Regeneración del nervio periférico con células madre y ...

RCCP Vol. 26 núm. 2Diciembre de 2020

LUIS NIETO R., LUZ MABEL ÁVILA P., JENNIFFER P. ÁVILA G., PAULA PÉREZ, ELISA SANTAMARÍARegeneración del nervio periférico con células madre y plasma rico en plaquetas

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Recibido para publicación: julio 1 de 2020Revisado: octubre 15 de 2020

* Cirujano plástico microcirujano, cirujano de mano, profesor de la Pontificia Universidad Javeriana,Hospital Militar Central. MD, MsC, FACS.

* * Directora científica del Stem, Medicina Regenerativa/CryoHoldco. BSc, MsC, PhD.*** Coordinadora del Laboratorio Stem, Medicina Regenerativa. BSc, MsC.**** Cirujana plástica, Universidad Militar Nueva Granada. MD.

Regeneración del nervio periférico con células madrey plasma rico en plaquetasRegeneration of peripheral nerve with stem cells and plasma richin platelets

LUIS NIETO R.*, LUZ MABEL ÁVILA P.**, JENNIFFER P. ÁVILA G.***, PAULA PÉREZ****,ELISA SANTAMARÍA****

Palabras clave: lesión del nervio periférico, regeneración del nervio periférico, injerto nervioso, células madre mesenquimales, plasma rico enplaquetas.Key words: peripheral nerve injury, peripheral nerve regeneration, nerve graft, mesenchymal stem cells, platelet rich plasma.

INVESTIGACIÓN

Rev Col Cirugía Plástica y Reconstructiva • 2020;26(2):7-12http://www.ciplastica.com • ISSN 2422-0639 (En línea)

ResumenLas lesiones de nervio periférico constituyen una patología frecuente;la recuperación no es completa si existe pérdida de segmento de ner-vio, y más, si se acompaña de lesiones de tejidos blandos y óseosconcomitantes.Objetivo: Comparar el grado de regeneración nerviosa en lesionesde nervio periférico con pérdida de tejido nervioso, utilizando la téc-nica actual «Gold Standard» de injertos nerviosos de interposición,con un modelo de tubo regenerativo descelularizado, al que se leagregan células madre mesenquimales y plasma lisado enriquecidocon plaquetas.Materiales y métodos: Estudio experimental en ratas Wistar de 250 a300 gramos de peso, distribuidas en tres grupos: grupo 1, resecciónde 1,5 cm reconstruida con injerto nervioso; grupo 2, resección de1,5 cm reconstruida con tubo regenerativo de interposición, y grupo3, resección de 1,5 cm reconstruida con tubo regenerativo de interpo-sición con células mesenquimales (MSC) derivadas de tejido adiposoy lisado de plasma rico en plaquetas. Después de cuatro semanas, serealizó una biopsia del nervio distal a la lesión y reconstrucción,realizando un recuento axonal con tinción con hematoxilina y eosina,comparando los datos entre los grupos (STATA 12).Resultados: Se compararon las variables cuantitativas en los tresgrupos, para los axones tipo A regenerados, obteniendo el número deaxones para cada grupo, grupo 1: 485,1, grupo 2: 14,2, grupo 3:93,8, y aplicando la prueba para determinar las diferencias entre losgrupos estudiados, se determina que existe una diferenciaestadísticamente significativa entre ellos.Conclusiones: Evidente mejoría de la regeneración axonal en el grupo3 comparado con el grupo 2. Primer estudio experimental que utilizaesta novedosa plataforma biológica para la regeneración del nervioperiférico con células madre mesenquimales xenogénicas; sin embar-go, el tiempo de seguimiento fue corto, por lo cual, pensamos que losresultados pueden ser aún mejores con tiempos de seguimiento mayores.

