Redes de Interacción de ProteínasRedes de Interacción de Proteínas

Antonio Rausell arausell@cnio.es

CNIO. Grupo de Biología Computacional y

Estructural.

Interacciones entre proteínasInteracciones entre proteínas

Fundamentales para comprender la función de las proteínas.Intervienen en el control del ciclo celular, diferenciación celular, plegamiento de proteínas, señalización, transcripción, traducción, modificación post-traduccionales y transporte.Las interacciones pueden alterar las propiedades cinéticas de los enzimas, permitir la canalización de secuencias de reacciones, crear nuevos sitios de unión, inactivar o destruir una proteína, cambiar su especificidad, tener un papel regulatorio, etc.

Se pueden clasificar en:Interacciones estables: asociados a los complejos con múltiples subunidades (Hemoglobina, RNA polimerasa, etc).Interacciones transitorias: implicadas en el control de la mayoria de los procesos celulares. Normalmente requieren de un conjunto de condiciones que provocan la reacción.

Interacciones entre proteínasInteracciones entre proteínas

El estudio de proteínas o interacciones concretas no es suficiente para explicar algunos fenotipos o procesos biológicos, en los que intervienen un número variado de ellos, interrelacionados mediante una red característica de interacciones.

Análisis basados en la agrupación de enfermedades por fenotipos sugieren relaciones a nivel de sub-redes inesperadas.

LimLim et al. et al. Cell. 2006. Cell. 2006.

Conjuntos masivos de interacciones

detectadas experimentalmente

Uetz et al. Nature. 2000 (YEAST)Ito et al. PNAS. 2001 (YEAST)

Gavin et al. Nature. 2002 (YEAST)Ho et al. Nature. 2002 (YEAST)Giot et al. Science. 2003 (FLY)Li et al. Science. 2004 (WORM)

Butland et al. Nature. 2005 (E. coli)Barrios-Rodiles et al. Science. 2005

(MAMMALIAN) Rual et al. Nature. 2005 (HUMAN)

Yeast two-hybrid

Fields & Song.Fields & Song. Nature. 1989. Nature. 1989.

Yeast two-hybrid & localizaciónn celular

Yeast two-hybridAlgunos problemas

•Falsos negativos: Interferencia de los dominios fusionados. Interacciones 1 Vs 1, no tiene en cuenta efectos cooperativos.

•Falsos positivos: Interacciones mediadas por terceras proteínas. Es capaz de obtener interacciones lábiles, pero esto lo hace más

vulnerable a uniones inexpecíficas. Aunque el ensayo es in vivo, las condiciones no suelen serlo (sobre-

expresión, forzado en el núcleo, etc) Baja reproducibilidad.

Purificación de complejos (TAP-MS y HMS-PCI)

Purificación de complejos

Se generan redes diferentes de las de y2hNodos = complejos; Enlaces=comparten elementosSe desconoce la topología (interacciones prot-prot) de los complejos.

Modos de representación binaria de los datos obtenidos de complejos

Purificación de complejosAlgunos problemas

•Falsos negativos:Interferencia del TAP-cassette en la interacción (~18% de las proteínas no son funcionalmente viables).Proteína no expresada en el momento de la lisis (se ha relacionado con la concentración de mRNA).Sesgo en contra de proteínas pequeñas (<15K).Detecta principalmente interacciones estables (se pierde las lábiles).En mamíferos requiere sobre-expresión.

•Falsos positivos:Proteínas pegajosas.Se estima un 70% de complejos reproducibles.Interacciones establecidas durante la lisis.

Solapamiento de los datos experimentales

Complejos gran escalaY2H gran escalaText MiningExperimentos pequeña escala

Combinando estrategias

Redes de interacciones predichas

Una revisión: Valencia & Pazos.Curr. Op. Struct. Biol. 2002

Algunas ideas de partida

Se sabe que proteínas funcionalmente Se sabe que proteínas funcionalmente relacionadas tienden a presentar una relacionadas tienden a presentar una evolución evolución coordinada.coordinada.

La interacción es una forma muy fuerte de La interacción es una forma muy fuerte de relación funcional.relación funcional.

Esto implica que la detección de proteínas que Esto implica que la detección de proteínas que hayan evolucionado coordinadamente puede hayan evolucionado coordinadamente puede ayudarnos a ayudarnos a predecir interaccionespredecir interacciones

La evolución se estudia a través de la La evolución se estudia a través de la comparación de comparación de secuencias homólogassecuencias homólogas con funciones comparables. con funciones comparables.

