Rafaela 2.ppt [Modo de compatibilidad] - inti.gob.ar · Rafaela, 2010. Introducción Piensos...

P d ió d b t i i biótiProducción de bacteriocinas y probióticos a partir de suero de leche

y su aplicación

en alimentación de animales monogástricos

Lorenzo Pastrana

Rafaela, 2010

Introducción

Piensos producción FormulaciónPrevenciónT t i t

Infecciones intestinalespindustrial de cerdos y pollos antibióticos Tratamiento

Promotores del crecimiento

R i t i i bi

Acidificantes

Efectos adversosResistencias microbianas

Restricciones uso

Aceites esenciales

Sustancias prebióticasAlternativas

Microorganismos probióticosMicroorganismos probióticos

Dificultad de obtener forma Productos comerciales

Sólida base científica (funcionalidad)

barata cultivos bacterianos concentrados

Extensión limitada

Composición del suero de leche (g/L)

SLC SLD

48 03

SLC

Carbohidratos totales 48,11 20,54

19 86

SLD

Azúcares reductores 48,03 19,86

5,02 2,04

1 05 0 45

Azúcares reductores

Proteínas

Nitrógeno total 1,05 0,45Nitrógeno total

Fósforo total

Cenizas

0,43 0,25

5 10 3 00CenizasResiduo sólido

5,10 3,00

62,70 26,60

Objetivos

Mejorar la calidad higiénica y funcional de piensos para alimentación de lechones y pollos incorporando

Reducir la incidencia de trastornos intestinales

para alimentación de lechones y pollos incorporando bacterias lácticas probióticas.

1. Seleccionar especies potencialmente probióticas

Sustituir la utilización de antibióticos

2. Diseñar un procedimiento de fermentación para obtener elevadas cantidades de biomasa probiótica y otras sustancias con actividad antimicrobiana.

2.1 Fermentación de sustratos de bajo coste: suero de leche

2.2 Suplementar el suero con extractos proteicos: harinas de soja y pescado

3. Formular un pienso con biomasa probiótica y/o bacteriocinas. Estudios de estabilidad y modelización de la supervivencia.

4. Evaluar la funcionalidad de los piensos con probiótico: pollos y lechones.4. Evaluar la funcionalidad de los piensos con probiótico: pollos y lechones.

Objetivo 1:

Potenciales bacterias probióticasPotenciales bacterias probióticas

Especie Clave* Procedencia

Lactobacillus casei Lb 3.04 CECT 4043

Criterio

Mayor producción láctico

Lactococcus lactis

Pediococcus acidilactici

Lc 1.04

Pc 1.02

CECT 539

NRRL B-5627

Productora nisina

Productora de pediocinaed ococcus ac d act c

Enterococcus faecium

E t

c 0

Ec 1.01

E 3 01

56

CECT 410

B t i i l d d

oducto a de ped oc a

Microbiota intestinal

M fi bilid dEnterococcus sp. Ec 3.01 Bacteria aislada de intestino de pollo

*Clave de las especies bacterianas utilizadas en el Grupo de Biotecnología,

Mayor fiabilidad identificación

Clave de las especies bacterianas utilizadas en el Grupo de Biotecnología,del Área de Nutrición y Bromatología de la Facultad de Ciencias de Ourense.CECT: Colección Española de Cultivos Tipo.NRRL: Nothern Regional Research Laboratory (Peoria, Illinois, EEUU).

Objetivo 1:

Potenciales bacterias probióticasPotenciales bacterias probióticas

BacteriasPotencial efecto probiótico

Bacterias candidatas Seguridad: carecer de toxicidad o patogeneicidad

Aptitud tecnológica Estabilidad y viabilidad celular Aplicación industrial bacterias lácticas

Obtener fácilmente elevados recuentos

Especialmente lábiles y p yespecialmente exigentes

• Obtener postincubados concentrados en IMPORTANTE biomasa y sustancias antimicrobianas

• Además de forma económicamente viable

Medio de cultivo barato Modalidad operatoria que conduzca a elevados rendimientos

Objetivo 2:

Producción de bacterias lácticasProducción de bacterias lácticas

Habitualmente:

Medios de cultivo convencionales t l MRS TGE Ventaja: concentraciones relativamente

elevadas de producto naturaleza cara: MRS, TGE

Modalidad proceso:Tipo batch

Problema: elevado costep

Tipo continuo

Nuestro laboratorio:

Medios de cultivo a base de efluentes residualessuero de leche

efluentes procedentes delefluentes procedentes del procesado del mejillón.

Objetivo 2.1: Producción de bacterias lácticas

Cultivos batchCultivos batch

D t ió d l lti

Pc 1.02 Lc 1.04 Lb 3.04 Ec 1.01

7

8

7

8

Detención del cultivo

Detención del cultivo

pH

4

5

6

7

g/L) 1,5

4

5

6

7

1,5 g/L)

pH

Bacterias lácticas Niveles: Biomasa, Láctico AA

C ?Limitación de

Bio

mas

a (g

0,0

0,5

1,0

g/L)

150,0

0,5

1,0

10

15

g/L)

Bio

mas

a (g

crecen en suero de leche ?

Inferiores medios convencionales:

MRS Lb 3 04

Causa ?Macronutrientes ?

Láct

ico

(g

0

5

10

A/m

L)

45

60

0

5

10

45

60

A/m

L)Lá

ctic

o (g

MRS :Lc 1.04Pc 1.02

Lb 3.04

AA

(UA

0

15

30

152025

0

15

30

152025

res

(g/L

)A

A (U

A

res

(g/L

)

Rothe : Ec 1.01

8

12

05

10

eína

(g/L

)

8

12

0510

eína

(g/L

)

Azú

car

Azú

car

0 5 10 15 200

4

Tiempo (h)

0 5 10 15 20 0 5 10 15 20

Prp

te

0

4

0 5 10 15 20

Prp

te


Cultivos batch

Causas de las bajas producciones en suero:

Cultivos batch

C1. Carencia de algún micronutriente esencial

2. Fuente de nitrógeno y carbono inadecuadas si se comparan con medios complejos. Solución ?

3. pH inadecuado

4. Acumulación de sustancias antimicrobianas

(ácidos orgánicos y bacteriocinas)


Cultivos batchCultivos batch

Causas de las bajas producciones en suero:

C1. Carencia de algún micronutriente esencial

2. Fuente de nitrógeno y carbono inadecuadas si se comparan con medios complejos.

3. pH inadecuado

4. Acumulación de sustancias antimicrobianas

Estrategias operativas:

(ácidos orgánicos y bacteriocinas)

1. Cultivos realimentados con sustratos concentrados

2. Realcalinizaciones sucesivas

3. Fuente de carbono: glucosa o lactosa

4 Sustituir parte del volumen de medio4. Sustituir parte del volumen de medio fermentado por medio fresco.

C Ai

Sustrato (suero de leche)

NaOH 5N

Cepa Aire

pH7

de leche)

30ºC7 pHi= 7

0,5 L de aire/h200 rpm

AT20

t(h)12 24 Suero de leche

EPM

p

20

t(h)

Muestra

t(h)12 24

V de muestra = V de adición


Cultivos realimentados realcalinizados

Cultivos realimentados realcalinizados:

• Diferentes medios de fermentaciónCaracterísticas intrínsecas de cada cepa

• Diferentes medios de realimentación

• Diferentes estrategias operativas

p

Necesidades de producciónDiferentes estrategias operativas



Características generales:7

8

7

8Pc 1.02 Lc 1.04 Lb 3.04 Ec 1.01

H t lá ti (P )

1. Fermentaciones:4

5

6

4

64

5

6

4

6

pH(g

/L)

(g/L

)pH

Heteroláctica (Pc)

Homoláctica (Lb)Mixta (Lc y Ec)

3 Fuentes de N y P no se agotaron

0

2

4

40

60

0

2

4

40

60LácticoAcéticoEtanol

LácticoAcéticoEtanol


Bio

mas

a (g

/L)

(g/L

)B

iom

asa

2. Acumulación de lactosa. Consumo preferente de glucosa

3. Fuentes de N y P no se agotaron totalmente

4. Pérdida paulatina en la capacidad d d i l H

0

20

40

600

0

20

40

456075

Butanodiol

Láct

ico

(U

A/m

L)

UA

/mL)

Láct

ico

(

60

90

de reducir el pH

5. Rendimientos producto/biomasa superiores. Biomasa más productiva

0

300

152025

0153045

152025

Lactosa

Glucosa

AA

(U

ares

(g/L

)A

A (U

ares

(g/L

)

0

30

p p

6. Rendimientos producto/sustrato inferiores. Mayor consumo azúcares

8

12

05

10

8

12

0510

Glucosaeí

na (g

/L)

eína

(g/L

)

Azú

c a

Azú

ca

6. Eficiencias en cuanto al consumo de sustrato superiores0 50 100 150 200

0

4

50 150 250 50 150 250 3500

4

0 50 100 150 200

Tiempo (h)

Prp

te

Prp

te



En conclusión:7

8

7

8Pc 1.02 Lc 1.04 Lb 3.04 Ec 1.01

• elevar rendimientos y eficiencias

• prolongar el periodo productivo

4

5

6

4

64

5

6

4

6

pH(g

/L)

(g/L

)pH

• prolongar el periodo productivo

• Eliminan los tiempos de parada, limpieza y carga

0

2

4

40

60

0

2

4

40

60LácticoAcéticoEtanol



Bio

mas

a (g

/L)

(g/L

)B

iom

asa

• Cultivos más concentrados0

20

40

600

0

20

40

456075

Butanodiol

Láct

ico

(U

A/m

L)

UA

/mL)

Láct

ico

(

60

90

producciones muy superiores a

las de cultivos batch

Estrategia adecuada para producir

postincubados concentrados0

300

152025

0153045

152025

Lactosa

Glucosa

AA

(U

ares

(g/L

)A

A (U

ares

(g/L

)

0

30

8

12

05

10

8

12

0510

Glucosaeí

na (g

/L)

eína

(g/L

)

Azú

c a

Azú

ca

0 50 100 150 2000

4

50 150 250 50 150 250 3500

4

0 50 100 150 200

Tiempo (h)

Prp

te

Prp

te

Utili ió d h i t i l f l ió

Objetivo 2.2:

Utilización de harinas proteicas en la formulación de medios de cultivo para bacterias lácticas

Utilización de harinas proteicas en la formulación d di d lti b t i lá ti

Objetivo 2.2:

de medios de cultivo para bacterias lácticas

Fuentes: Harinas de soja y pescado

Aptitud promover crecimiento

Optimización extracción proteica

pH alcalinos [NaOH] 0-1,12 N Cultivos con los T(ºC)

[NaOH](N)

T[NaOH]

Valores naturalesValores codificadosNúm. Comb.

Temperaturas superiores ambiente

Rango: 30-74ºCextractos proteicos

521 1201 2675340,12-1-14700,121-13341-112701111

( C)(N)

Plan factorial rotable orden 2 (α=±1,267)

3 tiempos y 3 bacterias

520 560010520,56009300,56-1,26708740,561,267075200-1,2676521,1201,2675

( )

Variables dependientes:

Proteínas NitrógenoAzúcares totales

Ácido láctico

Actividad antimicrobiana520,560013520,560012520,560011520,560010

p Azúcares totalesTirosina Grado hidrólisis proteínas

Utilización de harinas proteicas en la formulación de medios de cultivo para b t i lá tibacterias lácticas

Harinas soja y pescado NaOH

Incubar 1h 150 rpm

SB1PrecipitadoCongelar alícuota

para análisisCentrifugar 4000 rpm/10’/4-8ºC

EliminarpH=7

N OH/HCl NNaOH/HCl 5N

Centrifugar 4000 rpm/10’/4-8ºC SB2 SLC + H2OdPrecipitado

EliminarMedio de cultivo

3,5 g/L Pr20 g/L AT


Objetivo 2.2:

Proteína Nitrógeno Tirosina


640

2,0

2,5

2

4

1,010

20

30

1 0

g/L

0,5

1,0

1,5

2,0

1,0

00,0

0,5

1,0

3040506070

NaOH (N

)

T (ºC)

0

0

0,0

0,5

1,0

3040506070

NaOH (N

)

T (ºC)

0,0

0,5

0,0

0,5

3040506070

NaOH (N

)

T (ºC))

20 0

25,0

30,0

t*6,

25

Proteína

Nt*6,25

5,0

10,0

15,0

20,0

g/L

pro

t y g

/L N

t

0,0

,

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


Objetivo 2.2:


Proteína Nitrógeno Tirosina

640 2,5

2

4

6

1 010

20

30

1 0

g/L

0 5

1,0

1,5

2,0

1 0

g/L g/L

00,0

0,5

1,0

3040506070

NaOH (N

)