Abstract

The peripheral nerve injuries are a frequent pathology, recovery isnot complete if there is loss of nerve segment and if it is accompaniedby concomitant soft tissue and bone injuries.Objective: To compare the degree of nerve regeneration in peripheralnerve lesions with loss of nervous tissue, using the current «GoldStandard» technique of interposition nerve grafts, with a decellularizedregenerative tube model, to which mesenchymal stem cells are addedand lysed plasma enriched with platelets.Materials and methods: Experimental study in Wistar rats weighing250 to 300 grams, divided into three groups: group 1, 1.5 cm resectionreconstructed with a nerve graft; group 2, 1.5 cm resectionreconstructed with regenerative interposition tube; group 3, 1.5 cmresection reconstructed with regenerative interposition tube withmesenchymal cells (MSC) derived from adipose tissue and platelet-rich plasma lysate. After four weeks, a biopsy of the nerve distal to thelesion and reconstruction was performed, performing an axonal countwith hematoxylin and eosin staining, comparing the data between thegroups (STATA 12).Results: The quantitative variables in the three groups were comparedfor the regenerated type A axons, obtaining the number of axons foreach group, group 1: 485.1, group 2: 14.2, group 3: 93.8, and applyingthe test to determine the differences between the studied groups, it isdetermined that there is a statistically significant difference betweenthem.Conclusions: Evident improvement in axonal regeneration in group3 compared to group 2. First experimental study using this novelbiological platform for regeneration of the peripheral nerve withxenogeneic mesenchymal stem cells, however, the follow-up time wasshort, therefore, we think that the results can be even better withlonger follow-up times.



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IntroducciónEn el éxito de la regeneración axonal luego de una

lesión de nervio periférico, además de la oportuna inter-vención, la técnica quirúrgica, la magnitud de la lesión, lacoaptación nerviosa sin tensión y una adecuada cober-tura, se debe tener en cuenta componentes claves a nivelcelular que interactúan de forma sincronizada, tales comola matriz extracelular, factores estimulantes de crecimientonervioso, células que soporten el crecimiento axonal, yestructuras de soporte que permiten el crecimiento diri-gido del tejido nervioso hacia los órganos blanco de cadanervio1. Hasta el momento el mejor «andamio» o sopor-te para dirigir el crecimiento axonal ha sido el injerto ner-vioso autólogo colocado como puente entre los cabosde sección del nervio afectado, con resultados buenosen aproximadamente el 60% de los casos, proporcióndebida a factores como edad, comorbilidades y lesionesasociadas, sumadas a la morbilidad que resulta del áreadonante y la pérdida funcional correspondiente2. Por estose ha investigado el reemplazo del injerto nerviosoautólogo con diferentes tipos de soportes, con resulta-dos variables tanto en modelos animales, como sus apli-caciones clínicas en humanos. Tales resultados sonreproducibles en defectos de hasta 3 cm. Además, elmencionado soporte debe cumplir con las característi-cas de biocompatibilidad, biodegradabilidad, porosidadpara la interacción con los receptores de matriz extra-celular, que permitan anclar ligandos y factores de creci-miento neuronal, que favorezcan la proliferación celulary con propiedades biológicas y mecánicas adecuadaspara que los axones puedan crecer, generando así elmedio ambiente necesario para una regeneración ade-cuada3,4. En dichos soportes se han utilizado sustanciaso células que influyen positivamente en la regeneraciónaxonal, como células madre mesenquimales de tejidoadiposo (ADSC), las cuales tienen una respuestaparacrina de secreción de factores de crecimiento ner-vioso5-12, además con la capacidad de diferenciación acélulas de Schwann (SC), claves para el crecimientoaxonal13-15. Varios estudios demuestran que la fibrina dadireccionamiento al crecimiento axonal durante la rege-neración, la cual puede ser obtenida de plasma rico enplaquetas (PRP) que, activado, puede además secretargran cantidad de factores de crecimiento que promue-ven regeneración16. La combinación de estas diferentesterapias puede mejorar el grado de regeneración ner-

viosa dado por el crecimiento axonal hasta la región distalde la lesión17. El objetivo del estudio fue comparar loscambios regenerativos en lesiones de nervio ciático enratas Wistar de 2 a 3 meses de edad con peso de 250 a300 gramos, utilizando injerto nervioso autólogo versustubo regenerativo con células mesenquimales derivadasde tejido adiposo humano y lisado de plasma rico enplaquetas, evaluando el potencial regenerativo bajomicrocopia de luz y conteo axonal con coloración dehematoxilina y eosina para cada uno de los grupos.