Tanto la evolución génica, como la interacción de Tanto la evolución génica, como la interacción de proteínas se han de estudiar en el contexto de los proteínas se han de estudiar en el contexto de los organismos.organismos.

Las trazas de evolución coordinada se encuentran por la Las trazas de evolución coordinada se encuentran por la acumulaciónacumulación de señales en un número alto de de señales en un número alto de organismos.organismos.

Nos interesa identificar las proteínas que estan Nos interesa identificar las proteínas que estan históricamente relacionadas (históricamente relacionadas (homólogashomólogas), y desarrollan ), y desarrollan la la misma funciónmisma función (equivalogas). (equivalogas).

Algunas ideas de partida

Buscando evolución coordinadaPerfiles filogenéticos

Un perfil filogenético es un vector que define la Un perfil filogenético es un vector que define la ausencia/presencia de un representante de un ausencia/presencia de un representante de un conjunto de equivalogos en cada organismo.conjunto de equivalogos en cada organismo.

Las proteínas que interaccionan han de estar en los Las proteínas que interaccionan han de estar en los mismos organismosmismos organismos

La evolución tiende a eliminar proteínas La evolución tiende a eliminar proteínas innecesariasinnecesarias

Estos perfiles se pueden extender a parecidos entre Estos perfiles se pueden extender a parecidos entre una secuencia de referencia y sus ortólogos.una secuencia de referencia y sus ortólogos.

Buscando evolución coordinadaGene neighbourhood

Dos genes se consideran vecinos cuando Dos genes se consideran vecinos cuando están próximos en un genoma (menos de están próximos en un genoma (menos de 600bp)600bp)

Se sabe que en procariotas esta Se sabe que en procariotas esta vecindad se usa para para optimizar la vecindad se usa para para optimizar la coordinación de su expresión.coordinación de su expresión.

Además genes próximos pueden ser Además genes próximos pueden ser eliminados y transferidos juntos.eliminados y transferidos juntos.

La conservación de esta proximidad a lo La conservación de esta proximidad a lo largo de diferentes organismos es una largo de diferentes organismos es una señal de evolución coordinada.señal de evolución coordinada.

Dandekar Dandekar et al.et al. TIBS. 1998. TIBS. 1998.Overbeek Overbeek et al.et al. PNAS. 1999. PNAS. 1999.

Buscando evolución coordinada

Gene fusion

La evolución genera La evolución genera secuencias híbridas por fusión secuencias híbridas por fusión de otras más simples.de otras más simples.

Esto permite una mayor Esto permite una mayor coordinación de las funciones coordinación de las funciones desempeñadas por ambas desempeñadas por ambas proteínas.proteínas.

Además permite el incremento Además permite el incremento de la complejidad de los de la complejidad de los organismos por combinación y organismos por combinación y especialización de dominios especialización de dominios (eucariotas).(eucariotas).

La presencia de estas fusiones La presencia de estas fusiones sugiere una interacción entre sugiere una interacción entre las secuencias homólogas no las secuencias homólogas no fusionadas.fusionadas. Marcotte et al. Science 1999

Marcotte et al. Nature 1999Enright et al. Nature 1999.

Buscando evolución coordinada

Métodos basados en secuencia

Hay otro nivel de coordinación posible: Hay otro nivel de coordinación posible: coevolución de secuencias.coevolución de secuencias.Buscamos paralelismos históricos que Buscamos paralelismos históricos que deberían ser detectables comparando la deberían ser detectables comparando la evolución de las secuencias de evolución de las secuencias de diferentes conjuntos de equivalogos. diferentes conjuntos de equivalogos. Para ello, construímos alineamientos Para ello, construímos alineamientos múltiples de secuencias de estos múltiples de secuencias de estos conjuntos.conjuntos. Después hacemos pares de Después hacemos pares de alineamientos comparables extrayendo alineamientos comparables extrayendo aquellas secuencias de los mismos aquellas secuencias de los mismos organismos para ambos conjuntos.organismos para ambos conjuntos.

Fully sequenced Fully sequenced GenomesGenomes BLASTBLAST

10E-510E-5

10E-510E-5

Best hit

Best hitVery strict homology assignment

(same ancestor, different organism and the best possible

coupling)

Practical definition of equivalogy

Set of equivalogsSet of equivalogsMSAsMSAs

MUSCLEMUSCLE

ReferenceReferenceGenomeGenome

Buscando evolución coordinada

MirrorTree

Las proteínas que interaccionan tienden a compartir un conjunto Las proteínas que interaccionan tienden a compartir un conjunto de restricciones evolutivas comunes.de restricciones evolutivas comunes.

