Reacciones enzimáticas en sistemas no...

Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Reacciones enzimáticas en sistemas no acuosos

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa


La posibilidad de realizar reacciones enzimáticas en solventes no acuosos ha abierto una enorme puerta a las posibilidades de la biotecnología

Biocatálisis en solventes orgánicos

Alexander M. Klibanov


Es posible pensar en reacciones tales como: - reacciones de condensación catalizadas por hidrolasas, termodinámicamente imposibles en medio acuoso.


Moo-Yeal Lee and Jonathan S Dordick. 2002. Enzyme activation for nonaqueous media. Current Opinion in Biotechnology, 13: 376–384


-reacciones a altas temperaturas, ya que el agua participa directamente en el proceso de desnaturalización térmica, así las proteínas en sistemas semi-anhidros son significativamente más estables a altas temperaturas que cuando se encuentran disueltas en agua.

- reacciones que involucren substratos altamente hidrofóbicos e insolubles en sistemas acuosos



Vázquez-Duhalt, 2004

Diferentes tipos de sistemas de reacción enzimática con la presencia de solventes orgánicos


Reacciones catalizadas por lipasa porcina pancreátic a en diferentes solventes orgánicos (Zaks y Klibanov, 1985)

Velocidad inicial de reacción (µmol/h-mg)

Solvente

Transeste-rificación

Esterificación AminólisisIntercambiode acilo

Tio-esterificación

Oximólisis

Hexano 5.2 2.4 0.60 2.0 3.0 3.0

Acetona 1.2 0.30 0.60 0.54 1.1 1.5

THF 2.0 0.36 0.54 0.54 1.8 2.1

Eter etílico 5.1 0.90 0.24 0.72 1.9 2.1

Piridina 1.3 0.06 0.60 0.12 1.1 1.1

Tolueno 2.1 2.4 0.18 1.1 1.7 2.3

Bárzana y García-Garibay, 2004


Las proteínas están cubiertas con una cáscara de enlaces de agua, la cual compite con los ligandos por la unión a la superficie



Esquema de la secuencia del proceso de hidratación de una proteína globular


Principios

• Las enzimas no notan todas las moléculas de agua en solución, solamente aquellas que están alrededor

• Reemplazar el seno del agua con solventes orgánicos

• Enzima sólida húmeda, suspendida en solventes orgánicos

Klibanov, 2001


Ventajas

• Fácil proceso de separaciónFiltrar la enzima, evaporar el solvente y separar el producto del material remanente inicial

• No es necesaria la inmovilización• Cambia el equilibrio termodinámico• Cambia la selectividad enzimática

Klibanov, 2001


• Es necesario mezclar, agitar o sonicar para la difusión de Sustrato

• Optimizar micro-pH alrededor de la enzima• Control de actividad de agua• Usar la correcta hidrofilicidad de los solventes orgánicos

Precauciones

Klibanov, 2001

Catalíticamente activas cuando el contenido de agua < 2%


Limitaciones difusionales

• Enzimas cristalinas, liofilizadas, precipitadas o adsorbidas

• Suficiente movilidad requerida para permitir cambio s conformacionales menores (formación del complejo ES )

• El encauzamiento del substrato ocurre cuando se provee suficiente agitación

Klibanov, 2001


Liofilización

La deshidratación puede cambiar la estructura de la enzima

• Uso de lioprotectores, tales como azúcares, PEG, ciertas sales inorgánicas, substratos-semejando ligandos y éteres coronas

• Estructuras de los éteres corona más importantes: 1 2-corona-4, 15-corona-5, 18-corona-6, difenil-18-corona-6, y diaza-18-corona-6.

• Activación arriba de cuatro órdenes de magnitudKlibanov, 2001

http://es.wikipedia.org/wiki/Éter_(química)


Efecto de la estructura secundaria sobre la actividad de las enzimas suspendidas en

solventes orgánicos (Dong y col., 1996)

Se ha observado que las condiciones de liofilización pueden afectarprofundamente la actividad catalítica de las enzimas, esto se debe a un desdoblamiento de su estructura secundaria

El incremento en actividad en solventes orgánicos de enzimas liofilizadas con carbohidratos (trealosa o sorbitol) se debe a la protección a la estructura de la proteína durante el secado.