Materiales y métodosSe realiza un estudio experimental en animales, con

ratas Wistar de 250 a 300 gramos de peso, de 9 sema-nas de edad, aprobado por comité de cuidado animaldel Instituto Nacional de Salud de Colombia y el comitéde ética del Hospital Militar Central. Los animales fue-ron mantenidos e intervenidos bajo condiciones de bien-estar y anestesia adecuados.

Previa firma de consentimiento informado, se obtuvolipoaspirado de un paciente sometido a contorno cor-poral; el material fue procesado para la extracción decélulas mesenquimales humanas mediante digestiónenzimática con colagenasa tipo II, cultivo celular, diso-ciación con tripsina, y la verificación de la expresiónfenotípica se realizó mediante la lectura de la muestra encitómetro de flujo Facs Canto II con el software Diva®(figura 1).

Las unidades de plasma rico en plaquetas se obtu-vieron mediante fraccionamiento de componentes celu-lares en el banco de sangre «Fundación HematológicaColombiana».

Para el soporte del tubo regenerativo se utilizarontráqueas obtenidas de eutanasia de ratas Wistar de otrosestudios, sometidas a tratamiento de descelularizacióncon desoxicolato de sodio y digestión enzimática condesoxirribonucleasa-I (ADN-asa).

Procedimiento quirúrgico: asignación aleatoria de 7 ratasen cada uno de los tres grupos, grupo 1, lesión de 1,5 cmde longitud de nervio ciático reconstruido con injerto ner-vioso; grupo 2, lesión de 1,5 cm reconstruida con tuboregenerativo de interposición; grupo 3, lesión de 1,5 cmreconstruida con tubo regenerativo de interposición adi-cionando células mesenquimales derivadas de tejido adi-poso re suspendidas en solución salina isotónica con 10%de lisado de plasma rico en plaquetas (figura 2).



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Figura 2. Tubo regenerativo con células mesenquimales y plasma rico enplaquetas colocado en sitio de defecto, 1,5 cm, nervio ciático, rata Wistar.

Figura 1. Aislamiento de células mesenquimales humanas, extraídas delipoaspirado.

El seguimiento se realizó por cuatro semanas y al fi-nalizar este periodo se procedió a realizar eutanasia delos sujetos experimentales, siguiendo las normas esta-blecidas para tal fin. Se obtuvo el segmento del nerviointervenido, distal al sitio de la lesión; los 21 explantesde nervio ciático (figura 3) fueron conservados,deshidratados e incluidos en parafina para su correspon-diente corte histotécnico y coloreados con azul detoluidina al 1%. Estos cortes fueron observados en mi-croscopio Olymmpus DP80, fotografiandosectorizadamente a 40X; las fotografías fueronreconstituidas «off line» y abiertas en softwareImageJv1.45(NIH), para realizar el conteo de axonestipo A. Los resultados fueron supervisados manualmen-te y de forma aleatorizada por dos observadores exper-tos en reconocimiento de patrones histológicos en un

sistema doble ciego (tabla 1)18,19. De cada bloque, tresnuevos cortes a 3 micras se desparafinizaron depositan-do sobre ellos anticuerpos antineurofilamentos(Novocastra) con el fin de inmunomarcar los axones,considerando positiva la coloración axónica, el caracte-rístico color pardo de la inmunohistoquímica (figura 4).El análisis estadístico se realizó con el software STATA12.0, considerando un valor p < 0,05 estadísticamentesignificativo.

Figura 3. Medición y marcación de los cabos proximal y distal de los explantesde nervio obtenidos.

Figura 4. Coloración inmunohistoquímica para neurofilamentos.

ResultadosEl análisis estadístico comparó las variables cuantita-

tivas en los tres grupos, para el recuento de axones re-



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generados tipo A bajo microscopía. La media del núme-ro de axones tipo A para para el grupo 1 (Gold Stan-dard) fue de 485,1 DE 563,6 (5-1530); grupo 2 (controlnegativo) 14,2 DE 20,4 (0-49), y grupo 3 (grupo expe-rimental) 93,8 DE 226,4 (0-607) (tabla 2 ). Al aplicar laprueba de Kruskal-Wallis se observa una diferencia sig-nificativa entre los grupos P: 0,017 (tabla 3).

Como dato adicional, se evidenció en los cortesdistales, en el epineuro externo, la presencia de fibrasnerviosas tipo C regeneradas, corroborando la regene-ración nerviosa distal al sitio de reparación.