T (ºC)

00,0

0,5

1,0

3040506070

NaOH (N

)

T (ºC)

0,0

0,5

0,0

0,5

1,0

3040506070

NaOH (N

)

T (ºC)


Objetivo 2.2:

B

L)

40[N O H] 1 12 N

A

) 40


Tiro

sina

x10

(g/L

20

30

T = 74ºC [NaO H] = 1,12 N

Tiro

sina

x10

(g/L

20

30

30 40 50 60 70

Prot

eína

y

0

10

0,3 0,6 0,9 1,2

Pro

teín

a y

0

10

T (ºC)

30 40 50 60 70

[NaOH] (N)

0,3 0,6 0,9 1,2

a

A

a 0 08

0,10B

0 08

0,10

T = 74ºC [NaOH] = 1,12 N

irosi

na /

Prot

eína

irosi

na /

Pro

teín

a

0,04

0,06

0,08

0,04

0,06

0,08

T

[NaOH] (N)

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Ti

0,00

0,02

T (ºC)

30 40 50 60 700,00

0,02

[NaOH] (N) T ( C)


Objetivo 2.2:


0,10

0,12

0,14

teín

a0,04

0,06

0,08

Tiro

sina

/ Pr

ot

0,00

0,02

0 00 0,25 0,50 0,75 1,0030405060

T

T (ºC) 0,00 ,

NaOH (N)T (ºC)

Cómo influyen los diferentes extractosen las producciones ?

Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Lb 3 04

Objetivo 2.2:

producciones de Lb 3.04

8 horas 16 horas 28 horas

Actividad antimicrobiana

13,2 UA/mL

15 15 158,2 UA/mL 9,8 UA/mL

5

10

5

10

5

10A

A (U

A/m

L)

AA

(UA

/mL)

0

0,00,5

1,0

3040506070

[NaOH]

T (ºC)

0

0,00,5

1,0

3040506070

[NaOH]

T (ºC)

0

0,00,5

1,0

3040506070[NaOH]

T (ºC)

3,4 UA/mL

Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Lc 1 04

Objetivo 2.2:

producciones de Lc 1.04

40

8 horas

40

16 horas

40

28 horas

20

30

40

na (U

A/m

L)

na (U

A/m

L)

20

30

20

30

na (U

A/m

L)

0

10

0,00,5

1,0

3040506070

Nis

in

[NaOH]N

isin

0

10

0,00,5

1,0

3040506070NaOH] 0

10

0,00,5

1,0

3040506070

Nis

in

[NaOH]304050

[Na

T (ºC)

3040 [Na

T (ºC)

3040 [Na

T (ºC)

Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Lc 1 04

Objetivo 2.2:

Actividad antimicrobiana

producciones de Lc 1.04

Lc 1.04 Lb 3.048 horas

40

8 horas

10

15

20

30

40

a (U

A/m

L)

UA

/mL)

0

5

0,00,5

1,0

40506070OH]

0

10

0,00,5

1,0

40506070

Nis

ina

NaOH]

AA

(U

0,03040506070

[NaOH]

T (ºC)

0,030405060

[NaO

T (ºC)

Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producción de ácido láctico por Lc 1.04

8 horas 16 horas 28 horas4,3 g/L

3

4

5

co (g

/L)

co (g

/L)

3

4

5

3

4

5

ico

(g/L

)

0

1

2

3

1 0

Láct

ic

Láct

ic

0

1

2

3

1,0 0

1

2

01,0

Láct

i

1,6 g/L0

0,00,5

1,0

3040506070[NaOH]

T (ºC)

0

0,00,5

,

3040506070

[NaOH]

T (ºC)

0,00,5

3040506070

[NaOH]

T (ºC)

Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Pc 1 02

Objetivo 2.2:

8 horas 16 horas28 horas

producciones de Pc 1.02

30

40

(UA

/mL)

30

40

(UA/

mL)

UA/

mL)

30

40

0

10

20

0,51,0

Pedi

ocin

a

OH]0

10

20

0,51,0

H]

Pedi

ocin

a

Pedi

ocin

a (

10

20

30

1,00,0

,

3040506070[NaOH]

T (ºC)

0,0,

3040506070[NaOH]

T (ºC)

00,0

0,5

3040506070

[NaOH]

T (ºC)8 horas 16 horas 28 horas4,33 g/L

1 5

2,0

2,5

3,0

co (g

/L)

ico

(g/L

)

1 5

2,0

2,5

3,0

tico

(g/L

)

4

5

6

0,0

0,5

1,0

1,5

0 00,5

1,0

06070

Láct

ic

OH]

Láct

i

0,0

0,5

1,0

1,5

0 00,5

1,0

506070 OH]

Láct

0

1

2

3

0,00,5

1,0

3040506070NaOH]

0,03040506070

[NaOH]

T (ºC)

0,03040506070

[NaOH]

T (ºC)

304050[NaO

T (ºC)

Influencia de las fuentes de nitrógeno sobre producciones de Pc 1 02

Objetivo 2.2:

producciones de Pc 1.02

Ácido láctico

8 horas 16 horas 28 horas8 horas

2

3,0

2 5

3,0

16 horas

6

28 horas4,33 g/L

1,0

1,5

2,0

2,5

Láct

ico

(g/L

)

Láct

ico

(g/L

)

1,0

1,5

2,0

2,5

Láct

ico

(g/L

)

2

3

4

5

0,0

0,5

1,0

0,00,5

1,0

3040506070[NaOH] 0,0

0,5

,

0,00,5

1,0

3040506070

[NaOH] 0

1

2

0,00,5

1,0

3040506070[NaOH]

T

2 g/L

T (ºC) T (ºC) T (ºC)

Utilización de harina de pescado como fuente de nitrógeno para suplementar SLD

Recapitulación:

Objetivo 2.2: Utilización de harinas proteicas…

Recapitulación:

1. La producción de bacteriocina y ácido láctico —en los medios suplementados con los extractos proteicos— aumentó respecto al SLD sin suplementar.

2. Un elevado grado de hidrólisis de la proteína estimula las durante las primeras horas de cultivo (p. ej. láctico por Lc 1.04 y Pc 1.02). Sin embargo proteínas menos hidrolizadas estimulan la producción a tiempos más largos. (p. ej. láctico y pediocina por Pc 1.02).

