Radicales Libres y Estres Oxidativo

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Al fotocopiar este libro, el autor y el editor dejan de percibir lo que corresponde a lainversión que ha realizado y se desalienta la creación de nuevas obras. Rechacecualquier ejemplar “pirata” o fotocopia ilegal de este libro, pues de lo contrarioestará contribuyendo al lucro de quienes se aprovechan ilegítimamente del esfuer-zo del autor y del editor.

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DRA. MINA KONIGSBERG FAINSTEIN

Profesora titular C.Responsable del Laboratorio de Bioenergética

y Envejecimiento Celular, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma

Metropolitana, unidad Iztapalapa, México, D.F.

Editor responsable:DDrr.. MMaarrttíínn MMaarrttíínneezz MMoorreennoo

Editorial El Manual Moderno

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Radicales libres y estrés oxidativo.Aplicaciones médicasD.R. © 2008 por Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V.ISBN-10: 970-729-321-7ISBN-13: 978-970-729-321-2ISBN: 978-607-448-150-1 Versión Electrónica

Miembro de la Cámara Nacionalde la Industria Editorial Mexicana, Reg. núm. 39

Todos los derechos reservados. Ninguna parte deesta publicación puede ser reproducida, almacenadaen sistema alguno de tarjetas perforadas o transmitidapor otro medio —electrónico, mecánico, fotocopiador,registrador, etcétera— sin permiso previo por escritode la Editorial.

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Director editorial:Dr. Alfredo R. Boyd Filós

Editora asociada:Lic. Vanessa B. Torres Rodríguez

Coordinador de diseño:Esteban Gutiérrez Hernández

Diseño de portada:D.G. Jorge Alberto Muñoz Manzo

Konigsberg Fainstein, Mina.Radicales libres y estrés oxidativo : aplicaciones médicas /

Mina Konigsberg Fainstein. — México : Editorial El ManualModerno, 2008.

xxiv, 623 p. : il. ; 23 cm.Incluye índiceISBN 978-970-729-321-2

1. Radicales libres (Química). 2. Radicales libres (Química)– Patofisiología. 3. Estrés oxidativo – Patofisiología. 4. Antioxi-dantes – Mecanismo de acción. I. t.

616.07 KON.r. Biblioteca Nacional de México

CCOOLLAABBOORRAADDOORREESS

DDrraa.. BBeeaattrriizz AAgguuiillaarr--MMaallddoonnaaddooTécnico Académico Titular A, Departamento de Neurociencias, Instituto deFisiología Celular, UNAM, México, D.F.

DDrr.. HHééccttoorr BBoouurrggeess RRooddrríígguueezzDirector de Nutrición, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Sal-vador Zubirán, México, D.F.

DDrr.. AAllbbeerrttoo BBoovveerriissInvestigador Superior de CONICET. Profesor Titular de Fisicoquímica, Facultadde Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

DDrr.. AAlleejjaannddrroo DD.. BBoovveerriissFacultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

DDrraa.. LLeettiicciiaa BBuucciioo OOrrttiizzProfesor Titular C, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autóno-ma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.

MM.. eenn CC.. BBeeaattrriizz BBuueenntteelllloo VVoollaanntteeEstudiante de Doctorado, Departamento de Ciencias de la Salud, UniversidadAutónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.

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MM.. eenn CC.. NNooeemmíí CCáárrddeennaass--RRooddrríígguueezzDepartamento de Biología, Facultad de Química, UNAM, México, D.F.

DDrr.. LLuuiiss FF.. CCoovvaarrrruubbiiaass RRoobblleessInvestigador Titular C, TC Definitivo. Jefe del Laboratorio de Degeneración yRegeneración Tisular del Departamento de Genética del Desarrollo y FisiologíaMolecular, Instituto de Biotecnología, UNAM, México, D.F.

MMeedd.. GGiinn.. DDrraa.. BBeeaattrriizz CCuueevvaass BBaahheennaa DDeeiiddrryyMédico Ginecoobstetra, Servicio de Ginecología y Obstetricia, Centro de Espe-cialidades Médicas “Sinaí”, Zacatepec, Mor. México.

DDrraa.. AAnnddrreeaa MM..GG.. DDee VViizzccaayyaa RRuuiizzInvestigadora Titular 3A, Sección Externa de Toxicología, CINVESTAV-Zacaten-co, México, D.F.

DDrraa.. LLuuzz MMaarrííaa ddeell RRaazzoo Investigadora Titular, Sección Externa de Toxicología, CINVESTAV-Zacatenco,México, D.F.

MM.. eenn CC.. FFeerrnnaannddoo DDííaazz ddee LLeeóónn SSáánncchheezzProfesor Titular C, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autóno-ma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.

DDrr.. RRaaffaaeell DDííaazz SSoobbaaccProfesor-Investigador, Instituto de Ciencias Básicas, Programa de Maestría enCiencias Alimentarias, y Director de la Facultad de QFB. Universidad Veracruza-na, Veracruz, Ver. México.

MM.. eenn CC.. BBllaannccaa FFaarrffáánn LLaabboonnnneeEstudiante de Doctorado, Departamento de Ciencias de la Salud, UniversidadAutónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.

DDrraa.. SSaannddrraa FFeerrnnaannddeess AArrrruuddaaInstituto de Ciencias Biológicas, Departamento de Biología Celular, Laboratoriode Biofísica, Universidad de Brasilia, Brasil.

DDrr.. JJoosséé CC.. FFeerrnnáánnddeezz--CChheeccaaProfesor de Investigación, Consejo Superior de Investigaciones Científicas(CSIC), Universidad de Barcelona, España.

VI • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

DDrr.. JJoosséé CCaarrllooss GGaarrccííaaInvestigador Titular. Académico Titular de la Academia de Ciencias de Cuba,Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas, Universidad Médica de La Haba-na, Cuba.

DDrraa.. CCaarrmmeenn GGaarrccííaa--RRuuiizzCientífico Titular, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Uni-versidad de Barcelona, España.

DDrraa.. EErriikkaa OOlliivviiaa GGóómmeezz GGoonnzzáálleezzDepartamento de Bioquímica, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutri-ción Salvador Zubirán, México, D.F.

DDrr.. LLuuiiss EE.. GGóómmeezz QQuuiirroozzProfesor Titular, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad AutónomaMetropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.

DDrraa.. MMaa.. CCoonncceeppcciióónn GGuuttiiéérrrreezz RRuuiizzProfesora Titular C. Responsable del Laboratorio de Fisiología Celular y Coordi-nadora Divisional de Posgrado, Universidad Autónoma Metropolitana, UnidadIztapalapa, México, D.F.

DDrr.. WWiillhheellmm HHaannssbbeerrgg TToorrrreessInvestigador Titular C, Departamento de Bioquímica, Jefe de Laboratorio, Insti-tuto de Fisiología Celular, UNAM, México, D.F.

DDrraa.. EElliizzaabbeetthh HHeerrnnáánnddeezz PPéérreezzProfesora Titular C. Jefa del Área de Bioquímica y Fisiología Celular, Departa-mento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, UnidadIztapalapa, México, D.F.

DDrraa.. MMaarrííaa ddee JJeessúúss IIbbaarrrraa SSáánncchheezzDepartamento de Bioquímica, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutri-ción Salvador Zubirán, México, D.F.

DDrr.. JJoosseepp MMaarriiaa LLlluuiiss DDuuqquueezzInvestigador Asociado, Departamento de Hepatología, Hospital Clínico de Bar-celona, Universidad de Barcelona, España.

Colaboradores • VII

DDrraa.. NNoorrmmaa EE.. LLóóppeezz--DDiiaazzgguueerrrreerrooProfesora Titular B, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autóno-ma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.

DDrraa.. RReebbeeccaa LLóóppeezz MMaarruurreeInvestigador Titular, Departamento de Fisiología, Instituto Nacional de Cardiolo-gía “Ignacio Chávez, México, D.F.

DDrr.. EEggllee MMaacchhaaddoo ddee AAllmmeeiiddaa SSiiqquueeiirraaInstituto de Ciencias Biológicas, Departamento de Biología Celular, Laboratoriode Biofísica, Universidad de Brasilia, Brasil.

DDrr.. MMaarrcceelloo HHeerrmmeess LLiimmaaInvestigador CNPq 2A, Grupo de Pesquisa em Radicais de Oxigênio (GPRO).Departamento de Biología Celular, Universidad de Brasilia, Brasil.

DDrraa.. HHeelleennaa GGeennnnaarrii MMeeddeeiirrooss MMaarriissaaProfesor Titular, Grupo de Pesquisa: Radicais livres e lesões em biomoléculas. Ins-tituto de Química, Universidad de Sao Pablo, Brasil.

MM.. eenn CC.. OOmmaarr NNooee MMeeddiinnaa--CCaammppoossTécnico Titular B, TC, Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM,México, D.F.

DDrraa.. GGrraacciieellaa MMeezzaaInvestigador Titular C, Departamento de Neurociencias, Instituto de FisiologíaCelular, UNAM, México, D.F.

DDrraa.. MMaarrííaa ddeell PPiillaarr MMiillkkee GGaarrccííaaCoordinadora de Investigación y Servicio Social en Nutrición, Departamento deGastroenterología. Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición SalvadorZubirán, México, D.F.

DDrr.. LLuuiiss DD.. MMiirraannddaa GGuuttiiéérrrreezzInvestigador Titular, Departamento de Síntesis Orgánica. Instituto de Química,UNAM, México, D.F.

DDrr.. AAllbbeerrtt MMoorraalleess MMuuññoozzInvestigador Asociado, Departamento de Hepatología, Hospital Clínico de Bar-celona/IDIBAPS, España.

VIII • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

MM.. eenn CC.. MMaarriissooll OOrroozzccoo--IIbbaarrrraaEstudiante de Doctorado en Ciencias Bioquímicas, Departamento de Biología,Facultad de Química, UNAM, México, D.F.

MM.. eenn CC.. AAnnaaddiiaa OOssoorriiaa PPéérreezzInvestigador Agregado, Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas, UniversidadMédica de La Habana, Cuba.

DDrr.. JJoosséé PPeeddrraazzaa--CChhaavveerrrrííProfesor Titular, T.C., Departamento de Biología, Facultad de Química, UNAM,México, D.F.

DDrr.. LLeeoonnaarrddoo PPeerraazzaa RReeyyeessDepartamento de Bioquímica, Instituto de Fisiología Celular, México. Adscrip-ción actual: Investigador Posdoctoral en Institut de Génétique et Microbiologie,Francia.

MM.. eenn CC.. NNááyyaaddee PPeerreeiirraa RRoocchheeInvestigador Agregado, Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas, UniversidadMédica de La Habana, Cuba.

DDrraa.. LLaauurraa JJ.. PPéérreezz FFlloorreessProfesor Titular C, Responsable del Laboratorio de Fisiología Vegetal, Jefa delDepartamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana,Unidad Iztapalapa, México, D.F.

DDrraa.. EEvvaa PPhhiilliippppAlfred-Wegener, Profesor Asociado, Instituto de Investigación Polar y Marina,Alemania.

DDrr.. EEnnrriiqquuee PPiiññaaProfesor Emérito de Carrera, Departamento de Bioquímica, Facultad de Medici-na, UNAM, México, D.F.

DDrraa.. GGaabbrriieellllaa RR.. RRaammooss--VVaassccoonncceelloossAnsiva, Brasilia, Brasil.

DDrr.. FFéélliixx RReecciillllaass TTaarrggaaInvestigador Titular. Jefe de Laboratorio, Departamento de Genética Molecular,Instituto de Fisiología Celular, UNAM, México, D.F.

Colaboradores • IX

DDrraa.. MMaarriissaa GG.. RReeppeettttooFacultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

DDrr.. FFeerrnnaannddoo RRiivveerraa CCaabbrreerraaProfesor Titular, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad AutónomaMetropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.

DDrraa.. RRooccííoo SSaallcceeddaa SSaaccaanneelllleessInvestigador Titular C, TC, Profesor de Asignatura B. Jefe de Laboratorio, Depar-tamento de Neurociencias, Instituto de Fisiología Celular, UNAM, México, D.F.

DDrraa.. YYoollaannddaa SSaallddaaññaa BBaallmmoorrííProfesor Asociado C, TC, Definitivo. Presidenta de la Sociedad Mexicana de Pro-fesores de Bioquímica. Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medici-na, UNAM, México, D.F.

DDrr.. AAbbeell SSaannttaammaarrííaa ddeell ÁÁnnggeellInvestigador en Ciencias Médicas E, TC, Responsable del Laboratorio de Amino-ácidos Excitadores, Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía ManuelVelasco Suárez, México, D.F.

DDrraa.. VVeerróónniiccaa SSoouuzzaa AArrrrooyyooProfesor Titular C, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad Autóno-ma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, México, D.F.

DDrraa.. LLaauurraa BB.. VVaallddéézzFacultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

MM.. eenn CC.. JJoosséé LLuuiiss VVeennttuurraa GGaalllleeggoossTécnico Académico, Departamento de Medicina Genómica y ToxicologíaAmbiental, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM.

DDrr.. AAlleexxiiss FF.. WWeellkkeerrProfesor Asociado, Alfred-Wegener, Instituto de Investigación Polar y Marina,Alemania.

DDrraa.. MMaarrtthhaa ZZeenntteellllaa ddee PPiiññaaProfesor Titular B, TC, Definitivo, Departamento de Bioquímica, Facultad deMedicina, UNAM, México, D.F.

X • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

DDrr.. AAlleejjaannddrroo ZZeenntteellllaa DDeehheessaaInvestigador Titular, Departamento Medicina Genómica y Toxicología Ambien-tal, Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. Investigador en CienciasMedicas, Jefe del Departamento de Bioquímica, Instituto Nacional de CienciasMédicas y Nutrición Salvador Zubirán, México, D.F.

DDrraa.. TTaanniiaa ZZeenntteennoo SSaavviinnInvestigador Titular A, Programa de Planeación Ambiental y Conservación, Coor-dinadora de la Comisión de Ética y Co-coordinadora del Programa de Acerca-miento de la Ciencia a la Educación (PACE), Centro de InvestigacionesBiológicas del Noroeste (CIBNOR), La Paz, BCS, México.

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Colaboradores • XI

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CCOONNTTEENNIIDDOO

Agradecimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XVII

Prólogo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XIX

Breve introducción histórica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . XXI

Sección I. Química de los radicales libres1. Química de los radicales libres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

Sección II. El dioxígeno y sus especies reactivas2. El dioxígeno y sus especies reactivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Sección III. Orígenes de las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno

3. Cadena respiratoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 494. Sistemas microsomales de monooxigenasas, citocromo P450 . . . . . . . . . 615. NADPH oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 736. Xantina oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

Sección IV. Daño a blancos celulares7. Daño a proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 978. Daño al DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1199. Daño a lípidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

XIV • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

10. Concepto epigenético y sus alteraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

Sección V. Antioxidantes11. Superóxido dismutasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16912. Catalasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18313. Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20114. Tiorredoxinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21915. Hemooxigenasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23316. Glutatión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25317. Potencial antioxidante de los carotenoides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26918. Potencial antioxidante del ácido ascórbico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27919. Potencial antioxidante de los α-tocoferoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29120. Polifenoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303

Sección VI. Estrés oxidativo21. Concepto de estrés oxidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 319

Sección VII. Especies reactivas y enfermedades22. Hipoxia/reperfusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33123. ERO y cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34724. Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas . . . . . . . . . . . . . . 35925. Daño oxidativo y enfermedades hepáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37726. Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda . . . . . . . . 39527. ERO y disfunción endotelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41528. El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído . . . . . . . . . . . . . . . . 42329. Estrés oxidativo y retinopatías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43530. ERO, envejecimiento y senescencia celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44731. Daño oxidativo y enfermedades crónico-degenerativas asociadas a la contaminación ambiental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459

Sección VIII. Aspectos fisiológicos relacionados a las especies reactivas

32. ERO y apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47733. ERO y señalización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48734. Especies reactivas de oxígeno en las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50135. Vida animal en ambientes extremos, papel de los radicales libres y los antioxidantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52536. Estrategias para determinar la relevancia fisiológica de las especies reactivas de oxígeno en animales completos . . . . . . . . . . . 543

Contenido • XV

Sección IX. Nutrición37. Aspectos nutriológicos de los carotenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56138. Aspectos nutriológicos de la vitamina C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57939. Aspectos nutriológicos de la vitamina E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59540. Actividad física y estrés oxidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613

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AAGGRRAADDEECCIIMMIIEENNTTOOSS

Quisiera agradecer a la Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa (UAMI),en particular al Departamento de Ciencias de la Salud, así como al CONACYT,que ha apoyado a la mayor parte de los científicos que participamos en este libro,para que pudiéramos adentrarnos e investigar parte de lo que aquí se ha plasmado.

Agradezco a todos los investigadores que accedieron a acompañarme en estaaventura y que escribieron sus capítulos, aun y cuando la publicación de estelibro parecía algo inalcanzable, y a sabiendas de que tal vez nunca verían la luz.Muchas gracias por confiar en mí. En particular al Dr. Wilhelm Hansberg Torres,por todas sus sugerencias.

Asimismo, y de una manera muy especial, agradezco a los alumnos de mi labo-ratorio en la UAMI (Laboratorio de Bioenergética y Envejecimiento Celular), portodo su trabajo y dedicación, así como a los alumnos de la licenciatura en Biolo-gía Experimental, ya que todos ellos han sido el motor que nos estimula para rea-lizar esfuerzos como éste.

Por último, y con todo mi cariño, agradezco a mis padres, a mis hijas Ariela, yLiora, y a mi esposo Samy, por apoyarme, y aguantarme siempre.

Dra. Mina Konigsberg Fainstein

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PPRRÓÓLLOOGGOO

En la actualidad, no existe un libro en español que abarque de una forma clara ycompleta los temas relacionados a los radicales libres, como para que pueda serutilizado por estudiantes de pre y posgrado. De manera que el objetivo del estelibro titulado: Radicales Libres y Estrés Oxidativo. Aplicaciones médicas, esdoble. Por un lado, la idea consiste en tratar de exponer todos los conceptos bási-cos y generales, relacionados con los radicales y el estrés oxidativo, de un modosencillo y didáctico, para que los alumnos que cursan las licenciaturas del área deciencias biológicas y de la salud los entiendan, así como también pueda ser utili-zado como libro de texto o consulta. Por otra parte, el hecho de que los capítu-los fueron escritos por investigadores expertos en sus respectivos campos, es muyenriquecedor, ya que ellos son la gente que está haciendo ciencia en nuestro país,y en América Latina, esto sirve como ejemplo para que los alumnos se den cuen-ta de cómo y dónde se aplican los conocimientos que contienen este tipo delibros de texto.

Un objetivo implícito de este texto, se relaciona con el hecho de que la mayo-ría de los capítulos fueron escritos por científicos mexicanos, lo que permitiríaque en algún momento los alumnos puedan contactar a los investigadores direc-tamente.

Por último, quiero recalcar que el campo de los radicales libres y el estrés oxi-dativo es un área del conocimiento científico que está tomando mucha relevan-

cia en cuanto al esclarecimiento del mecanismo de acción de una gran cantidadde fenómenos fisiológicos, así como de la explicación etiológica de diversas pato-logías. Es por ello que esta obra resultará una herramienta útil para los estudian-tes e investigadores dentro del campo de las ciencias biológicas y de la salud.

Dra. Mina Konigsberg FainsteinIztapalapa, Ciudad de México,

noviembre, 2007

XX • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

BBRREEVVEE IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN

HHIISSTTÓÓRRIICCAA

Ahora sabemos que el superóxido se produce de manera normal en los organis-mos vivos expuestos al aire, pero que al mismo tiempo atenta contra su supervi-vencia. Sabemos que la familia de metaloenzimas llamada superóxido dismutasa(SOD) provee un sistema de defensa esencial y que la deleción de los genes paraestas enzimas puede llevar de fenómenos de mutagénesis dependiente de oxíge-no, auxotrofias nutricionales hasta la muerte. También sabemos que el superóxi-do (O2

•), puede generar toda una progenie de especies reactivas. Por una reacciónde difusión limitada con el óxido nítrico (NO•), el O2

• produce peroxinitrito(ONOO–) que es un fuerte oxidante en sí mismo, el cual se homolisa a NO2 yradical hidroxilo (•OH). El O2

• también oxida a los centros [4Fe-4S], que songrupos prostéticos de deshidrogenasas como la aconitasa, y al hacerlo desestabi-liza la estructura de la enzima liberando Fe(II). Lo cual inactiva a las enzimas,además de que el Fe(II) que se encuentra libre es capaz de reducir al peróxido dehidrógeno (H2O2) generando al anión y al radical hidroxilo (–OH y •OH). Ade-más el O2

• puede iniciar la oxidación de un gran número de reductantes pormecanismos en cadena de radicales libres.

Todo lo anterior y más, es ahora parte del conocimiento bioquímico estableci-do y convencional, sin embargo hace algunos decenios, todo lo anterior se habríaconsiderado como un “cuento de hadas”.

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“¿Cómo abrimos esta ventana en el mundo de la biología de los radicaleslibres? ¿Cómo nos dimos cuenta de estas entidades químicas, que por sus gran-des reactividades tienen tan sólo una efímera vida media y existen sólo a concen-traciones de muy bajo estado estacionario?”

Todo empezó con un interés sobre la acción de la enzima xantina oxidasa que,mientras oxida a sus sustratos verdaderos, puede iniciar la oxidación por radica-les libres del sulfito y producir quimioluminiscencia del luminol y de la lucigeni-na. Posiblemente lo más intrigante de todo, era que la enzima también causaba lareducción del citocromo c de manera dependiente de oxígeno. Esto era sorpren-dente puesto que en teoría, el oxígeno y el citocromo c deberían ser competido-res en aceptar electrones.

Una posible explicación podría haber sido que la reducción del citocromo sellevara a cabo por algún producto de la reducción del oxígeno como por ejemploel peróxido de hidrógeno. Sin embargo, se demostró que el H2O2 no era capaz dereducir al citocromo c. ¿Podría entonces haber un intermediario entre el H2O2 yel oxígeno? Ese intermediario tendría que ser el O2

•, que en ese momento sóloera conocido por los químicos dedicados a las radiaciones.

Mi alumno de posgrado Joe McCord y yo aprendimos cómo preparar una solu-ción estable de superóxido de terbutilamonio en un solvente no proteínico alasistir a un seminario de química. Rápidamente regresamos a nuestro laboratoriodonde realizamos la hidrólisis del bromuro de terbutilamonio en una celda dedos cámaras que tenía un flujo de O2 burbujeando en el compartimiento delcátodo. La solución resultante de la sal del superóxido redujo al citocromo c einició la oxidación de sulfito.

Mientras estudiábamos la reducción del citocromo c por la xantina oxidasaencontramos un potente inhibidor de la reducción del citocromo, pero que almismo tiempo, no inhibía la reacción de la xantina oxidasa. Este inhibidor, quese activaba en varias preparaciones comerciales del citocromo c, era abundanteen eritrocitos, ya que se asilaba a partir de varios litros de sangre bovina. Comoya teníamos a la enzima Cu/ZnSOD, la inhibición de la reducción del citocromoc parecía ser un ensayo conveniente a realizar.

Usando ese ensayo como nuestro guía, en poco tiempo aislamos a las enzimasMnSOD y FeSOD de Escherichia coli y a la MnSOD tetramérica de mitocon-drias de hígado. Las SOD nos permitieron demostrar la participación del O2

• enuna gran variedad de reacciones.

Mientras realizábamos estos trabajos fuimos objeto de innumerables contro-versias. Había personas que no aceptaban que el O2

• se podía formar por acciónde una enzima, y otras que no pensaban que la función real del las SOD pudie-ra ser la eliminación del radical O2

•.Preferían pensar que las SOD eran proteínas almacenadoras de metales que

incidentalmente catalizaban la dismutación del O2•. La persona que logró poner

XXII • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas

término a esta controversia fue Daniele Touati, quien deletó a la SOD de E. coliy reveló las deficiencias fenotípicas dependientes de oxígeno que aparecían enesta cepa, convenciendo de esta manera de su función.

Una búsqueda en la literatura para superóxido dismutasa en 1968 hubieradado como resultado una sola referencia. Una búsqueda similar el día de hoyarroja al menos 47 000 referencias. Claramente hemos aprendido mucho en losdecenios transcurridas y el flujo de nuevos reportes no presenta ningún signo dedetenerse, por lo que vendrán más. Los capítulos de este libro servirán como unaentrada hacia esta absorbente campo del conocimiento.

DR. IRWIN FRIDOVICH

DUKE UNIVERSITY

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Breve introducción histórica • XXIII

SSEECCCCIIÓÓNN II..QQUUÍÍMMIICCAA DDEE LLOOSS RRAADDIICCAALLEESS LLIIBBRREESS

1. Química de los radicales libres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

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QQUUÍÍMMIICCAA DDEE LLOOSS

RRAADDIICCAALLEESS LLIIBBRREESS

Luis D. Miranda

❚ ¿QUÉ ES UN RADICAL LIBRE?

Las moléculas que constituyen las sustancias o los materiales son un conjunto deátomos unidos entre sí por enlaces químicos. La mayor parte de estos enlacesestán constituidos por dos electrones (pares de e–), los cuales mantienen unidosa dichos átomos. Se dice que estos dos electrones están apareados porque cadauno tiene momentos magnéticos opuestos (spin electrónico) que se contrarres-tan. Durante las transformaciones químicas se rompe alguno de los enlaces de lamolécula y da lugar a la formación momentánea de especies intermediarias ines-tables que se transforman rápidamente y producen moléculas diferentes a las departida. Se pueden formar diferentes intermediarios, dependiendo de cómo serompe el enlace. En una fragmentación en donde sólo uno de los productos se lleva consigo todo el par de electrones del enlace que se rompe, se genera loque se conoce como iones, y se dice que la reacción procede a través de una frag-mentación heterolítica (figura 1-1). En este proceso, la especie que se lleva losdos electrones tendrá un electrón de más, y estará cargada negativamente(anión); por el contrario, la especie que se quedó sin el par de electrones tendráun electrón de menos y quedará cargada positivamente (catión) (figura 1-1). Por

❚ 3 ❚

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otro lado, cuando en el transcurso de una reacción química se rompe un enlace,y cada uno de los componentes enlazados se lleva uno de los dos electrones queal principio constituía dicho enlace o par de electrones, se forman radicales libresy se dice que la fragmentación es homolítica (figura 1-1). De esta manera, unrraaddiiccaall lliibbrree se define como un ááttoommoo o ggrruuppoo ddee ááttoommooss qquuee ccoonnttiieennee uunn eelleecc--ttrróónn ddeessaappaarreeaaddoo ddeennttrroo ddee ssuu eessttrruuccttuurraa, es decir, es la existencia de un electrónque no tiene una pareja con spin opuesto dentro de un átomo o grupo de áto-mos. Los radicales libres se representan colocando un punto sobre el símbolo delátomo que contiene al electrón desapareado. En la mayor parte de los casos, estasespecies son entidades altamente reactivas que tienen un tiempo de vida mediamenor de 1 μseg, y que se combinan para generar moléculas más estables. Formal-mente, los radicales libres son especies neutras, lo cual significa que en su estruc-tura electrónica se encuentra el mismo número de electrones y de protones.

❚ HISTORIA DE LOS RADICALES LIBRES

Aunque el término “radical” fue utilizado por Lavoisier desde finales del siglo XVII

y por algunos otros célebres investigadores durante el siglo XVIII, la historia de losradicales libres como intermediarios reactivos se inicia con los experimentos rea-lizados por Gomberg en 1900. Con base en una serie de observaciones realizadaspara la reacción del bromuro de trifenilmetano con plata, Gomberg propuso queel responsable de la coloración amarilla del producto en solución era el radicaltrifenilmetilo. Como era de esperarse, esta teoría fue completamente rechazadapor la comunidad científica de su tiempo. Sin embargo, la evidencia experimen-tal obtenida durante el decenio siguiente fue tan abundante que terminó poraceptarse.

A partir de este descubrimiento, se empezaron a estudiar una gran variedad dereacciones químicas que involucraban la formación de radicales libres. De estamanera, se propusieron mecanismos de reacción, vía radicales libres, para la des-composición de los peróxidos orgánicos (R-O-O-R) utilizados ampliamente en laproducción de polímeros, industria clave durante la Segunda Guerra Mundial.Mediante estos procesos se manufacturaron materiales que no sólo sustituyeron

4 • Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas (Capítulo 1)

A - B

A - B

Fragmentaciónhomolítica

Fragmentaciónheterolítica

A• + B•

A + B

Reacción vía radicales libres

Reacción iónica

FFiigguurraa 11--11.. Fragmentación del enlace covalente.

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Química de los radicales libres • 5

al caucho natural que se utilizaba, sino que permitieron el desarrollo de nuevosmateriales.

Muchas de las observaciones realizadas hasta el decenio de 1960-1969 apun-taban a que los radicales libres eran especies de muy alta energía que reacciona-ban indiscriminadamente en una reacción y que eran imposibles de controlar. Deaquí nació el mito de los radicales libres salvajes y peligrosos. Sin embargo, duran-te el periodo entre 1950 y 1979, los fisicoquímico orgánicos hicieron grandesavances en la determinación de las constantes de rapidez de un gran número dereacciones radicales, lo cual derivó en una mejor comprensión del comporta-miento de estas especies en el transcurso de una reacción. Estas investigacionesfueron aceleradas por el desarrollo de nuevas técnicas espectroscópicas para iden-tificar los compuestos orgánicos. El desarrollo de la resonancia de spin electrónico(EPR, por sus siglas en inglés) ayudó a confirmar de manera precisa la presenciade radicales libres no sólo en reacciones típicamente orgánicas, sino que confir-mó su presencia en un número considerable de procesos biológicos y atmosféri-cos. En ese tiempo, los investigadores empezaron a estudiar la descomposición de las grasas, aceites y algunos otros alimentos en presencia de oxígeno (procesos deautooxidación). De esta manera, se determinó que estos procesos involucranreacciones de radicales libres que se pueden retardar mediante la adición de cier-tas sustancias que atrapan radicales; de ahí surgió lo que ahora se conoce comoantioxidantes, que ayudan en la conservación de cierto tipo de alimentos.

A partir del decenio de 1970-79, se desarrolló un número importante de reac-ciones, y empezaron a aparecer las primeras aplicaciones sintéticas, inicialmentepara preparar moléculas pequeñas, y poco a poco para moléculas más complejas.En la actualidad, la química de radicales libres es un campo muy prolífero entodas sus facetas. Estas reacciones forman parte ya de las herramientas que unquímico orgánico tiene para transformar una molécula.

❚ GENERACIÓN DE RADICALES LIBRES

Un radical libre se forma cuando un enlace se fragmenta homolíticamente, paralo cual se debe suministrar la suficiente energía para disociar el enlace. Existencuatro maneras de suministrar dicha energía: térmica, fotoquímica, radioquímicay por una reacción de oxidorreducción.

Calor

R-O-O-R

Peróxidos

2-R-O•

FFiigguurraa 11--22.. Disociación de los peróxidos.

Térmica

Para lograr romper la mayor parte de los enlaces covalentes y obtener radicaleslibres, es necesario exponerlo a temperaturas mayores a 800 °C. Esto hace pen-sar que una fragmentación térmica no sería práctica para la generación de radi-cales libres en un laboratorio experimental. Se puede decir que para que unareacción sea práctica experimentalmente debería realizarse al menos por debajode los 200 °C. Para que un enlace se fragmente a estas temperaturas deberá tenereenneerrggííaass ddee ddiissoocciiaacciióónn mmeennoorreess ddee 3300 a 4400 kkccaall//mmooll.. Existen algunos enlacescovalentes muy específicos que se disocian dentro de este rango de energías, entreellos se encuentran los compuestos azo (adecuadamente sustituidos), peróxidos,ésteres de nitrito, y algunos ésteres de N-hidroxi-2-tiopiridona (figura 1-2).

Fotoquímica

La energía de la luz de una longitud de onda entre 600 y 300 nm es de aproxi-madamente 48 a 96 kcal/mol, la cual es del orden de magnitud de las energías dedisociación de los enlaces covalentes. Este rango de energía cae en la región de laluz ultravioleta, por lo que se puede utilizar irradiación de esta frecuencia parafragmentar ciertos enlaces y generar radicales libres. Por ejemplo, las moléculasde halógeno como la de cloro y algunos compuestos carbonílicos se pueden frag-mentar irradiando con luz ultravioleta (figura 1-3).

Oxidorreducción

Una reacción de oxidación o reducción puede generar radicales mediante latransferencia de un solo electrón. En una primera etapa, la transferencia de unelectrón produce un radical cargado, es decir, radicales cationes [R-X]+• o radica-les aniones [R-X]•, según sea el caso de una pérdida o la ganancia de un electrón,respectivamente (figura 1-4). Estas especies no son estables y se fragmentan


Cl-Cl

9

R R RR•

O O

+

2 Cl•

10

•

hv

hv

FFiigguurraa 11--33.. Fragmentación por radiación con luz UV.

espontáneamente a un radical R• y a un anión X– o catión X+. Un ejemplo típi-co de estas reacciones es la descomposición de los peróxidos en presencia de unasal de Fe (II) o Cu (I) (figura 1-4). En este caso, el peróxido R-O-O-R reduce alhierro (II) y forma un radical-anión [R-O-O-R]• que se fragmenta al radical alco-xicarbonilo R-O• y el alcóxido R-O–.

Radioquímica

En la mayor parte de lo casos en que la radiación γ incide sobre una sustanciaorgánica, induce fragmentación de enlaces, que generalmente producen radicaleslibres.

ESTRUCTURA

Los radicales libres se representan colocando un punto sobre el símbolo delátomo o grupo de átomos donde se encuentra el electrón desapareado. Sinembargo, queda la pregunta: ¿Cómo es realmente un radical libre? ¿Cómo es laestructura real de estas especies? ¿Cuál es la imagen asociada a la fórmula que seescribe en el cuaderno o que se ve en un libro cuando se representa un radicallibre? No hay que perder de vista que lo que se escribe o se dibuja generalmen-te sólo son símbolos de un lenguaje que representan moléculas o procesos quí-micos reales. Como ejemplo, se analizará la configuración del átomo de carbonocuando se encuentra como radical libre, observando que tiene siete electrones en©

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R-X R• + X+

R-OR-O• +

R• + X-R-X

R-X

R-X

R-O-O-R + Fe(II) + Fe(III)

+e-

-e- +

-

•

•

R-O-O-R•-

FFiigguurraa 11--44.. Ejemplo de reacciones de oxidación y de reducción.

su capa de valencia con sólo tres sustituyentes. En realidad, existen dos posiblesestructuras electrónicas para esta especie (figura 1-5). En la primera de ellas, elcarbono tiene una hibridación sp2, por lo que el radical se encuentra en un orbi-tal atómico p. La segunda posibilidad es cuando el carbono adopta una hibrida-ción sp3, por lo que el radical necesariamente se encuentra en un orbital híbridosp3. El carbono piramidal generado de esta configuración sufre inversión rápida-mente. Algunos cálculos teóricos realizados para radicales sencillos señalan que ladiferencia de energía entre estas dos estructuras es muy pequeña, por lo que elcarbono puede adoptar cualquiera de las dos sin un costo energético significativo.