No se presentaron reacciones desfavorables frente ala utilización de las células madre ni LPRP en los ratones.

Tabla 1. Resultado del conteo de axones tipo A en cada grupo.

Convenciones: p (cabo proximal), d (cabo distal), ir (índice de regeneración).

Tabla 2. Medias del número de axones para cada grupo de estudio.



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DiscusiónLas lesiones de nervio periférico constituyen una pa-

tología frecuente, con una incidencia estimada de 13 a23 casos por 100.000 personas20, en diferentes tipos desituaciones clínicas, tales como heridas cortopunzantes,accidentes automovilísticos, accidentes en moto, poste-rior a resección de tumores, malformaciones congénitasy heridas por arma de fuego; son lesiones nerviosas demuy difícil reparación, por las lesiones de tejidos blan-dos y óseos concomitantes.

Se requiere el mejor tratamiento en el momentoadecuado, en espera de la recuperación motora y sen-sitiva, la cual depende de factores como el tipo, elnivel y la extensión de la lesión, la edad del paciente,las comorbilidades, la técnica de reparación usada, yprincipalmente el momento del procedimiento quirúr-gico, evitando así atrofia muscular y daño de la placaneuromotora.

Las técnicas actuales para reparación de un nervioperiférico que ha sufrido una pérdida segmentaria sebasan en la interposición de tejidos o materiales capacesde permitir el paso del cono de crecimiento axonal através de ellos para alcanzar el cabo distal a la lesión yrecuperar la función motora o sensitiva según el tipo denervio lesionado. El método que ha mostrado los mejo-res resultados y en grandes defectos han sido los injer-tos autólogos de nervio, con la desventaja de la morbilidad

que se produce en el área donante del nervio seleccio-nado para servir de puente entre los cabos de seccióndel nervio lesionado. La interposición de tubos de dife-rentes materiales biocompatibles ha demostrado resul-tados hasta defectos de 3 cm en humanos, por lo cual labúsqueda de métodos que permitan el crecimiento axonalcon la mínima morbilidad posible y con la mayor canti-dad de axones hacia el órgano blanco del nervio recons-truido es fundamental.

Este estudio demostró el potencial de las MSC detejido adiposo humanas para mejorar la regeneración delnervio periférico después de lesión traumática en unmodelo murino, con un andamio biológico21-29 obtenidomediante el empleo de técnicas de ingeniería de tejidos.

El mecanismo de acción de las MSC está asociado asu gran poder paracrino para realizar neuroprotección,estímulo de la división celular y retardo del inicio deapoptosis, y a sus efectos inmunomoduladores. Estádemostrada la producción de sustancias neutróficas30,como FGF, factor neurotrófico ciliar, BDNF, GDNF;los altos niveles de NGF-b, presente en las MSC, me-joran la regeneración de axones y la remielinización31-39,mejorando de la regeneración axonal y la remielinización.

La combinación de MSC y LPRP puede mejorar laregeneración axonal debido a su direccionamiento porparte de la fibrina generada y mayor cantidad y númerode factores de crecimiento presentes en el plasma.

ConclusionesEste estudio experimental evaluó la regeneración del

nervio periférico con células madre mesenquimalesxenogénicas, demostrando su utilidad y eficacia en lareconstrucción de lesiones de nervio periférico. Sin em-bargo, cabe aclarar que el tiempo de seguimiento fuecorto, por lo cual pensamos que los resultados puedenser aún mejores con tiempos de seguimiento mayores.

Así mismo, este estudio abre el campo para nuevosestudios clínicos con el fin de evaluar su efectividad enotros modelos animales y humanos, abriendo la puertade nuevas opciones terapéuticas que logren disminuir lamorbilidad asociada a la reconstrucción nerviosa coninjertos autólogos.

AgradecimientosDoctora Alejandra Muñoz Suárez y doctor Ricardo

Vanegas del Instituto Nacional de Salud.

Tabla 3. Test de Kruskal-Wallis que determina diferencia estadísticamente significati-va entre los grupos de estudio (p:0,01) (STATA 12.1)



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Datos de contacto del autorLuis Nieto R., MD.Correo electrónico: Luis Nieto R. [email protected]

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