3. Cada una de las especies tiene requerimientos diferentes en cuanto a la naturaleza de la fuente de nitrógeno, y además estos requerimientos cambian en función del estado fisiológico edad de la célulaestado fisiológico —edad— de la célula

Incorporación de las bacterias lácticas l i

Objetivo 3:

a los piensos

Producción de probióticos: Efecto simbiótico de los productos de la fermentación

Nisina Láctico Acético 2,3-butanodiol

p

-1 -1 -1 -1

-1 -1 -1 1

-1 -1 1 -1

-1 -1 1 1

-1 1 -1 -1

-1 1 -1 1

-1 1 1 -1

-1 1 1 1

1 -1 -1 -1

1 -1 -1 1

1 -1 1 -1

1 -1 1 1

1 1 1 11 1 -1 -1

1 1 -1 1

1 1 1 -1

1 1 1 1

0 10 20 30 40 50 60

Unidades de Actividad

1 1 1 1

Producción de probióticos: Efecto del almacenamiento a -20ºC con leche descremeda en polvo (30% (p/v))

Ent. faecium

Ped. acidilactici L. lactisLact. casei

Producción de probióticos: Supervivencia en pienso a temperatura ambientep

Ped. acidilactici L. lactisEnt. faecium Lact. casei

D t i ió d l t l i l t t

Objetivo 3.4:

Determinación de la tolerancia al tracto gastrointestinal

Tolerancia a las condiciones ácidasObjetivo 3.4:

Pc 1 02 Lc 1 04

Tolerancia a las condiciones ácidas

Pc 1.02

L)8

10Lc 1.04

L)

8

10

log

(ufc

/mL

2

4

6

log

(ufc

/mL

2

4

6

pH 1pH 1

0 0Lb 3.04

10Ec 1.01

10

ufc/

mL)

4

6

8

ufc/

mL)

4

6

8

pH 1pH 1

log

(

0

2

4

log

(

0

2

4pH 1pH 1

Tiempo (h)0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5

Tolerancia a las condiciones gastrointestinales

Objetivo 3.4:

Condiciones gástricas (Pepsina y NaCl pH 2)

g(u

fc/m

L)

6

8

10

(ufc

/mL)

6

8

10

Pc 1.02

0 50 100 150

log

0

2

4

Lc 1.04

0 50 100 150

Lb 3.04

0 50 100 150

Ec 1.01

0 50 100 150 200

log

0

2

4

mL) 8

10

mL)8

10

Condiciones intestinales (Pancreatina y NaCl pH 8)

log

(ufc

/m

2

4

6

log

(ufc

/m

2

4

6

Pc 1.02 Lc 1.04 Lb 3.04 Ec 1.01

Tiempo (h)

0 100 200 3000

0 100 200 300 0 100 200 300 0 100 200 300 4000

ControlControl

Con enzimas

Evaluación del potencial probiótico en

Objetivo 4:

Evaluación del potencial probiótico en monogástricos (lechones y pollos)

4.1 Potencial probiótico en lechones

4.2 Potencial probiótico en pollos

Índices productivos:

• Recuentos en microbiota intestinal (microbiología clásica)

I t d• Índices productivos: Incremento de peso

Velocidad de crecimiento

Consumo

Índice de conversión

Evaluación del potencial probiótico en á t i l h

Objetivo 4.1:

Ensayo 1

• Tratamiento A: pienso blanco

Ensayo 2


monogástricos: lechones


• Tratamiento B: pienso con Pc 1.02

• Tratamiento C: pienso con Ec 1.01


• Tratamiento B: pienso con Lb 3.04

• Tratamiento C: pienso con Lc 1.04

Ensayo 1

p

• Tratamiento D: pienso con colistina

p

• Tratamiento D: pienso con colistina

Ensayo 2

ecto

al c

ontro

l

110

1150 días14 días28 días42 días

c/g)

6

9

ecto

al c

ontro

l

110

115

c/g)

6

90 días14 días28 días42 días2

6%

% d

e pe

so re

spe

100

105 log

(uf

0

3

% d

e pe

so re

spe

100

105log

(ufc

0

3%

5%0 10 20 30 40 Control EcPc Colistina

Tiempo (d)

00 10 20 30 40 50Control LbLc Colistina

Tiempo (d)

0 5%


Objetivo 4:

monogástricos: lechones

Lb 3.04 potencial probiótico ?


Objetivo 4:

monogástricos: lechonesEnsayo 3


• Tratamiento C: pienso con avilamicina



Tratamiento C: pienso con avilamicina

ntro

l 108 6%sp

ecto

al c

on

104

106%

de

peso

res

100

102

Tiempo (d)

0 15 30 45

% 100

Experimental Postadministración

Evaluación del potencial probiótico en

Objetivo 4.2:

Evaluación del potencial probiótico en monogástricos ( pollos)

Evaluación del potencial probiótico en á t i ll

Objetivo 4.2:

monogástricos: pollos

Ensayo 4



• Tratamiento C: pienso con Lc 1.04

• Tratamiento D: pienso con avilamicina

Ausencia efecto probiótico Metodología: Jaulas

Evaluación del potencial probiótico en condiciones de estrés nutricional

Objetivo 4.2:

en condiciones de estrés nutricional

Cama de viruta Número de animales por réplica es elevado

Facilita la transmisión de patógenosNuevo experimento:

Estrés nutricional Pienso a base de trigo y cebada

Aumentar la viscosidad intestinalAumentar la viscosidad intestinal

Potenciar la maortalidad producida por Clostridium

Pollos broiler

Evaluación del potencial probiótico en di i d t é t i i l

Objetivo 4.2 :

condiciones de estrés nutricional

Índice de conversión 3 Blanco

2

Lb 3.04Lc 1.04

1

Avilamicina

1

0

0-8

8-16

16-2

5

25-3

1

0-16

0-25

0-31

0-8

8-16

0-31

T iem po (d)

Evaluación del potencial probiótico de Lactobacillus caseib t i i l d i t d l i t ti d lly una bacteria aislada previamente del intestino de pollo

Evaluación del potencial probiótico de Lactobacillus casei y una bacteria aislada previamente del intestino de pollointestino de pollo

Enterococcus sp. Lactobacillus casei

(bacteria aislada de intestino de pollo)

(ligero efecto probiótico)

Efecto sinérgico

intestino de pollo)

Ensayo 6

• Tratamiento A: pienso blanco, trigo y cebada

• Tratamiento B: pienso probiótico, Lb 3.04 y Enterococcus sp. Tratamiento B: pienso probiótico, Lb 3.04 y Enterococcus sp.