Una de las consecuencias más importantes de este comportamiento es la for-mación eficaz de radicales en estructuras rígidas como los biciclos. De esta mane-ra, se pueden formar radicales en los carbonos llamados “cabeza de puente” deuna variedad de biciclos; por ejemplo, el radical de norbornano y de adamantanoque se muestran en la figura 1-6. En estas moléculas es claro que debido a la rigi-dez en la estructura, es casi imposible que el carbono radical adopte una confor-mación trigonal plana, y sin embargo el radical se forma sin problemas.

Como se muestra en la figura 1-7, también se pueden generar radicales endobles y triples ligaduras, en los cuales el electrón desapareado está, ya sea en un


Orbital p atómico Orbital híbrido Radical etilo Radical trifluorometilo

Carbono Sp2 trigonal plano

Carbono Sp3 piramidal

Radical alquilo sin gruposelectronegativos

Radical alquilo con gruposelectronegativos

H3CF

FF

FFiigguurraa 11--55.. Distintas estructuras electrónicas para el átomo de carbono.

Radical del Norbornano Radical del Adamantano

FFiigguurraa 11--66.. Estructuras de los radicales norbonano y adamantano.

orbital sp2 o sp, según sea el caso. Para radicales sobre dobles ligaduras puedenexistir radicales vinilo (enlace C=C), o bien fenilo cuando están sobre un sistemaaromático e incluso acilo o iminilo cuando se encuentran en el carbono de unenlace doble C=O o C=N, respectivamente. Como se muestra en la figura 1-7,los radicales vinilo pueden sufrir inversión, por lo que la configuración cis/transde la doble ligadura original se pierde durante la formación del radical. Cabemencionar que se pueden generar también radicales centrados sobre una granvariedad de átomos, entre los más importantes destacan los radicales centradossobre oxígeno, nitrógeno y azufre. De manera general, estos radicales son muchomás reactivos que los radicales centrados sobre carbono.

❚ ESTABILIDAD

Existen principalmente dos efectos que determinan la estabilidad termodinámi-ca de un intermediario reactivo (catión, anión o radical libre): los eeffeeccttooss ppoollaarreessy los eeffeeccttooss ddee rreessoonnaanncciiaa o ccoonnjjuuggaacciióónn..

Los efectos polares o mejor conocidos como efectos inductivos, están determi-nados por la diferencia de electronegatividad entre los átomos que forman un

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R-C C•

C C•

R — N•

R — O•R — S•

Radical alquinilo

R

R1

R1

R2R3

R3 R3

Radical vinilo

R1

R2R3

R1

R2

R3

Estructura del radical vinilo

Radical acilo Radical aminilo Radical aminiloRadical alcoxilo Radical tiilo

O

• •

N

FFiigguurraa 11--77.. Inversiones de los radicales vinilo.

enlace. Es decir, están directamente relacionados con la atracción que puedantener los átomos o grupos funcionales por los electrones (polarización de losenlaces). Desde esta perspectiva, los sustituyentes de una especie o intermedia-rio reactivo se clasifican como electrodonadores o electroatractores. Para interme-diarios que tienen una carga real, cationes y aniones, el efecto es determinante. Porejemplo, un carbocatión con deficiencia de carga será más estable teniendo comovecino a un grupo electrodonador, pero mucho menos estable cuando tiene devecino a un grupo electroatractor. En contraste, es difícil pensar que los efectosinductivos afectan de manera significativa la estabilidad de un radical libre. Porsu naturaleza neutra (mismo número de electrones que de protones), el radicalno se ve muy afectado por la presencia de grupos electrodonadores o electro-atractores.

Los efectos de resonancia o conjugación se observan cuando existe la posibili-dad del ttrraassllaappee ddeell oorrbbiittaall del átomo donde se localiza la especie reactiva (el car-banión, el carbocatión o el radical libre) con otro orbital de un átomo vecino. Losefectos de conjugación permiten explicar mejor la estabilidad de los radicaleslibres. Por ejemplo, un radical vecino a una doble ligadura (radical alilo) es rela-tivamente más estables que un radical alquilo simple, ya que en el primer casoexiste la posibilidad de traslape entre el orbital que contiene el electrón desapa-reado y los orbitales π. El traslape de estos dos orbitales da lugar al fenómeno lla-mado deslocalización del radical, y es lo que en realidad confiere estabilidadadicional a la especie. El término deslocalizar significa que el electrón desapa-reado se reparte en más de un átomo de la molécula y no se centra sólo en el quelo tenía. De esta manera, no tiene que soportar al electrón desapareado uno solode los átomos; cuando sucede esto, se dice que el radical está estabilizado por des-localización.

❚ CARÁCTER NEUTRO DE LOS RADICALES LIBRES

Por definición, los radicales libres son neutros, lo cual significa que tienen elmismo número de protones que de electrones. Esta característica le da a los radi-cales libres una serie de propiedades químicas únicas. Entre las más importantesque se pueden mencionar están:

1. Un radical puede reaccionar con otro radical.2. Un radical no se ve afectado por su ambiente molecular; en otras palabras,

no le afecta el cambio de polaridad de los disolventes.3. Los radicales no se solvatan (es decir, no se rodean de moléculas de disol-

vente cuando están en solución), por lo que son entidades puntuales (máspequeñas).


4. Un radical no reacciona con hidrógenos ácidos ni con heteroátomos conpares de electrones no compartidos.

5. Un carbocatión no reacciona con otro carbocatión, de hecho, se repelenelectrostáticamente, lo mismo sucede con los carbaniones; debido a sucarga formal, un carbocatión y un carbanión son muy influenciados por lapolaridad de los disolventes, son especies mucho más voluminosas, ya queno pueden estar sin su esfera de solvatación; los carbaniones reaccionan conhidrógenos ácidos, y los carbocationes con grupos funcionales con pares deelectrones no compartidos. Como consecuencia, cuando se realiza unareacción iónica, en la mayor parte de los casos se deben proteger ciertosgrupos funcionales para que no se vean afectados durante la reacción.

6. En las reacciones vía radicales libres no son necesarias protecciones de gru-pos funcionales. Una consecuencia directa de la neutralidad de los radicaleses que su estabilidad no se ve afectada por la electronegatividad de los gru-pos funcionales adyacentes al centro radical. Un radical libre con un grupoelectroatractor adyacente puede ser tan estable como aquel que posee un

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Grupo electroatractor

O

R3

R

O

R3

NR2NR2

R

R

RC C

• •

• •

Radicalelectrofílico

•O

R3

R3

R2

R2

R

•

Radical establepor resonancia

H

Traslape

R

R

R

Par de electrones libres

NR2

R

RC•

Grupo electrodonador

Radicalnucleofílico

Electrónica

Radical establepor resonancia

•• • • •••

• • •

FFiigguurraa 11--88.. Estructuras de resonancia y esquema de traslape de los orbitales en los radicales libres.

CH 4 + Br 2 CH 3 Br + CH 2 Br 2 + CHBr 3 + CBr 4

FFiigguurraa 11--99.. Reacción de halogenación (bromación) del metano.

grupo electrodonador como vecino. En la figura 1-8 se pueden observar lasestructuras de resonancia y el esquema del traslape de los orbitales deambos casos.

7. Un radical libre sí es afectado en su manera de reaccionar por los grupos alos que está unido, es decir, la electronegatividad de los grupos funcionalesvecinos afecta la reactividad de un radical, pero no su estabilidad. Los gru-pos adyacentes dan un cierto carácter electrofílico o nuclefílico a un radi-cal libre. Un radical que tiene un grupo carbonilo vecino es estabilizado porresonancia, como se muestra en la figura 1-8, y tiene un carácter electrofí-lico por la electronegatividad de dicho grupo. Este radical reacciona másrápido con dobles ligaduras ricas en electrones que con las que son defi-cientes de electrones. En el caso contrario, en que el radical está cerca deun grupo electrodonador, como lo es una amina, el radical es estabilizadopor conjugación del orbital que alberga al electrón con el orbital del par deelectrones no compartido del nitrógeno. Este radical tiene un carácternucleofílico y, por tanto, reacciona más rápido con dobles ligaduras defi-cientes de densidad electrónica.

❚ MECANISMO EN CADENA

La mayor parte de las reacciones de radicales libres proceden o se llevan a caboa través de un mecanismo en cadena. Un mecanismo en cadena es aquel en elcual ssee ggeenneerraa mmááss ddee uunnaa mmoollééccuullaa ddee pprroodduuccttoo ppoorr ccaaddaa eevveennttoo ddee iinniicciioo.. Unareacción en cadena se compone de tres etapas principalmente; inicio, propaga-ción y terminación. Para esquematizar este mecanismo se tomará como ejemplo


Br - Brfragmentación

homolítica2 Br•

FFiigguurraa 11--1100.. Reacción de iniciación.

Br • H-CH 3

Br - Br

HBr + CH 3

CH 3 Br + Br • CH 3

•

•

FFiigguurraa 11--1111.. Reacción de propagación.

la reacción de halogenación del metano (CH4). Esta reacción produce una mez-cla de productos polihalogenados, como se ve en la figura 1-9.

Etapa de inicio

Es la primera reacción que toma lugar en el proceso, y es cuando se generan losprimeros radicales libres a partir de moléculas estables. El inicio puede ser indu-cido por cualquiera de las formas mencionadas antes: térmica, fotoquímica,radioquímica o por oxidorreducción. En el caso de la bromación del metano, laetapa de inicio es la fragmentación del bromo inducida con luz ultravioleta queproduce radicales bromo (Br•) (figura 1-10).

Etapa de propagación

En estas reacciones, un nuevo radical se genera a expensas de otro, de tal mane-ra que no se pierde en ningún momento el carácter radical y el proceso continúa(figura 1-11). Puede haber más de una etapa de propagación de diferente natu-raleza cada una. Como se puede observar, el producto de halogenación se formaen esta etapa. Dado que el radical bromo se está regenerando cada vez que seforma una molécula de producto, la cadena puede seguir transformado al meta-no sin necesidad de otro evento de inicio. La cadena continuará hasta que elmetano escasee o hasta que la misma cadena se rompa por un evento de termi-nación anticipado.

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Br H 3 C – Br CH 3

H 3 C – CH 3CH 3 CH 3 • •

• •

FFiigguurraa 11--1122.. Reacciones de terminación.

R• + R• R – R

FFiigguurraa 11--1133.. Reacción de dimerización.

Etapa de terminación

Mediante estas reacciones se consumen radicales y no se generan nuevos radica-les, por lo que se pierde el carácter radical en el proceso. Normalmente es cuan-do dos radicales reaccionan entre sí y forman moléculas estables. Esto ocurrecuando la materia prima escasea y los radicales tienen la oportunidad de encon-trarse. En un proceso pueden presentarse varias reacciones de terminación dife-rentes (figura 1-12). En la halogenación, dos radicales metilo pueden formar unamolécula de etano, dos radicales de bromo formarán una molécula de bromo oun radical metilo y uno de bromo formará el bromuro de metilo.

Es importante señalar que la reacción de halogenación no sólo genera bromu-ro de metilo, sino una mezcla compleja de todos los productos polihalogenadosposibles. Esto sucede porque, en la medida que la reacción avanza, el radicalbromo tiene la oportunidad no sólo de abstraer un hidrógeno del metano, sinotambién de todos los otros intermediarios formados. Este proceso es parecido alo que sucede durante el mecanismo de lipoperoxidación (capítulo 4).

❚ REACCIONES ELEMENTALES

Dimerización

Una característica esencial de los radicales libres es que pueden reaccionar entreellos y lo pueden hacer de dos maneras. Una de ellas es la reacción de dimerización(figura 1-13).


H 2 C

R 2 R 2

R 1 R 1

R •

C C H

H

•

H

C

FFiigguurraa 11--1155.. Adición de un radical libre a una doble ligadura.

R C

H

•

R 2

CH 2 R C

H

•

R 2

CH 2 + R C

H

R 2

CH 3

R

C R 2

CH 2+

FFiigguurraa 11--1144.. Reacción de desproporción.

En esta reacción, dos radicales idénticos reaccionan entre ellos generando unnuevo enlace por la combinación de los dos electrones desapareados. Con estasreacciones sólo se pueden generar compuestos simétricos.

Desproporción

Otra manera de reacción entre dos radicales es la desproporción (figura 1-14). Eneste proceso dos radicales reaccionan para generar un alcano y una olefina. En rea-lidad, uno de los radicales abstrae un hidrógeno del carbono vecino al carbonoradical de otro radical. El radical que abstrae el átomo de hidrógeno se reduce, y elque lo pierde se oxida, según la definición formal de oxidación y reducción en quí-mica orgánica.

Adición a dobles ligaduras

Una de las reacciones más importantes de los radicales libres es la adición a unaligadura doble. En esta reacción se genera un enlace carbono-carbono. El proce-so es termodinámicamente favorecido cuando el radical se adiciona a un enlacecarbono-carbono, ya que se forma un enlace sigma a expensas de un enlace pimás débil (figura 1-15).

Abstracción

En la mayor parte de los casos, esta reacción sucede cuando la energía de disocia-ción del enlace que se rompe es menor a la del enlace que se forma. Las dos reac-

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R 1 R • X •

R - X + R 1

FFiigguurraa 11--1166.. Reacción de abstracción radical.

R 1 H R • 1

2 3

4

5

R 1H R • 1

2 3

4

5

T r ansposición 1,5 de hidrógeno

FFiigguurraa 11--1177.. Transposición de radicales libres.

ciones de propagación de la halogenación del metano son dos ejemplos típicos deeste tipo de reacción. Los radicales centrados sobre heteroátomos (como el oxí-geno, nitrógeno y halógeno) reaccionan abstrayendo hidrógenos de las moléculasde su alrededor (figura 1-16).

Transposición

La transposición 1,5 de un radical es una reacción característica de los radicaleslibres. En esta reacción el radical migra cinco posiciones a través de una abstrac-ción de un hidrógeno (figura 1-17). Cabe mencionar que las transposiciones 1,2también pueden ocurrir; sin embargo, no son muy comunes. Como se puede anti-cipar, esta reacción es un equilibrio, el cual estará desplazado hacia la formacióndel radical más estable. El equilibrio depende de la capacidad de estabilización deR y R1 para el radical.

β-fragmentación

Las β-fragmentaciones de radicales libres son procesos muy importantes en losprocesos biológicos, ya que a través de ellos se degradan una variedad de molécu-las. En casi todos estos procesos se fragmenta un enlace carbono-carbono, lo cualproduce fragmentos de moléculas más grandes (figura 1-18). Se puede decir queeste proceso es la reacción inversa de una reacción de adición de un radical a unenlace doble. Esta reacción cobra importancia cuando el enlace que se forma esmás fuerte al enlace que se rompe, o bien cuando a través de una fragmentación


R•-1 e–

RNu

R-Nu

FFiigguurraa 11--1199.. Oxidación de un radical libre.

R 1 R 1

X X

R R • + •

FFiigguurraa 11--1188.. Reacción de β-fragmentación radical.

se generan radicales más estables que los de partida. Las fragmentaciones máscomunes suceden cuando el radical inicial está centrado sobre un heteroátomocomo el oxígeno y nitrógeno.

Oxidación

Algunos metales oxidantes como el Fe (III) o Cu (II) pueden oxidar al radical,abstrayendo el electrón convirtiéndolo en un carbocatión (R+). En una secuenciade reacciones este carbocatión puede reaccionar con un nucleófilo y generar pro-ductos de naturaleza variada (R-Nu).

Reducción

Cuando un radical gana un electrón, se dice que se reduce y forma un carbanión(R-). El electrón normalmente proviene de un metal de transición. El carbaniónpuede reaccionar con un nucleófilo y formar el producto final (R-E) (figura 1-20). Como se puede anticipar, las reacciones de oxidación y de reducción sonmuy importantes, ya que en un solo proceso se puede combinar la química de losradicales libres con la química iónica.

❚ APLICACIONES DE LAS REACCIONES DE RADICALES LIBRES

Polimerización

El desarrollo de los polímeros (por lo general llamados plásticos o materiales sin-téticos), fue uno de los adelantos tecnológicos más importantes durante el sigloXX. Estos materiales no sólo reemplazaron al caucho natural que se utilizaba, sinoque multiplicaron exponencialmente sus aplicaciones. Con el desarrollo de lospolímeros, nuevos y variados materiales salieron al mercado; materiales rígidos oflexibles, transparentes u opacos, quebradizos o duros, entre otros. En la actuali-dad se producen miles de toneladas de polímeros por año, de las cuales cerca de75% se manufactura a través de una reacción de polimerización vía radicales©

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R•+1 e–

RE

R-E

FFiigguurraa 11--2200.. Reducción de un radical libre.

libres. Los polímeros más comunes que se producen mediante una reacción radi-cal son el policloruro de vinilo (PVC), muy utilizado en tuberías de agua; polies-tireno, utilizado entre otras cosas para fabricar bolsas y algunas partes deautomóviles, y el polimetilacrilato, utilizado para fabricar micas transparentes(figura 1-21).

En la figura 1-22 se describe el mecanismo mediante el cual transcurre la reac-ción de polimerización del estireno. La primera etapa es la fragmentación de uniniciador que genera los primeros radicales, los cuales reaccionan con una mo-lécula de monómero, que en este caso es el estireno. El nuevo radical se adicionaa otra molécula de estireno y genera un nuevo radical, el cual se adiciona a ladoble ligadura de otro estireno. Este procesos se repite hasta que el estirenoempieza a escasear, cuando ya se han formado cadenas muy largas de monóme-ro al cual que se le llama polímero.


In-Ininiciador In•

In

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X

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Estirteno

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Poliestireno

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FFiigguurraa 11--2222.. Mecanismo de polimerización del estireno vía radicales libres.

Policlorurode vinilo

(PVC)

CC

H

H*

Cl

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Poliestireno Polimetilacrilato

CC

H

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Ph

H*

n

CC

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CO2Me

H*

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FFiigguurraa 11--2211.. Estructuras de los polímeros.

Reacción de Fenton

La reacción de Fenton se conoce desde 1894, y es una de las reacciones de oxi-dación más poderosas que se han descubierto hasta ahora. Esta reacción se utili-za para degradar una variedad de desechos industriales que contienencompuestos orgánicos tóxicos, se utiliza en el tratamiento de aguas residualesprovenientes de las zonas urbanas, se pueden degradar algunos desechos de pes-ticidas, aditivos de madera encontrados en suelos contaminados. La reacciónimplica la oxidación de Fe (II) a Fe (III) mediada por peróxido de hidrógeno. Enla reacción el Fe(II) se regenera constantemente, por lo que se utilizan cantida-des catalíticas de la sal de Fe. Esta reacción fragmenta al peróxido en un iónhidróxido (OH–) y un radical hidroxilo (OH•). Este radical hidroxilo es de muyalta energía, y puede oxidar y fragmentar compuestos orgánicos. En principio, elradical hidroxilo reacciona abstrayendo hidrógenos de los compuestos orgánicos(H-R) y generando radicales alquilo (R•) que pueden sufrir diferentes reacciones,una de ellas es reaccionar con oxígeno molecular y generar peróxidos orgánicosque se fragmenten y generarán nuevos radicales que finalmente llevarán a la frag-

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H 2 O 2 + F e 2+

H 2 O

F e 3+ + OH – + OH •

OH • R • + H-R +

FFiigguurraa 11--2233.. Principales procesos en la reacción de Fenton.

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H H H H H H

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Bu3SnH

AIBN

Hirsuteno

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75

FFiigguurraa 11--2244.. Síntesis del producto natural hirsuteno a través de una reacción de radicales libres.

mentación de la molécula. Las principales ventajas de este proceso es que no pro-duce compuestos orgánicos tóxicos, ya que si la oxidación es completa, todos loscompuestos orgánicos se transforman en CO2 y agua.

Síntesis orgánica

Las reacciones de radicales libres son utilizadas por los químicos orgánicos paramanipular ciertos grupos funcionales o para transformar moléculas simples enmoléculas más complejas. La adición de un radical a una doble o triple ligaduragenera un enlace carbono-carbono, lo cual, desde el punto de vista sintético, esmuy atractivo, y más aún, si la estructura molecular lo permite, se puede formarmás de un enlace en una sola operación sintética. Quizá uno de los ejemplos másemblemáticos de esto es la síntesis del producto natural llamado hhiirrssuutteennoo. Parala construcción de esta molécula, Curran y colaboradores diseñaron una reacciónde radicales libres utilizando como materia prima el yoduro. Se sabe que en pre-sencia de hidruro de tributilestaño y un iniciador como azabisisobutironitrilo(AIBN) se puede generar un radical libre a partir de un yoduro. Una vez forma-do el radical, éste reacciona intramolecularmente sobre la doble ligadura y gene-ra un nuevo radical, el cual queda geométricamente muy cerca del triple enlace.La reacción con la triple ligadura genera el tercer anillo de cinco miembros y unnuevo radical vinílico, el cual, al no tener más instauraciones con las cuales reac-cionar, abstrae un átomo de hidrógeno del hidruro de tributilestaño y genera elhirsuteno. En el proceso se han generado dos enlaces carbono-carbono, lo cual diolugar a la formación del sistema triciclito del hirsuteno.

❚ REFERENCIAS

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SSEECCCCIIÓÓNN IIII..EELL DDIIOOXXÍÍGGEENNOO YY SSUUSS EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASS

2. El dioxígeno y sus especies reactivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

EELL DDIIOOXXÍÍGGEENNOO

YY SSUUSS EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASS

Wilhelm Hansberg Torres

❚ EL DIOXÍGENO

El 21% de nuestra atmósfera es dioxígeno (O2). Prácticamente todo el O2 atmos-férico tiene un origen biológico: es producto de la oxidación del agua que lleva acabo el fotosistema II de las plantas, algas y cianobacterias utilizando la energíaluminosa del sol. Por otro lado, la mayoría de los organismos usan el O2 para res-pirar, esto es, reducen el O2 en agua y la energía de esta reacción, que original-mente provino del sol, la emplean para formar ATP y para transportar iones ymetabolitos a través de las membranas celulares.

Los organismos que realizan la fotosíntesis sólo necesitan para crecer: la luzsolar, el bióxido de carbono y el dinitrógeno (N2) de la atmósfera (en las ciano-bacterias) y agua con algunas sales disueltas, como el nitrato (NO3

––) (en las algasy en las plantas). En cambio, los organismos que respiran requieren de una fuen-te de electrones para reducir el O2. Esta fuente de electrones es la comida. Deahí la gran competencia que hay entre estas especies por la comida, la cual hadado origen a las cadenas alimenticias.

La fotosíntesis oxigénica y la respiración forman un circuito continuo de oxi-dación del agua y reducción del O2. Este ciclo no ha cambiado desde hace millo-

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nes de años. Tampoco la biomasa total de la tierra ha variado. Los que han cam-biado en ese tiempo han sido los organismos que llevan a cabo el ciclo. Lo cualnos permite concluir que el aumento explosivo de la población humana, de losanimales domésticos y otros animales asociados con las actividades del hombreha sido a expensas de otras especies que respiran.

El O2 de la atmósfera reacciona con algunos metales y los oxida, por ejemplo,cuando un objeto de hierro se encuentra expuesto a la humedad, con el tiemposu superficie se torna rugosa y de color café rojizo que es el color del óxido dehierro (Fe2O3) hidratado. Observamos que algunos compuestos orgánicos tam-bién se oxidan, por ejemplo, muchas frutas abiertas cambian de color en contac-to con el aire. De hecho, el O2 se combina con casi cualquier otro elemento pero,en la mayoría de los casos, sólo lo hace a temperaturas elevadas. En su estadobasal y a la temperatura ambiente el O2 no reacciona o lo hace lentamente conotros compuestos.

El O2 es un diradical, es decir, tiene un electrón en cada uno de sus dos orbi-tales de antiunión π*. Debido a sus dos electrones desapareados el O2 es atraídopor un campo magnético, por lo que se dice que es paramagnético. En su estadobasal de energía genera tres señales (un triplete) en un campo magnético. Loselectrones desapareados tienen el mismo giro (spin) pues así, al mantenerse ale-jados uno del otro, reducen la repulsión de sus cargas negativas. Estos electronessólo pueden interaccionar con los electrones de otros elementos y compuestos queestén libres y que tengan el giro opuesto. La razón por la cual el O2 no es muyreactivo a temperatura ambiente se debe a que, en la mayoría de los compuestos,los electrones se encuentran apareados, hay pocos electrones libres y sólo algunosde éstos tienen un giro opuesto a los del oxígeno.

Por otro lado, la solubilidad del O2 en el agua es baja y es más baja mientrasmás sales tenga disueltas el agua y más alta sea su temperatura. La concentracióndel O2 en el agua destilada, en equilibrio con la atmósfera a nivel del mar a 25°C,es de 258 μM. En la sangre arterial la concentración del O2 es de al rededor de130 μM y en la venosa de al rededor de 50 μM; en las células es de ≤ 13 μM yde ≤ 1 μM en la mitocondria. Es decir, hay una diferencia de dos órdenes de mag-nitud entre la concentración del O2 en el sitio de entrada en los pulmones y laconcentración del sitio de consumo en las mitocondrias. Las investigaciones queutilizan cultivos de células frecuentemente no toman en consideración la concen-tración del oxígeno a la que están expuestas las células en condiciones fisiológi-cas. Esto puede influir en los resultados que se obtienen con estas investigaciones.

La solubilidad del O2 es mayor (alrededor de ocho veces) en solventes hidro-fóbicos que en el agua. Las membranas celulares, en donde se lleva a cabo la res-piración, están compuestas por lípidos que conforman un ambiente hidrofóbicoen el cual el O2 es más soluble que en el citosol. Hay que tomar en cuenta quela cantidad de colesterol en la membrana plasmática disminuye la solubilidad del


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El dioxígeno y sus especies reactivas • 27

oxígeno en las mismas, lo cual puede ser un mecanismo de regulación de la per-meabilidad del O2 a las células.

La concentración del O2 en una solución en agitación se puede medir median-te el electrodo de Clark. Este electrodo, recubierto con una membrana de teflónque es permeable al O2, tiene un cátodo de platino que reduce el O2, lo cualinduce una corriente que es proporcional a su concentración. También haymicroorganismos que han sido modificados para que sirvan como sensores deoxígeno cuando éste se encuentra en concentraciones muy bajas. La concentra-ción intracelular del O2 se ha podido determinar con sustancias que cambian sufluorescencia en presencia del O2, generalmente porfirinas, o con compuestosque al reaccionar con el O2 dan una señal característica de resonancia electrónicaparamagnética (EPR; por sus siglas en inglés Electron Paramagnetic Resonance).

Estando en reposo, los humanos consumimos unos 30 g de O2 cada hora, másde 260 Kg al año. Haciendo ejercicio utilizamos hasta diez veces más O2. Entreel 85 y el 90% de ese O2 se emplea en las mitocondrias para formar ATP. En lasmitocondrias se origina aproximadamente el 80% del ATP que requerimos paramantenernos organizados y funcionando. Como el ATP se usa segundos despuésde haber sido sintetizado, se necesita un suministro continuo de O2 y una fuente deelectrones para producir el ATP. El cerebro constituye sólo la quincuagésimaparte de la masa corporal pero emplea la quinta parte del O2, es decir, consumediez veces más O2 que el resto de los órganos y tejidos. Por eso la corteza cere-bral es el primer tejido que resiente la falta de O2 cuando, por ejemplo, el cora-zón deja de bombear suficiente sangre debido a un infarto de miocardio o cuandoun vaso sanguíneo cerebral se bloquea. En esas condiciones la corteza cerebral no puede generar la cantidad de ATP requerida para conservarse funcionando,produce especies de oxígeno reactivas (véase más adelante) y se destruye encuestión de minutos. Esta labilidad de la corteza cerebral a la isquemia conducefrecuentemente a un estado en el cual el individuo ha muerto pero la mayoría desus órganos y tejidos siguen vivos.

La mayoría de los animales y muchos microorganismos aerobios no puedenvivir sin el O2. Otros, en cambio, como las plantas y los microorganismos facul-tativos proliferan en su ausencia. Sin O2 nos morimos debido a que no podemossatisfacer la demanda energética para mantenernos organizados. Pero si bajára-mos la demanda energética ¿podríamos vivir sin oxígeno? La naturaleza ha inven-tado muchas formas de resistencia a diversas condiciones adversas del medioambiente como, por ejemplo, al calor o al frío extremo o a la sequía prolongada.En estas condiciones se induce una vida latente en los organismos que son capa-ces de reducir al mínimo su metabolismo celular. Esporas, esclerocios, quistes ysemillas son ejemplos de vida inanimada o en estado latente. Dentro del reinoanimal, algunos peces, sapos y salamandras tienen la capacidad para bajar sumetabolismo al mínimo y así sobrevivir al estiaje y algunos mamíferos, como las

ardillas del ártico, los osos pardos y los polares, hibernan para sobrevivir el invier-no. En dichas condiciones el ritmo cardíaco y respiratorio es casi imperceptible,la temperatura corporal se mantiene 2 o 3 grados por arriba de la temperaturadel ambiente y el consumo del O2 es muy reducido.

En el gusano Caenorhabditis elegans se ha observado que la anoxia, pero no lahipoxia, induce el estado de resistencia.También, utilizando miméticos del O2, sus-tancias que compiten por los sitios de unión del O2, como el sulfuro de hidrógenoo ácido sulfhídrico (H2S), es posible provocar la anoxia en ratones, suscitándolesun estado inanimado similar al estado de hibernación y del cual se pueden recu-perar sin ningún efecto colateral. Estos experimentos muestran que no es la falta deO2 per se la que nos mata sino el desequilibrio entre la demanda metabólica de O2y un suministro insuficiente del mismo, condición que resulta muy tóxica para lacorteza cerebral. La supervivencia en ausencia del O2 abre la posibilidad para pre-servar por más tiempo los órganos destinados a ser trasplantados.

❚ ¿POR QUÉ ES TÓXICO EL O2?

Por lo general hemos considerado el O2 como sinónimo de vida porque lo nece-sitamos para respirar, pero el O2 puede ser tóxico, nos puede enfermar e inclusomatar. La gran concentración del O2 en la atmósfera y su baja reactividad en con-diciones ambientales ha dado la impresión de que el O2 es inocuo. Así, es comúnque en los hospitales se administre O2 a cualquier paciente, aunque no lo requie-ra y, por supuesto, se cobre por ello. Al recién nacido invariablemente se le aplicaO2 para tornarlo sonrosado cuanto antes, como si no bastara el O2 del aire. Cuan-do se da en exceso perjudica al niño, causándole, por ejemplo, una fibropatíaretrolenticular o problemas respiratorios.

El O2 es tóxico a cualquier concentración. Así, por ejemplo, muchos microor-ganismos se alejan del O2 y se estratifican dentro de un gradiente de O2 según susrequerimientos y capacidades antioxidantes. Las plantas crecen mejor en ausen-cia del O2 debido a que consumen energía con la fotorespiración, la cual no pue-den evitar que ocurra cuando están en presencia del O2. La toxicidad del O2 seaprovecha en el tratamiento de algunos tumores cancerosos suministrando O2 alos pacientes durante su radioterapia, ya que las radiaciones ionizantes son mástóxicas en presencia de una mayor concentración de O2.

La toxicidad del O2 se explica debido a la formación de las especies reactivasdel oxígeno (ERO). Estas especies de O2 son más reactivas que éste en su estadobasal de energía.


❚ LAS ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO

Se consideran ERO al oxígeno atómico (O) y al ozono (O3) que se genera con launión del O al O2, al oxígeno singulete (1O2) que se produce con la excitación deuno de los electrones desapareados del O2 y al superóxido (O2

•), al peróxido de hi-drógeno (H2O2) y al radical hidroxilo (•OH) que son especies parcialmente redu-cidas. También el oxígeno forma compuestos con el nitrógeno y éstos pueden sermás reactivos que el O2 en su estado basal de energía. Estas especies son el monóxi-do de nitrógeno u óxido nítrico (NO•), el dióxido de nitrógeno (NO2

•) y el pero-xinitrito (ONOO–), y se reconocen como especies reactivas del nitrógeno (ERN).

Debido a que la naturaleza ha estado expuesta a las ERO por dos mil millonesde años se han seleccionado mecanismos para contender con ellas y tambiénmecanismos que las utilizan en múltiples funciones. Por eso no hay que conside-rar que las ERO son inevitablemente tóxicas, sino que su toxicidad depende desu concentración y del contexto en el que se producen. En la interacción entre or-ganismos, cualquiera que sea su naturaleza, para matarse o para beneficiarsemutuamente, intervienen las ERO. Bajas concentraciones de ERO estimulan elcrecimiento de las células, incluso de las bacterias y de otros microorganismos. ElH2O2 y el NO•, y posiblemente otras especies reactivas, funcionan como señalesque determinan respuestas fisiológicas de adaptación al medio ambiente. Final-mente las ERO son indispensables para la diferenciación celular y para la muer-te celular programada.

Algunas de las especies de oxígeno reactivas son radicales, esto es, tienen elec-trones desapareados. El O2

•, el NO2• y el •OH son radicales y el O2 es un diradical.

El hecho de ser radical no indica, como se suele suponer, una gran reactividad. Laactividad de los radicales puede variar diez órdenes de magnitud. Así, por ejem-plo, la ubisemiquinona es un radical muy estable y el O2

•, el NO2• y el O2 son

radicales que sólo interaccionan con otros radicales. En cambio, el •OH es una delas especies más reactivas que se conocen. Por otro lado, el 1O2 y el O3 no sonradicales pero son muy oxidantes. En otras palabras, la reactividad es una carac-terística intrínseca de cada especie de oxígeno que no tiene nada que ver con quela especie sea o no un radical.

El ozono

La luz ultravioleta de alta energía (UVC = 250 a 290 nm) y las descargas eléctri-cas rompen los dos enlaces covalentes en la molécula del O2 originando 2 O. Eloxígeno atómico se combina inmediatamente con el O2 para formar el O3. El oxí-geno atómico no se produce en los organismos y por lo tanto no es de interés parala biología.©

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El O3 se encuentra en la estratosfera, donde se genera constantemente porefecto de la luz UVC sobre el O2. La máxima concentración de O3 está a unos 25Km de la superficie terrestre. La absorción de la UVC por el O2 y el O3 de laestratosfera evita que ésta llegue a la superficie terrestre, lo cual hizo posible haceunos dos mil millones de años que la vida se extendiera en el planeta. Como laluz UVC es absorbida por los ácidos nucleicos y los modifica, los organismos pri-migenios no podían sobrevivir expuestos a la luz solar, lo que les impedía la colo-nización de la tierra.

