una fusión mccB—lacZ.
4.7.1.— Aislamiento del plásmido pGGSOO.
Comométodoparaobtenerunbancode genescromosómicosen multicopia,utilizamos
dc nuevo el sistema de donado in vivo de Groisman et al. (1984). La estirpe
pop300l.6(pDG2SO),portadorade la fusión mccB—lacZ,fue utilizada como receptoradel
banco de genescromosómicos(ver Métodos).Entre un gran númerode clones Cmt j<J~Y
azules,se seleccionóparaposteriorestudioun clon que mostrabauna coloraciónblancaen
placasde LB suplementadasconel indicadorX—gal. Sepreparó,mediantelisis alcalina,DNA
plasmídicodel clon blanco,con el que seretransformóla estirpepop300l.6,seleccionándose
porseparadoclonesCm’ y Km’ a fin de segregarlos dosplásmidos.Entrelos clonesKm’,
todos aquellosqueeranademásCmS mostrabanen placasde LB—Xgal un nivel de expresión
de la fusión mccB—lacZcomparableal silvestre.Este resultadoindicabaque todos ellos
llevabanel plásmidopDG25Ointacto, lo cualdescartabaquela fusión mccB—lacZsehubiera
perdido en el clon blancooriginal. A partir de un clon Cm’ que eraademásKmt se extrajo
el DNA plasmídico (pGGSOO) con el que se retransformóde nuevo la estirpe parental
pop300l.6(pDG25D).Todos los clonesCm’ Xm’ mostrabanunosnivelesde expresiónde la
fusión mccfi—lacZsimilaresa los del clon blancooriginal.
49
Sobreel DNA plasmídicodel pGGSOOse realizó un análisisde restricciónpara las
enzimas BamHl, EcoRí, HindIII y PstI. El mapa físico resultante para el segmento
cromosómicocontenidoen el pGGSOOsemuestraen la figura 4.7. Como sepuedeobservar,
el tamañodel fragmentocromosómicoportadoporel pGG500erade aproximadamentel9Kb.
Dentrodel mismo deberíanencontrarseuno o variosgenescuyos(s)producto(s)en principio,
al hiperproducirse,provocaría/nla represiónobservadade la fusión mccB—lacZ.
4.7.2.— Localización del fragmento cromosómicodel pGG500 en el mapa físico de E.coli.
Uno de los primerosobjetivos en el estudiodel fragmentocromosómicocontenidoen
el plásmidopGGSOOerasituarel mismoen el mapafísico del cromosomadeE.coli elaborado
por Kohara a’ al. (1987). La comparaciónvisual inicial entreel mapafísico del fragmento
cromosómicodel pGG500paralas enzimasde restricciónBamHI, EcoRI,HindIII y PstI con
el mapade restriccióndel cromosomade E. coli paralas mismasenzimas(Koharaet al.,
1987)no nospermitió localizarnuestrofragmento.Sin embargo,al compararel mapafísico
del pGGSOOconel del pGG300(portadorde un fragmentodeDNA que contienela mutación
de inserción hns—90::TnlO,ver sección 4.2.2), encontramosque había una zona de
solapamientoentreambos fragmentos,entre las coordenadas1301—1311Kb del mapa de
Koharaet al. Esteresultadosugeríaqueel fragmentocromosómicocontenidoen el pGG500
procedíatambiénde la región del minuto 27 del mapagenéticode E. cali, y que conteníael
genhns silvestre.
SO
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aU,
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52
Una vez establecidala localización genéticadel fragmento, observamosvarias
diferenciasentreel mapafísico de éstey el de Koharaa’ al. (señaladascon flechasen la
figura 4.7). Estadivergenciaeraresponsablede nuestrasdificultadesinicialesparasituarel
fragmentodel pGG500.Las diferenciasobservadaspodríanser atribuiblesen principio a la
existenciade polimorfismoparadichasdianasde restricciónen las distintascepasempleadas
en la elaboraciónde los mapasfísicos: mientras que en nuestroestudio se utilizaron los
derivadosde la estirpeMC4100(RYC1SO,pop300l.6), Koharaa’ al. realizaronsumapasobre
el cromosomade la estirpeW3110.
Paraverificarestashipótesis,un fragmentoPstlde 1,4 Kb (Fig 4.7) fue utilizado como
sondaradiactivafrentea un blot con digestionesgenómicasde la estirpeW3110(Fig 4.8). El
patrónde hibridaciónobtenidocoincidíaconelesperadoparala zonadondeseencontrabael
genhns en el mapade Koharaa’ al. (Góranssona’ aL, 1990; May et aL, 1990; 1-lulton et al.,
1990).Por último, un fragmentoHindII de lKb contenidodentrodedichofragmentoPstI fue
donadoenMl3tgl3l y unode sus extremosfue secuenciado.Lasecuenciadeterminada(unos
200pb) coincidía con la secuenciadel extremo 3t del genhns (Pon et al 1988; Góransonet
aL, 1990; May et al., 1990), verificandode estamaneratodos nuestrosdatosde mapeo.
4.7.3.— Identificación de un nuevo locus cercano al gen hns: efecto del mismo en la
expresión de la fusión mccB—kzcZ.
Los resultadospresentadosen la sección4.4 y 4.5 nos habían permitido concluir que
el productodel gen bis, la proteínade unión al DNA “histone—like’ II—NS se comportaba
comoun reguladornegativodel promotorPmcc, el cual dirige la transcripciónde los genes
53
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Fig 4.8.— Patrónobtenidoal hibridarun fragmentoPstI de 1,4 Kb utilizado comosondafrente
a diferentesdigestionesgenómicasde la estirpeW3110. Línea 1 , PstI ; 2, EcoRV;3, BglI;
4, Bgll—EcoRI; 5, EcoRI; y 6, EcoRI—HindLlI.