• Tratamiento C: pienso probiótico acidificado, fórmico 0, 25%

T t i t D i idifi d• Tratamiento D: pienso acidificado

Evaluación del potencial probiótico de Lactobacillus casei y una bacteria aislada previamente del intestino de pollode pollo

19% 18

cont

rol

120

125

10

14%

%%

BlancoProbiótico

resp

ecto

al

110

115

%

Probiótico y fórmico

Fórmico

% d

e pe

so

100

105

110

11%7%

Tiempo (d)

0 15 30 45

100

Evaluación del potencial probiótico en monogástricos. En conclusión:en monogástricos. En conclusión:

La administración de piensos probióticos suplementados al 2% con La utilización de antibióticos para mejorar la salud y el crecimiento postincubados de bacterias lácticas (dosis 109) puede aumentar los

índices productivos en pollos y lechones.de pollos y cerdos puede reducirse mediante la suplementación

de los piensos con bacterias lácticas

Técnicas de biología molecular para el estudio de la microbiota intestinal

Técnicas de biología molecular para el estudio de la microbiota intestinalde la microbiota intestinal

O ti i ió 1 P j d b dF357GC/R518 Amplifican ADNr 16S Optimización: 1. Pareja de cebadoresF968GC/R1401

pDominio Bacteria

2. Concentración de ADN molde

F357GC/R518 F968GC/R1401 F357GC/R518

Técnicas de biología molecular para el estudio d l i bi t i t ti l

Objetivo 4:

de la microbiota intestinal

Optimización: 1. Pareja de cebadores (F357GC/R518)

2. Concentración de ADN molde

3. Porcentajes desnaturalizantes

40% 65%40%

60%


DGGE

Índice de biodiversidad de Shannon Weaver

Índice de Shannon- Weaver: 3,0Índice de Shannon Weaver:

H = - [ pi . Ln (pi) ]2,5

Pi: proporción de la comunidad representada por especies i

H´

1,5

2,0

5 10 15 20 251,0

Com nidades con Tiempo (d)Comunidades con igual diversidad

peropero

Estructura completamente diferente de especiesdiferente de especies

Análisis cluster de la biodiversidad

Í di d i ilit d d Di

2nAB

Índice de similitud de Dice:

SD =nA+ nB Algoritmo de la media aritmética o

promedio entre grupos (UPGMA)

nA y nB son el número total de bandas en los perfiles A y B

n es el número de bandas comunesnAB es el número de bandas comunes a A y B

Algoritmo de la media aritmética (UPGMA)


8 dí Índice de similitud de Dice:8 días


18 días

Existen varios perfiles de bandas asociados al consumo de un determinado tipo de pienso

Algoritmo de la media aritmética (UPGMA)

Índice de similitud de Dice:


23 dí23 días

Secuenciación de bandas características

1 Bacillus fragilis 99%1. Bacillus fragilis 99%

3. Lactobacillus johnsonii 99% o Lactobacillus gasseri 98%g

5. Lactobacillus crispatus 99% Lactobacillus

casei

6. Lactobacillus salivarius con 100%

7. Ruminococcus hydrogenotrophicus con 100%hydrogenotrophicus con 100%

10. 98% de identidad con una bacteria de colon de pollo no cultivable.p


Bacterias estructurales:

1. Bacillus fragilis 99%

5 L t b ill i t 99%Lactobacillus

casei

5. Lactobacillus crispatus 99%

10. Bacteria no cultivable de colon de pollo con 98% de identidad.

Bacterias funcionales:

3. Lactobacillus johnsonii 99% o Lactobacillus gasseri 98%

6. Lactobacillus salivarius con 100%

7. Ruminococcus hydrogenotrophicus con 100%hydrogenotrophicus con 100%


Bacteria aislada de intestino de pollo

Lactobacilluscasei

Enterococcus sp.

Enterococcus durans

Enterococcus ratti

Enterococcus faecium

Enterococcus hirae

Comprobación de la capacidad de colonización

Pueden colonizar el intestino ?

Responsable mejoras í di d ti ?índices productivos ?

Enterococcus sp. Lactobacillus casei

Bacteria aislada deBacteria aislada de intestino de pollo adulto


Desenvolvimiento de un método molecular para evaluar el

Nuevo proyecto titulado:

Desenvolvimiento de un método molecular para evaluar el efecto de los ácidos orgánicos sobre la microbiota intestinal en pollos

Financiado por:: Empresa Coren SCL

Xunta de Galicia

Nueva colaboración:

Departamento de Microbiología de la Universidad de Wageningen (Holanda)

CC

Producción de péptidos con acción antihipertensiva a partir de sueros de quesería

Universidad de Vigo

OOb 1) Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación

de la actividad de la ECA.

je

2) Selección de condiciones óptimas de hidrólisis de las proteínas séricasutilizando distintas proteasas y concentraciones de las mismas, tiempos ytemperatura de hidrólisise

ti

temperatura de hidrólisis.

3) Caracterización de los hidrolizados proteicos mediante determinación delíndice IC50 (concentración proteica necesaria para inhibir el 50% de la

iv

50actividad de la ECA) determinado a partir de modelos matemáticos dosis-respuesta.

os

Puesta a punto de un método espectrofotométrico para la determinación de la

ti id d d l ECAactividad de la ECA

Método descrito por Shalaby et al. (2006) N-[3-(2-Furil) acriloil]-L-fenilalanil-glicil-glicina (FA-PGG)

ECAFA-Phe-Gly-Gly FA-Phe + Gly-GlyFA Phe Gly Gly FA Phe + Gly Gly

1.7

pte con inhibidor

1.7

1.6

1.65

ncia (3

40 nm)

pte con inhibidor

1.6

1.65

ncia (3

40 nm)

1.5

1.55

Absorba

n

pte control (ECA)1.5

1.55

Absorba

n

1.45

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Tiempo (min)

1.45

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Tiempo (min)

% IECA= [1 – (pte inhibidor / pte control)] x 100


ti id d d l ECA

1. Selección de la concentración óptima de ECA

actividad de la ECA

r2 = 0,975

Futuros ensayos: 0,25

U/mL

r2 = 0,995

r2 = 0,990

● 1 U/mL ● 0,5 U/mL ○ 0,25 U/mL

,99


ti id d d l ECA

2. Selección de la concentración óptima de sustrato (FA-PGG)

actividad de la ECA

r2 = 0,990

Futuros ensayos:

r2 = 0,974

ensayos: 1,75 mM

● 1,75 mM ● 0,88 mM


ti id d d l ECA

3. Validación del método

actividad de la ECA

Captopril (D-3-mercapto-2-metilpropanoil-1-prolina)

Rango de concentraciones: 0,0028 μM-0,34 μM

IC50 = 0,08 μM

4,71 nM en el ensayo

Prácticamente igual al obtenido por Shalaby et al.