Actualmente nuestro desarrollo tecnológico e industrial ha afectando peligro-samente esta protección natural de la luz UVC. Los fluoro-clorocarbonos soncompuestos gaseosos, sintéticos, muy estables que se utilizan como solventes yrefrigerantes y para hacer espumas y aerosoles. Estos compuestos y otros gaseshalogenados, al llegar a la estratosfera, producen radicales de halógeno que des-truyen el O3 que nos protege. La reacción es catalítica, es decir, el radical de haló-geno reacciona y se regenera continuamente. Se calcula que un radical Cl• escapaz de descomponer 100 000 moléculas de O3; el radical Br• es 10 a 100 vecesmás activo que el de cloro. Aunque se ha logrado limitar el uso de los carbonoshalogenados, la reacción en cadena que se ha generado en la atmósfera tardarávarios decenios en parar. Con el tiempo, el halógeno va formando otros compues-tos menos activos que se van eliminando de la estratosfera, por ejemplo, al disol-verse en pequeñas gotas de agua y regresar a la tierra con la lluvia, la nieve o elgranizo.

El O3 también se produce a nivel de la superficie terrestre por efecto de la luzsobre el NO2

• que se origina con la combustión de la materia orgánica, principal-mente en los automotores. En presencia de algunos hidrocarburos contaminantesdel aire, como el gas de uso doméstico y de la gasolina, el NO2

• se descomponeen NO• y O y este último reacciona con el O2 para formar el O3.

El O3 es un gas irritante, de olor penetrante y color azul. Es mucho más oxi-dante que el O2. En soluciones ácidas es uno de los compuestos más reactivos;sólo el flúor, el O, el 1O2 y el •OH son más oxidantes. El O3 es más estable ensoluciones alcalinas. Así la vida media del O3 es de 2 min en 1 N de NaOH a25°C. El O3 se puede detectar con una solución alcalina de ioduro de potasio yun poco de almidón con lo cual se produce un compuesto azul oscuro. Un méto-do más sensible y específico es medir la pérdida de la fluorescencia de la rodaminaB al reaccionar con el O3 o la quimioluminiscencia que se produce al interaccio-nar el O3 con algunos compuestos como los naftalenos.

El O3 reacciona con los ácidos nucleicos, las proteínas, rompe las olefinas enlos lípidos insaturados, oxida el NAD(P)H, el ácido ascórbico y el ácido úrico.También forma otras especies reactivas como el •OH.

En el aire, a una concentración de más de 0.5 ppm, causa inflamación y muer-te celular en los bronquios y los alveolos pulmonares. Las personas mayores y los


niños resultan más afectados con el O3 del aire que los adultos jóvenes. El O3activa el factor de trascripción NF-κB e induce la enzima superóxido dismutasa(SOD), la NO• sintasa (NOS), la fosfolipasa A2 y el factor α de necrosis tumo-ral en las células pulmonares del ratón. Los ratones transgénicos que sobreexpre-san la SOD (Cu/Zn) no presentan los daños que se observan en los ratonessilvestres cuando son expuestos al O3. Este efecto es debido, en parte, a que nose genera inflamación en el tejido pulmonar de los ratones transgénicos. Las plan-tas también son sensibles al O3, ya que éste entra por los estomas y reacciona conlos compuestos celulares, causando zonas de necrosis y finalmente senescencia de la planta. El ascorbato constituye la defensa principal contra el O3 en las plan-tas. La planta del tabaco Nicotiana tabacum es particularmente sensible al O3 porlo que se ha utilizado como indicador del mismo.

Recientemente se ha publicado que los anticuerpos tiene la capacidad paraformar O3 y que éste contribuye a los microorganismos que invaden nuestroorganismo. Estas publicaciones han causado una gran expectativa y a la vez se hanpuesto en duda. Para producir O3 se requiere una gran energía que difícilmentese puede formar en los organismos. Sin embargo, es posible que los resultadosobtenidos se expliquen con la producción del superóxido. A diferencia del O3, elO2

• se puede formar fácilmente con el O2 y algún aminoácido del anticuerpocomo donador de electrones.

El oxígeno singulete

El 1O2 se origina cuando uno de los dos electrones libres del O2 cambia de giroal captar energía. Teniendo ahora giros opuestos los electrones libres se apareaninmediatamente. Por eso hay dos especies de oxígeno singulete, el 1Σg++, que tienelos dos electrones desapareados pero con giros opuestos, y el 1Δg, en el que estoselectrones se han apareado. El primero decae al estado basal tan rápido que parala biología sólo tiene importancia el segundo. El 1Δg puede decaer al estado basal,emitiendo un fotón a 1 268 nm, o reaccionar con cualquier compuesto, pues el1O2 acepta electrones apareados y libres, sin importar su giro.

Las células tienen varias sustancias coloridas: las flavinas, las porfirinas y susderivados, como las clorofilas y la vitamina B12 (cianocobalamina) y también soncoloridas la vitamina A (retinol), las quinonas y las pterinas. Estos compuestos seexcitan con la luz azul (430 a 490 nm) y con el componente A de la luz ultra-violeta (UVA = 320 a 400 nm) y pueden transferir su energía de excitación al O2y formar así el 1O2.

Los individuos con porfiria acumulan porfirinas inservibles en la piel. Con laluz solar dichas porfirinas producen 1O2 y éste provoca irritación e inflamaciónde la piel y de las encías, que adquieren una coloración café. En estos enfermos©

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hay además un aumento en el desarrollo capilar. Los pacientes con porfiria nece-sitan ingerir carne cruda o sangre para obtener el hemo que requieren para sobre-vivir. El mito de los vampiros posiblemente se originó a partir de estos individuoshirsutos que salían de noche a consumir sangre fresca.

También cuando el jugo del limón cae en la piel, la furocumarina que contie-ne éste genera 1O2 con la luz solar y como consecuencia se produce una manchaoscura en la piel. Esto lo deben tener en cuenta los bañistas que consumen ali-mentos con limón en la playa. Además del limón otras plantas también tienenfurocumarinas (psoralenos) que pueden causar una dermatitis por fotosensibili-zación. El psoraleno, ingerido o untado, seguido de una irradiación con luz UVAse utiliza sin una justificación científica adecuada para tratar el eczema, la pso-riasis y el vitíligo y en ocasiones la alopecia. Las furocumarinas, además de serfotoactivas, son mutágenas porque se intercalan en el DNA e interaccionan conlas timinas. La fotoquimioterapia se usa también para combatir el cáncer de lapiel o tumores que están cerca de la piel o de las mucosas, generalmente utilizan-do derivados porfirínicos sensibles a la luz roja, que es la que más penetra en lapiel. Las fenotiazinas y las tetraciclinas también son compuestos fotoactivos.

La dismutación espontánea del O2• genera 1O2. Asimismo la descomposición

del H2O2, por ejemplo, con el ácido hipocloroso (HOCl) que secretan los leuco-citos neutrófilos y sobre todo con el hipobromoso (HOBr) que producen los leu-cocitos eosinófilos, forma 1O2. También la descomposición de los lipoperóxidospuede generar 1O2. El O2

• al reaccionar con el NO2• origina peroxinitrito que se

descompone en 1O2 y nitrito (2 NO2––). La reacción del O2

• con el H2O2 catali-zada con trazas de hierro (Haber-Weiss) produce 1O2 y el •OH, pero probable-mente esta reacción no ocurre in vivo.

La vida media del 1O2 en el aire seco es de unos 90 μseg, en el agua pura de 3 μseg y en la célula, en la que hay muchos compuestos reducidos, es sólo de0.5 μseg. Por un lado, el 1O2 decae rápidamente y, por el otro, reacciona casiinmediatamente con los compuestos celulares. De ahí que la concentración intra-celular del 1O2 sea muy baja, < 1 nM. En óxido de deuterio o agua deuterada(D2O) la vida media aumenta a 68 μseg y por eso a veces se usa agua deutera-da en un 90% para estudiar los efectos del 1O2 en las células.

El 1O2 se puede detectar por los fotones que emite en el infrarrojo cercano a1 268 nm pero para ello hace falta un equipo caro y sofisticado. Un método sofis-ticado pero menos costoso es utilizar un fotomultiplicador para captar la emisiónde fotones a 634 y 703 nm que ocurre cuando dos moléculas de 1O2 interaccio-nan y decaen al estado basal. Esta quimioluminiscencia de baja intensidad quedepende del O2 es el método ideal para detectar el 1O2 en condiciones in vivo.Sin embargo, las células deben generar suficiente 1O2 para poder captar la emi-sión dimol y también contar con un fotomultiplicador que sea muy sensible a laluz roja. El 1O2 también se puede determinar por EPR utilizando atrapadores


específicos para el 1O2. Un método indirecto es medir una oxidación específicade un compuesto biológico que esté presente en concentraciones adecuadas enla célula.

El 1O2 reacciona con la mayoría de compuestos celulares. El producido fuerade las células interacciona con la membrana plasmática; el producido dentro delas células reacciona con los ácidos nucleicos, las proteínas, los lípidos y los car-bohidratos, muy cerca del sitio en donde se forma. El 1O2 produce endoperóxi-dos con los ácidos grasos poliinsaturados que se descomponen en presencia delhierro formando radicales alcoxilo, contribuyendo así a la propagación de la lipo-peroxidación. El 1O2 interacciona con las bases nitrogenadas de los ácidos nuclei-cos, siendo el producto principal la 8-hidroxiguanina, que se puede detectar enun hidrolizado de DNA. La 8-hidroxiguanina también se puede formar con el•OH. Los cambios en las bases nitrogenadas pueden generar mutaciones cuandose duplica el DNA. Por ejemplo, la 8-hidroxiguanina puede hacer puentes dehidrógeno con una adenina en vez de con una citosina y la 8-hidroxiadenina conuna guanina en vez de con una timina. Con las proteínas el 1O2 produce deriva-dos principalmente del triptofano, de la tirosina, la histidina, la lisina, la metioni-na y la cisteína.

En la célula el 1O2 se desactiva con los carotenos y los tocoferoles que seencuentran en las membranas plasmáticas. El 1O2 reacciona con los plasmalóge-nos y se piensa que la unión vinilo éter de estos fosfolípidos es importante paraproteger las células del 1O2. En el citosol el 1O2 oxida el glutatión y el ascorbato.El 1O2 interacciona también con el hemo de la catalasa sin inactivar la enzima yesta modificación se puede utilizar para detectar el 1O2 intracelular. Con los lípi-dos forma hidroperóxidos. La oxidación del colesterol y de los plasmalógenos seha utilizado también como indicador del 1O2.

Cuando se produce 1O2 dentro de la célula se induce la trascripción de muchosgenes tales como los de las proteínas del choque térmico, el de la hemooxigenasa-1que es la proteína del choque térmico HSP32, los de las proteínas reguladas con laglucosa, el de la colagenasa y los de las proteínas de adhesión celular. El mecanis-mo puede ser a través de la activación de los receptores de citocinas, de algunasproteínas cinasas y de los factores de trascripción como el NF-κB y los AP. Lahemooxigenasa-1 que se induce con el 1O2 utiliza el Fe del hemo y O2 para rom-per el anillo porfirínico y así formar biliverdina, que es antioxidante, y monóxi-do de carbono (CO), que causa una respuesta antiinflamatoria y antiapoptótica.

El superóxido

Cuando el O2 capta un electrón éste se aparea con uno de los dos electroneslibres de los orbitales π* y forma así el O2

•, que es a la vez un anión y un radical.© E

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Como el electrón entra en un orbital antiunión, la doble ligadura del O2 se debi-lita, por lo que la distancia entre los átomos de oxígeno aumenta y correspondeen el O2

• a la de una ligadura y media.El O2

• se produce principalmente en la cadena respiratoria debido a que unaparte de los electrones que pasan por ella es captada por el O2. Esto ocurre prin-cipalmente a nivel de la ubiquinona (coenzima Q). La ubisemiquinona y el ubi-quinol, que se originan al aceptar uno y dos electrones libres respectivamentepueden ceder con facilidad un electrón al O2. Otro sitio desde el cual los electro-nes salen de la cadena respiratoria es el complejo I, NADH deshidrogenasa.Aproximadamente el 0.1% del O2 que se consume en la respiración forma O2

•.Esta cantidad podría parecer poca, pero hay que considerar que en los animalesel consumo de O2 es muy grande. Así, una persona de 70 Kg de peso genera unosdoscientos mililitros de O2

• al día estando en reposo. Con el ejercicio el consu-mo de O2 es mayor y por lo tanto la formación del O2

• aumenta.Otra fuente importante de O2

• es la actividad de las NADPH oxidasas, que tie-nen la función específica de sintetizarlo. También la xantina oxidasa, la lipooxi-genasa y algunas peroxidasas inespecíficas forman O2

•. En el hombre el 3% de suhemoglobina se oxida al día originando O2

• y metahemoglobina. El O2• también

se puede producir en las reacciones de los citocromos P450, que son enzimas queunen hidroxilos a una gran variedad de xenobióticos. Éstos son compuestos extra-ños que se forman en la célula o que entran en ella y que deben ser desechados.También la autooxidación de compuestos como el gliceraldehído o de las flavi-nas reducidas, incluso de algunas flavoproteínas, y la autooxidación de las tetrahi-dropterinas reducidas pueden formar O2

• en presencia del O2. La concentracióndel O2

• en la célula está en el intervalo de pico a nanomolar.Al contrario de lo que se ha divulgado de manera irresponsable, el O2

• es pocoreactivo. Sólo reacciona a una tasa importante con otros radicales: consigo mismo,con el hierro libre o el de los centros hierro-azufre (Fe-S) de varias proteínas, conel NO•, los radicales fenoxilo, las semiquinonas y los quinoles y con los difenoles.Oxida lentamente al glutatión y al ascorbato (105 M-1 seg-1) pero no reaccionacon el NAD(P)H, con las bases nitrogenadas del DNA, con los aminoácidos delas proteínas ni con los lípidos.

El O2• es tóxico para la célula en parte porque a partir de él se puede originar

el 1O2 y el •OH. El 1O2 se forma con la dismutación espontánea del O2•. Al reac-

cionar el O2• con los centros [4Fe–4S] de algunas deshidratasas se libera Fe(II)

que puede producir •OH con el H2O2. Los ácidos nucleicos unen el hierro librey con el H2O2 se forma el •OH que puede modificar una base o romper la cade-na del DNA. Se piensa que ésta es la razón por la cual en las células sin SOD segeneran más mutaciones. Entre las deshidratasas que el O2

• inhibe se encuentranla aconitasa y la fumarasa del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs).La inhibición del metabolismo energético acentúa la toxicidad del O2

•. Asimis-


mo, debido a la salida de un Fe(II) de un centro [4Fe-4S], se inhibe la terceraenzima de la vía de síntesis de la isoleucina, la dihidroxiácido deshidratasa. De lamisma manera se inhibe una transacetolasa, con lo cual no se produce la eritosa-4-P que se requiere para la síntesis de los aminoácidos aromáticos. Además, alinhibir la transacetolasa se sintetiza metilglioxal, que es tóxico. Los aldehidos,como el metilglioxal, son tóxicos porque por tautomerismo forman enolatos queson reactivos. El O2

• cancela también la síntesis de los aminoácidos azufrados, porlo que una bacteria que carece de la actividad de SOD secreta compuestos con azu-fre. En la vía de las pentosas el O2

• inhibe la 6-fosfogluconato deshidrogenasa. Laribonucleósido difosfato reductasa, que produce los desoxiribonucleósidos parala síntesis del DNA, tiene un radical de tirosina en su sitio activo. El O2

• puedereducir el radical tirosilo en tirosina con lo cual la enzima deja de ser activa. Tam-bién el O2

• reacciona con una cisteína del sitio activo de la calcineurina, que esuna proteína fosfatasa importante para la transducción de señales. La inhibiciónde estas dos enzimas es reversible por lo que puede tener una función metabólica.

La eliminación del O2• es a través de las enzimas SOD. La actividad de las

SOD es muy eficiente (109 M-1 seg-1) e independiente del pH. Como el O2• sólo

puede atravesar las membranas celulares como radical hidroperoxilo (OHO2•) o

a través de los poros aniónicos, es posible que se requiera tener una SOD en cadacompartimento celular limitado por una membrana. En las células de mamíferoshay una SOD (Cu/Zn) citosólica y otra extracelular más grande y además unaSOD (Mn) en las mitocondrias. En los hongos la situación es similar pero hay una mayor redundancia de estas enzimas. Incluso las bacterias como E. coli dis-ponen de varias enzimas, una SOD (Cu/Zn) periplasmática y dos SOD intrace-lulares muy parecidas pero que tienen Mn o Fe en el sitio activo. La dismutaciónespontánea del O2

• a pH intracelular ocurre a una tasa tres o cuatro órdenes demagnitud menor que la enzimática. Para ello se requiere que uno de los O2

•

se protone formando el OHO2•. Por eso la velocidad de la reacción es mayor

mientras más ácido sea el medio. Como la reacción ocurre entre un compuestoprotonado y otro sin protón, estrictamente hablando, no es una reacción de dis-mutación.

Las NADPH oxidasas son enzimas de la membrana plasmática que tienen lafunción de producir O2

•. Los electrones del NADPH citosólico se transfieren aun FAD de la enzima y de ahí a dos hemo, que se localizan en un cruce trans-membranal de la proteína. El hemo más externo cede un electrón al O2 extrace-lular produciendo O2

•. El hombre tiene siete NADP oxidasas, NOX 1-5 yDUOX 1-2. Las DUOX presentan un dominio adicional con probable funciónde peroxidasa extracelular. Las DUOX y algunas NOX (NOX5) tienen ademásun dominio intracelular de unión al calcio. De estas enzimas, la NOX2 (gp91phox) de los neutrófilos ha sido la más estudiada. Esto se debe a que los pacien-tes con enfermedad granulomatosa crónica carecen de esta actividad, por lo que©

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no pueden destruir a las bacterias que invaden el organismo, y sucumben concualquier infección. Las NADPH oxidasas se encuentran en la mayoría de loseucariotas y éstos generalmente tienen más de una.

La función de estas enzimas, además de la inmunológica, está relacionada conlas vías de señalización, como la de RAS, de MAP cinasas, de JAK-STAT y tam-bién con la activación del factor de trascripción NF-κB. Asimismo las NADPHoxidasas se requieren para el crecimiento apical, por ejemplo, del hongo endofíti-co Epichloë festucae en un pasto perenne y también para el crecimiento del peloradicular de Arabidopsis thaliana. Finalmente, estas enzimas se han asociado conlos procesos de diferenciación y de muerte celulares.Así, las NADPH oxidasas sonindispensables para algunos procesos de esporulación en Aspergillus nidulans, N.crassa y Podospora anserina, para la esporulación del amibozoa Dictyostelium dis-coideum, para endurecer la pared celular de los apresorios de los hongos fitopató-genos, para entrecruzar las proteínas de la matriz extracelular del gusano C.elegans, para confinar en las plantas la apoptosis al sitio de infección de un micro-organismo y para la formación de los otolitos vestibulares en los ratones.

El O2• se puede detectar por la reducción del citocromo c o de las sales de

tetrazolio. Al reducirse el citocromo c se torna de color púrpura y el tetrazolioreducido se polimeriza dando un formazán insoluble de color azul oscuro. Tam-bién hay sales de tetrazolio que producen derivados coloridos solubles. Estasreacciones no son específicas del O2

•. El citocromo c también se puede reducircon el glutatión o el ascorbato y el tetrazolio con el NO• y el ONOO––. Por esose debe verificar que la producción del color se inhiba con la SOD. Más especi-fica es la luminiscencia que se produce al reaccionar el O2

• con la lucigenina. Sinembargo, la lucigenina se regenera formando a la vez O2

• por lo que hay unasobreestimación del mismo. Con el EPR se pueden medir los derivados específi-cos de sustancias (como el DMPO) que reaccionan con el O2

•. El O2• no se

detecta con los compuestos de fluoresceína o de rodamina.

El peróxido de hidrógeno

El H2O2 o agua oxigenada se forma cuando cada uno de los dos electrones libresdel O2 se han apareado con un electrón de giro contrario. Como estos electronesentraron en los orbitales antiunión, en el H2O2 las dos ligaduras del O2 se hanreducido a una. El H2O2 es un líquido similar al agua aunque más denso y másviscoso. Es un ácido débil y como base es 106 veces más débil que el agua. Tieneun momento dipolar y una constante dielécrica mayor que el agua, por lo queforma más puentes de hidrógeno y es un mejor disolvente de solutos polares. Sinembargo, a concentraciones por arriba de 70% es explosivo, así que se usa dilui-do en agua (al 30% o menos).


La reacción de las SOD produce la mayor parte del H2O2 en las células. Tam-bién proviene de la actividad de algunas oxidasas, como las de xantina, de aminoá-cidos, de hexosas y de fenoles, entre otras. La concentración intracelular del H2O2va desde pico a micromolar, dependiendo del organismo y del tejido. En el cris-talino del ojo de los mamíferos puede alcanzar 100 μM en las condiciones en quese generan las cataratas.

El H2O2 se puede difundir a través de los compartimentos celulares, aunquetambién puede formar aductos con algunos carbohidratos, aminoácidos y basesnitrogenadas. En Saccharomyces cerevisiae la permeabilidad del H2O2 disminu-ye con la inclusión del ergosterol en la membrana plasmática. El H2O2 reaccionapoco con el ascorbato y con algunos cetoácidos como el piruvato o el α-cetoglu-tarato. Es aún menos reactivo que el O2

• y no interacciona con los compuestoscomo el NAD(P)H, los ácidos nucleicos, los aminoácidos de las proteínas, salvoalgunos tioles particularmente reactivos, ni con los lípidos, incluso a concentra-ciones milimolares.

No obstante, el H2O2 es tóxico a concentraciones intracelulares por arriba de1 μM debido, en parte, a que puede formar 1O2 y •OH. La toxicidad del H2O2se debe principalmente a la reacción con algunos metales de transición con losque se produce el radical •OH. El hierro se puede unir de manera inespecífica alas proteínas y a los ácidos nucleicos y con el H2O2 generar el •OH. El •OH inte-racciona en el sitio donde se forma con lo que ocasiona modificaciones irreversi-bles en las proteínas y alteraciones en el DNA, las cuales no siempre se puedenreparar. El H2O2 reacciona también con el hierro del hemo y de los centros Fe-Sde algunas proteínas y al liberar el hierro se produce el •OH. La descomposicióndel H2O2 con el HOCl o el HOBr genera 1O2.

Se han seleccionado varias maneras para eliminar el H2O2. Las catalasas mono-funcionales dismutan el H2O2 en O2 y H2O y lo hacen con una gran eficiencia.Las hemoperoxidasas reducen el H2O2 en H2O utilizando dos electrones sumi-nistrados por agentes reductores que pueden donar uno o dos electrones. Lasperoxirredoxinas desechan el H2O2 y otros peróxidos a través de un sistema deoxido/reducción de grupos tioles y lo mismo hacen las glutatión peroxidasas.

Las hemoperoxidasas no son un grupo monofilético sino que representan tresgrupos de enzimas diferentes que convergen en su función, la superfamilia dehemoperoxidasas animales, la de las hemoperoxidasas de plantas, hongos y pro-cariotas y un grupo menor de haloperoxidasas. Las catalasas-peroxidasas, quederivaron de una hemoperoxidasa de plantas, hongos y procariotas, son enzimascapaces de llevar a cabo eficientemente tanto la reacción de catalasa como la deperoxidasa. Se han encontrado haloperoxidasas en algunos hongos, en líquenes yen algas que tienen un vanadato unido covalentemente a una histidina en el sitioactivo. También algunas bacterias anaerobias tienen catalasa pero, para que laenzima sea activa, deben importar el hemo, ya que estos microorganismos no©

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pueden sintetizarlo. Algunos anaerobios tienen además una seudocatalasa queutiliza dos átomos de Mn en su centro catalítico.

Como el H2O2 es una fuente de 1O2 y del •OH, los organismos presentan unagran redundancia de enzimas que desechan el H2O2 y que funcionan a diferentesconcentraciones del mismo. Las enzimas menos eficientes son las peroxirredoxi-nas y las más eficientes son las catalasas; las primeras operan a concentracionesnano o micromolares y las segundas a concentraciones milimolares de H2O2. Lasperoxidasas tienen una eficiencia intermedia y funcionan a concentraciones in-termedias de H2O2. La Km para el H2O2 puede variar cuatro órdenes de magni-tud entre las peroxirredoxinas y las catalasas.

El H2O2 reacciona con la cisteína del sitio activo de algunas enzimas, como lagliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa o la fructosa-1,6-difosfato fosfatasa delcloroplasto. La unión de varios activadores con sus receptores específicos, comola unión de la insulina con su receptor, genera H2O2 y éste reacciona con unacisteína del sitio activo de algunas fosfatasas, inhibiéndolas de manera transito-ria. Como las fosfatasas son cien veces más activas que las cinasas se requiereinhibir las primeras para que ocurra la fosforilación de las vías de transducciónde señales. Es posible que la actividad de muchas otras proteínas también seregule a través de la oxidación reversible de las cisteínas o de las metioninas.

El H2O2 también se emplea en otras funciones muy importantes como en lasíntesis de la hormona tiroidea y en la maduración y capacitación de los esper-matozoides, así como en la formación de la envoltura de fertilización de los ovo-citos fecundados en algunos animales. Utilizando el H2O2 como sustrato lamieloperoxidasa en las células fagocíticas forma HOCl y la bromoperoxidasa delos eosinófilos produce HOBr. Es posible que el HOCl y el HOBr contribuyana oxidar algunos compuestos de los microorganismos fagocitados. En las plantasel H2O2 se usa para la formación de la lignina y para el entrecruzamiento de loscomponentes de la pared celular en los sitios de invasión de los microorganis-mos. En el gusano C. elegans el H2O2, que proviene de una DUOX, se utilizapara rigidizar la matriz extracelular.

El H2O2 se puede detectar con una peroxidasa y un sustrato que dé un pro-ducto colorido o con fluorescencia diferente. Los sustratos más empleados son laescopoletina, la fluoresceína y la benzidina y sus derivados y también el rojofenol, entre otros. Es importante tomar en consideración que las peroxidasasaceptan varios sustratos por lo cual la determinación del H2O2 se puede subesti-mar. Por otro lado el ensayo no debe tener catalasa u otras enzimas que consu-man H2O2. El H2O2 también se puede determinar con una mezcla de Fe(II) ytiocianato. El H2O2 oxida el Fe(II) en Fe(III) y éste produce con el tiocianato uncompuesto azul. El diacetato de diclorofluoresceína se ha utilizado para medir elH2O2 intracelular. Este compuesto entra a las células en donde pierde los aceta-tos por lo cual ya no puede salir de ellas con facilidad. Al ser reducido por una


peroxidasa se forma un producto fluorescente. Sin embargo, hay que considerarque la reacción del ONOO–– y del •OH con la fluoresceína es más rápida que lareacción de peroxidasa. Por eso, el diacetato de diclorofluoresceína se puede usarcomo indicador cualitativo de una tensión oxidante pero de ninguna manera paramedir el H2O2 intracelular.

El radical hidroxilo y los metales de transición

Tanto el O2• como el H2O2 son compuestos que interaccionan poco con los com-

puestos celulares. Sin embargo, ambos son tóxicos, en parte, porque generan 1O2y •OH. Cuando el H2O2 acepta un electrón desapareado, por ejemplo, de unmetal de transición como el Fe(II) o el Cu(I) entonces se fragmenta y forma el•OH y el ión hidroxilo OH–– (reacción de Fenton). Este último se protona paraformar agua y el •OH interacciona con cualquier compuesto vecino. La reaccióndel O2

• con el H2O2 catalizada con el hierro (Haber-Weiss) equivale a la estimu-lación de la reacción de Fenton con el O2

•, ya que éste funciona para reducir elFe(III) en Fe(II) (1.5 x 108 M-1 seg-1). Esta reacción posiblemente no ocurre invivo, pues hay otros compuestos reductores en la célula, como el glutatión, queestán en mucho mayor concentración que el O2

• y que pueden reducir el Fe(III).El •OH es uno de los compuestos más reactivos que existen. El •OH no se

puede difundir porque interacciona rápidamente (109 M-1 seg-1) casi con cual-quier compuesto celular. La urea es uno de los pocos compuestos con los que el•OH reacciona menos rápido (105 M-1 seg-1).

El •OH puede oxidar tanto las purinas como las pirimidinas y también la deso-xiribosa. Además puede producir rupturas en el DNA. El daño en el DNA sedetermina midiendo la cantidad de sitios apurínicos, las rupturas en una hebra ola 8-hidroxiguanina en un hidrolizado del DNA.

La mayoría de los daños irreversibles en las proteínas son causados por el •OH.El •OH reacciona con cualquier aminoácido en el sitio donde se origina, que gene-ralmente son sitios en donde se encuentra un metal de transición. Así la glutami-na sintetasa de N. crassa se inactiva cuando es oxidada por un •OH que se producepor la reacción del H2O2 con un Fe(II) unido a la enzima. En el mismo organis-mo, la glutamato deshidrogenasa dependiente del NADPH se inactiva cuando esoxidada por un •OH que se genera en la reacción del H2O2 con un Fe(II) unidoa un dicarboxilato en el sitio alostérico. La cantidad de proteína oxidada se puedemedir determinando los carbonilos que se forman por la oxidación de la prolinay de la arginina en semialdehido de glutamato y también por las rupturas de lascadenas peptídicas. Los carbonilos de las proteínas purificadas se detectan por laformación de la base de Schiff con la difenilhidrazina. El •OH reacciona con lafenilalanina produciendo primero un radical tirosilo y luego la dihidroxifenilala-©

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nina; dos radicales tirosilo pueden formar una ditirosina entre dos polipéptidos.Así, otra manera de medir la oxidación de proteínas es determinando la cantidadde ditirosinas en las proteínas.

Los ácidos grasos poliinsaturados son más susceptibles a la oxidación con el•OH que los saturados y los monoinsaturados. Esto se debe a que los metilenosentre dos dobles ligaduras pueden perder fácilmente un hidrógeno (hidrógeno alíli-co). La pérdida de un hidrógeno alílico produce un radical en el carbono. El radicalpuede migrar de un carbono a otro con lo cual hay un arreglo de las dobles liga-duras. En presencia del O2 se origina un radical peroxilo. El peroxilo a la vez puedetomar un hidrógeno alílico de otro lípido, con lo cual se propaga la reacción delipoperoxidación. El grado de lipoperoxidación se puede determinar por la canti-dad de dienos conjugados, por los carbonilos formados (malondialdehido, 4-hidro-xi-2-nonenal) o mediante reacciones que producen compuestos fluorescentes.

Como casi todos los compuestos reaccionan rápidamente con el •OH, no hayuna manera específica de contender con esta especie reactiva. Sin embargo, esposible que la acumulación de metabolitos como el ascorbato o el glutatión y losllamados solutos compatibles (trehalosa y otros polioles, glicerol, betaína) protejanlos ácidos nucleicos y las proteínas del ataque del •OH. Asimismo, algunas proteí-nas pequeñas, que recubren el DNA de las bacterias en crecimiento estacionarioo en las esporas y que unen hierro, pueden tener una función de protección.

El •OH se produce principalmente por la reacción de Fenton en la cual unelectrón del metal es captado por el H2O2. Algunos metales de transición contie-nen electrones desapareados, por lo que se consideran radicales libres. El Fe(II)tiene cuatro y el Fe(III) tiene cinco electrones desapareados; el Cu y el Cu(II) tie-nen un electrón libre; el Cu(I) no tiene electrones desapareados pero acepta fácil-mente uno para formar el Cu(II). Por eso, muchos iones de los metales detransición pueden donar o captar electrones. Así, el Fe(II) en solución cede unelectrón al O2 formando Fe(III) y O2

•. Por el contrario, el Cu(II) y el Mn(II) acep-tan un electrón del O2

•. En cambio, el Mg(II) y el Zn(II) no participan en reac-ciones de radicales. Tal vez por eso se utiliza el Zn(II) para estabilizar las cisteínasde algunas proteínas como en la SOD (Cu/Zn), la RNA polimerasa y en los“dedos de cinc” de los factores de transcripción y de otras proteínas.

El hierro y el cobre libres pueden catalizar la autooxidación de los compues-tos como el NAD(P)H, el ascorbato, los compuestos tioles y las pterinas y flavi-nas reducidas. La toxicidad del O2

• y del H2O2 depende en gran medida de ladisponibilidad y la distribución de los metales de transición.

La concentración de Mg en una célula como E. coli es de >10 mM; la concen-tración de Ca, Zn y Fe es diez veces menor (al rededor de 0.1 mM), la de Cu,Mn, Mo y Se es de 1 a 10 μM y la de V, Co y Ni es nanomolar. Además del Fe(II)y del Cu(I), sólo el quelato de Mn(II), el V(V), el quelato de Ni(II), el Co(II), elCr(V) y el Ti(III) pueden participar en reacciones de radicales.


Hay enzimas que oxidan el metal a su estado menos reactivo, por ejemplo, elFe(II) en Fe(III) y el Cu(I) en Cu(II). La mayor parte de los metales están unidosa las proteínas. Hay proteínas llamadas chaperonas de metales que suministran elmetal de manera específica a los sitios de las proteínas que los requieren y, porsupuesto, hay proteínas que secuestran un metal, como la ferritina el hierro, y lasmetalotioneínas el cobre y otros metales de transición. Un tercio de las proteínasque se conocen estructuralmente son metaloproteínas que tienen una gran afini-dad por uno o varios metales. La cantidad de sitios de unión en las proteínas parael Zn(II) y el Cu(I) sobrepasa el número de átomos de estos metales que hay enla célula. Por eso se piensa que la cantidad de metales libres en el citosol debe serextremadamente baja. Para el caso del hierro es posible que sí haya una pequeñafracción de este metal en el citosol o unido de manera inespecífica a diversoscompuestos celulares. Por otro lado hay transportadores que sacan los metales dela célula cuando éstos se encuentran en exceso.

El monóxido de nitrógeno, el peroxinitrito y el dióxido de nitrógeno

Hay también otras especies de oxígeno combinadas con el nitrógeno que sonimportantes en la biología. El NO• es un gas incoloro, moderadamente soluble enagua y muy soluble en solventes orgánicos y por lo tanto en las membranas celu-lares. En los organismos se forma a través de la NOS a partir del grupo guanidinode la L-arginina. Esta enzima tiene cuatro grupos prostéticos: FAD, FMN, tetrahi-dropterina y hemo. La reacción requiere cinco electrones que son suministradospor el NADPH. En los mamíferos hay tres NOS, dos son constitutivas y una esinducible, aunque se conocen condiciones en las que también aumenta la activi-dad de las primeras. Las dos constitutivas se regulan con Ca(II) y calmodulina. LaNOS inducible une la calmodulina pero su actividad es independiente del Ca(II).En las plantas y en los microorganismos no se ha encontrado una NOS del tipode los animales, salvo en Plasmodiun polycephalum. Sin embargo, el NO• sí seproduce en estos organismos y una parte proviene de la nitrato reductasa quereduce el NO3

–– en NO2–– y éste puede generar NO•. La concentración fisiológica

del NO• es del orden de 1 a 20 nM. La concentración puede ser micromolar enel sitio en el que se produce, pero se diluye debido a que el NO• se difunde rápi-damente.