54
mccABCen fase estacionaria.Era lógico suponerque el aumentodc dosis génicade bis
produciríaun incrementoen los nivelesintracelularesde H—NS, la cual, a travésde su efecto
represorsobre el promotor Pmccprovocaríael descensoen los nivelesde expresiónde la
fusión mccfi—lacZ,observadoen célulasportadorasdel plásmidopGG500.
Para verificar que el gen bis y su producto,la proteínade unión al DNA ‘histone—
like H—NS, seencontrabanefectivamenteinvolucradosen la represiónde la expresiónde la
fusión ,nccB—lacZ,seprocedióa realizarun análisisde deleciónmediantesubelonaje,con el
objetivo de identificar un fragmento mínimo de DNA que contuvierael determinanteo
determinantesgenéticos responsablesde la represión observada.Con tal propósito,
subclonamosun fragmentoHindIII dc 9 Kb, procedentedel pGG500,en la dianaHindIII del
vectorpUClE, dandoorigen al plásmidorecombinantepGG200.El mapafísico detalladode
dicho plásmido se muestraen la figura 4.7. El pGG200era capazde provocarel mismo
descensoen los niveles de la actividad g—galactosidasade la fusión mccB—lacZque el
plásmido original pGG500.A partirdel pGG200,sesubelonóun fragmentoBglII—HindIII de
5,3 Kb en las dianasBamHI—HindIII del plásmidopACYC184, dandoorigen al plásmido
pGGl2S (ver Fig 4.7). Sorprendentemente,a pesarde que el pGG12S portabael gen hns
silvestreintacto,la represiónde la fusión mccB—lacZno eraequiparablea la que provocaban
el pGG500 o el pGG200. De hecho, las coloniasde MC4100(pDG25O,pGG125)no eran
blancas,sino quemostrabanun ligerocolor azul,aunquemenosintenso que el de lascolonias
de la estirpecontrol MC4100(pDG25O,pACYCI84) en placasLB—Xgal.
Esteresultadosugeríaque, paraprovocarlos bajos nivelesde expresiónde la fusión
mccB—lacZ observadoscon el plásmido original pGG500,se requeríano sólo el efecto
55
reguladordel productodel gen bis, sino ademásel productocodificadopor un nuevolocus
situadoal menosaunas2 Kb pordetrásdel genhns.A estelocus, no descritoanteriormente,
lo denominamoshur.
4.7.3.1.— Construcción del plasmido pGG800 y análisis de deleción e inserción del
mismo.
Para continuar el estudio, necesitábamossubclonar un fragmento de DNA que
contuvieraambosloci (bis y hnr) con el que se pudierarealizarun análisis detalladodel
fenómenode represión.Un fragmentoSp/ii dc 3,3 Kb procedentedel pGG200fue donadoen
la únicadiana Sp/ii del pACYC184,dandoorigenal plásmidopGG800(Fig 4.7).El pGG800
fue introducido mediante transfonnaciónen la estirpe MC4100(pDG25O).En la estirpe
resultante,los nivelesde actividad~—galactosidasaeransimilaresa los nivelesobservadosen
la estirpe pop300l.6(pDG25O,pGG500). De hecho las colonias de la estirpe MC4100
(pDG250, pGGSOO)erantambiénblancasen LB—Xgal, indicandoque el fragmentoSp/ii de
3,3 Kb presenteen el pGG800contenía,ademásdel gen hns, el locus hnr. La diana BglII,
utilizada para construir el plásmido pGG12S (sección 4.7.3), se encontrabadentro del
fragmentoSphI portadopor el pGG800(Fig 4.7). Los diferentesresultadosde expresiónde
la fusión ,nccB—IacZobtenidoscon los plásmidospGG800y pGG125indicabanque el locus
hnr estabadelimitadoporun extremopor la diana5p1¿i, y quela dianaBgIIi seencontraría,
bien dentrodel locus, bien delimitandosu otro extremo.
Paradeterminarla situacióny la extensióndel locus hnr dentro del fragmentoSphI,
así como la contribuciónde los productosdel gen hns y del locus hnr al fenómenode
56
represiónde la fusión mccB—lacZ,seprocedióa construirvarios derivadosde insercióny dc
delecióndel pGG800.
a) Derivados de deleción.
Los plásmidos pGG8OI, pGG8O3 y pGG8O4 fueron construidos eliminando los
siguientesfragmentosinternosdel fragmentoSphI contenidoen el pGGSOO:SnaBI de 1,75
Kb (pGG8O1);Pstl de 1,4 Kb (pGG8O3>; y HpaI—StuIde 0,75 Kb (pGG8O4)(Fig 4.7).
b) Derivadosde inserción (Ap’).
Los plásmidos pGG8O5, pGGBO6 y pGG8O7 fueron construidos insertando
respectivamenteen los puntosúnicos paralas enzimasde restricciónHpaI, StuI y BglII del
pGGSOO,un cassettede resistenciaal antibióticoanipicilina (Ap». Este cassette(2,7 Kb) fue
obtenidoa partir del plásmidopKT25A—QA (Fellay et al., 1987)mediantedigestión, con la
enzimade restricciónSmaIparala inserciónen los puntosHpaI (pGG805)y Sud(pGG806)
o con la enzimade restricciónBamHI parala inserciónenel puntoBglIl (pGG8O7)(Fig4.7).
c) Derivadosde inserción(Apr, Karl).