(2006) = 4,10 nM



je


ti



iv


os

Actividad inhibitoria del suero frescofresco

Como paso previo al estudio de proteólisis con enzimas comerciales, se determinóp p pla actividad inhibitoria del suero deslactosado procedente de la empresa QUEIZÚARS.L. (A Coruña, España).

[Proteína] inicial del suero: 58 mg/mL

IC50 = 5431 μg/mL

IC50 captopril = o,o17 μg/mL(0,08 μM) ( , μ )

IC50 péptidos antihipertensivos = o,17-890 μg/mL

Actividad inhibitoria del suero frescofresco

Como paso previo al estudio de proteólisis con enzimas comerciales, se determinóp p pla actividad inhibitoria del suero deslactosado procedente de la empresa QUEIZÚARS.L. (A Coruña, España).

[Proteína] inicial del suero: 58 mg/mL

Necesidad de un proceso de hidrólisis que permitiera la liberación de péptidos con actividad inhibitoria de

la ECAla ECA

Hidrólisis de suero fresco utilizando una proteasautilizando una proteasa

Proteínas del suero lácteo

Hidrólisis (in vitro)Enzimas digestivas:

- tripsinaEnzimas microbianas:

- proteinasa kli i

Péptidos antihipertensivos

- α-quimotripsina - termolisina

Enzima Tampón Tª pHp p

Tripsina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0

Termolisina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0 E/S: 1/20

Quimotripsina Tris-HCl 0,02 M 25 ºC 8,0

Proteinasa K Tris-HCl 0,02 M 37º C 7,5


● TermolisinaTermolisina

∆ Proteinasa k

Tripsina

Q i i i○ α-Quimotripsina

Termolisina y proteinasa k: valores máximos (~50%)

Tripsina: máximo de inhibición a las 24h (52%)

α-Quimotripsina: %IECA < 40%


Análisis in silico PeptideCutter (http: //www expasy ch/tools/peptidecutter) PeptideCutter (http: //www.expasy.ch/tools/peptidecutter)

Determinar el número de sitios potenciales de corte teóricos que podríangenerarse mediante hidrólisis de las proteínas mayoritarias del suero lácteogenerarse mediante hidrólisis de las proteínas mayoritarias del suero lácteobovino (α-La y la β-Lg) con las 4 proteasas

Proteína del lactosueroProteasa

Proteína del lactosueroα-La β-Lg

α-Quimotripsina 37 10Tripsina 12 18

Proteinasa K 61 84Termolisina 41 61

H l í i t t t l t ti d l t li i l ECA l Homología existente entre los centros activos de la termolisina y la ECA en los que únicamente encajan péptidos pequeños y carentes de estructura

tridimensional


Análisis in silico PeptideCutter (http: //www expasy ch/tools/peptidecutter) PeptideCutter (http: //www.expasy.ch/tools/peptidecutter)

Determinar el número de sitios potenciales de corte teóricos que podríangenerarse mediante hidrólisis de las proteínas mayoritarias del suero lácteo

Proteína del lactosuero

generarse mediante hidrólisis de las proteínas mayoritarias del suero lácteobovino (α-La y la β-Lg) con las 4 proteasas

ProteasaProteína del lactosueroα-La β-Lg

α-Quimotripsina 37 10Tripsina 12 18

Proteinasa K 61 84Termolisina 41 61

Hidrólisis de suero pretratado térmicamentetérmicamente

Los tratamientos térmicos moderados tienden a aumentar la susceptibilidad delas proteínas a la hidrólisis enzimática particularmente en las proteínas séricaslas proteínas a la hidrólisis enzimática, particularmente en las proteínas séricas(muy compactas y estructuradas)

Una combinación adecuada de la proteasa y del tratamiento previo del suero puedeser un factor clave para obtener hidrolizados con ↑ actividad

Estudiar la influencia de un pretratamiento térmico del suero lácteo sobre la producción de inhibidores de la ECAproducción de inhibidores de la ECA

Hidrólisis de suero pretratado térmicamente


térmicamente

Tratamiento térmico 70ºC – 60 min

Hidrólisis (in vitro)Enzimas digestivas:

- tripsinaEnzimas microbianas:

- proteinasa kli i


α-quimotripsina - termolisina



Termolisina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0 E/S: 1/20

Quimotripsina Tris-HCl 0,02 M 25 ºC 8,0

Proteinasa K Tris-HCl 0,02 M 37º C 7,5

Hidrólisis de suero pretratado térmicamentetérmicamenteTratado (70ºC/1h) Sin tratar

Conformaciones glóbulo fundido: estructura terciaria poco definida g pquedando expuestas al medio zonas hidrófobas, que en el estado nativo de la

proteína quedaban ocultas en el interior


Valores máximos: termolisina

Valores mínimos: α-quimotripsina


El tratamiento térmico del suero no ofrecía ninguna mejora g jsignificativa cara lograr hidrolizados con mejores propiedades como

inhibidores de la ECA

Efecto de la relación E/S sobre la hidrólisis del suero


la hidrólisis del suero

Hidrólisis (in vitro)Enzimas digestivas:- tripsina

Enzimas microbianas:- proteinasa k

li i


- tripsina - termolisina

Enzima Tampón Tª pHE/S 1/5

p p


Termolisina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M 37º C 8,0

E/S: 1/5

E/S: 1/20

E/S: 1/100Proteinasa K Tris-HCl 0,02 M 37º C 7,5

/ /

Efecto de la relación E/S sobre la hidrólisis del suerola hidrólisis del suero

1/5

1/201/20

1/100

Muy sensible a la variación de la relaciónMuy sensible a la variación de la relaciónE/S

Efecto de la relación E/S sobre la hidrólisis del suerola hidrólisis del suero

1/5

1/201/20

1/100

Los valores de inhibición obtenidos con E/S de Los valores de inhibición obtenidos con E/S de 1/100 igualan a las concentraciones más altas