El NO• es un radical que se parece al O2• y, a semejanza de éste, no es muy

reactivo. Pero, a diferencia del O2•, el NO• no tiene carga y por ello pasa con faci-

lidad las membranas celulares y se difunde. En el aire reacciona con el O2 gene-rando NO2

•, un gas café que es mucho más reactivo que el NO•. En el agua elNO• también puede interaccionar con el O2 pero forma nitrito (NO2

––) y posible-© E

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mente NO2• como intermediario. Para producir NO2

• en el agua se requiere unaalta concentración de NO•. Estas altas concentraciones de NO• y de O2 tal vezsólo pueden ocurrir en las membranas en las que dichas especies son más solubles.

El NO• genera rápidamente ONOO–– con el O2• (109 M-1 seg-1). Sin embargo,

debido a que el NO• se diluye por su difusión y a la presencia de las SOD, sólouna pequeña parte (1%) del O2

• que se produce reacciona con el NO• y for-ma ONOO––. La mayor parte del O2

• se transforma en H2O2 con las SOD. ElONOO–– se puede protonar a pH fisiológico en ácido peroxinitroso (ONOOH)volviéndose más reactivo, pues se descompone en •OH y NO2

•. Sin embargo, estareacción probablemente no ocurre in vivo debido a que el ONOO–– se une rápi-damente con el bióxido de carbono (CO2) que normalmente está presente. Lainteracción del ONOO–– con el CO2 es 50 a 100 veces más rápida que su descom-posición. Con el CO2 el ONOO–– forma el nitrosoperoxocarbonato que es ines-table y se descompone: dos tercios en NO3

–– y CO2 y un tercio en el radicaltrióxido de carbono o radical carbonato (CO3

•) y el NO2•. Los radicales CO3

• yNO2

• constituyen un sistema nitritante muy efectivo. El CO3• reacciona con

algunos aminoácidos como la tirosina, el triptofano y la cisteína; 105 veces másrápido que con la glicina o la alanina. Así, el CO3

• interacciona con la tirosina atra-yendo un hidrógeno para generar un radical tirosilo con el cual el NO2

• reaccionaformando un nitrito de tirosina. El NO2

• también interacciona con el radical detirosina que se encuentra en algunas proteínas, por ejemplo, en el sitio activo de laribonucleósido difosfato reductasa o de la prostaglandina H2 sintasa-1.

El NO2• también se puede producir a partir del NO2

–– con una peroxidasa comola mieloperoxidasa o la bromoperoxidasa. Debido a la concentracion milimolardel glutatión intracelular, éste compite con el CO2 por el ONOO–– formando elácido sulfénico del glutatión y NO2

––. El NO2• también reacciona con el glutatión,

aún más que con las tirosinas, produciendo un radical tiilo y NO2––. El tiilo de glu-

tatión a la vez genera S-nitrosoglutatión con el NO•. De hecho, es probable que sea el glutatión nitrosilado el que nitrosile los tioles de muchas proteínas, locual puede ser un mecanismo de regulación de la actividad de algunas proteínas.

Asimismo el CO3• reacciona rápidamente con el glutatión, el NAD(P)H y el

ascorbato. No obstante la baja producción del ONOO––, del CO3• y del NO2

•,cuando hay tensión oxidante, aumentan los radicales tirosilo de las proteínas ytambién la nitritación de los mismos. Es probable que las tirosinas que se nitritandentro de las proteínas no estén accesibles al glutatión y que tiendan a generarradicales tirosilo y a reaccionar con el NO2

•. Esto puede ser una manera de regu-lar la actividad de estas proteínas.

En cambio, el NO• sólo reacciona lentamente con los tioles formando nitroso-tioles, por ejemplo, con el glutatión o la cisteína. Pero para que esta reacción selleve a cabo in vivo se requiere la interacción de un metal unido al NO• o al tiol.Es probable que algunos tioles de las proteínas sean particularmente sensibles a


la nitrosilación directa con el NO•, por ejemplo, un tiol de la hemoglobina y de la proteína AE1 de los eritrocitos y uno de la gliceraldehído-3-fosfato deshi-drogenasa.

El NO• no es capaz de iniciar una reacción de lipoperoxidación. Por el contra-rio, siendo un radical, se puede unir con los lipoalcoxilos y los lipoperoxilos y asíterminar la reacción en cadena de la lipoperoxidación. La mayoría de los lipope-roxilos nitrosilados se arreglan para formar peroxinitritos estables. Sin embargoalgunos de ellos se pueden romper y producir NO2

• y un lipoalcoxilo que conti-nuaría la reacción. El NO2

• sí es capaz de abstraer un hidrógeno alílico e iniciarel proceso de lipoperoxidación. También se puede unir a una doble ligadura ygenerar isomerizaciones cis-trans o formar nitritovinilos. El NO2

• puede reaccio-nar con el NO• y producir así el trióxido de dinitrógeno (N2O3), aunque, debidoa la concentración de los reactivos, es poco probable que esta reacción ocurra invivo. El N2O3 es muy oxidante: puede formar lípidos y tioles nitrosilados y NO2

––.En resumen, el NO• sólo interacciona con otros radicales, por ejemplo, con los

metales de transición, entre ellos el del hemo y los de los centros Fe-S de algunasproteínas, el O2

• o los radicales lipídicos. Para reaccionar con otros compuestos,el NO• se debe convertir primero en un compuesto más reactivo, como el NO2

•,o el N2O3.

En el hombre, la mayor parte del NO• que se genera en los tejidos se une a lahemoglobina o a la mioglobina, produciendo NO3

–– y metahemoglobina o meta-mioglobina. El NO3

–– se elimina con la orina. En los microorganismos el NO• sedesecha con la actividad de las flavohemoglobinas, que en realidad son monóxidode nitrógeno oxidasas y forman al NO3

––. Estas enzimas se inducen con el NO•.La función del NO• se lleva a cabo a través de su unión al hierro del hemo de

algunas proteínas, la nitrosilación de algunos tioles particularmente sensibles, eindirectamente mediante la nitritación de tioles y tirosinas en las proteínas y delos lípidos.

La NOS del endotelio de las arterias produce NO• que se difunde y es capta-do por una cisteína de la hemoglobina. Cuando la hemoglobina no tiene unidoO2 transfiere el NO• a una cisteína de la proteína membranal AE1 de los eritro-citos, que a la vez lo libera fuera del eritrocito. El NO• entra a la célula delmúsculo liso de los vasos sanguíneos, se une al hemo de la guanilato ciclasa y deesta manera la activa. El hemo no participa en la reacción de guanilato ciclasasino sólo en su regulación. La unión del NO• al hemo es preferentemente penta-coordinado, lo cual deja libre una histidina axial que conduce a la activación dela enzima. El aumento en el GMP cíclico origina una disminución del Ca(II)intracelular con lo cual se relaja el músculo produciendo así una vasodilatación.Otro efecto que tiene el NO• a través del incremento en el GMP cíclico es el deinhibir la adhesión y la fusión de las plaquetas. El GMP cíclico actúa tambiénsobre algunas proteínas cinasas y sobre algunos canales iónicos. La inhibición del©

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CCuuaaddrroo 22--11.. FFuueennttee,, ccoonncceennttrraacciióónn iinnttrraacceelluullaarr,, rreeaaccttiivviiddaadd yy eelliimmiinnaacciióónn ddeell ddiiooxxííggeennoo yy ddee llaass pprriinncciippaalleess eessppeecciieess ddee ooxxííggeennoo rreeaaccttiivvaass

EEssppeecciiee FFuueennttee CCoonncceennttrraacciióónn RReeaaccttiivviiddaadd EElliimmiinnaacciióónniinnttrraacceelluullaarr11

O2 Externa, catalasa 10 a 20 μM Hemo, Fe(II), flavinas, Respiración, oxi-pterinas alcoxilos, NO•• dasas

O3 Externa ≈ 0 Ácidos nucleicos, proteínas, Ascorbatolípidos, sacáridos y demáscompuestos celulares

1O2 Fotosensibiliza- pM, vida ½ Ácidos nucleicos, proteínas Carotenos, tocofe-ción, descompo- <1 μseg lípidos, sacáridos y roles, glutatión,sición H2O2 demás compuestos ascorbato(HOBr), dismu- celularestación espontá-nea del O2

•, pero-xilípidos, NO2

+ ONOO-

O2• Externa e interna: pM - μM O2

•, NO••, Fe(III), [4Fe-4S] SOD, dismuta-cadena respira- quinonas, difenoles ción espontáneatoria, NADPH oxidasas, y xantinaoxidasas, lipoxi-genasa, P450,hemoglobina,peroxidasas

H2O2 Externa e interna: nM a μM Ascorbato, hemo, Fe-S Catalasa, peroxida-dismutación del sas, peroxirredo-O2

•, oxidasas xinas•OH Reacción de Fenton ≈ 0 Cualquier compuesto Glutatión, ascorba-

vecino to, solutos compa-tibles

NO•• NOS nM O2•, hemo, Fe(III), Fe-S, Hemoglobina,

tioles flavohemoglobina

ONOO-- NO•• + O2• pM CO2, NO··, Fe-S, tioles, Espontánea

lípidos

NO2• ONOO-- + CO2 pM Tir, Trp, Cis, hemo, lípidos Glutatión, ascor-

bato1 Las concentraciones intracelulares varían según las condiciones fisiológicas de cada célula.

citocromo c oxidasa a través de su nitrosilación puede tener un efecto metabó-lico importante.

El NO• se puede medir con un electrodo de Clark recubierto con carbono y conuna membrana que es impermeable al NO2

•. Al formar con el carbono el catión

nitrosonio NO+ se genera una corriente que es proporcional a la concentración delNO•. El catión nitrosonio NO+ reacciona con el agua formando NO2

––. También sepuede determinar el NO• cuantificando la formación de la metahemoglobina,aunque hay que considerar que el NO2

• y el mismo O2 también produce dichocompuesto. Otra manera para medir el NO• es por su reacción con el O3 con elcual forma dióxido de nitrógeno excitado (NO2*) que al decaer a su estado basalemite luz. Con estos métodos se detecta el NO• libre pero no sus productos deoxidación. El NO• genera en última instancia el NO2

–– y el NO3––. Una manera

sencilla y muy usada para cuantificar el NO• formado es reducir el NO3–– en

NO2–– y medir el NO2

–– total mediante una reacción que produce un compuestodiazo, el cual se determina con el espectrofotómetro.

❚ CONCLUSIÓN

En la última década se ha demostrado que las especies de oxígeno y de nitróge-no reactivas se utilizan para una gran cantidad de procesos fisiológicos, desde elcrecimiento y la proliferación hasta la diferenciación y la muerte celulares, pasan-do por la transducción de señales, en las que algunas de estas especies funcionancomo segundos mensajeros. Debido a su relevancia en la fisiología celular y a queen la actualidad el hombre está sujeto a una gran cantidad de condiciones quealteran la producción y la regulación de las especies reactivas del oxígeno y delnitrógeno, se ha advertido que muchas de las patologías humanas tienen su ori-gen en una alteración del balance o de la regulación de dichas especies. En lossiguientes capítulos de este libro se podrán encontrar algunos ejemplos de laspatologías relacionadas con las especies de oxígeno y de nitrógeno reactivas.

❚ AGRADECIMIENTOS

El autor agradece a Teresa Pastor la revisión cuidadosa del texto.

❚ REFERENCIAS

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SSEECCCCIIÓÓNN IIIIII..OORRÍÍGGEENNEESS DDEE LLAASS EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASS

DDEE OOXXÍÍGGEENNOO YY DDEE NNIITTRRÓÓGGEENNOO

3. Cadena respiratoria mitocondrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4. Sistemas microsomales de monooxigenasas, citocromo P450 . . . . . . . . . 61

5. NADPH oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

6. Xantina oxidorreductasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

CCAADDEENNAA RREESSPPIIRRAATTOORRIIAA

MMIITTOOCCOONNDDRRIIAALL

Mina Konigsberg Fainstein

❚ INTRODUCCIÓN

La mitocondria es uno de los sitios propuestos como principales generadores deespecies reactivas de oxígeno. Esto obedece a que el oxígeno que se respira gra-cias al intercambio de gases en los pulmones, y que es transportado por la hemo-globina de la sangre hasta llegar a las células, se utiliza como aceptor final en larespiración mitocondrial. Es decir, la función del oxígeno es la de recibir los elec-trones provenientes de la cadena respiratoria, y junto con protones de la matrizmitocondrial, forman agua metabólica como un subproducto de la oxidación dela glucosa.

La mitocondria genera la mayor parte de la energía de las células animales.Esto ocurre principalmente durante la fosforilación oxidativa, un proceso en elcual los electrones pasan a través de una serie de moléculas transportadoras deelectrones dispuestas en complejos enzimáticos multiproteínicos llamados cade-na de transporte de electrones. Los electrones provienen del NADH (nicotinami-da adenín dinucleótido reducido), que es producido en el ciclo de Krebs durantela oxidación de nutrientes como la glucosa, y su aceptor final es el oxígeno, comose indica en la siguiente reacción:

❚ 49 ❚

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3

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + ATP

La cadena de transporte de electrones está formada por cuatro complejos res-piratorios embebidos dentro de la membrana interna mitocondrial y dos tipos detransportadores de electrones (ubiquinona y citocromo c). El paso de los electro-nes a través de los complejos hace que se transloquen protones (H+) desde lamatriz mitocondrial hacia el espacio intermembranal. Este flujo de H+ generauna diferencia de potencial electroquímico de protón (ΔμH+), también llamadofuerza protón-motriz, utilizada por la enzima ATP sintasa para sintetizar ATP apartir de ADP y fosfato (figuras 3-1 y 3-2).

❚ ESTRUCTURA DE LA CADENA RESPIRATORIA

En los últimos 20 años, la investigación relacionada con la bioenergética mito-condrial ha avanzado enormemente, y los experimentos han pasado de las prepa-raciones crudas de estos organelos a los acercamientos más directos gracias a labiología molecular. Asimismo, ya se conoce la estructura tridimensional para tresde los cuatro complejos enzimáticos de la cadena respiratoria y para la ATP sinta-sa. Lo que hace más accesible el sistema y ayuda a su comprensión.

Para entender por qué se acepta que la producción de especies reactivas deoxígeno es una propiedad inherente de la cadena respiratoria mitocondrial de las


NADH

H +

H +

H +

H +

Fuma r ato Succinato

e - citocromo c

4H +

O2

H 2 O

Ubiquinona

NAD +

NADH DH bc

1

bc 1

SDH

e -

C O X

e -

I

II III

IV

FFiigguurraa 33--11.. Cadena respiratoria mitocondrial. Se observan los cuatro complejos proteínicos embe-bidos en la membrana, así como los transportadores móviles de electrones, la ubiquinona y el cito-cromo c.

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Cadena respiratoria mitocondrial • 51

células eucariotas, hay que conocer cómo están formados los complejos respirato-rios que la componen, por lo que a continuación se describirán muy brevemente.

Complejo I

Llamado NADH: ubiquinona oxidorreductasa o bien NADH deshidrogenasa, esel más grande y complicado de los cuatro complejos respiratorios. En los mamí-feros está compuesto por alrededor de 46 subunidades diferentes y contiene ungrupo flavín mononucleótido (FMN) unido de manera no covalente, además depor lo menos ocho centros hierro-azufre [Fe-S] como cofactores redox. El com-plejo I cataliza la transferencia de electrones (e-) desde el NADH, que se encuen-tra en la matriz mitocondrial, hasta la ubiquinona (UQ). La UQ es soluble en lamembrana interna, por lo que se le considera un transportador móvil que lleva-rá los e- hacia el complejo III. La transferencia de e- está acoplada a la transloca-ción de H+ a través de la membrana interna mitocondrial, contribuyendo a lageneración del ΔμH+ para sintetizar ATP.

H +

H +

H +

H +

H +

H +

H +

H +

A TP sintasa

ADP + Pi

A TP

H +

H +

H +

H +

H +

NADH DH

bc 1

bc 1

C O X

e -

SDH

e -

FFiigguurraa 33--22.. Generación del potencial electroquímico de protón (ΔμH+) y síntesis de ATP.

Complejo II

Denominado succinato: ubiquinona oxidorreductasa o succinato deshidrogenasa(SDH); es otra vía de entrada de e- hacia la cadena respiratoria, por lo que su fun-ción también es reducir a la UQ para que ésta transporte los electrones hacia elcomplejo III. En este caso, los e- provienen de la oxidación del succinato a fumara-to durante el ciclo de Krebs; ya que la succinato deshidrogenasa es una enzima quese comparte en los dos procesos (cadena respiratoria y ciclo de Krebs). No obstan-te, la transferencia de e- en este complejo no se encuentra acoplada a la transloca-ción de H+, por lo que el complejo II no contribuye a la generación del ΔμH+. Lasuccinato deshidrogenasa tanto de eucariotas como de bacterias, está formada porcuatro subunidades proteínicas y cinco grupos prostéticos. Las dos subunidadesmayores son solubles en agua y se orientan hacia el lado de la matriz mitocondrial,en donde forman parte del ciclo de Krebs. Estas subunidades unen a los gruposprostéticos flavín-adenina dinucleótido (FAD) y a tres centros [Fe-S]; además deque están unidas al resto de las subunidades hidrofóbicas que se anclan en la mem-brana y poseen un grupo hemo tipo b, que provee el sitio de unión a la UQ.

Complejo III y ubiquinona

El complejo bc1 o UQ: citocromo c oxidorreductasa es el tercer complejo de lacadena y recibe los e- de la UQ y los transfiere al citocromo c. El complejo III es uno de los complejos evolutivamente más conservados y está formado por 11subunidades proteínicas. Posee un centro Fe-S descubierto por Rieske, dos hemotipo b (b566 y b562) y un hemo tipo c1. Parte de los e- que recibe de la UQ sontransferidos hacia el Fe-S de Rieske, de ahí pasan al citocromo c1, y posteriormen-te al citocromo c, que a su vez los transfiere al complejo IV. Mientras tanto, losotros e- se reciclan dentro de la enzima gracias a los hemo b, ayudando a translo-car H+ para generar ΔμH+ en lo que se conoce como ciclo Q.

Citocromo c y complejo IV

El cciittooccrroommoo cc es un transportador soluble que transporta los e- al ccoommpplleejjoo IIVVo citocromo c oxidasa. Este complejo, que está formado por 13 subunidades es elencargado de que los e– provenientes de la cadena respiratoria utilicen H+ prove-nientes de la matriz mitocondrial y se unan al oxígeno singulete para formaragua, terminando el proceso. El complejo IV también transloca H+ para generarel ΔμH+, y tiene como grupos prostéticos dos grupos hemo tipo a y a3, además dedos átomos de cobre.


❚ GENERACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENOEN LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL

Si se recuerda que los elementos que tienden a ceder electrones fácilmente y aoxidarse se les conoce como aaggeenntteess rreedduuccttoorreess, mientras que a los que recibenelectrones y se reducen se les llama aaggeenntteess ooxxiiddaanntteess, (cuyo prototipo es el oxí-geno de donde se deriva el nombre del proceso), es lógico pensar que para queun elemento se reduzca y gane electrones otro debe reducirse. De modo que alconjunto de un oxidante y un reductor se le conoce como un ssiisstteemmaa o ppaarr rreeddooxx;mientras que a las reacciones en las que se transfiere un electrón se les conocecomo rreeaacccciioonneess óóxxiiddoo--rreeddooxx o simplemente rreeddooxx. Cuando se realiza la transfe-rencia de electrones se genera una corriente eléctrica, marcada por una diferen-cia de potencial entre ambos. El elemento que se reduce es el que posee unacapacidad oxidante mayor. La capacidad oxidante se denomina ppootteenncciiaall rreeddooxx(Eh), y cuanto más grande es su valor, mayor es la capacidad oxidante del siste-ma y mayor es la concentración de la forma reducida. El potencial redox se mideen voltios, aunque como su valor es muy pequeño se expresa en milivoltios (mV).

Las reacciones redox implican la transferencia de e- de uno en uno. Lo cualimplica que el e- que forma parte del par electrónico en el orbital de un átomoquedará desapareado, generando lo que se ha descrito en capítulos anteriorescomo un radical libre. Ésta es la razón por la cual la mayor parte de las reaccio-nes óxido-redox se llevan a cabo en compartimientos o sitios especiales dentrode las células, como es el caso de la cadena respiratoria mitocondrial. El ambien-te semiaislado que provee la membrana lipídica, así como la organización de loscomplejos proteínicos anfipáticos, permiten la transferencia de un solo e- a travésde los grupos prostéticos. Este tipo de compuestos generalmente tienen meta-les de transición como el Fe o el Cu, que pueden cambiar su estado redox y reci-bir o donar e- sin alterarse (Fe+3 a Fe+2, Cu+1 a Cu+2). Sin embargo, el hecho deque la cadena respiratoria esté constantemente transfiriendo e- de uno en uno,sugiere que de existir una fuga en el sistema, los e- desapareados podrían generarradicales libres.

El potencial de reducción estándar que se requiere para la conversión del 1O2en O2

• es de –160 mV. La cadena respiratoria incluye una variedad de centrosredox con potenciales redox que van desde –320 mV (del NADH) hasta +390mV (del citocromo a3 en el complejo IV); lo anterior sugiere que, debido a queel ambiente intramitocondrial es altamente reductor, varios componentes respi-ratorios, incluyendo las flavinas, los centros [Fe-S] y las quinonas, sí serían termo-dinámicamente capaces de transferir un e- al oxígeno (figura 3-3).

Se mencionó antes que la mayor parte del oxígeno que se respira se utilizapara fijar a los e- provenientes de la cadena respiratoria mitocondrial y formaragua metabólica. No obstante, el O2 es un gas que difunde libremente a través de©

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las membranas, por lo que es muy factible que su forma activada (oxígeno singu-lete, 1O2) se encuentre alrededor de la cadena respiratoria, por lo que de existirfugas en la cadena, se favorecería la reducción monovalente del 1O2 generandoasí al superóxido (O2

•).La mitocondria cuenta con enzimas antioxidantes como la superóxido dismu-

tasa (SOD), que transforma al O2• en peróxido de hidrógeno (H2O2), y a la glu-

tatión peroxidasa (GPx), que a su vez convierte al H2O2 en H2O; se ha estimadoque las concentraciones de estas especies reactivas de oxígeno son alrededor de 1 x 10-10 y 5 x 10-9 M, respectivamente. Sin embargo, si estas concentracionesrebasan estos valores o las concentraciones de enzimas antioxidantes son insufi-cientes, el H2O2 podría convertirse en el radical hidroxilo (•OH) mediante lareacción de Fenton catalizada por los Fe o Cu presentes en las enzimas mitocon-driales; o bien las mismas especies reactivas de oxígeno pueden dañar a la mem-


Cis

Cis Cis

Cis S S S S S S

S S S

S S S S S S

S S S S S S

S S S F e F F e e

F e F F e e F e F F e e

F e F F e e

[4 F e-4S]

H 3 C

H 3 C

H 3 C

H 3 C

H

H H C C

C H

C

HOOC COOH

CH 3

CH 3 O

CH 3 O

CH 3 O

CH 3 O

CH 3 O

CH 3 O

CH 3

CH 3

CH 3

O

O

O

O

FMN FMNH 2

P P

N N H H

O -

O -

O -

O •

O H

O H

O

CH 3

CH 2

CH 2

CH CH

N N

N N N N

F e

Hemo

(CH 2 -CH=C-CH

2 ) n

CH 3

(CH 2 -CH=C-CH

2 ) n

CH 3

CH 3

(CH 2 -CH=C-CH

2 ) n

+ 2H + / + 2e -

+ 2H +

+ 2e -

+ 2H +

+ 2e -

+ 2H + / + 2e -

+ 2H + / + 2e -+ 2H + / + 2e -

UQ

UQH 2

UQ - •

2

N N

N N

N N

H H H

OH OH OH

O O P P

H 3 C

H 3 C

O

O

O P P

NH NH

O - O -

CH CH 2

N N N H H

N N H H

N N

H H H

OH OH OH

O O

A B

C D

S S S

S S

S S

S F e

F e F e

F e

HC HC

H H C C

C C H H

CH CH

N N N N

N N N N

F F e e HC

H C

C H

CH

N N

N N

F e

N H

CH N

N

N

O P

NH

CH N H

N H

N

PO

FFiigguurraa 33--33.. Estructura de los grupos prostéticos. Los grupos que transfieren únicamente electronesson: AA)) centros Fe-S, BB)) grupos hemo; mientras que los que transfieren electrón y protón son:CC)) flavín mononucleótido (FMN) y DD)) ubiquinona.

brana interna mitocondrial y a los complejos de la cadena respiratoria, permitien-do la liberación de los grupos prostéticos que catalizarían la reacción de Fenton.Este mecanismo se convertiría en un círculo vicioso, ya que la cadena respirato-ria alterada aumentaría la fuga de e–, generando más especies reactivas de oxíge-no que a su vez dañarán la cadena respiratoria, perpetuando así este fenómeno ydesestabilizando el equilibrio energético de la célula.

Desde hace más de 35 años, varios laboratorios han identificado diversas fuen-tes de O2

• mitocondrial; así, se le ha encontrado en la membrana externa, en la matriz y a ambos lados de la membrana interna. No obstante, mientras que elO2

• generado en la matriz mitocondrial normalmente se elimina por las defensasantioxidantes, una parte del O2

• producido en el espacio intermembranal pue-de ser transportado al citoplasma mediante canales de aniones dependientes devoltaje.

La contribución de cada sitio a la producción general de O2• varía dependien-

do del órgano y del tejido, y también de si las mitocondrias están respirando demanera muy activa (llamado estado III) o están más bien en un estado altamen-te reducido (llamado estado IV).

Al parecer, el complejo III es el responsable de la mayor producción de O2• en

las mitocondrias de corazón y pulmón; mientras que el complejo I es, en aparien-cia, la fuente principal de este radical en el cerebro en condiciones normales. Sinembargo, el complejo I parece ser la fuente principal de radicales en una grancantidad de patologías que van desde la enfermedad de Parkinson hasta el enve-jecimiento. En la actualidad, existe un sinnúmero de evidencias experimentalesque apoyan estas ideas, aunque también hay evidencias que las refutan.

❚ FORMACIÓN DE O2• EN EL COMPLEJO I

En un estudio pionero de 1975, Boveris y Cárdenas identificaron a la ubiquinona(UQ) como la fuente del radical O2

• en el complejo I. Desde entonces, se sabe quela concentración de O2

• formado se puede ver afectada tanto por el estado respi-ratorio mitocondrial, como por la presencia de inhibidores (p. ej. la rotenona, quees un inhibidor del complejo I; o la antimicina A, que inhibe al complejo III).

Por lo general, los e- fluyen en la cadena respiratoria para que se acumule ungradiente de H+, que se disipa gracias a la participación del complejo V o ATPsintasa sintetizando ATP a partir de ADP y Pi. En ausencia de ADP, el movimien-to de H+ a través de la ATP sintasa cesa, el ΔμH+ se acumula causando que el flujode electrones se haga más lento y por tanto, la cadena respiratoria se encuentramás reducida (estado IV). Como resultado, la formación basal de O2

• se incre-menta. De igual manera, la formación de O2

• puede seguir aumentando en pre-sencia de ciertos inhibidores del complejo (figura 3-4).©

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Un fenómeno interesante que se ha reportado en mitocondrias de diferentestejidos es que en ausencia de antimicina A, aun con sustratos oxidables como elNADH, la producción de especies reactivas de oxígeno en el complejo I es ape-nas detectable. Mientras que usando succinato como sustrato, se han cuantifica-do niveles mucho más elevados en la producción de H2O2. Lo anterior sugiereque pudiera existir un flujo de e– en sentido contrario del succinato al NAD+,proveyendo así equivalentes reductores para la producción de especies reactivasde oxígeno. Este proceso se inhibe por rotenona (inhibidor clásico del complejoI que funciona bloqueando el flujo de e– entre un centro [Fe-S] particular deno-minado N2 y la UQ) (figura 3-4). No obstante, dado que la fuente principal deequivalentes reductores para la cadena respiratoria mitocondrial es el NADHmás que el FADH2 o el succinato, la relevancia de esta producción de especiesreactivas de oxígeno no queda clara.

Se ha propuesto también que no es el sitio N2 ni la UQ en donde se fugan loselectrones del complejo I, sino es en el sitio de la flavina FMN, debido a su poten-cial redox.

Sin embargo, debido a la corta vida media del radical O2• y a la gran variabili-

dad de datos en cuanto a la producción de especies reactivas de oxígeno en lasmitocondrias de diversos tejidos, hasta ahora no ha sido posible determinar elsitio exacto de generación del O2

• en el complejo I. Además, la mayor parte delos estudios realizados durante los pasados decenios se han llevado a cabo ya seaen mitocondrias intactas, en partículas submitocondriales o en cultivos celulares.Esto hace muy difícil y ambiguo identificar el sitio exacto de generación del O2

•.Existen muy pocos estudios realizados con la enzima aislada, y aun éstos son con-


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e -

NADH

NAD +

Flujo reversa

Rotenona

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Antimicina A

UQH 2

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FFiigguurraa 33--44.. Eventos en donde la fuga de un electrón reduce al oxígeno singulete y forma al radical superóxido.

tradictorios, ya que dependiendo del tipo de técnica empleada, se obtienen com-plejos con distinta sensibilidad a inhibidores.

❚ FORMACIÓN DE O2• EN EL COMPLEJO III

En el caso del complejo III, se ha pensado que el O2• posiblemente se produzca

como resultado de la autooxidación de la ubisemiquinona (UQ•), un intermedia-rio que se forma en el complejo III durante el ciclo Q para la translocación deH+. La primera evidencia experimental para ello viene desde el año 1974, con lostrabajos de Chance et al., que reportaron que la adición de O2 a mitocondriasanaerobias causaba una reducción transitoria del hemo b, en lugar de la esperadaoxidación del mismo.

Según el modelo del ciclo Q, la UQ es reducida totalmente del lado interiorde la membrana interna mitocondrial (UQH2); una vez reducida viaja hacia ellado exterior de la membrana interna translocando o sacando 2H+ que van a for-mar parte del ΔμH+. En cuanto a los 2e-, el primero lo transfiere al Fe-S de Riskepara que vaya hacia el citocromo c1, de modo que la UQH2 quedaría ahora comoel intermediario UQ•. El e– que le queda lo transfiere a los hemo b566 y b562 paraque recircule en el ciclo, de modo que al donar este último e- quedará nuevamen-te oxidada (UQ). El hecho de que ya no tenga carga le permite moverse al ladointerior de la membrana y recibir el e– de b562, para volver a formar UQ•, que eneste momento está en posibilidad de recibir otro e– y 2H+ para formar UQH2 yreiniciar el ciclo.

Se ha estimado que la especie UQ• pudiera acumularse y funcionar como unsitio de fuga para los e– que estarían siendo recibidos por el 1O2 para formar O2

•.En el caso de la inhibición por antimicina, lo que sucede es que este agente seune al hemo b, impidiéndole recibir los e- provenientes de la UQ•, y favorecien-do el escape de ellos hacia el oxígeno (figura 3-4).

❚ FORMACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE NITRÓGENO MITOCONDRIALES

Dos laboratorios independientes han reportado la existencia de una enzimaóxido nítrico sintetasa mitocondrial (mNOS, por sus siglas en inglés). Al parecer,esta enzima es una variante muy particular de la familia de las NOS.

Las NOS son enzimas dependientes de NADPH encargadas de producir óxidonítrico a partir del rompimiento de arginina a citrulina. El óxido nítrico (NO•)tiene diversas funciones celulares (p. ej., vasodilatación), pero su papel a nivel mito-condrial es aún incierto. Sin embargo, la producción simultánea de O2

• y de NO•

produce un oxidante y nitritante muy fuerte conocido como peroxinitrito (ONOO–).© E

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Aunque el papel fisiológico de la mNOS es aún incierto, la formación de NO•

en la mitocondria podría tener consecuencias importantes porque este compues-to se une a los grupos hemo de los citocromos (en particular a los del complejoIV) e inhibe la respiración. Lo anterior estimularía la generación de O2

•, que a suvez reaccionaría con el NO• formando ONOO–, un oxidante capaz de inhibirenzimas importantes y afectando la integridad mitocondrial.

❚ CONCLUSIONES

No es posible terminar este capítulo sin tomar en cuenta que existen variosreportes de investigadores que afirman que las determinaciones y experimentosrealizados para cuantificar las especies reactivas de oxígeno producidas en lamitocondria no son más que meros artefactos de los sistemas de medición o delaislamiento de las mitocondrias, y que éstas sólo producen O2

• y H2O2 en condi-ciones extremadamente raras o patológicas.

En general, la producción de especies reactivas de oxígeno y especies reactivasde nitrógeno mitocondriales, los daños generados tanto en las enzimas de la cade-na respiratoria, la membrana y DNA mitocondrial, así como el deterioro energé-tico de la misma, son factores importantes que pueden conducir a la célula amuerte por apoptosis, envejecimiento y a diversas enfermedades de las cuales sehablará en los siguientes capítulos.

❚ REFERENCIAS

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DDEE MMOONNOOOOXXIIGGEENNAASSAASS,, CCIITTOOCCRROOMMOO PP445500


❚ INTRODUCCIÓN

La naturaleza ha encontrado múltiples maneras de utilizar el dioxígeno atmosfé-rico (O2) para realizar algunos procesos fisiológicos, para lo cual ha desarrolladoenzimas llamadas oxigenasas. Existen varios tipos de oxigenasas, entre los que seencuentran las mmoonnooooxxiiggeennaassaass, que insertan uunn átomo de oxígeno en el sustra-to a oxidar, mientras el segundo átomo de oxígeno es reducido con electrones quevienen de algún donador específico y generalmente dan como producto unamolécula de agua:

Sustrato + O2 + H+ + NADPH sustrato-O + NADP+ + H2O

Esta simple reacción en realidad resulta ser muy compleja, ya que necesita dela participación de moléculas con un centro metálico, así como de la transferen-cia de electrones desde cofactores reducidos.