Los plásmidospGG8O8y pGGBO9fueron construidosa partirdel pGG8O5,mediante
inserciónen los puntosúnicosSud y BglII, respectivamente,de unacassettede resistenciaal
antibiótico Kanamicina(Kan». ata cassette(1,2 Kb) fue obtenidaa partir del plásmído
pIJC4Kmediantedigestióncon la enzimade restricciónHindII parala inserciónen el punto
Sud&GG8OB) o con BamHI parala inserciénen el sitio BglII (~pGG809)(Fig 4.7).
Todos los derivadosde delecióne insercióndel pGG800fueronintroducidosmediante
transformaciónen la estirpeMC4100(pDG2SO)y el efectode los mismossobrela expresión
de la fusión mccB—lacZ fue observadoen placasde LB—X—gal (Fig 4.7).
57
Varias son las conclusionesque se puedenextraeral examinarla figura 4.7:
1.— Solamentelos plásmidospGG800 y pGG8O6,portadoresdel genhns y del locus
hur funcionalesprovocabanunos bajos niveles de expresiónde la fusión mccB—lacZ. El
pGGSO6portauna inserciónQ::Ap’ que debeestarlocalizadaen un locus no involucradoen
el fenómenode represión.
2.— Los niveles de expresiónde la fusión mccB—lacZobtenidoscon los plásmidos
pGGBO1y pGGSO7eranintermediosentrelos del pACYC184 y los del pGG800,indicando
que la funcionalidaddel locushnr en estosplásmidossehabíaperdido,observándosesólo el
efectode regulaciónnegativadel productodel genhns.
3.— Interesantemente,los plásmidospGG8O4,pGG8OSy pGG8O8,apesarde no llevar
el genhns funcional,provocabanque los nivelesde actividadde la fusión mccB—lacZfueran
tambiénintermediosentrelos obtenidoscon el pACYC1B4 y los del pGG800.Esteresultado
sugeríaque el incrementode dosisgénicadel locus hnr tambiénregulabanegativamentela
expresiónde la fusión mccB—lacZ.
4—. Con el plásmido pGG8O9, portadorde las insercioneshns::Ap’ y hnr::Kan, se
recuperanlos nivelessilvestresde expresiónde la fusión mccB—lacZ.Análogamenteocurre
conel derivadopGG8O3(pGG800A PstJ), indicandoqueestadelecióndeberíaestarafectando
tanto al genhns como al locus hnr.
4.7.4.— Efecto del incrementodel número de copias de bu y hnr en la expresión de la
fusión mccB—IacZ a lo largo del ciclo de crecimiento.
Los resultadospresentadosenel apartadoanteriorerancualitativos,obtenidosa partir
58
dcl color de las coloniasde las distintasestirpesen placasde LB—Xgal.
Paracuantificarlos efectosobservados,lasestirpesresultantesdctransformarlaestirpe
MC4100(pDG2SO)con los plásmidospGG800,pGG8OI,pGG8O5,pGGSO6,pGG8O7,pGG8O8
o pGG8O9,fueroncultivadasa 37 0C en medioLB y la actividadde la fusión mccli—laeZfue
medidaa distintostiempos del ciclo de crecimiento(Fig 4.9).
Comosepuedeapreciar,las medidasde la actividad~—galactosidasaestándeacuerdo
con los resultadoscualitativos.Los plásmidosque incrementanla dosisgénicadel genbis y
del locushnr (pGG800y pGGSO6)provocanun fuertedescenso(10veces)de la actividad3—
galactosidasade la fusión mccli—(acz. Los plásmidospGGSO1(hns4Ahnr) y pGG8O7(hn<
hnr::Q—Ap’), queincrementanúnicamentela dosisgénicadel genbis, provocanun descenso
de unasdosvecesen los nivelesde la actividadfl—galactosidasade la fusión mccli—lacZ.Por
último, los plásmidosque incrementanúnicamentela dosisgénicadel locushnr (pGG8O5y
pGGSO8)producenun descensode unas3—4 vecesen los nivelesde actividadf3—galactosidasa
de la fusión mccli—lacZ en fase estacionaria.
Tomadosen conjunto los resultadosanterioressugeriríanlo siguiente:el incremento
de la dosisgénicadebis provocaríaun aumentode los nivelesintracelularesde H—NS, y esta
proteína sería responsablede provocar un descensode unas 2 veces en los niveles de
expresiónde la fusión mccli—lacZ, a travésde la regulaciónnegativadel promotorPmcc.El
incrementode dosis génicadel loarnhin- seríaresponsabledeprovocarun descensode 3—4
vecesen los niveles de expresiónde mccB—IacZ;y ambosefectosseríanaditivos, dando
cuentade la bajaexpresiónde la fusión mccB—lacZ observadaen presenciadel plásmido
pGGSOO.
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Fig 4.9.— Efecto del aumentode la dosisgénicade hns y Mr en la expresiónde la fusión
mccli—lacZ duranteel ciclo de crecimiento.Todos los plásmidosfueron introducidos por
transformaciónen la estirpeMC4iOO(pDG25O)y las cepasresultantesfueron cultivadasen
medioLB a37 “C. La actividad~—galactosidasafue cuantificadaa distintostiemposdel ciclo
del crecimiento.Símbolos:(O) pACYC184, (O) pGG800,(U) pGG8Oi, (V) pGG8O5; (Y)
pGGSO6,(A) pGG8O7,(A) pGG8OS,y (@) pGG8O9.