Este método intenta detectar la coevolución al nivel de secuencias Este método intenta detectar la coevolución al nivel de secuencias comparando una simplificación de los árboles evolutivos de pares comparando una simplificación de los árboles evolutivos de pares de alineamientos.de alineamientos.

Pazos & Valencia. Proteins. 2002

HIS4_ECOLIHISX_ECOLI

Pazos & Valencia. Prot. Eng. 2001

Buscando evolución coordinada

In silico two-hybrid

Para un número de casos se ha Para un número de casos se ha mostrado la existencia de patrones mostrado la existencia de patrones de substituciones correlacionados de substituciones correlacionados entre diferentes posiciones de una entre diferentes posiciones de una secuencia (relacionado con secuencia (relacionado con proximidad espacial). proximidad espacial).

Se cree que esto se debe a la Se cree que esto se debe a la coevolución de estas posiciones coevolución de estas posiciones (mutaciones recíprocas).(mutaciones recíprocas).

Siguiendo esta lógica, buscamos Siguiendo esta lógica, buscamos estos comportamientos, no intra-estos comportamientos, no intra-proteína, sino inter-proteína en pares proteína, sino inter-proteína en pares de alineamientos comparables.de alineamientos comparables.

Una ventaja de este método es que Una ventaja de este método es que apunta a resíduos relacionados con apunta a resíduos relacionados con la interacción.la interacción.

Pazos & Valencia. Proteis. 2002

Algunos problemas generales de

los métodos de predicción

-> Falsos negativos:-> Se requiere una señal clara a lo largo de varios organismos.-> Si la detección de proteínas equiválogas falla, no se encuentra la señal.-> Una interacción dada no necesariamente debe mostrar ninguno de los indicios usados.

-> Falsos positivos:-> Las relaciones filogenéticas entre los organismos, suponen sesgos que pueden producir señales erróneas.-> La evolución coordinada tiene problemas para distinguir entre interacción física y asociación funcional.-> La evolución coordinada sufre de cierta transitividad (si a-b y b-c entonces a-c).-> El nivel de especificidad depende de la similitud entre las secuencias (distancias globales).

EciD (E. coli interaction Database)

http://www.pdg.cnb.uam.es/ecidhttp://www.pdg.cnb.uam.es/ecid

STRING

http://string.embl.de/

Otras redes relacionadas con interacción

(basadas en literatura)

Blaschke & Valencia. Genome Inform Ser Workshop Genome Inform. 2001

Hoffmann & Valencia. Nat. Genetics. 2004

c

SUISEKI

Extraction of the interactions Human expert manipulation

Pubmed15M entries

Extraction of protein names

* [protein A] ... verb indicating an action ... [protein B]

“After extensive purification, Cdk2 was still bound to cyclin D1”

Rules (frames) to identify the interactions

Selecting terms that indicate interaction

activate, associated with, bind, interact, phosphorylate, regulateAction words are for example:

Selection of the text corpus

Hoffmann & Valencia Nat Genet 2004

Algunas evaluaciones de conjuntos

de interacciones

von Mering et al. Nature. 2002Lee et al. Science. 2004

Otra comparación de métodos (respecto a complejos)

Comparación más reciente (funcional)+

Predicción funcional

Aprendiendo de las redes de interacción

Una revisión: Barabasi & Oltvai. Nat. Rev. Genetics. 2004

Otros: Lee et al. Science. 2004

He & Zhang. PLoS Gen. 2006

Algunas carácterísticas

Conectividad: número de enlaces de un nodo.

Distribución Power-Law de conectividades -> p(k)~k-γ (¿Scale-free?).

Camino mínimo: el mínimo número de enlaces que hay que recorrer para ir de un nodo a otro.

Camino mínimo medio es mucho más corto que la de redes con topología generada al azar (Small world).

Algunas carácterísticas

Conectividad: número de enlaces de un nodo.

Distribución Power-Law de conectividades -> p(k)~k-γ (Scale-free).

Coeficiente de clustering: mide la densidad de conexiones alrededor de un nodo: 2n1/(k*(k-1))

Los nodos más conectados (hubs), parecen tener menores coeficientes de clustering (¿redes jerárquicas?).

Presenta módulos difíciles de detectar (¿Jerárquica?, ¿ruido?. ¿?).