Por otro lado, las ddiiooxxiiggeennaassaass catalizan la incorporación de los ddooss átomos deoxígeno de la molécula de O2 hacia el sustrato, y no necesariamente son depen-dientes de cofactores:

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Sustrato + O2 sustrato-O2

Este capítulo se enfocará a describir una de las monooxigenasas más impor-tantes, que contiene un grupo hemo como grupo prostético (hemooxigenasa),llamada cciittooccrroommoo PP445500 y abreviada CYP o P450. Aunque el P450 es sólo un miem-bro de la familia de las monooxigenasas, juega un papel importante en variosmecanismos críticos dentro del metabolismo celular. Los citocromos P450 son unafamilia de proteínas hemotioladas que funcionan como oxidasas terminales. Lamayor parte están formadas por 400 a 500 aminoácidos, de los cuales cerca de55% son de naturaleza apolar; la mitad hemo es protoporfirina IX, y el ligandoaxial para el hierro es un residuo cisteína ubicado cerca del extremo carboxiter-minal de la proteína.

En la actualidad, se conoce una gran variedad de isozimas o miembros de lasuperfamilia de P450, lo que permite una alta selectividad al momento de oxidardiversos sustratos. Existen cerca de 4 000 genes identificados y relacionados conla familia de P450, y el número sigue creciendo conforme se secuencian los geno-mas de más y más especies; incluso se han conformado varios sitios de internetpara reunirlos y describirlos. Asimismo, se han encontrado variantes de P450 entodas las ramas filogenéticas.

En cuanto a su nomenclatura, a cada una de las diferentes isoformas de P450 seles asignan las letras CYP seguidas de un número arábigo. Si presentan 40% o másde identidad en su secuencia, son incluidas en la misma familia y designada conel mismo número. Enseguida se les asigna una letra mayúscula que se refiere a lasubfamilia, y por último, a las enzimas individuales se les asigna un número arbi-trario específico; por ejemplo CYP2A5 y CYP2B6 son enzimas que pertenecena la familia 2 y a las subfamilias A y B, y son la enzima 5 y la 6, respectivamen-te. Cada enzima se denomina como una isoforma, ya que proviene de un gendiferente; sin embargo, la similitud estructural con la que se han agrupado nopuede usarse para predecir cuál de las isoformas será responsable de metabolizara los diferentes fármacos. Es por ello que ahora existen listados en los que se des-criben los fármacos particulares que metaboliza cada isoforma.

En términos generales, se han descrito dos funciones principales para estasmonooxigenasas. El primero es su papel clásico y ampliamente descrito, relacio-nado con el metabolismo de los xenobióticos (compuestos exógenos al organis-mo), a manera de protección. Los citocromos P450 se encargan ya sea de degradaro de transformar a los compuestos polares para solubilizarlos y después excretar-los. La segunda tarea del P450 se ha descrito más recientemente, y se refiere a suparticipación en la biosíntesis de moléculas de señalización para el control deldesarrollo y la homeostasia de los organismos. En los últimos años se ha incluidodentro de estas moléculas señalizadoras precisamente a las especies reactivas de


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Sistemas microsomales de monooxigenasas, ... • 63

oxígeno. En algunos casos, los agentes químicos (fármacos, entre otros), reaccio-nan con los grupos sulfhidrilos de las proteínas, o bien rompen las interaccioneshidrofóbicas, lo que inactiva a los P450.

Se sabe que en los tejidos de mamíferos, los P450 juegan esos dos papeles a tra-vés del metabolismo de fármacos y xenobióticos, la síntesis de hormonas esteroi-des, el metabolismo de vitaminas lipofílicas (solubles en grasas) y la conversiónde ácidos grasos poliinsaturados a moléculas biológicas activas. Funciones simila-res se han descrito en plantas (biosíntesis de hormonas y degradación de herbici-das) e insectos (control del desarrollo mediante biosíntesis de hormonas yresistencia a insecticidas).

❚ SISTEMA MOM

Los P450 se encuentran dentro de lo que se conoce como el sistema de monooxige-nasas microsomales (MOM), unido a las membranas, y se localiza principalmen-te en el retículo endoplasmático de la mayor parte de los tejidos animales. Aunqueel mayor contenido de MOM se encuentra en el hígado, también está presen-te en pulmones, riñones, cerebro, músculo, entre otros. El sistema MOM no sólocataliza la monooxigenación de una gran cantidad de compuestos xenobióticos(drogas, fármacos y etanol), sino que también cataliza la degradación de varioscompuestos endógenos (ácidos grasos, esteroides, eicosianoides, hidroperóxidoslipídicos, entre otros). Esta gran variedad de sustratos que pueden ser oxidadospor MOM, se debe a la existencia de las múltiples isozimas de P450 con selectivi-dad a diferentes sustratos específicos.

El sistema MOM es un complejo multienzimático formado por un citocromoP450 como oxidasa terminal (o aceptor final de los electrones) y una reductasa deP450 dependiente de NADPH, que contiene grupos flavino como FAD/FMN (lla-mada CPR), y que es la que provee los electrones para oxidar al sustrato (figura4-1). Tanto CPR como P450 están ancladas a la superficie citoplasmática del retí-culo endoplasmático e interaccionan por difusión lateral formando complejosdinámicos (figura 4-1). El sistema MOM también contiene al citocromo b5, quees una hemoproteína pequeña unida a la membrana, junto con su reductasadependiente de NADH. El citocromo b5 puede servir como una fuente de elec-trones alternativa para P450; sin embargo, es mucho menos eficaz que CPR, y supapel exacto en el sistema MOM sigue sin conocerse a fondo.

Además del sistema MOM en el retículo endoplasmático, las células de lamayor parte de los tejidos de los mamíferos poseen otras monooxigenasas depen-dientes de P450 localizadas en la membrana externa mitocondrial. Éstas se espe-cializan en la oxidación de sustratos endógenos como el colesterol, y juegan unpapel crucial en la síntesis de hormonas esteroideas. En algunos tejidos como en

la corteza suprarrenal y el cerebro, los niveles de P450 mitocondriales llegan a sersuperiores a los que se encuentran en el retículo endoplasmático. Aunque sonsimilares, las monooxigenasas mitocondriales difieren de las MOM en cuanto a lanaturaleza del donador de electrones. La reductasa mitocondrial dependiente deNADPH inicialmente transfiere los electrones a una proteína hierro-azufre lla-mada adrenodoxina, y ésta a su vez transfiere los electrones a P450.

❚ CICLO CATALÍTICO DEL SISTEMA MOM

Aun cuando se ha descubierto una gran cantidad de isoformas de P450 en mamí-feros, la mayor parte de las reacciones son muy similares. El ciclo catalítico deP450 en el sistema MOM se muestra en la figura 4-2, y es el siguiente:

11)) Unión del sustrato (R-H) al citocromo P450 respectivo, seguido de un cam-bio conformacional de la molécula de P450. El estado de oxidación del hie-rro en el hemo en este momento es de Fe+3, también llamado P450 férrico.


e - NADPH

e - R-H

R-OH

Citosol

Luz del retículo endoplasmático

O 2

P450

F e +3

F e +2

e -

F AD

FMN

FFiigguurraa 44--11.. Sistema de monooxigenasas microsomales (MOM). MOM es un complejo multienzi-mático formado por una P450 reductasa dependiente de NADPH que contiene grupos flavino comoFAD/FMN (llamada CPR), y un citocromo P450 como oxidasa terminal.Tanto CPR como P450 estánancladas a la superficie citoplasmática del retículo endoplasmático e interaccionan por difusiónlateral.

Para que el mecanismo de acción de la enzima sea más fácil de entender, eneste capítulo se denominará al Fe+3 como Fe (III) y al Fe+2 como Fe (II). Demodo que el primer paso es la unión del sustrato al hierro del hemo de laenzima de la siguiente manera: [R-H-Fe (III)].

22)) El P450 férrico acepta un primer electrón de la CPR (P450 reductasa depen-diente de NADPH), lo que da como resultado la reducción del hemo Fe (III) a hemo Fe (II), esto es, el P450 férrico se reduciría al P450 ferroso: [R-H-Fe (II)].

33)) El intermediario P450 ferroso [R-H-Fe (II)] se une entonces a un dioxígenomolecular (O2) para formar lo que se conoce como un oxicomplejo o com-plejo oxidado: [R-H-Fe (II)-O2

•].44)) Este complejo recibe un segundo electrón donado, ya sea por CPR o por el

citocromo b5, para dar un peroxi-complejo: [R-H-Fe (III) -O-O-], comple-jo peroxidado o peroxicitocromo P450.©

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[ R-H - F e (II) ]

[ R-H - F e (II)-O 2 •

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[ R-H - F e (III)-O-O - ]

2H +

R-H

Sust r ato

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Producto

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[ F e (III) ]

O 2 - •

H 2 O

H 2

O 2

[ R-OH - F e (III) ]

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

FFiigguurraa 44--22.. Ciclo catalítico del P450 en el sistema MOM. Una vez que el sustrato se une a P450, elhierro del grupo hemo se reduce al aceptar un electrón de CPR. La hemoproteína reducida escapaz de unirse en ese momento a una molécula de oxígeno para dar lugar a un complejo “oxi” quees nuevamente reducido para convertirse en un “peroxi”. La entrada de dos protones rompe el enla-ce O-O de manera heterolítica, dando como resultado una molécula de agua y un complejo “oxe-noide”, el cual inserta el oxígeno activado dentro de la molécula del sustrato para oxidarla. Los sitiosdonde se producen las especies reactivas de oxígeno se encuentran marcadas con líneas gruesas.

55)) La unión de dos protones a este intermediario resulta en el rompimientoheterolítico del enlace entre los oxígenos (O-O), produciendo H2O juntocon un complejo “oxenoide”, también llamado hierro-oxeno: [R-H-Fe (IV)= O] o bien [R-H-(FeO)+3].

66)) El oxígeno activado por el hemo se une al sustrato (R-H) para convertirloahora en el producto (R-OH), y lo induce a que se disocie de la molécula de P450.

Es importante notar que la entrada de electrones a P450 es un paso limitante y requerido para la activación del dioxígeno molecular y para poder insertar posteriormente un átomo de oxígeno (monooxigenación) en la molécula del sus-trato, así como la cantidad de electrones disponibles por parte de las molécu-las reductoras.

Se sabe que los niveles de CPR en la membrana del retículo endoplasmáticoson mucho menores que los de P450 (existen alrededor de 40 moléculas de P450por molécula de CPR en hepatocitos de rata), de manera que múltiples especiesde P450 compiten por el donador de electrones. Estos factores, entre otros, pue-den afectar la velocidad y eficacia con la que se oxidan los sustratos.

A la eficacia en la transferencia de electrones desde el NADPH (a través de lostransportadores de electrones) hacia P450 para las reacciones de oxigenación se leconoce como el ggrraaddoo ddee aaccooppllaammiieennttoo. En comparación con los sistemas demonooxigenasas microbianas solubles en el protoplasma, el sistema membrano-so microsomal MOM, en eucariotas es muy ineficaz y está mal acoplado. No obs-tante, el grado de acoplamiento en el consumo de NADPH para la oxigenaciónde los fármacos varía dependiendo de la isoforma de P450, y por lo general esmenor de 50%, aunque alcanza a llegar tan bajo como 0.5 a 3% de eficacia enalgunos casos.

Debido a tal desacoplamiento, la tasa de consumo de NADPH y oxígeno mo-lecular por las reacciones del P450 es muy poco dependiente de la presencia de los sustratos. Es decir, aun en ausencia de éstos, la cadena de transporte deelectrones microsomal o el sistema MOM continúa oxidando NADPH, de mane-ra que una porción significativa del oxígeno activado se libera de la enzima sinque lleve a cabo ninguna modificación aparente del sustrato, lo cual conlleva auna alta tasa de generación de especies reactivas de oxígeno.

❚ GENERACIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO

Aunque los sitios de generación de especies reactivas de oxígeno se considerancomo ramas alternas a la vía principal del sistema MOM, ahora se sabe que éstaes una vía que está funcionando continuamente aun en ausencia de sustrato. En


la figura 4-2, dichas ramas o ffuuggaass se encuentran señaladas con flechas gruesas. Laprimera reacción que lleva a la producción de especies reactivas de oxígeno es la li-beración del anión superóxido debido al decaimiento del complejo oxidado (oxi-complejo) [R-H-Fe (II)-O2

•]. La segunda fuente productora es la liberación delperóxido de hidrógeno a partir del peroxicitocromo P450 [R-H-Fe (III) -O-O-] almomento de su protonación. Ésta es una vía alternativa a la vvííaa “principal” en lacual se produce agua. Junto con estos dos sitios productores de especies reactivasde oxígeno existe un mecanismo adicional de “goteo” o “pérdida” de electronesque requiere de otros dos electrones adicionales (cuatro e- en total) que inducenel decaimiento del peroxicitocromo P450, lo que resulta en la liberación del se-gundo átomo de oxígeno en la forma de una molécula de agua.

La producción continua de especies reactivas de oxígeno es un resultado ine-vitable del consumo de NADPH por el sistema MOM en presencia o ausencia de sustratos. Sin embargo, la participación de cada uno de estos sitios depende devarias condiciones, como son el tipo de sustrato, pH, fuerza iónica, concentraciónde oxígeno y otros factores.

Como se mencionó antes, siempre se ha considerado que la función principaldel sistema MOM es el metabolismo oxidativo de los xenobióticos, y que la pro-ducción de especies reactivas de oxígeno es una actividad secundaria. Sin embar-go, en los últimos años se ha intentado reevaluar esta aseveración, tomado encuenta diversos factores. En primer lugar, el sistema MOM es catalíticamentemuy ineficaz. Si se compara el sistema MOM con el sistema bacteriano de mono-oxigenasas, éste último es de 100 a 1 000 veces más eficaz. En segundo lugar,como resultado del desacoplamiento del sistema, la magnitud de las reaccionesde monooxigenación catalizadas es insignificante si se compara con la cantidad deespecies reactivas de oxígeno que genera este sistema; y por último, la concentra-ción extremadamente alta de MOM que se encuentra en las células hepáticas, alparecer, es incompatible con la función que éstas llevan a cabo. Es decir, la expo-sición a concentraciones tan elevadas de xenobióticos in vivo que justificarían lapresencia de los altos niveles de MOM es muy extraña e inusual.

Tomando en cuenta lo anterior, muchos científicos se han preguntado ¿porqué se ha perdido la eficacia catalítica del sistema MOM durante la evolución?Una respuesta es que la producción de especies reactivas de oxígeno comomecanismo de señalización pudiera ser uno de los papeles principales de la enzi-ma. Se sabe que muchas hormonas, citocinas y otros factores señalizadores pue-den modular la generación de especies reactivas de oxígeno por MOM. Demodo que este sistema podría ser una “fuente controlable” de especies reactivasde oxígeno, a diferencia, por ejemplo, de la mitocondria, que por tener tantasfunciones, la producción de dichas especies resultaría muy difícil de “regular” y“controlar”.

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❚ MODULACIÓN DE MOM EN LA GENERACIÓN DE ESPECIESREACTIVAS DE OXÍGENO

Dado que el sistema MOM se ha reconocido como una fuente de especies reac-tivas de oxígeno, sería de esperarse que las células tuvieran los medios para unaregulación rápida y eficaz de los niveles de P450 presentes necesarios para equili-brar el metabolismo de los sustratos con la producción de especies reactivas deoxígeno. Uno de los mecanismos para ello sería suprimir la interacción de las iso-formas de P450 que no son específicas para un sustrato dado con los donadores deelectrones (como CPR y citocromo b5), esto evitaría los flujos improductivos de electrones y la consecuente formación de especies reactivas de oxígeno. Un me-canismo de este tipo (regulación alostérica) permitiría una respuesta rápida delsistema MOM al estímulo regulador.

Una molécula muy importante en el control del acoplamiento del sistemaMOM y en la formación de especies reactivas de oxígeno es el citocromo b5.Aunque al parecer no resulta ser esencial para la actividad catalítica de la mayorparte de las isoformas de P450, su introducción en los sistemas MOM reconstitui-dos da como resultado un incremento considerable en la actividad y el acopla-miento de la monooxigenasa, y disminuye la generación de especies reactivas deoxígeno. Asimismo, la asociación de P450 con b5 da como resultado un incremen-to en su afinidad por los sustratos y por CPR.

Otro mecanismo que modula a P450 es su fosforilación mediante las proteínascinasas A y C dependientes del AMP cíclico. La fosforilación de P450 impide suinteracción con b5, disminuyendo la actividad de la monooxigenasa, aumentan-do la producción de especies reactivas de oxígeno y la lipoperoxidación en el re-tículo endoplasmático. Estos hechos indican que la relación P450-b5, junto con lageneración de especies reactivas de oxígeno dependiente de P450, podrían estarinvolucrados en algunas vías principales de la regulación hormonal; por ejem-plo, en los efectos del glucagón y las hormonas tiroideas. Las hormonas pan-creáticas e hipofisarias, así como algunos glucocorticoides, pueden influir en laexpresión de P450.

Por otro lado, se sabe que existe una regulación transcripcional mediada porlos niveles de especies reactivas de oxígeno (capítulo 8), y que los citocromos P450son especialmente susceptibles a ello, en particular las isoformas CYP1A1 yCYP2E1. Las especies reactivas de oxígeno inactivan al factor nuclear 1 (NF1), locual evita la transcripción de los P450 antes mencionados. Al parecer, el residuo de cisteína en la posición 427 del sitio de transactivación de NF1 resulta ser unsitio crucial para su regulación por las especies reactivas de oxígeno, ya que al oxi-darse se inactiva el NF1. Los mediadores inflamatorios como las interleucinas,interferón y factor de necrosis tumoral α (TNF-α) también afectan los niveles de


expresión de esta enzima. Se ha reportado que el TNF-α disminuye la transcrip-ción de genes de algunos P450, como la CYP1A1, debido a que incrementan elestrés oxidativo.

Se ha observado que la actividad del sistema MOM y de los P450 incrementanlos niveles de antioxidantes celulares como el glutatión (GSH) y la catalasa. Estainducción del sistema antioxidante en respuesta a una expresión aumentada de P450evidencia que la célula se encuentra oxidativamente estresada durante el funciona-miento del sistema MOM.

❚ PAPEL FISIOLÓGICO Y PATOLÓGICO DE LAS ESPECIESREACTIVAS DE OXÍGENO GENERADAS EN EL SISTEMA P450

Es difícil definir claramente la función que tienen las especies reactivas de oxíge-no generadas por MOM. Un factor que complica el entendimiento es el hechode que los P450 también convierten sustancias fisiológicas en compuestos bioacti-vos, y es difícil de separar esta función de la generación de estas especies. Porejemplo, los P450 son importantes en el control del flujo sanguíneo, de maneraindependiente del efecto del óxido nítrico y de las prostaciclinas, especialmenteen el corazón y riñón. Se ha sugerido que parte de los efectos de P450 en este sis-tema parecen estar asociados con la activación del ácido araquidónico, pero alparecer, también el estrés oxidativo podría tener un papel importante en la regu-lación de la presión arterial. De manera particular, los citocromos P450 del tipoCYP2C9, CYP4A y CYP3A contribuyen en la regulación del flujo sanguíneo, yel CYP2C9 se encuentra presente en arterias coronarias.

En el caso de las patologías, se ha propuesto a los hemo de los P450 como unafuente importante de hierro catalítico que pudiera fomentar la producción deespecies reactivas de oxígeno, por ejemplo mediante la reacción de Fenton, lo queconseguiría desequilibrar el estado redox de la célula y contribuir a aumentar losefectos tóxicos.

En el caso del hígado, se sabe que los P450 disminuyen su función como partede la respuesta inflamatoria, implicando diversas afectaciones clínicas en cuantoa los efectos y degradación de fármacos. Por otro lado, el citocromo CYP2E1 con-tribuye a la enfermedad alcohólica hepática, a la fibrosis y a la esteatohepatitisno alcohólica (véase capítulo 2: Dioxígeno y sus especies reactivas).

También se ha sugerido que la generación del radical superóxido por la isofor-ma CYP1A1 puede relacionarse con la artritis reumatoide y el síndrome de Sjö-gren. No obstante, éstos son sólo algunos ejemplos de la función que pudierantener las isoformas de P450.

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❚ CONCLUSIONES

Como resumen, puede decirse que a pesar de todos estos hallazgos, aún se des-conoce el significado fisiológico preciso de la producción de las especies reacti-vas de oxígeno por P450, así como el papel que juega el sistema MOM en las víasque controlan el crecimiento y la diferenciación celular. Sin embargo, aunque la función principal del sistema MOM es degradar los compuestos lipofílicos, lanecesidad de modular los niveles celulares de las especies reactivas de oxígeno hallevado al desarrollo de sistemas que generan estas especies, para que se puedanregular eficazmente, y éste pudiera ser el caso del sistema MOM.

❚ REFERENCIAS

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NNAADDPPHH OOXXIIDDAASSAA


❚ INTRODUCCIÓN

Las especies reactivas de oxígeno se estudian principalmente como subproductosdañinos del metabolismo aeróbico; sin embargo, ahora se sabe que en muchoscasos tienen un papel benéfico. Esto quedó totalmente demostrado al encontrar-se que existen enzimas cuya función es la de producir radicales libres y otrasespecies reactivas de oxígeno.

Un ejemplo es la familia de enzimas NADPH oxidasas (NOX) que se encuen-tran en varios tejidos, de las cuales la más estudiada es la que se encuentra den-tro de las células fagocíticas. Este tipo de NOX se activa cuando hay unaamenaza por agentes patógenos, produciendo especies reactivas de oxígeno ymatando a los agresores.

Las células fagocíticas constituyen una de las defensas más poderosas del sistemainmunitario contra las bacterias, levaduras y hongos. Dentro de este grupo, tam-bién llamado células inflamatorias, pueden incluirse a los neutrófilos y eosinófi-los, a los monocitos y macrófagos (incluyendo macrófagos de distintos linajesespeciales, como las células de Kupffer, que son macrófagos residentes del híga-do, macrófagos alveolares en el pulmón y la microglia en el sistema nervioso cen-

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tral). Estas células circulan por la sangre y migran a través de los capilares hacialos tejidos en donde avanzan lentamente en busca de bacterias, hongos o dese-chos celulares que posteriormente digieren.

La migración dirigida (quimiotaxis) de los neutrófilos hacia el sitio de infecciónes el primer paso necesario para asegurar la actividad bactericida y fungicida, y porlo general es dirigida por quimioatrayentes como el complemento, interleucinas,entre otros. Una vez arribado al sitio, deben reconocer y englobar o fagocitar alpatógeno, lo cual es mediado por opsoninas como las inmunoglobulinas G (IgG)o ligandos preservados durante la evolución, como los receptores de la familiaToll (TLR; del inglés, Toll-like receptors), que reconocen partículas de levaduray lipopolisacáridos (LPS) de bacterias.

(La opsonización es un fenómeno por el que ciertos anticuerpos, en particularlos IgG, combinados con el antígeno, permiten una mejor fagocitosis de éste).

Después de su reconocimiento, el patógeno es envuelto en una membranadenominada vacuola del fagosoma. El proceso de encapsulación activa los proce-sos en las células inflamatorias que culminarán con la destrucción y muerte delpatógeno debido a la activación de proteasas y a la generación de especies reacti-vas de oxígeno. Para ello, la oxidasa, en este caso la NADPH oxidasa (NOX), recibeun electrón de la nicotinamida adenín dinucleótido fosfato reducido (NADPH) quese encuentra en la superficie citosólica de la membrana del fagosoma, y lo donaal oxígeno molecular que se encuentra del otro lado del fagosoma, generando al


O 2 O 2 • H 2 O 2 HOCl

• OH

NADPH

NADP +

Microorganismos

F agocito

f agosoma

F agosoma NOX

FFiigguurraa 55--11.. Defensa del organismo en contra de las bacterias mediante la fagocitosis y la acción dela enzima NADPH oxidasa (NOX).

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NADPH oxidasa • 75

radical superóxido (O2•). Éste a su vez puede convertirse más tarde en otras espe-

cies reactivas de oxígeno, aunque la mayor parte dismuta hacia peróxido dehidrógeno (H2O2), principalmente por acción de la enzima mieloperoxidasa(MPO) (figura 5-1). El H2O2 producido funciona de varias maneras:

• Oxidando a una diversidad de compuestos aromáticos (R-H) por transfe-rencia de electrones, dando como resultado la formación de radicales libres.

• Oxidando a los iones cloruro para convertirlos en el ácido hipocloroso(HClO), un oxidante no radical conocido como el bactericida más potente.

• Mediante la reacción de Fenton, puede convertirse en el radical hidroxilo(•OH), un radical libre muy poderoso (capítulo 2).

• Produciendo la forma energética del oxígeno llamada oxígeno singulete(1O2).

Además de la función que tiene la NOX para defender al organismo en con-tra de los patógenos, en los últimos años se han descrito otro tipo de funcionespara la enzima relacionadas con los procesos de desarrollo. Así pues, se ha descri-to su participación en la formación de matriz extracelular en Caenorhabditis ele-gans, la formación de otogonias en ratones y el desarrollo de vellosidades en lasraíces de A. thaliana.

❚ HISTORIA DE LA EXPLOSIÓN OXIDATIVA O ESTALLIDO RESPIRATORIO

La respiración fagocítica, como se le llamó en un inicio, fue descubierta en 1933por Baldrige y Gerrard. Estos investigadores notaron que los neutrófilos mostra-ban un incremento exagerado en la toma de oxígeno al momento de fagocitar alas bacterias, por lo que por muchos años se asumió que el “estallido respiratorio”era una respuesta de las mitocondrias celulares para proveer de la energía necesa-ria para poder englobar y fagocitar a los patógenos. Años después, esta respiraciónresultó ser insensible a los inhibidores clásicos de la cadena respiratoria, comorotenona, cianuro y azida, y fue entonces cuando por primera vez se advirtió loinsólito del proceso.

Más tarde se encontró que la absorción acrecentada de oxígeno era esencialpara poder matar a los patógenos. Se encontró que en ausencia de oxígeno, lascélulas lograban fagocitar a los microorganismos de una manera adecuada, peroque éstos no se destruían. Ahora se sabe que el oxígeno consumido se convierteen O2

• y otras especies reactivas de oxígeno gracias a la acción de la enzimaNOX, lo cual se detallará más adelante.

❚ ESTRUCTURA DE LA ENZIMA NADPH OXIDASA

La NOX se encuentra desensamblada dentro de las células, y es necesario que seacoplen todos sus componentes para que pueda funcionar. La NOX activa es unmulticomponente enzimático localizado en las membranas plasmáticas de lascélulas activadas (figura 5-2). Sin embargo, las proteínas que la conforman pue-den ser membranales o citosólicas.

Componentes membranales

El corazón de la enzima, es decir, el complejo que está anclado a la membrana,está compuesto de una subunidad proteínica glucosilada con un peso de 91 kDa(gp91phox) y una subunidad proteínica no glicosilada de 22 kDa (p22phox), for-mando un complejo en una relación 1:1. Este complejo contiene dentro de su estructura proteínica a dos grupos hemo y a un grupo flavín-adenín dinucleó-


p22 ph o x gp91 ph o x

p67 ph o x p40 ph o x

Cit b 558


p40 ph o x

P P P P

P


p40 ph o x

P P P P

P

Proteína cinasa P

Rac GDP

Rhe GDI

p22 ph o x gp91 ph o x p22 ph o x gp91 ph o x


p40 ph o x

P P P P

P

P

Rac GTP

O 2 O 2 •

NADPH NADP +

CI T OSOL

p47 ph o x

F e F e F e F e F e F e

P

P

FFiigguurraa 55--22.. Ensamble de la NOX a partir de sus componentes citosólicos y membranales.

tido (FAD), que son los encargados directos del flujo de los electrones dentro dela NOX.

El máximo de absorción del grupo hemo o citocromo es de 558 nm, por lo quemuchas veces a este complejo membranal se le conoce como flavocitocromo b558.Habrá que aclarar que el citocromo b558, además de su máximo de absorciónespectral de 588, tiene un potencial redox de –245 mV, por lo que a veces se leconoce también como b-245; sin embargo, se trata del mismo complejo.

Componentes citosólicos

Los componentes citosólicos de la NOX son las subunidades proteínicasp47phox, p67phox, p40phox (nombradas así por sus respectivos pesos molecu-lares en kDa), junto con una pequeña proteína G que actúa como GTPasa y quepuede ser rac1 o rac2. En las células en reposo o no activadas, las subunidadesp47phox, p67phox y p40phox, interactúan entre sí formando un complejo cito-sólico. Durante la activación, aproximadamente 10% de estas proteínas migranhacia la membrana plasmática.

❚ ENSAMBLE Y ACTIVACIÓN DE LA NOX

La NOX se puede activar ya sea por mecanismos dependientes o independien-tes de receptor, y su inducción en los fagocitos puede deberse a un gran númerode partículas y factores solubles como bacterias opsonizadas, zimosanos opsonizados,partículas de látex, fragmentos del complemento (C5a), péptidos pequeños, ionó-foros de calcio (como A23187), diacilglicerol (DAG), activadores de proteínascinasas (como acetato-miristato-forbol, PMA; por sus siglas en inglés, phorbol my-ristate acetate), lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas (LPS), hormonascomo la angiotensina II, etcétera.

Diversos experimentos han demostrado que existe un retraso entre la activa-ción de la NOX por dichos factores y la producción de O2

•, por lo que debenocurrir diversos sucesos que hacen que se ensamble y empiece a funcionar. Loseventos que acompañan la activación de la NOX son: la partícula opsonizada oel agente soluble se debe unir al receptor; aunque, como se mencionó antes, enalgunos casos de ciertos estímulos artificiales como el PMA no presentan recep-tores membranales.

El receptor transmite la información a través de la familia de proteínas G hete-rotriméricas (proteínas que unen GTP).

Las proteínas G activan a las enzimas de la membrana como la fosfolipasa C(PLC), fosfolipasa A2 (PLA2), y fosfolipasa D (PLD), lo cual conlleva a la libe-©

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ración de mensajeros intracelulares o segundos mensajeros. Por ejemplo, la PLCcorta al lípido membranal fosfatidilinositol-4,5-difosfato (PIP2) y lo convierte endiacilglicerol (DAG) e inositoltrifosfato (IP3). El IP3 está involucrado en la libe-ración del calcio de sus pozas intracelulares, mientras que el DAG activa a lafamilia de proteínas cinasas (PKC). Por otro lado, la activación de PLD da comoresultado la producción del ácido fosfatídico a partir de fosfatidilcolina. Mientrasque la activación de PLA2 produce ácido araquidónico, que a su vez se puedeusar como sustrato para la síntesis de leucotrienos y prostaglandinas. Este tipo demoléculas activan a proteínas cinasas como la PKA, PKC y las MAP-cinasas.

Las proteínas cinasas fosforilan a algunos de los componentes citosólicos de laNOX, en particular a p47phox, que tiene varios sitios de fosforilación. La fosfo-rilación hace que la proteína cambie de una conformación autoinhibitoria (endonde las regiones de unión se encontraban escondidas) a una conformaciónextendida que es capaz de unirse con b558 (la parte membranal de la enzima).

La PLA2 activada por las proteínas G produce ácido araquidónico, que a suvez activa a la NOX. Los tres componentes citosólicos que forman el heterotrí-mero, p47phox, p67phox y p40phox, junto con rac, se translocan a la membra-na plasmática o membrana del fagosoma, y se ensamblan con el flavocitocromob558. El NADPH se asocia al complejo. Casi al mismo tiempo, los canales mem-branales de protones son abiertos por la PKC o por la tirosina cinasa, posiblemen-te activados por el ácido araquidónico.

Una vez que la NOX está ensamblada, el control sobre la actividad de la enzi-ma y su velocidad catalítica puede llevarse a cabo en diversos puntos. El meca-nismo para que comience a funcionar para producir O2

• se describe en la figura5-3 y se explica a continuación: el NADPH debe ligarse a su sitio de unión en la


NADPH

O 2

F e e xt F e int

F AD NADPH

NADP +

O 2 •

O 2

H 2 O 2

e-

e-

e-

FFiigguurraa 55--33.. Flujo de electrones durante el mecanismo por el cual la NOX produce el radical O2•.

subunidad gp91phox,, een donde se oxida perdiendo ddooss electrones,, y se libera dela enzima en forma de NADP+.

Los electrones se transfieren de uno en uno hacia el FAD, posteriormente alhemo más interno y de ahí al más externo. Cada e– pasa del último hemo al O2,y por último, el oxígeno recibe un e–, se convierte entonces en el O2

•, como semuestra en la siguiente reacción:

2O2 + NADPH 2O2• + NADP+ + H+

El O2• puede dismutar de manera espontánea y por el pH ácido del fagosoma

convertirse en H2O2 o bien, puede tener una dismutación enzimática catalizadapor la enzima superóxido dismutasa:

2O2• + 2O2

• H2O2 + O2

La interacción entre el O2• y el H2O2 puede producir •OH mediante la reac-

ción de Haber-Weiss si existen metales de transición libres (Fe+2 o Cu+1), o bienmediante la reacción de Fenton (capítulo 2).

Dentro del fagosoma también se encuentra la enzima mieloperoxidasa(MPO), que produce ácido hipocloroso, HClO, a partir de H2O2 en presencia deun halógeno:

H2O2 + H+ Cl– MPO + •OH

Se propone que algunas de las limitantes de ese proceso pudieran ser la dispo-nibilidad de NADPH y su velocidad de unión a la enzima, así como la tasa detransferencia de electrones y la liberación de O2

•. La concentración de O2 tienemuy poco efecto en la generación de O2

•, a menos que la presión parcial de estegas se reduzca 5% por debajo de los niveles atmosféricos. El papel que juegan lasconcentraciones de NADPH es menos claro. Se ha considerado que los nivelescitoplasmáticos de NADPH son de 50 a 100 μM, lo cual es comparable con suafinidad por la oxidasa. La Km calculada para sistemas reconstituidos libres decélulas es de 26 a 260 μM, de modo que los cambios en la concentración o dis-ponibilidad de NADPH sí alterarían la actividad de la oxidasa.

Es importante aclarar que durante el estallido oxidativo debe haber una sínte-sis continua de NADPH. Al parecer, el NADPH que se sintetiza en este eventose deriva de la degradación del glucógeno. Los neutrófilos tienen un alto conte-nido de glucógeno, que cuando se convierte en equivalente de glucosa son del©

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orden de 60 μM. Es por ello que la glucogenólisis se incrementa durante el esta-llido respiratorio. Incluso se ha encontrado que el consumo de oxígeno duranteel estallido respiratorio es exactamente el mismo tanto en presencia como enausencia de glucosa, lo cual indica que la glucosa exógena no es la fuente princi-pal para la producción de NADPH.

❚ INACTIVACIÓN DE LA NOX

La inactivación de la enzima es un proceso tan importante como la activación, yaque, aunque las especies reactivas de oxígeno producidas tienen como objetivomatar a los patógenos, la generación de demasiadas especies de este tipo, o bien sulocalización en un sitio inadecuado, puede ser la causa de serios daños al organismo.

La desfosforilación de una o más serinas en la subunidad p47phox se ha pro-puesto como uno de los mecanismos para la inactivación, implicando en ello a lasfosfatasas PP1 y PP2A. Se sugiere que la desfosforilación desensambla a la NOX,y eso hace que se inactive. Sin embargo, se han sugerido algunos otros mecanismos,e incluso se propone que existan vías alternativas, dependiendo del estímulo y delagonista que hubiera activado la enzima.