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60
4.7.5.— Construcción de un inutante cromosómicoIgnr—l::Kan.
Con el objeto de obtenermás información sobre la funcionalidaddel locus hnr,
decidimossustituir el alelo cromosómicosilvestrepor un alelo luir nulo.
4.7.5.1.— Construcción del plásmido pGGK200.
Un cassettede resistenciaal antibiótico Kanamicina (Kan) de 1,2 Kb, obtenido
mediantedigestión BamHI del plásmido pUC4K, fue insertadoen el sitio único Bglll del
plásmidopGG200,paradar origenal plásmidopGGK200(Fig—4.7). El plásmidopGGK200
fue introducido mediantetransformaciónen la estirpe MC4100(pDG25O). En la estirpe
resultante los niveles de expresión de la fusión mccli—lacZ eran intennediosentre los
obtenidoscon el pGG200 y el plásmido control pUC18, indicandoque la inserciónhabía
inactivadoel locushnr (Fig 4.7). El alelo mutanterecibióel nombrede hnr—1::Kan.
4.7.5.2.— Sustitución del alelo silvestrepor el alelo mutante hnr—I::Kan.
Paratransferir el alelo mutantehnr—1::Kan al cromosoma,empleamosla técnicade
sustituciónalélicadescritaporWinansetat(1985).El DNA del plásmidopGGK200(Fig 4.9),
fue linealizadocon la enzimade restricciónKpnI, la cualcortaúnicamenteenel polilinker del
pUC18, pero no en el fragmentocromosómicoque contienela inserciónhnr—1 ::Kan del
pGGK200. Con el DNA en forma lineal se transformó la estirpeJC7623 recli2l recC22
sbclils (Winanset aL, 1985).Un transformanteKmr Ap’ fue elegidoparaposterioranálisis.
Sobreesteclon (JC7623hnr—1::Kan)sepreparóun lisado de Plvir con el que seinfectó la
estirpe MC4100. Se obtuvieronvarios transductantesKm’ y uno de ellos (JMG200) fue
61
elegidoparaposteriorestudio.
4.7.5.3.— Localización de la mutación knr—I::Kan en el cromosomade la estirpe
JMGZOO.
Se procedióa realizar experimentosde Southemblot, para verificar la sustitución
alélica. Un fragmentoPstI de 1,4 Kb procedentedel pGGBOO (Fig 4.7) y un fragmento
BamHI de 1,2 Kb portadorde la resistenciaa kanamicina(Kan) procedentedel pUC4K,
fueronutilizadoscomosondasradiactivasfrentea digestionesEcoRI,HindIII y 5p1¡i delDNA
genómicode las estirpesMC4100 y JMG200 (Fig 4.10).
El patróndehibridaciónobtenidocoincidíacon lo esperadosi la sustituciónalélicase
hubiera realizado (Fig 4.10) indicando que la mutación hnr—1::Kan se encontraba
correctamentelocalizadaen el cromosomade la estirpeJMG200.
4.7.6.— Efecto de las mutacioneshns—90—TnlO y hnr—1::Kan sobrela expresiónde la
fusión mccB—JaeZ.
Dadoque tanto el genhnr comoel genhns reducenla expresiónde la fusión mccB—
lacZ cuandoseencuentranen alto númerode copias,decidimosensayarel efectoconjuntode
las mutacioneshnr—1::Kan y hns—90::TnlOsobredichaexpresión.
La estimeJMG300 (hnr—1::Kanhns—90::TnlO)fue construidatransfiriendovia Pivir
la mutaciónhns—90::TnlOalaestimeJMG200.Severificó quelas mutacioneshns—90::TnlO
y hnr—1::Kan segregabana la frecuenciaesperada(de entre 100 transductantesTe’ Kni’
ensayadosel 98% eranTe’ Km’, los restantesTe’ Knfl. Un transductanteTe’ ¡Cm’ fue elegido
62
123456 789101112
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—. -4.5kb-3.9kb-3.3kb
Fig 4.10.— Patrónde hibridaciónobtenidodespuésdel Southernblot realizadoparaverificar
la sustituciónalélicaen el cromosomadeE. cali. Los DNAs genómicosde la estirpeMC4100
(líneas1, 3, 5, 7, 9 y 11) y JMG200(líneas2, 4, 6, 8, 10 y 12) fueron digeridosconHindIlI
(líneas 1, 2, 7 y 8), EcoRI (líneas3, 4, 9 y 10) o SphI (lineas5, 6,11 y 12). Un fragmento
BamHI procedentedel pUC4K (líneas 1—6) o un fragmentoPsi! procedentedel pGG800
(líneas7—12) fueronusadoscomosondasmarcadasradiactivamenteQ2P).
63
(JMG300) para posterior estudio. Las estirpesMC4100 (hnr~ hns~); JMG100 (hnr~ hns—
90::TnlO); JMG200 (hnr—1::Kan hns~) y JMG300 (hnr—1::Kan hns—90::TnlO) fueron
transformadasconel plásmidopDG2SO,portadorde la fusión mccli—lacZ, y la actividadf3—
galactosidasafue ensayadaa distintostiemposdel ciclo de crecimiento(Fig 4.11).
El patrón de inducción de la expresiónde la fusión mccl3—lacZprovocadopor la
mutación hnr—1::Kan es comparable al provocado por la mutación hns—90::TnlO.