Un aumento de [proteasa] en el medio de Un aumento de [proteasa] en el medio de reacción no implica un aumento de la

actividad inhibitoria de la ECA

Futuros ensayos: 1/100

Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisinautilizando termolisina

El pretratamiento térmico (60ºC/1 h) sólo permitió mejorar la producción deinhibidores de la ECA a tiempos cortos de hidrólisis cuando se utilizó termolisinainhibidores de la ECA a tiempos cortos de hidrólisis cuando se utilizó termolisina

Las proteínas lácteas se renaturalizan durante el proceso de proteólisis (37ºC)

Realizar el proceso de hidrólisis a ↑ Tas , de tal modo que se integrasen el proceso de desnaturalización parcial y la proteólisis enzimática

Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisina


utilizando termolisina

Hidrólisis (in vitro) TERMOLISINA(termoestable)


(termoestable)


Termolisina Tris-HCl 0,02 M-CaCl2 0,01 M

37º C

50ºC

60ºC8,0 E/S: 1/100

70ºC


50ºC37ºC 60ºC 70ºC

A 37ºC %IECA ctes.



65%65%

A 24 h 60 y 70ºC% IECA similaresA 24 h 60 y 70 C

IECA ↓

Termolisina se inactiva porque ↓ su

estabilidad estabilidad



↓ En menor medida ↓ En menor medida que a 60 0 70ºC

Estabilidad de la termolisina

comprometida por las comprometida por las ↑Tas

Efecto de la Tª de hidrólisis utilizando termolisinautilizando termolisina¿Estabilidad de la termolisina comprometida?¿Estabilidad de la termolisina comprometida?

termolisina termolisina E/S: 1/1003h 6h

/ /

60ºC

%IECA = 69,5% %IECA = 60%

La estabilidad de la termolisina disminuye tras 3 h a 60ºC

La producción de péptidos inhibidores de la ECA no se mejora mediante di ió d d i di i l d l iadición de una dosis adicional de la enzima



je


ti



iv


os

Determinación de los valores ICIC50

ÚÚnicamente los hidrolizados que producían porcentajes de inhibición de la ECA máselevados

2 hidrolizados obtenidos con termolisina a 60ºC (relación E/S: 1/100)

3 h

doble adición de termolisina (9 h)

Con fines comparativos

Suero fresco

Captopril

Soluciones de [proteína] decreciente %IECA


No es posible una extrapolación directa

de la IC50

Ajustar los resultados Ajustar los resultados experimentales a

diferentes modelos matemáticos


Modelo logístico modificado por Murado et al., (2007) :g p

con

K: inhibición máxima aparente (%).

D: dosis (µg/mL o µM)

µ: velocidad específica de inhibición aparente (mL/µg o L/µmol)µ: velocidad específica de inhibición aparente (mL/µg o L/µmol)

m: IC50 aparente (µg/mL o µM).

IC50: concentración inhibitoria real (µg/mL o µM)


Combinación de enzimas Sustrato Variables ā ± DE t p r2

- Suero

K 58,78 ± 1,46 40,23 <0,0001

0,9841µ 0,0005 ± 0,00003 13,75 <0,0001M 5030,13 ± 127,38 39,49 <0,0001

IC50 (µg/mL) 5430,91K 90 95 ± 7 50 12 12 <0 0001

- Captopril

K 90,95 ± 7,50 12,12 <0,0001

0,9640µ 16,43 ± 1,21 13,57 <0,0001M 0,026 ± 0,010 2,61 0,0099

IC50 (µM) 0,08

T li iK 89,32 ± 8,66 10,31 <0,0001

0 0007 ± 0 0001 6 55 <0 0001Termolisina(3 h) Suero 0,8768µ 0,0007 ± 0,0001 6,55 <0,0001

M 1827,36 ± 318,10 5,74 <0,0001IC50 (µg/mL) 2541,26

Termolisina+ Suero

K 64,96 ± 9,71 6,69 <0,0001

0 9124µ 0,0030 ± 0,0006 5,04 <0,0001Termolisina

(9 h)

Suero 0,9124M 334,86 ± 102,70 3,26 0,0018IC50 (µg/mL) 549,54

Valores significativos (p < 0,05)


Errores experimentales

r2 = 0,984 r2 = 0,964r 0,984 r 0,964-Barras de error en

cada pto de muestreo

E l d - Empleo de un sustrato sensible a la

precipitación y/o agregación

r2 = 0,877 r2 = 0,912g g


IC50 = 5431 µg/mL IC50 = 0,08 µg/mL50 543 µg/ 50 , µg/

IC50 captopril << IC50 suero

IC50 = 2541 µg/mL IC50 = 550 µg/mL50 54 µg/ IC50 550 µg/mL

IC50 78,35% inferior


Resultados alentadores ya que permiten:

Reciclaje e incorporación del suero lácteo, en un proceso de

Resultados alentadores ya que permiten:

j p , pproducción, evitándose así las desventajas, que su vertimiento en los

sistemas ecológicos podrían producir

Obtención de hidrolizados proteicos con actividad inhibidora de la ECA, pque se pueden incorporar en alimentos funcionales

Conclusiones

1) Se puso a punto un método para determinar la actividad de la ECA utilizandocomo sustrato FA-PGG, optimizando la concentración de sustrato y de la enzimaen el medio de reacción.en el medio de reacción.

2) Se comprobó que los hidrolizados de suero lácteo con termolisina y proteinasa Kpresentaban mayor actividad inhibitoria de la ECA que los hidrolizados de

i i d i i i Ad á d i ó i dtripsina y de α-quimotripsina. Además se determinó que cortos tiempos dehidrólisis eran suficientes para obtener péptidos inhibidores de la ECA. La rapidezde acción unida a la especificidad hacia aminoácidos hidrófobos pudo serresponsable de la superior eficacia de las proteasas de origen microbiano.responsable de la superior eficacia de las proteasas de origen microbiano.

3) Un tratamiento térmico del suero, previo a la proteólisis, no ofrecía ningunamejora significativa en la producción de péptidos inhibidores de la ECA. Sin

b l ili li i li d l j lembargo, al utilizar termolisina como catalizador, se lograron mejorar losporcentajes de inhibición al aumentar la temperatura del proceso de proteólisishasta 60-70ºC.