❚ ENFERMEDAD GRANULOMATOSA CRÓNICA

Queda claro que la generación de especies reactivas de oxígeno por parte de laNOX es un mecanismo vital, no sólo como sistema de defensa del huésped, sinotambién como parte de las más amplias redes de comunicación celular.

La trascendencia de esta enzima se ilustra perfectamente con el desordengenético en humanos llamado enfermedad granulomatosa crónica (EGC).

La EGC es una deficiencia inmunitaria congénita en la cual los fagocitos sonincapaces de producir especies reactivas de oxígeno. La EGC tiene una inciden-cia de 1 entre 200 000 a 250 000 nacimientos. Ésta es una enfermedad quepuede llegar a ser mortal, ya que los pacientes son muy susceptibles a infeccio-nes bacterianas y por hongos, en particular con microorganismos conocidos comocatalasa positivos del tipo de Staphylococcus, Burkholderia cepacia, Nocardia,Mycobacteria, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas, y principalmente hongos dediversas especies de Aspergillus y Candida. Las infecciones bacterianas y fúngi-cas recurrentes dan como resultado linfadenitis, abscesos y la formación de gra-nulomas, de los cuales se hablará más adelante. Los síntomas se presentan a muytemprana edad, por lo general durante los dos primeros años de vida.

Histológicamente, la enfermedad se caracteriza por la formación de granulo-mas muy grandes que resultan de la fusión de los macrófagos que han fagocita-


do a las bacterias, pero que son incapaces de destruirlas, porque su NADPH oxi-dasa carece de actividad. Los granulomas pueden obstruir las estructuras vitalescomo el tracto gastrointestinal o el genitourinario, lo que trae consigo consecuen-cias adicionales.

Genéticamente, la EGC resulta de las mutaciones en los genes de algunos delos componentes de la NOX, como por ejemplo el gen CYBB (Xp21) que codi-fica para la subunidad gp91phox, o los genes CYBA (16q24), NCF1 (7q11) yNCF2 (1q25) que codifican para las subunidades p22phox, p47phox y p67phox,respectivamente.

La forma más frecuente de EGC (70% de todos los casos) es la que se relacio-na con mutaciones en el cromosoma X relacionado con la deficiencia engp91phox. El resto de los casos se reparten entre las diversas mutaciones de cro-mosomas autosómicos.

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Segmentos t r ansmemb r anales

F AD NADPH

N C


F AD NADPH

N C

Extremo EF


F AD NADPH

N C

Extremo EF P er o xidasa

NOX 1

NOX 3NOX 2

NOX 4NOX 5

DUOX 2

DUOX 1

FFiigguurraa 55--44.. Esquematización de los miembros de la familia NOX, y árbol filogénico de los miem-bros de la familia NOX.

❚ LA FAMILIA NOX

Por muchos años, la actividad de la NOX se asoció sólo con la explosión oxida-tiva dentro de la repuesta inmunitaria de las células inflamatorias. Sin embargo,recientemente se han descrito varios homólogos de la subunidad catalíticagp91phox, en otros tejidos humanos como el pulmón, riñón y colon, en varios ti-pos celulares distintos como células epiteliales, endoteliales y células del múscu-lo liso. Estos homólogos se han clonado y agrupado como una familia bajo elnombre de NOX (NOX 1 hasta NOX 5) para las NADPH oxidasas y DUOX(DUOX 1 y DUOX 2) para las oxidasas duales (figura 5-4).

Una de las diferencias esenciales entre el gp91phox fagocítico (ahora llamadoNOX 2) y los otros tipos de NOX, es que la producción de especies reactivas deoxígeno en la enzima fagocítica ocurre en la cara externa de la membrana plas-mática, liberando dichas especies hacia fagosomas o bien al espacio extracelular,mientras que las especies reactivas de oxígeno producidas por las otras especiesde NOX se han detectado en el espacio intracelular y son producidas en cantida-des mucho menores.

❚ CONCLUSIONES

El descubrimiento de nuevas isoformas de la enzima NOX, no sólo en animalessino en una gran variedad de eucariotas, incluyendo plantas, hongos y mixomice-tos, representa un gran avance en el entendimiento de las especies reactivas deoxígeno. El hecho de que la expresión de las NOX esté mucho más extendido de lo que se pensaba, y que estas enzimas se encuentren en lugares donde lasespecies reactivas de oxígeno no se habían estudiado antes, incrementa el enten-dimiento sobre la importancia de estas moléculas y su papel modulador del esta-do redox, así como mecanismos de señalización celular y activación de diversasvías metabólicas. Aunque ya se empieza a conocer el papel de algunas de las enzi-mas NOX, como por ejemplo las NOX/DUOX que están involucradas en la bio-síntesis de hormonas tiroideas, la NOX 3 en la formación del oído interno y laNOX 1 en la regulación del flujo sanguíneo, la función fisiológica de otras enzi-mas NOX/DUOX aún queda por aclararse.

❚ REFERENCIAS

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XXAANNTTIINNAA

OOXXIIDDOORRRREEDDUUCCTTAASSAA


❚ INTRODUCCIÓN

La enzima xantina oxidorreductasa (XOR) es un miembro evolutivamente muyconservado de la familia de las enzimas que poseen molibdeno (Mo) como grupoprostético. Dentro de este grupo de enzimas se encuentran también la aldehido-oxidasa (AO) y la sulfitooxidasa (SO). A diferencia de los sistemas de monooxi-genasas que se han descrito en los capítulos anteriores, las molibdeno oxigenasasutilizan agua en lugar de O2 como la fuente de la cual toman al átomo de oxíge-no que se incorporará al sustrato determinado.

En mamíferos, los mayores niveles de XOR se encuentran en el hígado y en elintestino delgado. Esta enzima puede encontrarse en una de dos formas intercon-vertibles, que son la xantina deshidrogenasa (XDH) y la xantina oxidasa (XO).La diferencia entre ellas es que la XO sólo puede reducir al oxígeno, mientrasque la XDH puede reducir tanto al oxígeno como al NADP+ (nicotinamida ade-nín dinucleótido fosfatado oxidado), pero es mucho más afín a este último.Ambas formas participan en el catabolismo de los compuestos nitrogenados, par-ticularmente en la degradación de las purinas (adenina y guanina). La XOR cata-liza las reacciones terminales de esta vía, transformando a la hipoxantina en xan-

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tina y a la xantina en ácido úrico, que es el producto final de purinas en huma-nos (figura 6-1). En otros primates, la uratooxidasa transforma al ácido úrico enalantoína.

La actividad de la XDH se ha estudiado mucho, ya que entre otras razones, elácido úrico puede llegar a acumularse en forma de cristales dentro del cuerpohumano, lo cual se ha relacionado con la enfermedad llamada gota. Además, elinterés en esta enzima ha crecido mucho en los últimos años debido a que se sabeque la XOR genera especies reactivas de oxígeno, por lo que se cree que juegaun papel importante en el daño por reperfusión, así como en una gran cantidadde alteraciones cardiacas.

❚ ESTRUCTURA DE LA XOR

El gen que codifica para la enzima XOR humana se encuentra en el cromosoma2, y conserva más de 90% de homología con otras especies de mamífero, como elratón y la rata. Aunque su expresión basal en los humanos es relativamente baja, sesabe que algunos factores como la disminución en la presión de oxígeno (hipo-xia), así como algunas hormonas (cortisol y prolactina) y las citocinas (IL-1, IL-6,TNF-α) pueden aumentar su expresión.

La enzima XOR es un homodímero compuesto de dos subunidades catalítica-mente independientes de casi 150 kDa cada una. Se ha visto que existe una so-

H 2 O

2

A TP ADP AMP Adenosina

Inosina

Hip o xantina

Xantina

Ácido úrico

5´ n ucleotidasa

Adenosina deaminasa

Inosina f os f o r ilasa

XDH

XDH XO

XO

NAD +

NAD +

NADH

NADH O 2

•

O 2

•

O 2

O 2

e - /H

+

e - /H

+

H 2 O

2

FFiigguurraa 66--11.. Catabolismo de purinas.

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Xantina oxidorreductasa • 87

breposición de parte de las subunidades, lo que da como resultado que la enzimatenga la forma de mariposa.

Cada subunidad posee un grupo mmoolliibbddoopptteerriinnoo, que le da una característicamuy particular a la enzima. El molibdeno es un metal de transición de númeroatómico 42 que es un componente crucial para el funcionamiento de una gran cantidad de enzimas, y se encuentra ampliamente distribuido dentro de los sistemas biológicos. Cuando el molibdeno, o el tungsteno forman parte de las enzimas, se unen a la cadena de aminoácidos de una manera muy particular queimplica la deslocalización de la carga del metal por átomos de azufre (ditioleno)y un anillo pteridino (figura 6-2), por lo que se les conoce como grupo molib-dopterino (Mo-Co),y es muy importante para la actividad de la enzima, ya quese ha encontrado que la hidroxilación oxidativa de la xantina al ácido úrico selleva a cabo dentro de este centro. Asimismo, la XOR posee dos centros hierro-azufre [2Fe-2S] no idénticos, que rápidamente transfieren los equivalentes redu-cidos hacia un grupo flavín-adenín dinucleótido (FAD), en donde la oxidaciónfisiológica se lleva a cabo.

HNHNHN

H2N

O

OOOO

OO

OO

ORNHNH

HNHN

S-Mo=OS-Mo=OS-Mo=O

X X=Oo S

Ditiolenoeno

A

B

Pteridino

Molibdeno

FFiigguurraa 66--22.. Grupo molibdopteridino. Unión del Mo a la cadena de aminoácidos involucrando a losátomos de azufre (ditioleno) y al anillo pteridino.

❚ CONVERSIÓN DE XDH A XO

Cuando por primera vez se descubrieron las distintas variantes de la XOR, siem-pre se obtenía preferentemente la forma XO, y por muchos años se supuso queésta era la variante predominante. No obstante, ahora se sabe que esto se debía alproceso de aislamiento que se utilizaba, y más tarde se descubrió que in vivo, laenzima se encuentra más en forma de XDH. Aunque ambas formas catalizanreacciones que involucran sustratos similares, varían en los aceptores de electro-nes que utilizan, por lo que ahora existe una gran cantidad de estudios que ana-lizan el mecanismo de conversión de la XDH a XO.

La conversión de la enzima ocurre por dos diferentes vías que determinan lairreversibilidad del proceso.

Conversión irreversible de la XDHa XO

Cuando la enzima se rompe de manera proteolítica, se convierte en la forma XOde manera irreversible. Esto puede ocurrir ya sea por tratamiento con enzimasque degradan proteínas como la tripsina, pancreatina o alguna proteinasa.

Conversión reversible de la XDH a XO

La conversión reversible ocurre cuando se oxidan algunos grupos tioles (-SH) delas cisteínas (al parecer la cis 535 y la 922). También puede ser por efectos del aislamiento y almacenamiento de la enzima, como por ejemplo, conservarlaa –20 °C, o incubarla a temperaturas de 37 °C, así como por la exposición a con-diciones anaeróbicas y a distintos agentes o fármacos como el etanol. Esta con-versión, a diferencia del rompimiento proteolítico, se puede prevenir e inclusorevertir con diversos agentes como los que impiden la oxidación de las cisteínas,entre los que se encuentra el ditrieritrol (DTT).

❚ MECANISMO DE REACCIÓN DE LA XOR Y GENERACIÓNDE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO

El mecanismo de reacción específico que explica la acción de la enzima XORaún no se conoce del todo. Es por ello que el fenómeno general se ha dividido endos semirreacciones: reductora y oxidante. La semirreacción reductora ocurre en el Mo-Co (figura 6-3 y 6-4A). La XOR recibe dos electrones provenientes de la xantina para reducir al Mo(VI) en Mo (IV). Asimismo, se transfiere un


hidrógeno de la posición del carbono 8 de la xantina hacia uno de los ligandos deazufre que unen al molibdeno reduciéndolo (pasa de Mo= S a Mo-SH). Almismo tiempo, se lleva a cabo un ataque nucleofílico hacia el C8 por un grupohidroxilo proveniente del agua, para formar ácido úrico.

En contraste, la semirreacción oxidante se lleva a cabo en el FAD (figura 6-4B), ya que existe una transferencia intramolecular de electrones desde el Mo-Co hacia el FAD mediada por los centros [2Fe-2S]. El FAD, por tanto, sirve comoreservorio de electrones para mantener al centro Mo-Co en estado Mo(VI), y laflavina se convierte en FADH2. De este punto, los electrones se transfieren a suaceptor final, ya sea O2 o NAD+.

Es importante notar que en los primeros dos pasos durante la reoxidación dela XOR totalmente reducida, cada uno comprende la transferencia de un par de electrones al O2, generando H2O2. Después, la XOR transfiere los electronesremanentes en pasos separados, de manera tal que cada electrón reduce de formaindependiente a un oxígeno, generando O2

•. De modo que la reoxidación de laXOR totalmente reducida produce dos H2O2 y dos O2

• (figura 6-4C).

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N N

O N

N

O

H H

H

O Mo

SH IV

O

N N

O N

N

O

H H

H

H

O Mo

S VI

N N

O

N

O

H H

H

OH O Mo

S VI

OH -

H +

XOR-Mo(VI) Mo VI f o r ma o xidada

XOR 2e- -Mo(IV) Mo IV f o r ma reducida

H 2 O 2

O 2

2H +

XOR-Mo(VI) Mo VI f o r ma o xidada

Ácido úrico

Xantina

N

FFiigguurraa 66--33.. Participación del grupo molibdopteridino en la transformación de la xantina al ácidoúrico.

Al parecer, y de manera sorprendente, la XDH genera más O2• por mol de O2

que la XO debido a la gran estabilidad (termodinámicamente hablando) quetiene la molécula de FAD que reacciona con el oxígeno. Sin embargo, lo que secree que pasa en realidad es que la XDH sí reacciona con el oxígeno, pero lo hacede una manera tan lenta que la cantidad de O2

• que se genera es tan sólo la cuar-ta parte de lo que puede producir la XO. Por si su velocidad tan lenta fuera poco,la afinidad que tiene el NAD+ para unirse a la XDH es tan alta, que deja muypocas probabilidades al O2 para entrar en contacto con la enzima y recibir al e–.El mecanismo exacto de transferencia de electrones al NAD+ no se conoce en sutotalidad, lo que se sabe es que la XDH pasa por varios estados de reducción(ganando 2 o 4 e–), y que el NAD+ se une a la enzima cuando está reducida concuatro e-, más tarde hay una transferencia de dos protones, lo cual forma alNADH.

Debido a que el aceptor final de electrones preferido por la enzima es elNAD+, la generación de O2

• por la XDH es muy limitada cuando este sustratoestá presente. No obstante, se ha visto que cuando el NAD+ se convierte aNADH, la XDH puede empezar a funcionar como una NADH oxidasa. Esto sig-nifica que los electrones del NADH se transfieren al FAD, y más tarde reducen


XOR-Mo(VI) f o r ma o xidada

XOR 2e -Mo(IV) f o r ma reducida

Ácido Xantina

B

C

XOR XOR 4e XOR 2e XOR 6e XOR 2e

H 2

O 2

O 2

H 2

O 2

O 2

O 2

O 2

O 2 • O

2 •

Ácido úrico Xantina

Mo(IV) [2 F e-2S] [2 F e-2S] F AD

H 2

O 2

O 2

2e

A

-

-

- - - -

FFiigguurraa 66--44.. Mecanismo de acción de la XOR y generación de especies reactivas de oxígeno.AA)) Semirreacción reductora. BB)) Semirreacción oxidante. CC)) Formación de especies reactivas de oxígeno.

al O2 produciendo O2•. Esta actividad de NADH oxidasa puede llegar a ser hasta

de 40% de la actividad total de la XDH en presencia de xantina. Al contrario delo que sucede con la XDH, la XO reacciona de manera deficiente con el NADH.

El radical O2• producido ya sea por la XO o por la XDH, puede combinarse

con óxido nítrico (NO•) para formar al peroxinitrito (ONOO–).

❚ EFECTOS FISIOLÓGICOS Y PATOLÓGICOS DE XOR

Por muchos años se pensó que el único papel de la enzima XOR era el catabo-lismo de las purinas, pero evidencia reciente ha demostrado que tiene propiedadesantimicrobianas, ya que inhibe el crecimiento de las bacterias de una maneradependiente del óxido nítrico NO•. Sin embargo, aunque la XOR participa en elsistema de defensas antimicrobianas, su participación al parecer no es esencial.

Por otro lado, la producción de ácido úrico por parte de la XOR puede en símismo tener efectos más importantes que tan sólo la degradación de las purinas,ya que se ha reportado que el ácido úrico tiene propiedades antioxidantes. Elhecho de que los humanos, a diferencia de otros mamíferos, tengan la uratooxi-dasa inactivada, causa que se acumulen a altos niveles de ácido úrico, lo cualpudiera servir como una ventaja, ya que la hiperuricemia mantiene estable losniveles de presión arterial aun cuando la ingesta de sal es baja. Asimismo, se hasugerido que el ácido úrico contribuye al aumento de la longevidad en humanos,ya que provee protección antioxidante, por lo que retrasa el fenómeno del enve-jecimiento y minimiza el riesgo de cáncer, siempre y cuando no se complique su acumulación, como en el caso de la gota.

El papel patológico de la XOR evidentemente se asocia a la producción de lasespecies reactivas de oxígeno en cuanto al daño estructural a los tejidos y a lainterferencia de vías de transducción de señales. Una de las principales suposicio-nes es que la XOR genera al radical O2

• y al H2O2 durante el daño por isquemiadebido al catabolismo del ATP durante la hipoxia, y después disminuye la dispo-nibilidad de aceptores de electrones al momento de la reperfusión. Respecto a laproducción del peroxinitrito (ONOO–), se ha demostrado que disminuye la fun-ción contráctil en el miocardio. Además, recientemente se ha encontrado queexiste una relación espacial y temporal directa entre la enzima óxido nítrico sin-tasa (NOS) y la XOR, lo que sugiere un nuevo modelo de cooperatividad entrelas enzimas durante la fisiopatología de las enfermedades cardiacas.

Por si fuera poco, se propone que además del daño cardiovascular directo, lasespecies reactivas de oxígeno producidas por la XOR interfieren con la señaliza-ción celular, modificando a las proteínas con grupos tioles involucradas en elmetabolismo del calcio, como el receptor de rianodina y la ATPasa de calcio, porlo que todo ello contribuye a la disfunción del miocardio.©

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❚ CONCLUSIONES

La enzima XOR está ampliamente distribuida en los tejidos de los mamíferos yotros organismos, y se acepta que su papel es clave en el catabolismo de las puri-nas. Cataliza la oxidación de una gran diversidad de sustratos y puede transferirelectrones al oxígeno molecular generando especies reactivas de oxígeno y des-pués de nitrógeno.

Mientras que la XOR se ha implicado en el daño por hipoxia-reperfusión, suparticipación en los procesos fisiológicos normales ha sido menos estudiada. Seha sugerido que las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno derivadas del meta-bolismo de la XOR juegan un papel en la inmunidad innata, de manera específicaen la respuesta inflamatoria y la defensa antimicrobiana del aparato digestivo.También se ha propuesto que las especies reactivas de oxígeno derivadas de laXOR pudieran estar involucradas en la señalización y metabolismo de xenobió-ticos.

Todo lo anterior hace suponer que el papel de la enzima XOR es aún contro-vertido, y que tanto su buen funcionamiento como la regulación entre la formade XO y XDH son factores muy importantes para la homeostasia tanto celularcomo del organismo.

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SSEECCCCIIÓÓNN IIVV..DDAAÑÑOO AA BBLLAANNCCOOSS CCEELLUULLAARREESS

7. Daño a proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

8. Daño al DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

9. Daño a lípidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

10. Concepto epigenético y sus alteraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

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DDAAÑÑOO AA PPRROOTTEEÍÍNNAASS

Martha Zentella de PiñaEnrique Piña

❚ INTRODUCCIÓN

El estrés oxidativo puede dañar a las proteínas de manera similar a como ocurreen otras macromoléculas. Sin embargo, para el caso de las proteínas, la situaciónes más compleja por dos razones. Por un lado, la oxidación parcial y selectiva enalgunos casos produce proteínas modificadas que pueden actuar como modula-dores en algunas reacciones, favoreciendo la homeostasia celular. En este caso, laoxidación de proteínas tendría un papel totalmente fisiológico. Pero por otrolado, existe una gran cantidad de agentes que oxidan y pueden dañar a las pro-teínas, por lo que en este capítulo se revisa principalmente el tema de los dañosprovocados por las especies reactivas de oxígeno en las proteínas.

Los estudios sobre la oxidación de los lípidos y el DNA tuvieron durante añosmayor relevancia que los de la oxidación de las proteínas. Tal vez sucedió asídebido a que los lípidos y el DNA ofrecen un número más limitado de sitios reac-tivos y el análisis de las reacciones y productos es más accesible, mientras que lasituación de las proteínas es más compleja, con mecanismos de reacción compli-cados y numerosos productos de las reacciones.

Los principios básicos que gobiernan la oxidación de las proteínas fueron esta-blecidos por trabajos pioneros en este campo, y se iniciaron desde 1906. En

77

dichos trabajos se caracterizaron los productos de reacción formados cuando lasproteínas se trataron con radiaciones ionizantes, bajo condiciones en las que sólose producen radicales hidroxilo (•OH) y radicales superóxido O2

• (junto con suforma protonada HO2

•), o la mezcla de todos ellos. Los resultados indicaron quecon el modelo experimental seleccionado, el •OH es el iniciador de la oxidaciónde las proteínas; sin embargo, el curso del proceso de oxidación está determina-do por la disponibilidad de oxígeno singulete (1O2) y el radical O2

•. Además, seha demostrado que otras especies reactivas de oxígeno producen resultadossemejantes, e incluso los metales de transición pueden sustituir al •OH y al O2

•

en algunas reacciones.Muy pronto se hizo evidente que el estudio del daño inducido por dichas espe-

cies en las proteínas se dificulta por un sinnúmero de factores. Desde luego, comoen el caso de cualquier otra reacción química, la velocidad de la reacción depen-de de la concentración de las sustancias reaccionantes (proteínas y especies reac-tivas de oxígeno) y la constante de velocidad del oxidante con la molécula blanco.La molécula blanco es la cadena proteínica dada por los enlaces peptídicos, quepor lo general se identifica como la columna vertebral de la proteína. Pero tam-bién son molécula blanco todos los grupos químicos unidos al carbón α de cadauno de los aminoácidos que integran la proteína. Entonces, al estudiar el dañoinducido por las especies reactivas de oxígeno en las proteínas hay que conside-rar lo siguiente:

• Localización de los grupos químicos que son blanco de las especies reac-tivas de oxígeno, las cuales muestran diferente reactividad si se encuen-tran en un ambiente hidrofílico o hidrofóbico.

• Interacción de los diferentes grupos químicos de los aminoácidos entresí, en ausencia y en presencia del oxidante.

• Presencia de daño secundario (reacciones en cadena y procesos de trans-ferencia de daño).

• Aparición de reacciones atrapadoras de oxidantes.• Reacciones de reparación de los daños iniciales, muy comunes en condi-

ciones in vivo (efectuadas por agentes ajenos a las especies reactivas deoxígeno y al grupo químico blanco afectado).

De los factores enunciados, los que determinan la velocidad a la cual una reac-ción particular se llevará a cabo son la reactividad entre el oxidante y la biomo-lécula blanco, así como la localización de esta última. Los otros factores más bienmodulan el grado en el que la reacción sucede.

En la figura 7-1 se representa un equilibrio dinámico muy general entre lasproteínas dañadas y su reparación. Como se observa en esta figura, el equilibriodepende de la velocidad de biosíntesis de cada proteína en particular, de la modi-


ficación oxidativa de esas proteínas y de la velocidad de reparación o degradaciónde cada una de ellas. Es importante añadir que la degradación y la reparación sehacen menos eficaces con la edad, lo cual lleva a la acumulación de proteínasdañadas y a la formación de agregados. Además, es bien sabido que las proteí-nas modificadas por oxidación se acumulan durante el envejecimiento, el estrésoxidativo y en algunas condiciones patológicas.

❚ REACCIONES ENTRE LAS ESPECIES REACTIVASDE OXÍGENO Y LAS PROTEÍNAS

Es fundamental recordar que las proteínas son, después del agua, el componentemás abundante de cualquier sistema biológico, ya sean células o tejidos, tal comose observa en los ejemplos del cuadro 7-1. Incluso en materiales celulares conmayor proporción de lípidos, por ejemplo en las proteínas de baja densidad(LDL) en membranas celulares, las proteínas son las moléculas más abundantes:una proteína LDL, la apolipoproteína B-100, conforma 25% de la masa de laslipoproteínas, y la membrana plasmática de muchas células contiene de 50 a 60%de proteína, calculada por peso seco.©

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Daño a proteínas • 99

Glucación Oxidación Glucooxidación

Proteasoma (citosol y núcleos)

Lon proteasa (mitocond r ia) De gr adación Biosíntesis

A g regació n Conjugación con lípidos

Daño

Reparación

Aminoácidos Aminoácidos

Sulfóxido reductasa

Sistema péptido metionina

P R O TEÍNA N A TI V A

P R O TEÍNA D AÑA D A

+ + +

+ + +

+

FFiigguurraa 77--11.. Equilibrio entre las proteínas nativas y las proteínas que han sido sujetas a una modifi-cación oxidativa. En un lado de la balanza para mantener las proteínas en su estado nativo se con-sidera la biosíntesis de dichas proteínas y los sistemas de reparación, una vez que las proteínas hansido oxidadas y que incluyen el sistema de la sulfóxido reductasa y el sistema péptido metionina.En el otro lado de la balanza, el daño de la proteína ocurre por la oxidación o la conjugación conlípidos o carbohidratos; una vez dañada la proteína, ésta se agrega y forma precipitados, o bien, esdegradada en el citosol y en el núcleo por el proteosoma y en las mitocondrias por la Lon proteasa.

CCuuaaddrroo 77--11.. CCoommppoossiicciióónn aapprrooxxiimmaaddaa ddee mmaatteerriiaalleess bbiioollóóggiiccooss eenn ddiissttiinnttaass mmuueessttrraass

HHííggaaddoo LLeeuuccoocciittooss PPllaassmmaa((gg//kkgg ddee ppeessoo hhúúmmeeddoo)) ((gg//11001122 ccéélluullaass)) ((gg//ddmm33))

RNA — 8.5 0.1Colesterol 3.6 2.2 0.2Lípidos 49.4 15.7 >0.1DNA 2.1 6.1 —Proteína 146.4 100.0 73.0

Cuadro elaborado a partir de los datos publicados por M.J. Davis

Las constantes de velocidad para las reacciones entre las diversas especies reac-tivas de oxígeno (•OH) y las biomoléculas varían, de aquí que la velocidad totalde la reacción, que es el producto de la constante de velocidad por la concentra-ción de la molécula blanco, estará determinada principalmente por la concen-tración de la molécula blanco, que para el caso de las proteínas es mayor que lade los ácidos nucleicos o de los lípidos. Este dato subraya la dificultad en el dise-ño de estrategias antioxidantes que puedan competir con éxito con el daño oxi-dativo que reciben las proteínas, dado que la mayor parte de los antioxidantesestán presentes a concentraciones micromolares, comparados con las concentra-ciones milimolares de las moléculas blanco.

❚ ACUMULACIÓN DE PROTEÍNAS OXIDADAS

En los capítulos anteriores se describieron los diferentes procesos fisiológicos ydel ambiente que llevan a la formación de especies reactivas de oxígeno y nitró-geno (figura 7-2). Cualquiera de ellos es potencialmente capaz de promover laoxidación de las proteínas, pero también depende, en diversa medida, de otrasproteínas presentes en la célula. Por ejemplo, la reacción de Fenton es dependien-te de hierro y cobre, los cuales a su vez están determinados por la concentraciónde metaloproteínas (ferritina, transferrina, lactoferrina y ceruloplasmina, inclui-das en la figura 7-2). El nivel tisular de las especies reactivas de oxígeno está rela-cionado con la concentración de vitaminas (A, C y E) y metabolitos (ácido úrico,albúmina, bilirrubina), que son secuestradores de radicales libres o facilitadoresde la regeneración de los metabolitos que hacen eso. Por último, los quelantes deiones metálicos pueden suprimir o aumentar la velocidad de regeneración de lasespecies reactivas de oxígeno, formando complejos con hierro o cobre, que inhi-


ben su habilidad para catalizar la formación de dichas especies o alteran los poten-ciales redox, y por tanto, su habilidad para desarrollar interconversión entre losestados oxidados y reducidos.

Respecto a la concentración de proteasas, cabe mencionar que algunas formasde proteínas oxidadas (proteínas con entrecruzamientos modificados por glica-ción, o por productos de la lipoperoxidación) no sólo son resistentes a la proteó-lisis, sino que pueden inhibir la habilidad de las proteasas para degradar lasformas oxidadas de las proteínas. La acumulación de proteínas oxidadas es la basede un conjunto de posibles problemas para las células y los individuos, y en parte de-pende de la eficacia de los sistemas responsables para la eliminación de las pro-teínas modificadas por la oxidación.

En el citosol y en el núcleo existen proteosomas, y en la mitocondria son lasLon proteasas las encargadas de degradar las proteínas oxidadas. Las células cuen-©

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Prooxidantes

Inflamación

Neutrófilos Macró f agos

RH o xidasas

E n v ejecimiento

Arginina NOS

Cadena respi r ato r ia micotond r ial

Etanol

Lipoper o xidación

Productos de la glucación y la glicoperoxidación

F actores reguladores Ubiquitina

RSH Metales

T r ansc r ipción Síntesis

Péptidos Aminoácidos

Proteínas resistentes a proteasas (por entrec r uzamiento)

Proteínas o xidadas

Carbonilos Aminoácidos

o xidados Péptidos

Metabolitos y vitaminas

Vitaminas A, C y E Bilir r ubina Ácido ú r ico GSH/GSSG NAD(P)H/NAD(P) Zn, Mg, Mn Lipoato

Antioxidantes

Superóxido dis m utasa Catalasa Glutatión per o xidasa Glutatión reductasa Metionina sulfóxido

reductasa Tiol per o xidasa Ce r uloplasmina F er r itina T r ans f er r ina Albúmina

Polución atmosférica

Proteínas (enzimas) nati v as

Proteínas (enzimas)

EOR

Proteasas

+

+

–

–

X

UV

FFiigguurraa 77--22.. Agentes prooxidantes y activadores de proteasas que favorecen la oxidación y degrada-ción de proteínas y agentes antioxidantes que activan la oxidación y degradación de las proteínasen las células.

tan con enzimas específicas para la reparación. La tiorredoxina reductasa es capazde revertir los productos de oxidación de la cisteína a cistina. La metionina puedeoxidarse a su sulfóxido creando un nuevo centro de asimetría con dos estereoi-sómeros S y R que pueden ser reducidos por metionina sulfóxido reductasas A(MsrA) y B (MsrB), respectivamente. La oxidación de los residuos de metioninasepultados al principio pueden tener efectos consecutivos sobre la estructuraproteínica; la flexibilidad de esta cadena lateral también puede permitir cambioslocales en la estructura que ocurren más rápido que con grupos más grandes yrígidos, dando cambios más grandes en la estructura total que se requieren parapermitir el acceso de la fase acuosa al residuo oxidado.

❚ SITIOS DE DAÑO PROTEÍNICO: SELECTIVIDAD DEL MISMO

La intensidad del daño va de acuerdo con la selectividad del oxidante; en gene-ral, entre más reactivo sea el oxidante, su selectividad será menor y viceversa.Por ejemplo, el radical •OH reacciona con diferentes cadenas laterales de unaproteína con una constante de velocidad relativamente pequeña (kca de 10-7 a10-10 dm3mol-1seg-1), de manera que todas las cadenas laterales se oxidan enmenor o mayor grado, aunque las cadenas laterales aromáticas, o las que contie-nen azufre, se afectarían más rápido. La abstracción de hidrógeno del esqueletode carbono por radicales hidroxilo ocurre con una kca de velocidad de alrede-dor de 10-9 dm3 mol-1seg-1; este radical causa consistentemente daño en el es-queleto de carbono y en las cadenas laterales, con la consecuente fragmentaciónde las proteínas. Como muchas de las especies reactivas de oxígeno generadasen los sistemas biológicos son deficientes en electrones (oxidantes electrofíli-cos), tienden a reaccionar más rápido con cadenas laterales ricas en electrones,por ejemplo, los residuos de los aminoácidos triptófano, tirosina, histidina, me-tionina, cisteína y fenilalanina.

Los oxidantes menos reactivos son más selectivos para actuar en el sitio queoxidan, por ejemplo, la constante de velocidad para la reacción del radical peró-xido sustituido CCl3OO• con las cadenas laterales de un aminoácido varían dekca 9 x 10-7 dm3mol-1seg-1 para residuos de triptófano, hasta más abajo del lími-te detectable, lo cual es consistente con un daño mucho más selectivo producidopor este oxidante.

Oxidación del esqueleto de carbono en las proteínas

El ataque oxidativo al esqueleto de carbono de un polipéptido por lo general seinicia por el ataque de un •OH que abstrae un átomo de hidrógeno del carbono-


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α de un residuo de aminoácido para formar H2O, dejando en la proteína un radi-cal centrado al carbono (reacción a en la figura 7-3). El radical centrado recién for-mado reacciona rápido con 1O2 para producir un radical alquilperoxilintermediario (reacción b en la figura 7-3), el cual puede dar lugar al radical alquil-peróxido (reacción c en la figura 7-3) seguido de la formación de un alcohoxirra-dical (reacción d en la figura 7-3), la cual da lugar al derivado hidroxilproteína(reacción e en la figura 7-3). Los pasos de esta secuencia de reacciones están sig-nificativamente mediados por interacciones con •OH o con HO•

2, aunque tam-bién pueden ser catalizados por Fe2+ o por Cu+. Los radicales alquilo,alquilperoxilo y alcohoxilo, intermediarios de esta vía, pueden generar reaccionescon otros aminoácidos en la misma o de otra molécula de proteína para produ-cir un nuevo radical centrado al carbono (reacciones tipo 1), capaz de conducirreacciones similares a las ilustradas en figura 7-3.

Reacciones tipo 1

Más aún, cuando se evita la reacción b de la figura 7-3 en ausencia de oxíge-no, el radical centrado al carbono puede reaccionar con otro radical centrado enel carbono y formar un nuevo derivado por el entrecruzamiento proteína-pro-teína (reacción tipo 2).