Sorprendentemente,el nivel máximo de expresiónde la fusión mccli—lacZ en el contexto
doblemutante(JMG300)essimilar el obtenidoen contextohns—90::TnlO, indicandola no
aditividadde los efectosde ambasmutaciones.
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Fig. 4.11.— Efectode las mutacioneshnr—1::Kan y/o hns—9OsTniOsobrela expresiónde la
fusión mccli—lacZen medio LB. Las estirpesMC4100(pDG25O);JMG100(pDG25O)y JMG
200 (pDG2SO) fueron cultivadasa 37 0C en medio LB, y la actividadf3—galactosidasade la
fusión mccli—IacZ fue cuantificada a distintos tiempos del ciclo de crecimiento.Símbolos
(O) MC4lOO (hns~hnr), (U) IMGIOO (hns—90::TnlOhnr9, (@)JMG200(hns hnr—1::Kan)
y (O) JMG300 (hns—90::TnlO hnr—1::Kan).
5. DISCUSION
66
La expresión de los operonesmcb (microcina B17) y mccABC(microcinaC7) tiene
lugar durantela fase estacionariadel crecimientobacteriano.Sin embargo, los estudios
realizadospreviamenteen nuestrolaboratoriono habíanidentificadoningúnreguladorcomún
a ambossistemas.La expresióndel operón mcbdependedel promotorprincipal Pmcb (Fig
1.1A). La proteínaOmpR y el factor de integracióndel huesped([HF) regulanpositivamente
la expresióna partir de Pmcb,mientrasquelaproteínaMprA secomportacomoun regulador
negativode la misma.Por otrapartela expresióndel operónmccABCdependedel promotor
principal Pmcc(Fig 1.1B). La transcripcióndirigidapor Pmccestáreguladapositivamentepor
los productosde los genescrp y rpoS. El trabajodescrito en la presentememoria estaba
destinadoaidentificarnuevosgenescuyosproductosregulasena la vez laexpresiónde ambos
operones.
5.1.— La proteína H—NS regula negativamente la expresión de los operonesmcb y
mccABC.
El seguimientosimultáneode laexpresiónde ambosoperonessehizo posiblemediante
un diseñoexperimentalquecombinael uso de dos fenotiposfácilmenteobservables(color de
las coloniasportadorasde la fusión mcbA—lacZy halo de antibiosisdebidoa la producción
de microcinaC7). En un experimentode mutagénesiscon el transposónTnlO seobtuvo un
clon (JMG89) con un alto nivel tanto de expresiónde la fusión comode producciónde la
microcina.Pudoobservarsetambiénque la inserciónteníaefectospleiotrópicos,resultando
en un fenotipo mucoide y resistenciaa diversos bacteriófagos.La caracterizaciónde la
mutación,mediantemapeofísico y genético,así como mediantesecuenciacióndel sitio de
67
inserción del transposón,permitió concluir que el TnlO está dentro del gen previamente
descritohns.
En paralelo, la búsquedade genessilvestrescapacesde alterarla expresiónde una
fusión mccli—lacZdio comoresultadoel aislamientode un fragmentocromosómicoque en
alto númerode copiasreducíala expresiónde la fusión. Esta reducciónde la expresiónse
debea la acciónde dos genespresentesen el fragmento.De nuevo, uno deellos eshns,de
cuyaparticipaciónen la regulaciónde los operonesmcby mccABCnosocuparemosen este
apartado.El segundogen (locus), al que sedenominóhnr, no habíasido descritoantesde la
realizaciónde estetrabajo. Susefectosserándiscutidosen el apartado5.2.
5.1.1.— El gen hns y su producto.
Antes de discutir los efectosreguladoresdel productodel gen hnssobrela expresión
de los operonesmcb y mccABC,esconvenienterevisar brevementeel estadoactualde las
investigacionessobreestaproteína,implicadaen numerosasfuncionescelulares.
El gen hns fue inicialmente mapeadoen el minuto 6,1 del mapagenéticode E. coli
(Pon a’ al., 1988), pero posteriormenteotros autoresdemostraronque tal conclusiónera
erróneay lo localizaronen el minuto 27,3 (Hulton et al., 1990; May et aL, 1990; Góransson
et al., 1990). Las mutacionesenel genhns sonaltamentepíciotrópicas,siendomúltiples los
genesy operonescuyaexpresiónestáreguladapositiva o negativamentepor la proteínaque
codifica(véaseunacompilaciónde los mismosen laTabla 5.1). Debido aestapleiotropía,el
gen fue designadocon numerososnombresdiferentes(osmZ, bglY drdX pilG, virR, cur),
dependiendode la funciónqueseobservóafectadaen cadacaso.En los últimos años,diversos
68
autoreshan establecidoque todos esosgenesmutadoseranalelas de luis.
El productodel genluis es la proteínaneutrade 15,5 KDa H—NS (tambiéndenominada
111), la cual hasido incluidaentrelas proteínasde pequeñotamañoque seunenal DNA y se
suponen implicadas en la estructuraciónde la cromatina bacteriana. Debido a estas
característicasque las asemejana las histonas eucarióticas,a estas proteínasse les ha
denominado“similaresahistonas” (histone—like).En Escherichiacoli sehanincluido dentro
de este grupo las proteínasHU(a13), IHF(c43) y FIS (Drlica and Rouviere—Yaniv, 1987;
Pettijohi~ 1988; Schmid, 1990). Recientementeotros dos nuevos componenteshan sido
añadidosal grupo: la proteínaDps, implicadaen la proteccióndel DNA y en la regulación
transcripcionalde la expresióngénicaen faseestacionariatardía(Almirón et al., 1993),y la
proteínaLrp, mediadorade la respuestaa leucina(Newman e al., 1992; Dan et al., 1993).