Sin embargo, no hubo una correlación consistente entre la actividad en solventes orgánicos de su estructura inicial obtenida en la enzima seca o en la estructura final cuando fue suspendida en el solvente orgánico.


Lioprotector Solvente Tasa

(µµµµmol/min mg)

Agua total

(µµµµg)

Ninguno Etanol 0.95 2020

Ninguno Hexano 2.8 330

Ninguno Piridina 0.002 430

10% trealosa Etanol 1.6 2420

10% trealosa Hexano 3.3 730

10% trealosa Piridina 0.003 830

2% sorbitol Etanol 0.97 2020

2% sorbitol Hexano 0.55 330

2% sorbitol Piridina 0.002 430

Tasas de reacción para αααα-quimotripsina suspendida en solventes orgánicos

(Dong y col., 1996)


Lioprotector Solvente Tasa

(µµµµmol/min mg)

Agua total

(µµµµg)

Ninguno Etanol 37 2030

Ninguno Hexano 0.22 340

Ninguno Piridina 0.38 440

10% trealosa Etanol 65 2500

10% trealosa Hexano 0.088 840

10% trealosa Piridina 7.6 940

2% sorbitol Etanol 81 1980

2% sorbitol Hexano 0.10 300

2% sorbitol Piridina 2.9 400

Tasas de reacción para Subtilisina Carlsberg suspendida en solventes orgánicos

(Dong y col., 1996)


• La medición de pH no es fácil

• El estado de ionización de la enzima determina su conformación, actividad y selectividad

• Emplear enzimas sólidas que han sido recuperadas de liofilización o precipitación de un bufer a su pH óp timo: memoria de pH

Efecto de pH

Klibanov, 2001



Representación esquemática del equilibrio del agua entre las diferentes fases de un sistema de reacción enzimática

en solvente orgánico


• ¿Cuánta agua se requiere para retener actividad catalítica?

• ¿Cómo podemos definir la cantidad de agua en la mezcla de reacción?

• ¿Cómo podemos controlar la actividad de agua en la mezcla de reacción?

Efecto de agua

Klibanov, 2001


• Enzimas dependientes(quimotripsina, tirosinasa)

• Agua enlazada fuertemente permanece presente, aún después de la liofilización

• Frecuentemente se puede encontrar un contenido de agua óptimo

¿Cuánta agua se requiere para retener la actividad catalítica?

Klibanov, 2001


• Baja tasa a bajo contenido de agua

• Alta estabilidad a bajo contenido de agua

• El agua está involucrada en reacciones de inactivación

• El agua incrementa la flexibilidad de la enzima →desdoblamiento

Tasa de reacción vs estabilidad

Klibanov, 2001


• La concentración o el porcentaje en volumen no es útil

• Grado de hidratación (agua enlazada a la enzima)

• Actividad de agua termodinámica aw

¿Cómo podemos definir la cantidad de agua en la mezcla de reacción?

Klibanov, 2001


• Pv (agua-solvente) / P v (agua-agua)

• Determina cuánta agua está enlazada a la enzima• Determina la actividad catalítica a una gran extens ión• Determina el efecto del agua sobre la posición de

equilibrio químico

Actividad de agua

Klibanov, 2001


• Permite investigar la influencia del solvente sobre la catálisis enzimática

• Correcto para diferentes grados de hidratación debido a diferentes solubilidades

Actividad de agua fija (Klibanov, 2001)

• A una actividad de agua conocida la hidratación de la enzima es fija

Patrick Adlercreutz . Chapter 1. 2008. Fundamentals of Biocatalysis in Neat Organic Solvents. In Organic Synthesis with Enzymes in Non-Aqueous Media. Edited by Giacomo Carrea and Sergio Riva. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim


• Pre-equilibrio de la solución de enzima y substrato en atmósferas de actividad de agua controlada (antes d el mezclado)

• El rango de actividades de agua puede obtenerse usando diferentes soluciones salinas saturadas

¿Cómo podemos controlar la actividad de agua en la mezcla de reacción?