Reacción tipo 2


C• + R2

radical alquilo

radical aquilperoxilo

radical alcohoxilo

R1 CH C•R2 + R1

CH

C•R2 + R1 OOH• + R2R1OO CH

+ R1 OOH C•R2 O• + R2R1 CH

C• • + R4

R3 C CR3 CR4

La velocidad de reacción entre el esqueleto de carbono de las proteínas y lamayor parte de los oxidantes que no son radicales libres es baja, y por eso el dañoes pequeño. En contraste, los radicales libres reaccionan rápido con el esquele-to de carbono de las proteínas mediante la abstracción de un átomo de hidrógenode carbono-α, el sitio de unión de las cadenas laterales de los aminoácidos, paradar un radical estable, centrado en el carbono (reacción tipo 2; vía electrón des-localizado por el carbonilo vecino y el grupo funcional nitrogenado).


Entrec r uzamiento de proteínas

Productos de la glucación y la

glicoper o xidación

De r i v ado hidr o xil proteína

F e 2+ + H

+

F e 3+

R

–NH-CHCO–

a • OH H

2 O

–NH-C-CO– •

R

O 2

b

R

–NH-C-CO–

O O

•

R adical cent r ado al carbono (alquilo)

–NH-C-CO–

HO 2

O 2

c

R adical alquilper o xil

F e 3+ , • OH R a y os o r a F e 2+

y os X

H 2 O H 2 O

2

O 2 HO 2

e

• R –NH-C-CO–

O

H 2 O + O 2 HO 2 d

•

•

R –NH-C-CO–

O O H

Ruptu r a de la unión peptídica

F e 3+ F e 2+ + H + F e 3+ +

• OH F e

2+ R adical alcoh o xil R adical alquilperóxido

•

FFiigguurraa 77--33.. Oxidación de proteínas mediadas por especies reactivas de oxígeno. En las reaccionesen las que participa el Fe2+, éste puede ser sustituido por Cu2+.

Oxidación de las cadenas laterales de los aminoácidos de las proteínas

Todos los residuos de aminoácidos son susceptibles a ser oxidados por el radical•OH. Sin embargo, los productos formados en la oxidación de algunos residuos nohan sido completamente caracterizados. Las 20 cadenas laterales de los aminoáci-dos ofrecen una gran variedad de sitios potenciales de reacción y productos dereacción con oxidantes. Para una discusión más fácil se presentarán por separadolas reacciones de oxidación de los aminoácidos alifáticos, aromáticos y azufrados,en particular cisteína, cistina y metionina.

Residuos alifáticos durante la oxidación de proteínas

La mayor parte de las reacciones de oxidación de los residuos alifáticos en lasproteínas ocurre al reaccionar con los radicales más reactivos, y dan lugar a radi-cales centrados en el carbono con eliminación del átomo de hidrógeno, puedensuceder en todos los sitios disponibles. Se consideran tres destinos principales deestos radicales centrados en el carbono: la dimerización con otros radicales, en lacual se generan entrecruzamientos dentro de la misma proteína, así como entrepolipéptidos y otras proteínas. Esta reacción se ha descrito cuando se someten lostejidos a periodos de anoxia, y se ha reportado que los dímeros tienen un papelimportante en la agregación de proteínas. Un segundo destino es hacia la repara-ción de los radicales centrados en el carbono por medio de tioles, resultando enla formación del radical tiilo (R-S•). Estas reacciones están en equilibrio, por loque el grado de reparación, en contraste con el de oxidación de la cadena lateralpor los radicales tiilo, depende de la naturaleza exacta de cada una de las espe-cies involucradas. El tercer camino de los radicales centrados en el carbono es elque ocurre con más frecuencia en condiciones de oxigenación, estos radicalesreaccionan con el 1O2 para producir peroxilo, cuyo destino no está definido porcompleto, pero en experimentos con modelos de compuestos se sabe que pue-den originar la terminación de las reacciones radical-radical que generan ácidos,peróxidos, alcoholes y carbonilos (algunos ejemplos de productos obtenidos conaminoácidos alifáticos y azufrados se incluyen en el cuadro 7-2), aun cuando otraalternativa es la producción de radicales alcohoxilo y 1O2. A su vez, los radicalesalcohoxilo, mediante la eliminación de átomos de hidrógeno, generan compues-tos carbonilo, o bien constituyen un proceso de propagación de los radicales li-bres cuyas moléculas blanco con las que reaccionan incluyen DNA, lípidos yotras proteínas.

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Generación de derivados carbonilos durante la oxidación de proteínas

Como se ha hecho notar, la ruptura oxidativa de las proteínas ya sea por vía dela α-amidación (figura 7-4) o por oxidación de las cadenas laterales del Glu (reac-ción 3), conduce a la formación de dos péptidos:

Reacción tipo 3

Además, la oxidación directa de los residuos de lisina, arginina, prolina y treo-nina, pueden producir también grupos carbonilos. Por otra parte, los grupos car-


CCuuaaddrroo 77--22.. PPrroodduuccttooss eessttaabblleess ffoorrmmaaddooss aa ppaarrttiirr ddee llaa ooxxiiddaacciióónn ddee aammiinnooáácciiddooss aalliiffááttiiccooss yy aazzuuffrraaddooss yy ddee llaass ccaaddeennaass llaatteerraalleess

ddee ddiicchhooss aammiinnooáácciiddooss eenn llaass pprrootteeíínnaass

AAmmiinnooáácciiddooss oo rreessiidduuoo PPrroodduuccttoossArginina Ácido 5 hidroxi-2-amino valérico

Compuestos carboniloCisteína Cistina (disulfuro)

Oxiácidos (RSO2H, RSO3H)Sulfonamidas

Glicina Ácido aminomalónicoIsoleucina Alcoholes

Compuestos carboniloLisina Alcoholes

Compuestos carboniloMetionina Sulfóxido de metionina

Metionina sulfonaProlina Alcoholes

Ácido 2 hidroxi-5-amino valéricoCompuestos carbonilo

Valina AlcoholesCompuestos carbonilo

No se incluyeron en la lista los compuestos formados de carácter inestable, los más comunes para la mayor

parte de los aminoácidos incluidos fueron hidroperóxidos.

• OH, HO2•, O2

R1CONHCHCONHR2 R1CONH2 + CH3 COCONHR2 + COOH + H2O2

COOH

(CH2)2 COOH

bonilos pueden ser introducidos en las proteínas por reacciones con aldehídos(malondialdehído, 4-hidroxi-2-nonenal) producidos durante la lipoperoxidación(figura 7-5). Una reacción muy similar ocurre cuando el 4-hidroxi-2-nonenal(4HNE) es sustituido por el malondialdehído (MDA). Asimismo, se puede incor-porar un grupo carbonilo a una proteína al reaccionar residuos de lisina con azú-cares reductores o de sus productos de oxidación (reacciones de glucación yglucosilación, figura 7-6). Por tanto, la presencia de grupos carbonilo en las pro-teínas se ha empleado como un marcador de oxidación de proteínas mediada porespecies reactivas de oxígeno, y se han diseñado varios métodos sensibles paradetectar y cuantificar los grupos carbonilo en las proteínas, lo que ha permitidoestablecer que la oxidación de proteínas se asocia al estrés oxidativo, enfermeda-des y por último al envejecimiento.©

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b

a

NH 2 – C - C-NH-C-C-NH-C-C–O

NH 2 –C-C-NH + R2 –C-C-NH-C-C–O

NH 2 – C- C-NH- C + O=C=N-C-C–

O O H O

O

H

O O O H O H

O O O H O H

R1

R1 R3

R2 R3

R1 R2 R3

•

FFiigguurraa 77--44.. Ruptura de la unión peptídica vía formación de una diamina (aa) o vía α-amidación (bb).

Residuos aromáticos en la oxidación de proteínas

Los residuos aromáticos son, entre todos los residuos de los aminoácidos, losblancos preferidos para el ataque por las especies reactivas de oxígeno. Como semuestra en el cuadro 7-3, los residuos de triptófano son rápidamente oxidados aformilquiniurenina y quinurenina y otros hidroxiderivados. La fenilalanina y latirosina, al oxidarse, producen varios hidroxiderivados, y a su vez los residuos dela histidina dan lugar a 2-oxohistidina, asparragina y ácido aspártico.

Con el descubrimiento del óxido nítrico como producto normal del metabolis-mo de la arginina y como mensajero intercelular, se encontró que reacciona rápi-do con el O2

• para formar peroxinitrito (ONOO––), cuyos efectos biológicos sonde suma importancia, sobre todo en la regulación de varias funciones celulares.

La metionina y la cisteína son particularmente vulnerables a la oxidación porONOO–, mientras que la tirosina y el triptófano son blancos selectivos para lanitración por el mismo. La nitración de los residuos de tirosina resulta de sumaimportancia, ya que impide la habilidad de la tirosina para llevar a cabo la inter-conversión cíclica entre formas fosforiladas y desfosforiladas, o entre las formasno modificadas y las nucleotidiladas. La demostración de que la nitratación de losresiduos de tirosina en sustratos modelos previene la fosforilación de los mismospor la proteína tirosina cinasa, apoya también la posibilidad de que la nitrataciónparticipe de manera activa regulando la función.

La habilidad del ONOO– para nitratar a los residuos de tirosina y oxidar losde metionina de las proteínas, depende de la disponibilidad de CO2. En ausencia de CO2, el ONOO– está en equilibrio con su forma activa, de estructura desco-nocida, que reacciona rápido con residuos de metionina para formar sulfóxido demetionina (MeSOX); pero en presencia de CO2, el ONOO– es instantáneamente


HN

HC-CH C = O

R2

R1 R3

R HN 3 HO-HC HC HC

HC-CH2-CH

2-CH

2-NH

2- + CH CH O CH2-CH2-CH2N-CH

HC C = O2

O

R2 HO

R1

HC

Lisina deuna proteína

4-hidroxi-2-nonenal Proteína concarbonilo

FFiigguurraa 77--55.. Introducción de un grupo carbonilo a una proteína. La reacción se ejemplifica aquí conun residuo de lisina, pero puede ocurrir también con el grupo –SH de un residuo de cisteína o conun nitrógeno del grupo imidazol de la histidina. El residuo de alguno de estos aminoácidos en unaproteína reacciona con un aldehído, en este caso el 4 hidroxi-2-nonenal, generado por la lipoperoxi-dación de ácidos grasos poliinsaturados, y el aducto que forman tiene incorporado un grupo carbonilo.

convertido a un derivado (O = NOOCO2 o O2NOCO–2) que puede nitratar com-

puestos aromáticos. Como tales, la nitratación de la tirosina y la oxidación de resi-duos de la metionina en las proteínas son procesos mutuamente excluyentes, queestán regulados en forma diferencial por la disponibilidad de CO2 (figura 7-7).

Oxidación de cisteína y metionina

Los residuos de cisteína y metionina son muy sensibles a la oxidación por casitodas las formas de especies reactivas de oxígeno. Bajo condiciones moderadas, lacisteína es convertida a disulfuro, y los residuos de metionina a sulfóxido demetionina. Casi todos los sistemas biológicos contienen tanto disulfuro reducta-sas como sulfóxido metionina reductasas, que pueden convertir a los residuosoxidados de cisteína y metionina a las formas originales.

La facilidad con la que se oxidan la cisteína y la metionina hacen de estos resi-duos los sitios más susceptibles de oxidación dentro de las proteínas. Dicha oxi-dación puede suceder vía directa interactuando con el oxidante, o mediante latransferencia de radicales dentro de una proteína después de una oxidación en un©

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CCuuaaddrroo 77--33.. PPrroodduuccttooss eessttaabblleess ffoorrmmaaddooss aa ppaarrttiirr ddee llaa ooxxiiddaacciióónn ddee aammiinnooáácciiddooss aarroommááttiiccooss yy ddee llaass ccaaddeennaass llaatteerraalleess ddee ddiicchhooss

aammiinnooáácciiddooss eenn llaass pprrootteeíínnaass

AAmmiinnooáácciiddooss PPrroodduuccttoossFenilalanina 2 hidroxifenilalanina

3 hidroxifenilalaninaHistidina 2 oxohistidina

AlcoholProductos carbonilos

Tirosina Dos tirosinas unidas por un enlace C-CAlcoholesProductos ciclizadosN-formil kinureninaKinurenina

Triptófano 5-hidroxitriptófano7- hidroxitriptófanoAlcoholesProductos ciclizados

No se incluyeron en la lista los compuestos formados de carácter inestable, fueron hidroxiperóxidos para 3 delos 4 aminoácidos incluidos. Tampoco se anotaron los derivados obtenidos con el tratamiento de agentes oxi-dantes conteniendo halógenos o nitrógeno en su molécula.

sitio lejano. Con la mayor parte de los radicales oxidantes se forman los radicalestiilo (R-S•), cuyo destino puede ser la dimerización para producir el dímero (cis-tina), o la reacción con oxígeno para formar el radical peroxilo, se trata de proce-sos competitivos. El destino último del radical peroxilo es la formación deoxiácidos (RSO2H y RSO3H).

La formación de disulfuros (R-S-S-R) es una de las pocas “lesiones” por oxida-ción de las proteínas que pueden ser reparadas con rapidez, ya que la mayor partede los sistemas biológicos cuentan con reductasas y disulfuro isomerasas que man-tienen los residuos de cisteína en su forma reducida. En la actualidad se puedeasegurar que la oxidación controlada de los residuos de cisteína y la reducción de la cistina constituyen un mecanismo de alternancia del estado redox que con-trola la estructura y función de gran número de proteínas clave.

La oxidación de los residuos de cistina se ha estudiado menos que la oxidaciónde los residuos de cisteína, pero también ocurren rápido. La oxidación de talesresiduos sucede por varios caminos, y comprende la formación inicial de una es-pecie de aducto y la subsecuente y rápida reacción para formar finalmente espe-cies oxigenadas como el monosulfóxido (RSS[ = O]R).

El grupo funcional tioéter (R-S-R) de la metionina es rápidamente oxidadopor un gran número de especies debido a su bajo potencial de oxidación. De par-ticular importancia es la facilidad con la que la metionina libre reacciona con elHOCl y el HOBr, lo cual explica el uso común de la metionina como atrapadorde estos oxidantes.

El principal producto resultante de la oxidación de la metionina en la mayorparte de los péptidos y proteínas es el sulfóxido correspondiente; oxidacionesposteriores de estas especies forman las sulfonas, aunque éstas ocurren en unaproporción mucho menor. Es importante anotar que son dos los sulfóxidos gene-


CHO C=O (HCOH)n-1 R

C=N-P (HCOH)n

R

C-NH-P

C=O (HCOH)n-1 R

CH=N-P C=O (HCOH)n-1 R

P-NH2 + (Lis)

CHO (HCOH)n R

O2, Me2+

P-NH2

FFiigguurraa 77--66.. Formación de proteína carbonilo por glucación o glucoxidación.

rados, el D– y el L–. Este hecho tiene repercusiones importantes durante la repa-ración de las lesiones oxidantes, ya que la reducción es estereoespecífica. La rela-ción de los dos isómeros varía con los diferentes oxidantes, y también con losdiferentes residuos de metionina en una proteína; algunas evidencias sugierenque la estructura proteínica, al menos in vitro, es el factor más importante en elcontrol del isómero predominante. Lo anterior resulta evidente en experimentosin vitro; sin embargo, no se dispone de información suficiente para valorar lareparación tal como ocurre in vivo, ya que dicha reparación se sobrepone alrecambio de la proteína, con lo cual se afecta a la población.

El H2O2 puede oxidar a los residuos de metionina en los sitios activos de variasenzimas, y como consecuencia, de tal oxidación puede resultar una pérdida de laactividad enzimática. Los alquilperóxidos pueden inducir la oxidación de la me-tionina en algunas proteínas, pero no en todas. Además, los residuos de metioni-na pueden ser oxidados por algunos péptidos y peróxidos de proteína. Tambiénlos lipoperóxidos pueden oxidar a la metionina de las proteínas, así como tam-bién mezclas de lipoproteínas oxidadas y lipohidroperóxidos en las lipoproteínasde baja y alta densidad.©

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2 2

2

+

2

+

et M

[ONOO*] MeS O X

HONOO

[ONOOCO NO TIR

Tir

CO

H

CO

H

- - ]

FFiigguurraa 77--77.. La posibilidad del peroxinitrito (PN) para nitratar los residuos de tirosina de las proteí-nas depende de la disponibilidad de CO2. En ausencia de CO2, el PN está en equilibrio con laforma activa (PN*) de la estructura desconocida, pero reacciona rápido con residuos de metioninapara formar metionina sulfóxido. En presencia de CO2, el PN es casi instantáneamente convertidoa un derivado (quizá O = NO2CO2

– o O2 NOCO2), que puede nitratar compuestos aromáticos.

❚ CAMBIOS EN LA MOLÉCULA DE PROTEÍNAPRODUCIDOS POR LA OXIDACIÓN

Dimerización y fragmentación

Como puede deducirse de la información previa, la oxidación de las proteínasproduce cambios físicos importantes: desde la fragmentación del esqueleto hastala oxidación de las cadenas laterales de los residuos de los aminoácidos, que a suvez promueven directamente la dimerización o la agregación. El entrecruzamientodirecto sucede vía dimerización intermolecular radical-radical, mediante reaccio-nes que permiten entrecruzamientos de dos tirosinas. La dimerización secunda-ria de dos proteínas se establece a través de numerosas reacciones que incluyena los residuos que contienen grupos amino (lisina y arginina) con grupos carbo-nilo procedentes de las reacciones de oxidación. Por otra parte, las reacciones deentrecruzamientos y las especies formadas en algunos casos aún no han sidocaracterizadas totalmente.

Es de suponerse que algunas de las reacciones donde ocurre la descomposiciónde los productos formados éstos sean una fuente de radicales, los cuales puedenreaccionar con 1O2, por ejemplo, y producir radicales superóxido y H2O2. A suvez, de estos procesos pueden formarse nuevas especies reactivas de oxígeno, y laoxidación de proteínas puede suceder mediante reacciones “en cadena”.

Respecto a la fragmentación de las proteínas, la oxidación de radicales alcoho-xilo (figura 7-3, producto de la reacción dd) sienta la plataforma para la rupturade la unión peptídica, ya sea por medio de la diamida (figura 7-4a) o por la α-amidación (figura 7-4b); en ambas vías los extremos N terminal y C terminalson característicos. También puede suceder la ruptura de la unión peptídica enlas proteínas vía especies reactivas de oxígeno, que reaccionan con las cadenas late-rales de glutamil, aspartil y propil de la propia proteína. Por medio de una reac-ción de abstracción dependiente de •OH sobre el hidrógeno presente en el átomode carbono-γ del residuo de glutamil, el proceso químico puede continuar con unconjunto de reacciones análogas, que finalmente llevan a la ruptura de la uniónpeptídica por un mecanismo en el cual se forma ácido oxálico y el N-terminal delaminoácido del péptido derivado de la porción carboxilo terminal de la proteínaque al final será un derivado N del piruvato. Este caso se revisó al tratar la gene-ración de derivados carbonilo durante la oxidación de proteínas (reacción tipo 3).

También es posible cuantificar la fragmentación de proteínas con base en laobservación de que el número de péptidos formados durante la radiólisis de pro-teínas es aproximadamente igual al número de residuos de prolina presentes enla proteína, por lo que se propuso que la oxidación de la prolina conduce a laruptura de la unión peptídica. Esto ha sido verificado en experimentos donde sedemuestra que la oxidación de la prolina lleva a la formación de la 2 pirrolidona


y la ruptura concomitante de la unión peptídica. La hidrólisis ácida de la 2 pirro-lidona produce ácido 4 aminobutírico, la presencia de este ácido en hidrolizadosde proteínas es una evidencia presumible de la mencionada ruptura de la uniónpeptídica por la vía de la oxidación de prolina:

Reacción tipo 4

Desdoblamiento y cambios conformacionales

La oxidación de las cadenas laterales de los residuos de los aminoácidos en las pro-teínas puede provocar desdoblamientos y cambios conformacionales en las propiasproteínas, con consecuencias importantes sobre la función biológica desempeña-da. Existen estudios en los que se demuestra que la oxidación de tales residuosque se localizan en la superficie de la macromolécula tiene menos influenciasobre la conformación de la proteína que la oxidación de los residuos sepultadosen el seno de la misma. Además, estos últimos son más lentos para oxidarse (enocasiones requieren de condiciones más severas), sobre todo cuando el oxidanteiniciador está presente en la fase acuosa donde está embebida la proteína. Lamayor parte de los procesos de oxidación que suceden en las cadenas lateralesdan como resultado una mayor hidrofilicidad del residuo. Hay excepciones nota-bles, por ejemplo, la descarboxilación del ácido aspártico y del glutámico y ladesaminación de la lisina inducida por la descomposición del hidroperóxido y dela cloramina, respectivamente. Muchas uniones C-H de las cadenas hidrofóbicasen los residuos laterales de los aminoácidos se convierten en peróxidos, alcoholeso grupos carbonilo, que tienen momentos dipolo más grandes y pueden partici-par formando puentes de hidrógeno con las moléculas del solvente. La oxidaciónde muchos residuos aromáticos también pueden favorecer la incorporación degrupos con carga (hidroxil, peroxil, nitro, cloro y bromo sustituyentes, además de otros). De lo anterior se percibe la existencia de una ffuueerrzzaa ggeenneerraaddoorraa decambios en la conformación de proteínas, resultado de la oxidación de residuosde aminoácidos presentes en la superficie externa de la proteína, la superficiemás accesible al agua.

La cadena lateral de la metionina es relativamente no polar, por lo general seencuentra sepultada en regiones hidrofóbicas de la estructura proteínica, y suconversión al sulfóxido más polar tiene marcados efectos conformacionales, porlo que no es de sorprender que la oxidación de un residuo de metionina original-©

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R1CON R1CONCONHCHCO–

R2 R2

• OH, HO2•

O + CO2 + H2NCHCO– + H2O

mente sepultado, pueda tener consecuencias lesivas en la estructura y funciónproteínica. Mientras que la oxidación de un grupo de metionina en una cadenaperiférica en la región hidrofílica de la proteína no conlleva cambios en su estruc-tura y función.

Por ejemplo, la oxidación del residuo de metionina expuesto sobre la superfi-cie de varias proteínas no tiene ningún efecto sobre su estructura. En contraste,la oxidación de otros residuos internos de metionina puede resultar en cambiosdetectables en la estructura y en la interacción de otras moléculas. La oxidaciónde uno de los ocho residuos de la metionina (met 385) en el inhibidor de la pro-teinasa α-1, resulta en la pérdida de la inhibición de las elastasas por estas espe-cies. Igual sucede con la oxidación de una de las metioninas vecinales (met 146o met 147) en el dominio C terminal de la calmodulina, donde determina unapérdida de 30 veces en la afinidad por el Ca2+. Sin embargo, no en todos los casostienen efectos deletéreos; hay varios ejemplos donde la oxidación de los residuosde metionina que pasan a ser sulfóxidos resulta en un aumento de la actividad bio-lógica. La oxidación a sulfóxido del residuo de la met-1-de ubiquitina aumenta50% su reactividad, mientras que una mayor oxidación la lleva a sulfona, resul-ta en un descenso en la actividad.

Puede anotarse algo más sobre la oxidación de los residuos de metionina.Como en el caso de la oxidación de otras cadenas laterales de aminoácidos, se haempleado como marcador de la degradación de proteínas por la maquinaria celu-lar. Se ha propuesto que como consecuencia de la modificación oxidativa de lasproteínas resulta un aumento en el recambio de la proteína, aunque también secuenta con datos sobre una disminución de la velocidad de recambio para algu-nas proteínas muy modificadas. Por ejemplo, al oxidar a la calmodulina en resi-duos específicos de metionina hay evidencia de una mayor degradación por elproteosoma 20S, en cuyo caso la velocidad de degradación depende del grado demodificación de la proteína.

Transferencia del daño proteínico

Existe evidencia experimental de que la transferencia del daño proteínico inicia-do en las cadenas laterales alcanza la secuencia vertebral de la cadena proteínicapara lograr estabilizar el radical carbono-α deslocalizado. Los radicales alcohoxi-lo formados en el carbono-β (posición C-3) llevan a cabo una rápida escisión paradar un radical carbono-α y la liberación de la cadena lateral como un aldehído ocetona. El radical carbono-α reacciona con el esqueleto de carbono y ocasiona lafragmentación del mismo. De esta manera, se tiene un mecanismo mediante elcual la oxidación inicial de la cadena lateral da lugar a la fragmentación del es-queleto de carbono (figura 7-3).


Transferencia del daño de una cadena lateral de aminoácidos a otra cadenalateral de aminoácidos ubicada dentro de la misma proteína. La mayor parte deestas transferencias implican reacciones de un electrón. Se han identificado variosprocesos en los que se transfiere la oxidación del sitio inicial a los residuos que seoxidan rápido: triptófano, tirosina, histidina, cisteína y metionina. Estas reaccio-nes suceden a gran distancia en las estructuras proteínicas, y son importantes envarias actividades enzimáticas en las que participan.

Se ha demostrado que las reacciones de transferencia de electrones sucedendesde otros residuos, como tirosina y triptófano, para oxidar por ejemplo a losresiduos de metionina en los péptidos y las proteínas. Este proceso con frecuen-cia también implica a la cisteína y la cistina. La transferencia de especies reduc-toras a través de proteínas puede suceder después de la adhesión inicial de unelectrón.

❚ REPARACIÓN DEL DAÑO PROTEÍNICO

Tal como quedó expresado en el tema Acumulación de proteínas oxidadas (véaseantes) de este capítulo, cuando las proteínas contienen un daño importante en suestructura no son reparadas por los mecanismos presentes en la célula y su des-tino es el catabolismo. La excepción parece ser la formación de cistina y disulfu-ros mixtos, los cuales pueden reducirse rápido por una batería de reductasas oisomerasas y el sulfóxido de metionina. Varias proteínas han sido caracterizadasen E. coli, y por supuesto más tarde en otras células, incluyendo las de los mamí-feros, las cuales son capaces de reducir el sulfóxido de metionina al aminoácidooriginal. Algunas de las reductasas del sulfóxido de metionina (Msr, por sus siglasen inglés) son específicas para el sulfóxido de metionina libre, mientras que otrasreducen sólo a las especies contenidas en los péptidos o en las proteínas. Estas úl-timas son intracelulares y algunas isoformas están asociadas a la membrana. Laactividad reductora del sulfóxido de metionina no se ha reportado fuera de lascélulas; por lo que la presencia de sulfóxido de metionina en suero se considera unindicador de daño oxidativo presente in vivo. Las isoformas de esta enzima son és-teres específicos, y la forma MsrA sólo reduce al isómero D, y otra forma reciéndescrita, la MsrB, que reduce el isómero L.

La mayor parte de sistemas biológicos contiene reductasas de sulfóxidos(MrSOx-reductasa) que convierten las formas oxidadas de cisteína y metioninaa su formas originales no modificadas. Prácticamente son las únicas alteracionesde proteínas que pueden ser reparadas. Con base en la observación de que laoxidación preferencial de varios residuos expuestos en algunas proteínas tienepoco efecto sobre su función biológica, se ha propuesto que los residuos demetionina convertidos en el sulfóxido representan un sistema “amortiguador ©

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de sacrificio” para proteínas sometidas a una situación excesiva de oxidación. Deesta manera se resuelve la etapa transitoria de oxidación excesiva y las enzimascelulares pueden regenerar la proteína nativa sin que ésta pierda su función y sinlesionar irreversiblemente otras proteínas no provistas del amortiguador desacrificio.

❚ EXPERIMENTOS REALIZADOS EN EL LABORATORIODE LOS AUTORES

En trabajos realizados en el laboratorio de los autores se emplea un modelo deestrés oxidativo mediante la intoxicación aguda con etanol a una dosis alta (5 g/kgpeso corporal) VO. Se mide la presencia de grupos carbonilo en las proteínasplasmáticas mediante la técnica de Levine. El objetivo de los trabajos es definirsi los antiinflamatorios no esteroideos (AINE: ácido acetilsalicílico, naproxeno,nimesulida y piroxicam) evitan la oxidación de las proteínas séricas. Con susresultados han demostrado que la mayor carbonilación de las proteínas por laacción prooxidante del etanol es clara. Asimismo, han encontrado que la adiciónde ácido acetilsalicílico y piroxicam, en ausencia de etanol, también producen unaumento la carbonilación de proteínas. El efecto prooxidante del etanol es blo-queado por cualquiera de los cuatro AINE empleados. Incluso se abate el efectoprooxidante del ácido acetilsalicílico y el piroxicam cuando son aplicados sin etanol. Se desconoce el mecanismo de acción antioxidante de los AINE emplea-dos. Cabe comentar, en relación con los métodos empleados para medir carboni-los, que debe considerarse el tipo de muestras y la procedencia de las mismas; porejemplo, se ha documentado que en pacientes diabéticos ocurre mayor glucacióny glucosilación de las proteínas plasmáticas, lo cual puede arrojar datos erróneosdebido a que en este último caso la detección de carbonilos puede correspondera los carbohidratos unidos a la proteína y no a los carbonilos de los aminoácidosoxidados de la proteína.

❚ CONCLUSIONES

Las proteínas son los blancos más abundantes en las células y tejidos para losnumerosos agentes químicos y físicos que llegan a producir estrés oxidativo. Eldaño a proteínas por estrés oxidativo puede afectar tanto las cadenas laterales delos aminoácidos que la integran como la columna vertebral de la proteína. Lareacción de especies reactivas de oxígeno menos reactivas con residuos azufradosespecíficos de aminoácidos (–SH y –S–CH3) en las proteínas produce oxidación


del residuo, que se acompaña de un cambio en la estructura, función y actividad dela proteína, dicha oxidación es reversible. Las proteínas dañadas por oxidación noreversible son degradadas intracelularmente aun cuando en ocasiones se acumulanen las células y los tejidos; ambos procesos se asocian a numerosas enfermedadeshumanas, entre otras Alzheimer, síndrome de inmunodeficiencia respiratoria, dis-trofia muscular, cataratas, artritis reumatoide, progeria, intoxicación alcohólicaaguda, diabetes, aterosclerosis, hipertensión arterial, enfermedad de Parkinson,entre otras.

❚ AGRADECIMIENTOS

Los experimentos aquí relatados fueron parcialmente apoyados por el donativoIN-224903, de la DGAPA-UNAM, para MZ de P.Agradecemos a Alejandra Palo-mares Ayala por su excelente trabajo secretarial.

❚ REFERENCIAS

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DDAAÑÑOO AALL DDNNAAMarisa H. G. Medeiros

❚ INTRODUCCIÓN

El mecanismo por el cual suceden las reacciones de oxidación dentro de las célu-las, como resultado del metabolismo aeróbico, ha sido objeto de un sinnúmero deestudios en los últimos años, por lo que una gran parte de las reacciones ya hapodido esclarecerse. Se sabe que tanto las especies reactivas de oxígeno como lasespecies reactivas de nitrógeno, así como otros agentes endógenos o exógenos,pueden modificar al DNA celular (figura 8-1). El daño al DNA tiene consecuen-cias biológicas serias como mutaciones y transformaciones carcinogénicas, eincluso puede llevar a la muerte celular.

Las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno están involucradas en los pro-cesos de daño, no sólo porque son capaces de interactuar de manera directa sobreel DNA, sino también porque afectan la transducción de señales, la proliferacióncelular y la comunicación intercelular. Para asegurar el control normal del creci-miento, así como la precisión en la replicación del DNA, las células han desarro-llado una gran cantidad de estrategias para lidiar con el estrés. No obstante, elfracaso de algunos de los mecanismos de defensa celular podría contribuir a lamutagénesis, carcinogénesis, envejecimiento y la muerte celular.

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8

❚ ESTRUCTURA DEL DNA

El DNA es una molécula muy larga con apariencia de doble hélice constituidapor dos cadenas. Cada una está formada por desoxirribonucleótidos, compuestosde tres diferentes subunidades: una base nitrogenada, una molécula de azúcar(ribosa) y un grupo fosfato. La parte variable de la molécula es su secuencia debases. El DNA contiene cuatro tipos de pares de bases, dos bases púricas: adenina(A) y guanina (G), y dos bases pirimídicas: citosina (C) y timina (T). El esquele-to del DNA está compuesto de desoxirribosas unidas por enlaces fosfodiéster. Elgrupo 3’-OH hidroxilo del segmento del azúcar de un desoxirribonucleótido seune con el grupo 5’-hidroxilo del azúcar adyacente por medio de una unión fos-fodiéster (figura 8-2). La presencia de varios grupos fosfato le confieren al DNAuna carga sustancialmente negativa, dado que los grupos fosfato se encuentranionizados a pH fisiológico, de modo que los cationes metálicos como Na+, K+, ylos iones de hierro y cobre pueden unirse al DNA. En una molécula de DNA, doscadenas antiparalelas que son complementarias en su secuencia de nucleótidosestán apareadas en una estructura de doble hélice con un giro hacia la derecha,formando aproximadamente 10 apareamientos de bases por cada giro helicoidal.Las bases púricas y pirimídicas se encuentran orientadas hacia el lado interior dela hélice, mientras que las unidades de fosfato y de desoxirribosa se orientan haciael exterior. Las dos cadenas se mantienen unidas gracias a la formación de puen-tes de hidrógeno entre los pares de base. La adenina se une con la timina median-


Sitios abásicos

Lesiones a las bases

Rompimiento de cadenas

E R O/ERN

Xenobióticos

Radiación UV/ ionizante

Aductos

DNA

FFiigguurraa 88--11.. Esquema de los factores que conllevan al daño sobre el DNA inducido por estrés oxidativo.

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Daño al DNA • 121

POHO

O-OO

C.

PO

H

O

POO

O-OO

TPOH

-O O

O

A

PO

-O OH

O

PO O

-O O

O

G

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NN

N

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O

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O

HO

OH

dGuo dAdo

Purinas

dThd

13

56

7

89

4

12

34

5

6

dCyd

(1) (2)

(3) (4)

Componentes del ácido desoxirribonucléico (DNA)

Pirimidinas

dR = 2-desoxirribosa

Esqueleto de azúcar-fosfato Esqueleto de azúcar-fosfato

Pares de bases

Puentes de hidrógeno

O

O

FFiigguurraa 88--22.. Estructura de los ácidos nucleicos. AArrrriibbaa:: nucleósidos en el DNA (bases nitrogenadasunidas a un azúcar) (1) dGuo, desoxiguanosina; (2) dAdo, desoxiadenosina; (3) dThd, desoxitimi-dina; (4) dCyt, desoxicitosina; dR, desoxirribosa (el azúcar presente en el DNA). AAbbaajjoo:: unionesde puente de hidrógeno en la estructura del DNA. La adenina se aparea con la timina mediantedos puentes de hidrógeno, y la guanina con la citosina mediante tres puentes de hidrógeno.

te dos puentes de hidrógeno (A=T), y la guanina con la citosina mediante trespuentes (G≡C). La secuencia u ordenamiento preciso que tienen las bases es loque confiere la información genética y puede ser traducido para sintetizar proteí-nas, o puede copiarse (replicación) para heredarse a la siguiente generación celular.