La proteínaH—NS esuna de las másabundantes,habiéndoseestimadoquehay unas
20.000moléculasporcélula, lo querepresentaríaunamoléculacada400 nucleótidosde DNA
cromosómico.En gelesde poliacrilamidabidimensionalesdel tipo OFarrelí, H—NS presenta
tres isoformas,denominadasHia, Hlb y ~ cuyascantidadesrelativasvariancon la fasede
crecimiento(Spasskyet al., 1984). Asimismo, varias bandascorrespondientesa posibles
isoformas de la H—NS han sido detectadasutilizando anticuerposanti—H—NS, y se ha
observadoque la abundanciarelativade cadaforma dependedel medio <rico, LB, o mínimo,
M63) enelquesoncultivadaslas bacterias(Falconia al., 1993).El origende estasisoformas
aún no ha sido determinado.
Launión de la proteínaH—NS al DNA ha sido ampliamenteestudiada.El seguimiento
de la formaciónde los complejosDNA circular—proteínaH—NS a travésde los cambiosen
69
la velocidadde sedimentaciónde los mismos,permitióconcluir queII—NS provocaunafuerte
condensacióno compactacióndelDNA (Spasskya’ al., 1984; Friedrichet al., 1988). Porotra
parte,los estudiosde microscopiaelectrónicae inniunocitoquimicadel nucleoide,llevadosa
cabo tanto en células con la dosis normal de H—NS como en células en las que se
hiperproducela proteína,apoyanla misma idea(Dúrrenberga’ al., 1992; Spurio R. a’ al.,
1992).Existe una ciertaespecificidadde secuenciaparala unión de II—NS al DNA (consenso
TNTNAN) (Rimskya’ al., 1990),mostrandopreferenciahaciaregionesdeDNA concurvatura
intrínseca(Braccoetal., 1989; Yamadaa al., 1990; Owen—Hugheset aL, 1992; Ueguchiet
al., 1993; Yoshidaet aL, 1993). II—NS se une al DNA probablementeen forma dimérica
(Falconiet al., 1988).
Paraexplicar la capacidadde H—NS pararegularla expresióngénica,se han propuesto
varios mecanismos:
a) La proteínaH—NS actuaríacomo un ‘silenciador’ de la transcripción,inactivando
parte del cromosomamediante la formación de una estructurasimilar a la cromatina
(chromatin—like)(GóranssonetaL, 1990).Estefenómenode represión(silencing)serialocal,
efectuadopor medio de la unión de H—NS a zonas curvadasdel DNA situadasen la
proximidadde las regionespromotorasde los genescontroladospor estaproteína(Yoshida
et aL, 1992; Ueguchia aL, 1993; Owen—Hugheset al., 1992).
b) La regulación de la expresióngénica por II—NS sería ejercidade una manera
indirecta,al provocarcambiosen el nivel de superenrrollamientodel DNA, que afectaríanen
último termino a los promotoresde los genescontroladospor la proteína(Higgins., et al.,
1988; Hulton et aL, 1990).
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71
c) Finalmente, la proteínaH—NS podría influir en la transcripciónactuandocomo
proteínaauxiliar, por estabilizaciónde complejosDNA—represor(Falconi et al., 1991).
5.1.2.—La proteína H—NS y la regulacióndel promotorPmcb.
La mutaciónhns—90::TnlOprovocaun incrementode la producciónde la naicrocina
B17. El estudiode la expresiónde la fusión mcbA—lacZen contextohns—90::TnlO(Figura
4.4) indicaque la proteínaH—NS regulanegativamentela expresiónde los genestncb, lo cual
explicael incrementode la producciónde la microcinaen dicho contexto.
El principal efectoobservadode la mutaciónhns—90::TnlOsobrela expresiónde una
fusión mcbA—lacZconsisteen desplazarel momentode la inducción,quenormalmenteocurre
al entrarlas bacteriasen fase estacionaria,haciala faseexponencial(Fig 4.4). Esteresultado
indica que la proteínaH—NS regula negativamentela expresióndel operónincb en fase
exponencial.Teniendoen cuentalo dichoanteriormenteacercade los mecanismospropuestos
parael control de la expresióngénicapor H—NS, la regulaciónde los genesmcbpodríaser
ejercidadc las siguientesmaneras:
a) Pormedio de la unióndirectaa las regionesde DNA adyacentesal promotorPmcb.
En estesentido, hay que destacarque estaregión promotorano parecemostrarcurvatura
intrínseca(Espinosa—Urgely Tormo, 1993), lo cualiría encontrade las preferenciasde unión
de la proteínaH—NS, aunqueno excluyedichaunión. La elucidaciónde estacuestióndeberá
serproporcionadapor los experimentosde retrasoen gel y footprinting con II—NS, queestán
proyectadosparasu próximarealizaciónen nuestrolaboratorio.
b) Mediantecambiosen el nivel de superenrrollamientoque afectaríana la topología
72
del DNA en la regióndel promotorPmcb.
c) Como proteínaauxiliar, quizáestabilizandopresuntoscomplejosDNA—represor.El
promotor Pmcbes reguladonegativamentepor el productodel gen mprA. Sin embargo,aún
no seconocesi estaregulaciónesdirecta, medianteunión al DNA, o indirecta,medianteun
mecanismoporahoradesconocido.La purificaciónde laproteínaMprA serequeriríapara,en
primer lugar, concretarsu papel regulador; y, en segundolugar, para estudiarpresuntas
interaccionesentreel promotor, MprA y H—NS.
d) De forma indirecta,afectandoa laexpresiónde algún otro reguladordel promotor,
seauno ya conocido(OmpR, IHF, MprA) o por descubrir.