Conclusiones

4) Se caracterizaron dos hidrolizados de suero lácteo obtenidos contermolisina mediante cálculo de la concentración proteica necesaria paratermolisina mediante cálculo de la concentración proteica necesaria parainhibir el 50% de la actividad de la ECA (IC50). Los valores de inhibiciónobtenidos a distintas concentraciones de proteína se ajustaron a una curvadosis-respuesta aplicando distintos modelos matemáticos. Los mejoresp p jajustes se obtuvieron aplicando un modelo logístico modificado porMurado et al. (2007).

5) Se comprobó que la sola utilización de termolisina durante 3 h producía5) Se comprobó que la sola utilización de termolisina durante 3 h producíaun hidrolizado con una IC50 de 2,54 mg/mL, que se reducía 5 vecescuando se realizaba una doble adición de termolisina (0,55 mg/mL). Estevalor aunque superior al del inhibidor comercial captopril (0,17 μg/mL),q p p p μgera inferior al del suero fresco sin tratar (5,5 mg/mL).

CC

Producción de péptidos con acción antihipertensiva a partir de sueros de quesería

Natalia Estévez TelleUniversidad de Vigo

Antecedentes: Experiencia previa:Fermentación de suero desproteinizado con gránulos de kéfir

Entrenamiento de Andrea Pataro, licenciada procedente del CIDCA y miembro de la red Red Iberoamericana 108RT0362 del Área de

MATERIA PRIMA: Suero dulce obtenido de la quesería Prado de Lugo, España.

miembro de la red Red Iberoamericana 108RT0362 del Área de agroalimentación del CYTED

COMPOSICIÓN:Lactosa: 34.7 g/LAzúcares reductores: 24.8 g/LAzúcares reductores: 24.8 g/LProteínas: 11.5 g/LpH inicial: 4.86

CONDICIONES DE CULTIVOCONDICIONES DE CULTIVO:

Medio de cultivo: Suero dulce, desproteinizadoTemperatura: 30ºCpAgitación: 200 rpmpH inicial: 6.5Tiempo fermentación: 80 horasI ó l 1 L l h f t d 0 5 K fiInóculo: 1 mL leche fermentada y 0.5 g KefirFermentador: Matraces de 250 mL de capacidad conteniendo 50 mL de medio decultivo

Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado congránulos de kéfir. Primeros resultados

5

6

7

1.0

1.5

3

4

5

0.5

1 5

2.0 9

2 0

Cinética de la f t ió d SLDdP

0.5

1.0

1.5

3

6 fermentación de SLDdP ( ) y leche ( ) con gránulos de kéfir.

45

60

0

4

0

15

302

00 20 40 60 80

Horas

00 20 40 60 80 1000 20 40 60 80

Horas

Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado tamponado, con gránulos de kéfir

5

6

1.10

1.65

Cinética de la fermentación del SLDdP

3

40.55

fermentación del SLDdP y tamponado a pH inicial de 6.5 con tampón biftalato-sosa 3 0

4.0 6

2 0

p(0.1 M), con gránulos de kéfir.

1.0

2.0

3.0

2

4

24

32

0

4

0

8

16

24

2

00 20 40 60 80

Horas

00 20 40 60 80 100

Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado congránulos de kéfir

Optimización de la composición del suero lácteo tamponado a pH inicial de 6.5 contampón biftalato sosa.

Fuente de N (extracto de carne, peptona bacteriológica y extracto de levadura) y

Tabla 1 Dominio experimental y valores utilizados en el plan ortogonal ensayado

( , p p g y ) y

Fósforo: K2HPO4

Tabla 1. Dominio experimental y valores utilizados en el plan ortogonal ensayadopara estudiar la influencia de las fuentes de N y P sobre la producción desustancias antimicrobianas y el crecimiento de los gránulos sobre suero lácteodesproteinizado y tamponado a pH inicial de 6.5.p y p p

Valores Codificados Valores Naturales

Fuente N (g/L) Fuente P (g/L)

-1.267 0.00 0.00

-1 2.32 0.21

0 11.01 1.00

1 19 70 1 791 19.70 1.79

1.267 22.00 2.00

Antecedentes: Optimización: Resultados

Antecedentes: Resultados del plan factorial. Modelos

11.. CrecimientoCrecimiento deldel gránulogránulo (PSG(PSG enen g)g)::11.. CrecimientoCrecimiento deldel gránulogránulo (PSG(PSG enen g)g)::

PSG = 0.046 + 0.008*N + 0.006*P – 0.002*N*P – 0.006*N2 – 0.005*P2

Óptimos: N = 0.528 (18.79 g/L) y P = 0.487 (1.38 g/L), Ymax = 0.05 g

2 Producción de Acido Láctico (AL en g/L):2 Producción de Acido Láctico (AL en g/L):2. Producción de Acido Láctico (AL en g/L):2. Producción de Acido Láctico (AL en g/L):

[AL] = 5.66 + 0.53*N + 0.53*P – 0.55*P^2

Óptimos: N = 1.267 (22.00 g/L) y P = 0.47 (1.37 g/L), ALmax = 6.5 g/L

Producción de Ácido acético (AA en g/L):Producción de Ácido acético (AA en g/L):

[AA] = 22.06 + 1.76*N + 2.77*P – 6.91*N^2 (2)[ ] ( )

Óptimos: N = 0.127 (12.12 g/L) y P = 1.267 (2.00 g/L), AAmax = 25.7 g/L

[N]media = 17.64 g/L; [P]media = 1.58 g/L

Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado congránulos de kéfir. Efecto de la agitación y la aereación

Efecto de la agitación y la aireación (T = 30ºC; t = 80 h)

Series Vol. Matraz(mL)

Vol. Suero (mL)

Inóculo Agitación (rpm)

1 250 50, pH 6.5 0.5 g kéfir 1 mL lechefermentada

200

2 250 100, pH 6.5 1.0 g kéfir 2 mL lechefermentada

0 a 24hs: 20024 a 48 hs: 0

48 a 72hs: 20072 a 96hs: 0

3 150 90, pH 6.5 0.9 g kéfir 1.8 mL lechef t d

0

fermentada

Antecedentes: Fermentación de suero desproteinizado congránulos de kéfir. Resultados

6

7

3

4

5

1.0

1.5

4

6

8

3

Serie 1

32

0

0.5

0

2

4 Serie 1Serie 2Serie 3

8

16

24

32

9

18

27

0

8

0 20 40 60 80Horas

0

9

0 20 40 60 80 100

Rafaela 2.ppt [Modo de compatibilidad] - inti.gob.ar · Rafaela, 2010. Introducción Piensos...

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