Klibanov, 2001



Soluciones sobresaturadas de sales, con actividad termodinámica de agua conocidas, sirven para fijar la actividad de agua en el

sistema de reacción y en la enzima antes de la reacción


Sylvie Maury, Paulette Buisson, Alain Perrard, Alain C. Pierre. 2005. Compared esterification kinetics of the lipase from Burkholderia cepacia either free or encapsulated in a silica aerogel. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 32: 193–203

Compared esterification kinetics of the lipase from Burkholderia cepacia either free or encapsulated in a silica aerogel


[ ][ ][ ] [ ] [ ] [ ] [ ][ ]alcoholacid

K

acidacidK

K

alcoholalcoholK

alcoholacid

V

v

acid

alcoholacid

im

alcoholim +

++

+

=11

max

0

Mecanismo Bi Bi Ping-Pong con inhibición por sustrato


• Solventes apolares inmiscibles en agua (log P > 4)

• Correlación no clara en la región 1 < log P < 4

• Influencia de la constante dieléctrica

La naturaleza de los solventes orgánicos

Klibanov, 2001


Pat

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solvente puro

co-solvente

sistemas bifásicos

Usos de los líquidos iónicosen procesos biocatalíticos

Seongsoon Park and Romas J Kazlauskas. 2003. Biocatalysis in ionic liquids - advantages beyond green technology. Current Opinion in Biotechnology, 14: 432-437.


• Baja εεεε →→→→ flexibilidad de la enzima reducida

• Media εεεε →→→→ flexibilidad óptima y actividad

• Alta εεεε →→→→ el solvente polar desmonta la capa de agua de la enzima

Influencia de la constante dieléctrica

Klibanov, 2001


• La tasa de la enzima mejora en agua porque el substrato quiere pasar del agua hacia el interior d el sitio activo

• En solventes orgánicos el substrato ya no sale con dificultad fuera del medio debido al efecto hidrofó bico

y la ventaja energética de la caída de la partición →→→→tasas más bajas

Los sitios activos hidrofóbicos como los substratos hidrofóbicos

Klibanov, 2001



Efecto del incremento en la concentración de solvente orgánico miscible en agua sobre transformación enzimática de substratos hidrofílicos e hidrofóbicos. Los substratos hidrofóbicos dejan de ser transformados a concentraciones menores

de solvente que los substratos hidrofílicos


• Muchas enzimas forman reacción intermedias tetrahedras cargadas (estado de transición polar)

• Estabilizados por agua enlazada internamente

• Actividad disminuida en solventes orgánicos

Energía del estado de transición

Klibanov, 2001


• Cambio en el substrato, enantiomérico, proquiral, regio y quimoselectividad

Efectos sobre la selectividad de la enzima



Reconocimiento del substrato

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• Lipasas• Preferencia por grupos funcionales distintos en la

molécula del substrato• Acilación de grupos hidroxil en relación a grupos

amino favorecidos en solventes orgánicos

Efectos sobre la regio y quimoselectividad (Klibanov, 2001)



• Cambio en la selectividad del producto

• El solvente orgánico influencia el acceso de agua a l sitio activo

Efectos sobre la selectividad de la enzima

Klibanov, 2001


Enzimas halofílicas extremas en solventes orgánicos (Marhuenda-Egea y Bonete, 2002)

Comportamiento cinético• Las dos enzimas halofílicas encapsuladas en micelas inversas, pNPPasa y hMDH,

mostraron un comportamiento tipo Michaelis-Menten si la concentración salina era alta (≥ 0.85 M NaCl)

• A bajas concentraciones salinas, la cinética enzimática puede mostrar un comportamiento sigmoidal. Aunque los valores de Vmax fueron similares en ambos casos

• Esto sugiere que la enzima se adapta al microambiente especial en la fase acuosa de la micela


Diseño de la composición del medio para optimizar el rendimiento de la reacción

• Efectos sobre la actividad y estabilidad enzimática• Requerimientos de agua, pH y capacidad buffer• Solubilidad y estabilidad de substrato y productos• Recuperación de productos, separación del

biocatalizador y remoción de substrato

Ingeniería del medio

Klibanov, 2001


Mutagénesis dirigidasMutagénesis aleatoria

• Minimización de las cargas superficiales, mejoramien to de las interacciones polares internas, enlaces disu lfuro, etc.

• Cambio de la especificidad del substrato, afinidad de enlace o estereospecificidad

Ingeniería de proteínas

Klibanov, 2001


Efecto de la temperatura sobre la enantioselectividad de lipasas

(Persson y col., 2002)


Efecto de la temperatura sobre la enantioselectividad de hidroxinitril liasas

(Persson y col., 2002)

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