5.1.3.—La proteínaH—NS y la regulacióndel promotorPmcc.
La mutaciónhns—90::TnlOprovocaun incrementode la producciónde la microcina
C7. El estudiode la expresiónde la fusiónmccli—lacZen contextohns—90::TnlO(Figura4.5)
indicaquela proteínaH—NS regulanegativamentela expresiónde los genesmccABC,lo cual
explicael incrementode la producciónde microcinaen dicho contexto.
Análogamentea comoocurreen el casodel operónmcb,el principal efectoobservado
de la mutaciónhns—90::TnlOsobre la expresiónde una fusión mccli—lacZ consisteen
desplazarel momentode la inducciónde la faseestacionariaa la faseexponencial,si bienen
estecasoel desplazamientova acompañadode un ligero incrementoen los nivelesmáximos
de expresión(Figura4.5). EsteresultadosugierequelaproteínaII—NS controlanegativamente
la expresióndel operónmccABCen faseexponencial.
Los resultadosde mapeoSi (Figura4.6)indicanqueesteefectode regulaciónnegativa
73
de mccABCsellevaa caboa nivel transcripcional,a travésdc la represióndel promotorPmcc.
La regulaciónpor II—NS del promotorPmcc podríaserejercidade diversasmaneras:
a) Por medio de la unióndirectaa las regionesde DNA adyacentesal promotorPince.
De hecho, el DNA de esta región promotora muestra una amplia curvatura intrínseca
(González—Pastor,J. E. y San Millán, J. L., comunicaciónpersonal).DadoqueII—NS seune
preferentementea regionesque tienen tal propiedad,resulta verosímil que en el casodel
promotorPinceseaésteel mecanismoqueestéfuncionando.Noobstante,estahipótesisdeberá
serconfirmadamedianteexperimentosde retrasoen gel yfooeprintingcon la proteínaH—NS.
b) Mediantecambiosen el nivel de supereurrollamientoque afectaríana la topología
del DNA en la región del promotor Pince.
e) Comoproteínaauxiliar,quizáestabilizandopresuntoscomplejosDNA—represor.Esta
hipótesisrequierecuidadosaatención,dadoel recientedescubrimientodel locus hnr, cuyo(s)
producto(s)se comporta(n)como regulador(es)negativo(s)de la expresiónde los genes
mceABC.En esperade profundizaren el mecanismode regulaciónen el que estánimplicados
esteproductoo productos,no sepuedendescartarpresuntasinteraccionesentreéstosy II—NS
a nivel del promotor.
d) De forma indirecta,afectandoa la expresiónde algúnotro reguladordel promotor,
seauno ya conocido(RpoS, CRP) o por descubrir.
La expresiónde los genesmccABCrequiereel producto del gen rpoS (Fig 4.5).
Recientementehasido demostradoque RpoSesun nuevofactor sigma (&), utilizado por la
RNA polimerasapreferentementepara la expresiónde genesen la fase estacionariadel
crecimiento.Los resultadospresentadosen las figuras 4.5 y 4.6 indican que la transcripción
‘74
de los genes mccABC, a partir del promotor Pmcc y en fase estacionaria,se hace
independientede & en contextohns—90::TnlO.Esteresultadosugiere:1) que U—NS regula
negativamentela expresiónde los genesmccABCtanto en fase exponencialcomo en fase
estacionaria.2) que la funcionalidadde & en la expresiónde Pmccsea la de liberaren fase
estacionariala regulaciónnegativaejercida por la proteínaH—NS. Este efecto podría ser
ejercidodeuna maneradirectao indirecta(a travésde otro reguladorpositivo controladopor
RpoS). Un fenómenosimilar ha sido descritoparala transcripcióndel gen csgA,que codifica
la subunidadestructural(curlina)de un nuevotipo de apéndicecelular, los curli (Olsénet al.,
1993). En conjunto, estosdos resultadospermitensugerirque el fenómenopudierasermás
global, y ocurrir tambiénen otros genesreguladospositivamentepor y negativamentepor
II—NS. En este contexto recientementeha sido demostradala existenciade proteínas
antirepresorasque liberaríanla represiónejercidapor U—NS (Jordi et al., 1992; Forsmanet
aL, 1993; Kano et aL, 1993; Liu y Richardson,1993; Falconi a’ aL, 1993; revisadopor
Dormanet al., 1993).
La expresiónde los genesmccABC requieretambiénel producto del gen crp. De
hecho,el complejo CRP—AMPc esun activadortranscripcionalde estosgenes(González—
Pastor et al., manuscrito en preparación). Los niveles de expresión obtenidos en fase
estacionariaa partirde Pmcc, en contextocrp hns (Tabla 4.1 y Fig 4.6), indican que existe
en estafaseuna pequeñapero significativa transcripciónresidual,que es independientedel
complejo CRP—AMPc. Estatranscripciónresidualtambiénseríasilenciadapor U—NS.
75
5.2.— Identificación de un nuevo locus, ¡¿nr, que regula negativamente la expresión del
operón mccABC.