Assortativity: tendencia de un elemento a sociarce con otro similar a él (en conectividad).

Los nodos más conectados suelen estar unidos a otros con pocas interacciones (disassortativity -> ¿ruido?).

Algunas carácterísticas

Distribución Power-Law de conectividades -> p(k)~k-γ

(¿Scale-free?) Robusta a eliminación de nodos al

azar. Los nodos más conectados suelen

estar unidos a otros con pocas interacciones.

Presenta módulos difíciles de detectar (¿Jerárquica?).

Algunas carácterísticas

Distribución Power-Law de conectividades -> p(k)~k-γ

(¿Scale-free?) Robusta a eliminación de nodos al

azar. Los nodos más conectados suelen

estar unidos a otros con pocas interacciones.

Presenta módulos difíciles de detectar (¿Jerárquica?).

Assortativity: tendencia de un elemento a sociarce con otro similar a él.

Los nodos más conectados suelen estar unidos a otros con pocas interacciones (disassortativity).

Algunas carácterísticas Robustez: capacidad para mantener su

estructura global ante delecciones de nodos o enlaces.

En las redes de interacciones los hubs tienden a ser esenciales.

Mayor robustez ante fallos aleatorios (eliminación de nodos al azar)

Menor robustez ante ataques dirigidos a los hubs.

Explicación alternativa: lo esencial son las interacciones, y los hubs tienen más probabilidades de estar implicados en una interacción esencial.

Estructura de la red: Red libre de escala.Coherente con un crecimiento por unión preferencial.Se han desarrollado simulaciones incluyendo crecimiento de la red por duplicación génica.

Evolución de las redes

Los grafos no bastan

Las interacciones no son sólo relaciones entre nodos. Las interacciones tienen superficies de distinto tamaño y pueden ser solapantes (mutuamente excluyentes).

Teniendo esto en cuenta se ve que: Mayor superficie de interacción

supone menor velocidad de evolución. Los “date hubs” son aquellos con

interacciones mutuamente excluyentes.

La duplicación sólo explica el crecimiento de los “date hubs”.

Kim et al. Science 2006.

Motivos, Función y Conservación

Se pueden describir motivos de un número pequeño de nodos y unas conexiones determinadas entre ellos.Algunos de estos motivos están sobre-representados en las redes de interacción (y2h).Se puede ver que existe relación entre los motivos y el tipo de proceso celular.Además, los motivos más conectados están más conservados entre organismos (relacionado con la robustez de la red)

Wutchty, Oltvai & Barabasi. Nat. Genet. 2003.

Añadiendo la variable temporalInteracciones + Expresión

Ulrik de Lichtenberg,Lars Juhl Jensen,Søren Brunak,Peer Bork.Dynamic Complex Formation During the Yeast Cell Cycle. Science.2005.307,724-7

Interacciones + Expresión + Módulos funcionales

Coordenada radial: basada en el tráfico que atraviesa al nodoCoordenada angular: minimiza la longitud de las conexionesColor: Niveles de expresión 20 min después de un golpe de calor

Valente & Cusick. Nucleic Acids Research. 2006

Prediciendo función con redes de interacción

Contexto de red o dime con quien andas y te diré quien eres.Se asigna función basándose en la función de los nodos vecinos.Se reduce el número de enlaces entre proteínas con función diferente.

Vazquez et al, Nat Biotech. 2003

Predicción de función integrando información

Aproximación bayesiana estableciencio confianzas en función de rutas metabólicas.

Lee et al. Science. 2004.

Futuro

Está claro que los conjuntos de interacciones están lejos de ser completos. ¿Hasta dónde pueden ayudar los métodos de predicción?

Las interacciones son importantes, pero sólo parte del sistema La mayoría de los estudios no integran diferentes tipos de redes

interacción, coexpresión, metabolismo, regulación génica, etc. Las redes de interacción no representan la naturaleza dinámica

de la célula. El análisis de las redes es muy joven, por lo que se requieren

nuevos estudios para llegar a comprenderlas. Estos avances ayudarán a mejorar las predicciones de función,

relevancia de las proteínas, etc. El estudio dinámico de los sistemas biológicos y de sus

respuestas a determinadas condiciones (estrés, enfermedades, envejecimiento, etc) debe apoyarse en el conocimiento de las redes de interacción, regulación, rutas metabólicas, ...

Ruegos y preguntas

¡Manos arriba!

y/o

arausell@cnio.es