La búsquedade genes que en alto númerode copias fueran capacesde alterar la
expresiónde unafusión mccli—lacZ condujoal aislamientode un fragmentocromosómicode
19 Kb, capaz de provocar una fuerte reducción de la expresión de dicha fusión. Este
fragmentocromosómico,provenientedel minuto 27 dcl mapagenéticode E.coli, portabael
gen silvestre¡Tws. Esteresultadosugeríaque la hiperproducciónde la proteínaII—NS, debida
al incrementodel númerode copiasdel gen hns, seríaresponsablede provocar la fuerte
reducciónobservadaen los nivelesde expresiónde la fusión.
Sin embargo,el análisisde subelonadode la regiónmínima de DNA responsablede la
reducciónde la expresióncondujo a un sorprendentehallazgo:en el fragmento existía un
segundolocus, al que denominamoshnr, necesariopara obtenerla reducciónmáximade la
expresiónobservadacon el fragmentototal. Los plásmidosque incrementanúnicamentela
dosisgénicadel genhns soncapacesde provocarun descensode 2—3 vecesen los nivelesde
actividadf3—galactosidasade la fusión mccli—lacZ (Fig 4.9). Porotra parte,el incrementodel
númerodecopiasdel locus hnr provocapor sí solo un descensode 3—4 vecesen los niveles
de expresiónde la fusión mccli—lacZen fase estacionaria(Fig 4.9). Estosefectosparecenser
aditivos, porque el incrementosimultáneode la dosis génica de bis y hnr produceuna
reducciónde unas 10 vecesen los nivelesde actividadfl—galactosidasade la fusión.
Dadoque el estudiode la expresióngénicausandoconstruccionesmulticopia puede
en ocasionesserengañoso,se construyóun alelo ¡¿nr mutantenulo, que fue situadoen el
cromosomamediantetécnicasde sustituciónalélica.La expresiónde la fusión mccli—lacZ fue
76
estudiadaen medio LB en los diferentes contextosgenéticos: ¡¿nú, hnsj y hn< hnr.
Sorprendentemente,el momentode la inducciónde la fusión sufreun desplazamientode fase
estacionariaa faseexponencialen los tres contextos.Sin embargo,los nivelesmáximosde
expresiónsólo seven aumentadosen contextohns o hnr ¡¿nr (Figura 4.11).
Estosresultadossugierenque el producto(s)del locus hnr se comporta(n)como un
reguladornegativode la expresiónen faseexponencialde la expresióndel operónmccABC.
Resultainteresantela falta de efectosaditivos de las mutaciones¡¿nr y ¡¿nr: a nivel de la
expresiónde la fusión mccli—lacZ, un doblemutante¡¿nf ¡¿nr esindistinguibledeun mutante
simple¡¿nr. Futurosexperimentosdeberánelucidarel mecanismoporel que ¡¿nr lleva a cabo
la regulaciónde los genesmccAliC: secuenciacióndel segmentode DNA que contieneel
locus ¡¿nr; purificación de la proteínao proteínascodificadas; y estudios in vitro de las
interaccionesDNA—proteínay proteína—proteínaentrelos diversosreguladoresdel operóny
el DNA del promotorPmcc. Asimismo, seráinteresanteexaminarsi estafunción reguladora
de ¡¿nr seextiendea otros genesu operonesde E. cali.
6. CONCLUSIONES
78
Las principalesconclusionesquesepuedenextraerdel trabajodescritoen la presente
memoriason las siguientes:
1.— En experimentosde mutagénesiscon el transposónTrilO, seaislóun mutantede
Esclwrichia cali que mostrabaincrementadastanto la expresióndel operónmcb
(microcinaB17) como la producciónde la microcinaC7.
2.— La insercióndel transposónTnlO en dicho mutantefue localizadadentrodel gen
¡¿nsmediantelas siguientesaproximaciones:1) Mapeogenéticoporconjugación.
2) Clonadode un fragmentoquecontieneel TnlO y regionesadyacentes,seguido
de mapeofísico del fragmento y secuenciacióndel punto de inserción del
transposón.La mutaciónrecibió el nombrede hns—90::TnlO.
3.— El efectode la mutación¡¿ns—90::TnlOsobrela expresiónde las fusionesmcbA—
lacZ y mccli—lacZ indica que el productodel gen ¡¿us, la proteínasimilar a las
histonas(histone—like)H—NS regulanegativamentelaexpresiónde los operones
mcby mccABC.
4.— Los estudiosde expresióndel operónniccAliC en contextogenético¡¿nr rpoS~,
mediantela utilizaciónde unafusión mccli—lacZ y pormapeocon nucleasaSi,
indicanqueel factorsigmaalternativode la RNA polimerasa& no esrequerido
parala expresiónde dicho operónen ausenciade la proteínaH—NS.
5.— La expresiónde la fusión mccli —lacZ en contexto¡¿nr crjf permite detectar
cierto nivel residualde expresióndel operónmccABC, que esindependientedel
activadorCRP.
79
6.-. Se aisló un plásmido multicopia que portabaun fragmentocromosómicoque
reducíalaexpresiónde unafusiónmccli—lacZ.El análisisdedelecióneinserción
de dicho fragmento demostróque el fenotipo de reducción de la expresión
observadosedebíaa la presenciade dos genes:uno de ellos erahns, y el otro
era un locus no descritopreviamente,al que denominamos¡¿nr.
7.— Mediantetécnicasde sustituciónalélica, se construyóun mutantecromosómico
¡¿nf. Estudios realizadoscon una fusión mccB—jaeZendicho contextomutante
indican que cl producto(s)del locus ¡¿nf regula(n) negativamentela expresión
del operónmccABCen fase exponencial.
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