❚ DAÑO AL DNA POR ESPECIES REACTIVASDE OXÍGENO Y NITRÓGENO

Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, que incluyen al radical superóxido(O2

•), radical hidroperoxilo (HO2••), peróxido de hidrógeno (H2O2), radicales

hidroxilo (•OH), alcoxilo (RO•), peroxirradicales (RO2••), hidroperóxidos orgáni-

cos (ROOH), óxido nítrico (NO••), peroxinitrito (ONOO–) y el oxígeno singulete(1O2), son producidas en las células a través de diversos procesos normales, comoel metabolismo oxidativo y la inflamación, así como por la exposición a diversosagentes físicos como la luz UV, radiación ionizante o los agentes químicos conta-minantes o carcinogénicos. El radical superóxido es generado como un productoalterno de la reducción incompleta del oxígeno molecular durante el transportede electrones en la mitocondria y en el retículo endoplásmico. El O2

• se producetambién por los macrófagos y neutrófilos como parte del sistema de defensainmunitario por medio de la reducción de O2 mediada por NADPH. Existenotras fuentes de radical superóxido que incluyen reacciones enzimáticas, como lallevada a cabo por la xantina oxidasa y por la activación metabólica de xenobió-ticos como el benzapireno.

A pesar de que el DNA es un blanco biológico importante para las especiesreactivas de oxígeno, el O2

• es relativamente poco reactivo con el DNA. Sinembargo, la mayor parte de los radiales O2

• sufren un proceso de dismutacióndentro de las células. Este proceso, que puede ser de naturaleza química o enzi-mática, genera H2O2, otra especie reactiva de oxígeno que por sí misma presentauna actividad de oxidación muy baja hacia la mayor parte de las biomoléculas.En presencia de metales de transición reducidos, en particular de Fe2+ o Cu+, elH2O2 es convertido, mediante la reacción de Fenton, en el radical •OH que tieneun poder altamente oxidante.

El radical hidroxilo es muy reactivo y tiene la capacidad no sólo de abstraerátomos de hidrógeno de la molécula de DNA, sino también de pegarse a las basesformando aductos, lo cual produce una gran diversidad daños. El •OH se generatambién por radiólisis del agua inducida por rayos X o γ.

Otra molécula oxidante que puede propiciar daño en el DNA es el peroxinitri-to (ONOO––), un producto de la reacción del óxido nítrico (NO•) con el O2

•. Elóxido nítrico es un radical libre sintetizado durante la oxidación del aminoácidoL-arginina. Esta reacción es catalizada por la enzima óxido nítrico sintetasa. Es


importante aclarar que el óxido nítrico y el radical superóxido se producen almismo tiempo dentro de los macrófagos, generando niveles elevados de ONOO–

en células inflamatorias activadas. Algunos autores han sugerido que este meca-nismo es un posible nexo entre la inflamación y la inducción de mutaciones.

El oxígeno singulete parece tener un papel importante en varios sistemas bio-lógicos, y podría generar daño oxidativo en una variedad de blancos biológicos,incluyendo al DNA. Se ha logrado acumular evidencia que confirma los efectosgenotóxicos y carcinogénicos del 1O2; por ejemplo, las consecuencias biológicasde la exposición a la radiación UVA están mediadas, al menos en parte, por la

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-H 2 O

dR = 2-des o xir r ibosa

dGuo

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OH

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reducción

(1) (5)

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(7)

(8)

(9) (10)

•

•

•

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N H 2

N H 2

N H 2 N H 2

N H 2 N H 2

N H 2 N H 2

FFiigguurraa 88--33.. Modificaciones principales sobre los segmentos de guaninas del DNA por radicaleshidroxilo. La adición del radical ·OH al C4 del segmento de guanina del DNA (1) genera dos pro-ductos de oxidación principales: 2,2-diamino-5-[2-desoxi-b-D-eritro-pentafuranosil amino]-5(2H)-oxazolona (8) y su precursor 2-amino-5-[2-desoxi-b-D-eritro-pentafuranosil amino]-4H-imidazol-4-ona (7). La adición del radical ·OH al C8 del segmento de guanina conlleva a la forma-ción del 8-oxo-7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxodGuo) (9), así como del 2,6-diamino-5-for-mamido-4-hidroxipirimidina (FAPY-Gua) (10).

incidencia de reacciones fotosensibles de tipo II, incluyendo la formación transi-toria de 1O2 (capítulo 2).

Entre las diversas moléculas afectadas por el estado prooxidante en la célula,el DNA es de singular importancia, ya que esta molécula es la que conlleva lainformación genética, además de que sólo está presente en una única copia encada célula. Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno producen diferentestipos de daños al DNA, como daños a las bases, azúcares, entrecruzamientos deproteínas con DNA, así como rupturas de doble cadena y sencilla, y formaciónde sitios abásicos, todo ello mediante diversos mecanismos que han sido amplia-mente revisados. En este capítulo se tratará de dar un panorama general de algu-nos de estos mecanismos.

❚ DAÑO A LAS BASES

La exposición de las células a diversos agentes químicos y físicos como las radia-ciones ionizantes y solares, así como a la reacción de Fenton, pueden promover laformación de radicales •OH, de modo que el daño a las bases del DNA ocasionadopor este radical ha sido ampliamente revisado. Es importante aclarar que la veloci-dad de reacción del •OH está determinada por su difusión; como consecuencia, elproceso de oxidación mediado por esta especie reactiva de oxígeno, altamente reac-tiva y poco específica, se lleva a cabo en los sitios donde se forma. Como se men-cionó en el capítulo anterior, entre más reactivo sea un radical, menor especificidadtendrá al reaccionar, y lo hará muy cerca del lugar de su formación.

Por otro lado, la guanina es la base nitrogenada que presenta el potencial deionización más bajo entre los componentes de los ácidos nucleicos, por tanto, esla base más susceptible de ser oxidada por diferentes componentes oxidantes,como los radicales •OH, 1O2 y ONOO–.


N

d R

N N

N H

N H 2

O

dR = 2-des o xirribosa

8- o xodAdo

8

(11)

FFiigguurraa 88--44.. Uno de los productos principales de la oxidación de la adenosina mediada por el radi-cal hidroxilo.

Existen dos vías principales de descomposición de los segmentos de guaninadel DNA, que comprenden la adición inicial de un •OH en los carbonos C4 y C8 del anillo de las purinas (figura 8-3). La adición del •OH en C4 de la 2’-deso-xiguanosina (1) que proviene de la adición del •OH en el C4, resulta en un radi-cal (5) que se deshidrata en soluciones neutrales dando como resultado un radicalneutro (6). En pasos subsecuentes se generan los dos productos principales de laoxidación: 2-amino-5-[2-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosil amino]-4H imidazol-4-ona (7) y 2,2-diamino-5-[2-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosil amino]-5(2H)-oxalozona (8).

En otro evento, la adición del •OH en el C8 de 2’-desoxiguanosina produce unradical de aducto-C8-OH que puede llevar a la formación de 8-oxo-7,8-dihidro-2’-desoxiguanosina (8-oxodGuo o bien 8OHdG) (9), junto con un 2,6-diamino-5-formamido-4-hidroxipirimidina (FAPY-Guo) (10) que proviene de la aperturadel anillo de imidazol seguida por la protonación y reducción con un electrón.

La química de adenina/adenosina con •OH es similar a la que se describióantes para la guanina. Sin embargo, las lesiones oxidativas en la adenina prevale-cen menos en el DNA. Uno de los productos principales de la oxidación de ade-nosina mediada por el radical •OH es el 8-oxo-desoxiadenosina (8-oxodAdo)(figura 8-4).

En cuanto a la timina (3) y la citosina (4), ambas muestran una variedad dereacciones con el radical hidroxilo. Ahora existe una gran cantidad de informa-ción sobre el mecanismo de las mismas, de modo que las reacciones más impor-tantes con timina se han resumido en la figura 8-5. El radical •OH se adiciona ose pega de manera preferente al carbono 5 del segmento de pirimidina, forman-do un radial centrado en C-6 (12). El carbono 6 es un sitio menos favorable parala reacción con el •OH, por lo que esta reacción lleva a la formación de otros radi-cales (13). A partir de la reacción con O2, los radicales son convertidos en radica-les peroxilo o peroxirradicales (14) y (15). Existen, asimismo, reaccionessubsecuentes que derivan en la formación de productos oxidados de timina,como (16) (17) (18) y (19).

Las especies reactivas de nitrógeno como N2O3, HNO2 y ONOO– puedennitrar y desaminar al DNA causando rupturas en las cadenas y mutaciones. Invivo, el peroxinitrito tiende a actuar a través de sus radicales derivados, el radicalcarbonato (CO3

•) y el bióxido de nitrógeno (•NO2) debido a las altas concentra-ciones de CO2 que se encuentran en equilibrio con HCO3

– en la mayor parte delos fluidos biológicos. En ambientes donde el pH es bajo, el radical •OH deriva-do del peroxinitrito llega a tener un papel relevante. Tanto el CO3

• como el •NO2

son radicales oxidantes que pueden tener efecto sobre diversos blancos biológi-cos y convertirlos en sus correspondientes radicales. La presencia de estos dosradicales juntos, producidos a partir de peroxinitrito, es muy eficaz al momentode nitrar residuos de tirosina y guanina mediante la combinación de poder oxi-©

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O 2

R = H, T h y R = 2-de soxirribosa, Thd

O 2

.- ,H

+ O

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.- ,H

+

1 2

3 4

5

6

(13) (12)

(14) (15)

(17) (18) (19)

(16)

(3)

•

•

•

•

•

FFiigguurraa 88--55.. Modificación principal del segmento de timina en soluciones de DNA aereadas con elradical hidroxilo. El radical •OH se adhiere de manera preferente al carbono 5 del segmento de piri-midinas (en este caso timina) (3) dando como resultado un radical centrado en el C-6 (12). El car-bono 6 es un sitio menos favorable para la reacción con el •OH, por lo que esta reacción conllevaa la formación de otro radical (13). Al reaccionar con el O2, los radicales se convierten en los radi-cales peroxilo (14) y (15). Reacciones subsecuentes generan los productos oxidados de la timina(16), (17), (18) y (19).

dativo del CO3• con las reacciones de recombinación de radicales del •NO2. La

base guanina en el DNA tiende a ser oxidada y transformada en sus correspon-dientes radicales mediante radicales derivados de peroxinitrito. La reacción deONOO–– con el DNA produce diferentes lesiones en esta base, entre las que seencuentran la 8-nitroguanina y 8-oxodGuo. La figura 8-6 muestra algunos de losproductos resultantes del ataque del peroxinitrito sobre el DNA.

❚ DAÑO A LOS AZÚCARES DEL DNA

El esqueleto del DNA, compuesto de azúcares y fosfatos, es muy vulnerable a laoxidación por una gran variedad de especies radicales. El producto inicial de esteevento oxidativo es un radical de carbono ubicado en un azúcar, el cual lleva a ladegradación de la desoxirribosa y a la generación de una variedad de productoselectrofílicos.

La reacción de los radicales •OH con los azúcares del DNA ocurre por la abs-tracción de átomos de hidrógeno unidos a carbonos, principalmente en el C4 yC5. Reacciones subsecuentes de estos radicales de carbono centrados en los azú-cares generan varios productos del azúcar, rompimientos de las cadenas del DNAy formación de sitios libres de bases (abásicos) mediante una diversidad de meca-nismos ilustrados en la figura 8-7. La abstracción del hidrógeno en el C4 da como©

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dGuo

8- o xodGuo

(1)

(21) (8)

(9) 8-nitrodGuo (20)

FFiigguurraa 88--66.. Productos de la oxidación del peroxinitrito con la desoxiguanosina (dGuo) (1); (20) 8-nitro-2’-desoxiguanosina (8-nitrodGuo); (9) 8-oxo-7,8-dihidro-2’-desoxiguanosina (8-oxod-Guo); (8) 2,2-diamino-5-[2-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosil amino]-5(2H)-oxazolona; (21) 5-guanidino-4-nitroimidazol.

resultado que se produzcan el residuo del ácido 3’-fosfoglicólico y un aducto pro-penal en la base. Los radicales de purina y pirimidina, generados por la adiciónde •OH pueden, a su vez, abstraer al hidrógeno de los segmentos de azúcar.

❚ DAÑO AL DNA POR OXÍGENO SINGULETE

Otra especie reactiva de oxígeno de importancia biológica es el oxígeno singule-te (1O2), el cual puede ser generado por procesos fotosensibles o enzimáticos,como se describió en el capítulo 2. Por ejemplo, se ha visto que el componenteUVA de la radiación solar produce efectos dañinos en los cuales el 1O2, en su esta-do menos excitado (1Δg), parece jugar un papel importante.

Las respuestas mutagénicas y genotóxicas observadas cuando el DNA o lascélulas son tratadas con 1O2 podrían entenderse mejor si se identificaran los pro-ductos de oxidación generados durante este proceso. Los estudios sobre la oxida-ción del DNA por 1O2 han demostrado que el aducto 8-oxodGuo es un productoexclusivo encontrado en DNA aislado. La formación de dicho aducto, al parecer,se realiza de manera directa mediante la reacción del DNA con el 1O2 en elmedio celular.

Se ha demostrado que el 1O2 está involucrado en la citotoxicidad celular aso-ciada con la terapia fotodinámica y con el componente UVA de la radiación so-lar. La participación del 1O2 se ha relacionado también con la inducción de laexpresión génica y con la transducción de señales. Además, el 1O2 es generado enla fagocitosis, donde participa en los mecanismos de defensa contra los virus y lasbacterias. En contraste con el radical hidroxilo, las reacciones del 1O2 con el DNAson altamente específicas. La reactividad del 1O2 hacia el DNA aislado se ha estu-diado en detalle y se ha encontrado que las bases de guanina son su blanco específico, generando al 8-oxodGuo como el producto principal de oxidación.


P

R 2 O O

O

P R 1 O

O

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4'

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3 5

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6

+

+ .

-

-

-

-

-

.-

FFiigguurraa 88--77.. Escisión de las cadenas del DNA por la vía de la abstracción del H-4’.

Utilizando fotosensibilizadores tipo II, los productos principales generados en lareacción de 1O2 con la 2-desoxiguanosina libre en una solución acuosa, se identi-ficaron diasteroisómeros de nucleósidos espiroimino-dihidantoínas (dSp) (22).Ade-más, el aducto 8-oxodGuo también fue detectado, pero en un rango relativamentemenor comparado con los diasteroisómeros (figura 8-8).

Por otro lado, se ha demostrado que el 1O2 reacciona con el aducto 8-oxod-Guo, ya sea cuando está como nucleósido libre o bien cuando está formandoparte de fragmentos de DNA. Para la identificación cualitativa de los productospredominantes en la oxidación final del 8-oxodGuo mediante el 1O2, se utilizó unatécnica de separación muy específica usando un cromatógrafo líquido de alta reso-lución (HPLC) acoplado a un detector electroquímico, y un analizador de masas(HPLC-ESI-MS/MS). Los productos principales más estables de la descomposi-ción del 8-oxodGuo fueron 2-amino-5-[(2’-desoxi-β-D-eritro-pentofuranosil)amino]-4H-imidazol-4-ona (dIz),2,2-amino-4-[(2’-desoxi-β-D-eritropentofura-nosil) amino]-5-(2H)-oxazolona (dOz), y los diasterómeros dSp (figura 8-9).

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N

O

O d R

1 O 2

H 2 O

reductor

-H 2 O

(a)

(b)

n ucleosido = vía a >> vía b DNA = vía a > 99%

dR = 2-de soxirribosa

dSp

8- o xodGuo dGuo (1)

(9)

(22)

FFiigguurraa 88--88.. Productos de la oxidación de la reacción de la desoxiguanosina (dGuo) con el oxígenosingulete.

❚ FORMACIÓN Y CUENTIFICACIÓN DE ADUCTOS ETENO EN EL DNA

El daño sobre el DNA a partir de la peroxidación endógena de lípidos (lipoperoxi-dación) ha sido reconocido como un factor contribuyente durante carcinogénesis.La lipoperoxidación, como se describirá en el capítulo siguiente, es una reacciónen cadena iniciada por los radicales libres sobre los ácidos grasos poliinsaturadosque forman las membranas celulares. Su relación con el daño al DNA es impor-tante, puesto que se sabe que los aductos exocíclicos de origen endógeno delDNA pueden ser generados por diversos productos de la lipoperoxidación. Entreellos se encuentra el 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), trans,-2,4-decadienal (DDE),malonaldehído (MDA), acroleína y el crotonaldehído. Las actividades químicas ybiológicas de todos estos aldehídos han sido muy estudiadas, y se ha visto quepueden inducir daño al DNA, ya sea mediante una reacción directa con las basesdel DNA, o bien a través de la generación de más compuestos electrofílicos reac-tivos, como los epóxidos bifuncionales.


N H

N H N H

O

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N

O

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N H

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O

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N H

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O

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N N H 2

O

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O

O N H

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O

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dSp

1 O 2

H 2 O reductor

dR = 2-desoxirribosa so

8- o xodGuo

dOz

(9)

(22)

FFiigguurraa 88--99.. Productos principales de la reacción de la 8-oxodGuo con el oxígeno singulete. La reac-ción del 1O2 con la 8-oxodGuo (1) da como resultado el 5-hidroperoxido (5-OOH-8-oxodGuo),el cual se descompone en el 2-amino-5-[(2’-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosol) amino]-4H-imida-zol-4-ona (dIz), 2,2-diamino-4-[2’-desoxi-β-D-eritro-pentafuranosil) amino]-5-(2H)-oxazolona(dOz), y diasteroisómeros dSp.

En el primer caso, los productos generados son aductos del propano cíclico sus-tituidos, principalmente la 1-N2-propano-2’-desoxiguanosina para las reaccionesde aldehídos α,β-insaturados y la pirimidopurinona cíclica (M1G) y aductos ací-clicos formados con desoxiadenosina (M1A) y desoxicitidina (M1C) para las reac-ciones de MDA. Los compuestos epoxicarbonilos generados como resultado dela oxidación de aldehídos α,β-insaturados reaccionan con las bases de DNA, for-mando aductos etano y eteno sustituido, y aductos eteno no sustituidos (figuras 8-10 y 8-11). La habilidad de estos electrófilos reactivos de alquilar las bases deDNA generando las antes mencionadas lesiones promutagénicas respectivas, hasido considerada como un factor que contribuye a los efectos mutagénicos y car-cinogénicos asociados con el proceso de lipoperoxidación, y la consecuente gene-ración de estrés oxidativo.

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O

N 2 ,3- dGuo

dAdo dCi d

1 ,N 2 - dGuo

Aductos eteno insustituidos

FFiigguurraa 88--1100.. Productos resultantes de la reacción de los aldehídos α,β-insaturados con el DNA.Aductos de eteno no-sustituido1, N6-Eteno-2’-desoxiadenosina (εdAdo), 3,N4-eteno-2’-desoxici-tidina (εdCyd), N 2,3-eteno-2’-desoxiguanosina (N2,3-εdGuo), 1,N2-eteno-2’-deoxiguanosina(1,N2-εdGuo).

❚ CONCLUSIONES

Las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno pueden inducir daño al DNA,incluyendo rupturas de cadenas, entrecruzamientos, sitios abásicos y modifica-ción de las bases. Las lesiones en el DNA se han relacionado con los procesos decáncer, envejecimiento y muerte celular, por lo que el mejoramiento de los estu-dios analíticos ha permitido la generación de metodologías precisas para el es-tudio de los mecanismos que participan en estas reacciones y que permiten lacuantificación de dichos daños in vivo. Además, los mecanismos de reparacióntienen que ser evaluados junto con el análisis de los daños al DNA para poderesclarecer el papel exacto que juegan las lesiones inducidas por oxidación a nivelcelular y molecular. Ello contribuirá a entender el papel de estas lesiones en pro-


Aductos eteno y etano sustituidos

C H 3

O H

O

O H

N

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N

N

N

O H

O H

C H 3

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N

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O H

C H 3

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O H

O

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N

O O H

C H 3

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O

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N

N

N

N

O H O H

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N

N

N

N

O H

O

C H 3

O H

O

O H

N H

N

N

N

N

O

O

O H

HNE- aducto dGuo HNE-aducto dAdo

DDE-aducto dGuo DDE-aducto dAdo

FFiigguurraa 88--1111.. Aductos eteno y etano sustituidos. Los aductos de la reacción del HNE con dGuo ydAdo. Aductos de la reacción de DDE con dGuo y dAdo.

cesos como mutagénesis, carcinogénesis y enfermedades neurodegenerativas, aunasí, se requiere mayor información, principalmente de los sistemas in vivo.

❚ REFERENCIAS

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DDAAÑÑOO AA LLÍÍPPIIDDOOSS

Tania Zenteno SavinYolanda Saldaña Balmori

❚ INTRODUCCIÓN

La rancidez de las grasas y aceites almacenados es un fenómeno que ha preocu-pado desde la antigüedad, debido a que por ella, las grasas y aceites sufren modi-ficaciones en el sabor, olor, color, viscosidad y solubilidad. Los primeros estudiosrealizados al respecto fueron llevados a cabo por de Saussure en 1820 cuandomediante el uso de un manómetro pudo ver las diferencias en el consumo de oxí-geno en dos muestras de aceite de nuez, una de ellas estaba rancia.

El mecanismo por el cual los ácidos grasos insaturados reaccionan con el oxí-geno molecular para oxidarse, se estableció hacia 1940 por Farmer en relación ala industria del caucho. A partir de ello, se desarrollaron múltiples estudios rela-cionados con la preservación de los alimentos, con los polímeros químicos, entreotros, pero fue hasta algunos años más tarde, que se inició el estudio de la lipo-peroxidación en el campo biológico y la medicina, la cual fue definida por Tappelcomo el deterioro oxidativo de los lípidos poliinsaturados. Las grasas presentes enlos alimentos, después de ser digeridas y absorbidas, son transportadas como lipo-proteínas para ir a desempeñar distintas funciones en el organismo, una muyimportante es formar parte de las membranas.

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Los ácidos grasos participantes de las membranas de las células animales gene-ralmente tienen de 14 a 24 átomos de carbono y la posición de las dobles ligadu-ras es cis. Un doble enlace en una cadena hidrocarbonada impide la rotación delos grupos unidos a los átomos de carbono, de modo que ellos están forzados apermanecer en un sitio, por ejemplo los 2 hidrógenos unidos por una doble liga-dura de un ácido graso (R-CH=CH-R), están obligados a permanecer del mismolado en una unión cis y a estar en posición distal en una unión trans. Los fosfolí-pidos contienen ácidos grasos con varias dobles ligaduras, en las membranas delas células animales el principal fosfolípido es la lecitina, las membranas de losorganelos como la mitocondria y el núcleo raramente contienen esfingolípidos ocolesterol, mientras que la membrana interna mitocondrial contiene cardiolipi-nas (figura 9-1).

Los lípidos de la membrana son moléculas aannffiippááttiiccaass (poseen una parte polaro hidrofílica y una no polar e hidrofóbica), contienen regiones hidrocarbonadascon poca afinidad por el agua y al estar en presencia de ella tienden a agregarseen forma de bicapa exhibiendo su región hidrofílica; esta bicapa es la base estruc-tural de la membrana en la que se insertan diversas proteínas, las extrínsecas operiféricas penden de la superficie de la membrana, mientras que las integralesestán embebidas en el interior de la ella, en algunos casos localizadas en el inte-rior de la membrana o atravesándola completamente. La fluidez de la membrana


Proteína

Colesterol Proteínaperiférica

Proteínasintegrales

Citosol

Capas lípidas

PoroCanal

GlucoproteínaProteína peritérica

Glucolípido

Fosfolípidos

Cabeza polar(hidrofilica)

Colas deacido graso(hidrofóbicas)

FFiigguurraa 99--11.. Composición de las membranas.

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Daño a lípidos • 137

se debe la presencia de las dobles ligaduras de los ácidos grasos poliinsaturados,cuando hay daño en estos ácidos grasos o cuando disminuye la cantidad de liga-duras dobles, la membrana se vuelve rígida.

❚ LIPOPEROXIDACIÓN

La participación de radicales libres y otras especies reactivas de oxígeno (ERO)con los lípidos de las membranas biológicas ocasiona la producción de diversoscompuestos tóxicos, altera su fluidez y permeabilidad, así como la actividad delas proteínas, las enzimas, los receptores o canales iónicos asociados a ellas, situa-ción que compromete la estructura y función celular. Los ácidos grasos saturadoso los monoinsaturados que forman parte de la membrana, son poco susceptiblesal ataque de las ERO, mientras que los poliinsaturados linoléico, linolénico y ara-quidónico, son rápidamente atacados debido a la presencia de sus enlaces doblesconjugados, los que debilitan la energía de unión del átomo de hidrógeno presen-te en el carbono adyacente a los enlaces. Es precisamente esta alta reactividad loque hace que la peroxidación de los lípidos en los sistemas biológicos, sea un pro-ceso aauuttooccaattaallííttiiccoo y de pprrooppaaggaacciióónn..

La peroxidación de los lípidos de las membranas puede ocurrir tanto por la víano enzimática como por la enzimática; durante la peroxidación no enzimática lasERO inician el daño oxidativo en los lípidos de la membrana y los radicales libresde los lípidos resultantes propagan el proceso de la peroxidación. Lo anterior per-mite la acumulación de hidroperóxidos que finalmente se descomponen en unagran variedad de productos terminales en donde los principales son el malondial-dehído (MDA), el hexanal y el 4-hidroxinonenal (4-HNE). Por otro lado, en lalipoperoxidación enzimática los ácidos grasos oxidados son liberados de los lípi-dos de las membranas por fosfalipasas y otras lipasas. El ácido araquidónico es unácido graso liberado de las membranas de los fosfolípidos por la fosfolipasa A2 enrespuesta a una gran variedad de estímulos, entre otros la participación de agen-tes proinflamatorios. El metabolismo del ácido araquidónico representa unafuente de ERO que pueden inducir estrés oxidativo, este ácido se metabolizaprincipalmente por tres rutas:

1. Por la vía de la lipooxigenasa, que hace posible la formación de derivadoshidroxilados y leucotrienos.

2. Por la vía de la ciclooxigenasa, que permite la formación de prostaglandinas.3. Por la vía catalizada por el citocromo P450, que interviene en los procesos

de detoxificación de xenobióticos, además de que conduce a la produc-ción de epóxidos derivados del ácido eicosatrienoico.

El estudio de la lipoperoxidación se ha dividido en tres etapas: iniciación, pro-pagación y terminación (figura 9-2).

Iniciación

La iniciación se desencadena cuando el residuo de un ácido graso poliinsaturadodentro de los lípidos de membrana, es atacado por una ERO que es capaz de abs-traer o retirar un átomo de hidrógeno entero (electrón y protón) de un grupometileno (-CH2-).

Al abstraerse el átomo de hidrógeno, el residuo de ácido graso queda comoradical libre centrado en el carbono (R• o bien L•), esta reacción se puede inhibirpor la participación de algunos secuestradores de radicales libres como el manitoly el formato, moléculas que compiten por el •OH con los lípidos. El carbono queha perdido el hidrógeno es generalmente estabilizado mediante un rearreglo mo-lecular que da lugar a un dieno conjugado el cual no reacciona con el oxígeno sin-gulete (1O2) sino con oxígeno molecular y forma el radical peroxilo (ROO• o bien,LOO•)(figura 9-3), molécula que tiene el suficiente poder oxidante para atraer unhidrógeno metilénico del ácido graso adjunto para quedar como hidroperóxido,también llamado lipoperóxido (ROOH o LOOH) (figura 9-4). Ésta moléculapuede ser tóxica ya que inactiva a algunas enzimas debido a que los residuos de


Lipoperoxidación

HH

=

R-OO- H

R- H ROO ••

Radical peroxilo

Iniciación

Propagación

O2

Radical librecentrado en carbono

Agentedesencadenante

R ••

Reacción

en cadena

Ácido graso poliinsaturado

Lipohidroperóxido

FFiigguurraa 99--22.. Esquema de la oxidación de los lípidos iniciada por la abstracción de un átomo dehidrógeno, lo que genera un radical libre centrado en carbono.

aminoácidos participantes en ellas como la metionina, la lisina, la cisteína y la his-tidina son oxidados.

Propagación

La nueva molécula a la que se le ha abstraído un hidrógeno, hará lo mismo a loque fue sujeta ella —abstraerle un hidrógeno a la molécula de ácido graso poliin-saturado adyacente—, estableciéndose una reacción en cadena y de esta manerase propaga la lipoperoxidación a través de la membrana (figura 9-5).

Existe otro mecanismo que se considera como propagación de la lipoperoxi-dación, ésta parte de un lipoperóxido (ROOH) que se encuentra presente en lamembrana, ya sea de reciente formación, como se describió antes, o bien que seencuentre almacenado en la membrana de un proceso de lipoperoxidación ante-©

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H 2 C-O-C =

O _

F os f olípidos

Abst r acción

del hidrógeno

OH •

H 2 O

Rearreglo molecular

. . . •

. . .

O •

-

O -

. . .

•

R-H

R •

R •

R OO •

INICI A CION

O 2

FFiigguurraa 99--33.. Diagrama de la primera etapa de la lipoperoxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.

rior. En este caso el ROOH al encontrarse en presencia de un metal de transición(preferentemente Fe o Cu) puede reaccionar y fraccionarse para dar lugar denuevo al radical peroxilo (ROO•), pero también puede romperse de tal maneraque genere al radical alcoxilo (RO•). Ambos tienen la capacidad de abstraer unhidrógeno de un ácido graso poliinsaturado de la cadena vecina y propagar deesta manera la peroxidación lipídica (figura 9-6).

La longitud de esta cadena lipoperoxidativa depende de varios factores ya seala relación de las proteínas y los lípidos en la membrana, la composición del ácidograso, la concentración de oxígeno y la presencia o no de antioxidantes en lamembrana.

Terminación

La lipoperoxidación puede finalizar cuando el radical lipídico reacciona con otramolécula, la cual puede ser un segundo radical lipídico, para formar un agregado


C=O CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3

C=O CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2

CH 2

CH 2 CH 2

CH 2 CH 3

CH 2 - CH - CH 2 O O glicerol

O O = P - O

O f os f ato

CH 2 N + (CH 3 ) 3

CH 2

CH 2 colina

C=O CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 3

C=O CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2

CH CH 2 CH 2

CH 2 CH 2 CH 3

CH 2 - CH - CH 2 O O glicerol

O O = P - O

O f os f ato

CH 2 N + (CH 3 ) 3

CH 2

CH 2 colina

C-O-O •

CH CH

FFiigguurraa 99--44.. Representación de la formación del radical peroxilo.

o un dímero que queda dentro de la membrana y altera sus funciones, principal-mente la fluidez como la permeabilidad. Las reacciones más comunes suelen serde la siguiente manera:

a) ROO• + ROO• ROO-OORb) ROO• + RO• ROO-ORc) RO• + RO• RO-OR

Otro mecanismo de terminación es la ciclización, en este proceso las molécu-las de oxígeno quedan englobadas dentro de la cadena poiinsaturada. Este tipo determinaciones son muy poco estables y generalmente culminan en rompimientosdel tipo de la β-escisión, la cual se describirá más adelante.

Alternativamente, cuando el ROO• encuentra a una molécula antioxidantecapaz de donar un átomo de hidrógeno se forma de nuevo el ROOH, terminan-do así la cadena de reacciones. El α-tocoferol, (vitamina E), y la ubiquinona(CoQ10) son los antioxidantes más relevantes para participar en la fase de termi-nación de la cadena de reacciones de oxidación de los lípidos en los sistemas ©

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O •

O

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R-O-C

= O

+

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O O

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R-O-C

= O

•

• R-O-C

= O

O 2

Abst r acción del H

. . . -

O •

O

- Propagación

R OO • R-H

R •

R •

R OO •

R OOH Hidroper ó xido

FFiigguurraa 99--55.. Diagrama de la segunda etapa de la lipoperoxidación de los ácidos grasos poliinsaturados.

biológicos. La vitamina E tiene propiedades antioxidantes porque dona un hidró-geno a la molécula de ROO• para quedar como ROOH, mientras que la vitami-na queda como radical alfa-tocoferilo (α-Toc•) que es un radical libre estable yaque su electrón desapareado queda deslocalizado en la molécula, de esta manerase interrumpe la peroxidación de lípidos. El radical α-Toc• se puede regenerar apartir de interacciones con moléculas de la membrana o del citosol, tales comola ubiquinona, el ácido ascórbico o tioles como el GSH. Así, los radicales libresgenerados en el proceso de la lipoperoxidación pueden ser detoxificados directa-mente por glutatión reducido (GSH) o a través del efecto que tiene éste sobre lavitamina E. Es importante mencionar que el decremento de los niveles intrace-lulares de GSH puede favorecer la lipoperoxidación inducida por otros factores(capítulo 10).

Por otro lado, durante el proceso también se producen algunos lipoperóxidosintramembranales que para su remoción se requiere de la participación de enzimasespecíficas, por ejemplo la glutatión peroxidasa, que metaboliza dichos lipoperó-xidos a alcoholes, o bien las fosfolipasas que favorecen la disociación de los pe-róxidos lipídicos de las membranas.


. . .

-

O O

-

H

-

F e +3

F e +2 OH

. . .

O

-

•

. . .

O O

- -

•

Propagación

R OO • R O •

R OOH Hidroper ó xido

–

FFiigguurraa 99--66.. Propagación de la peroxidación.

❚ EFECTOS DE LA LIPOPEROXIDACIÓN

Como se ha mencionado anteriormente, cuando reaccionan los radicales libres deácidos grasos poliinsaturados entre si se pueden formar dímeros por entrecruza-miento o pueden ciclizarse, creando aglomerados que conducen a la disminuciónde la fluidez y de la permeabilidad de la membrana.

La alteración en la permeabilidad de la membrana implica que ésta permite laentrada de diversos solutos a la células sin ningún control, pero principalmentepermite la entrada de agua por osmosis, lo cual hincha a la célula hasta el extre-mo de hacerla reventar y con ello causar su muerte. Este tipo de muerte se co-noce como necrosis. Cuando la célula estalla, vacía todo su contenido sobre lascélulas vecinas iniciando de esta manera la respuesta inflamatoria, proceso que seha asociado a una gran cantidad de patologías.

En cuanto a la pérdida de la fluidez, se ha asociado a otro tipo de alteracionescomo disminución en la actividad de algunos receptores, por ejemplo la unión delas hormonas proteínicas a sus receptores membranales y alteraciones en los com-plejos de la cadena respiratoria mitocondrial, entre otras. De modo que la pero-xidación de los lípidos puede dañar tanto la estructura como la función de lascélulas y los tejidos, lo que está asociada con diferentes enfermedades entre lasque destaca la ateroesclerosis (por la peroxidación de LDL) y el daño tisular cau-sado por infarto de miocardio.

Por otro lado y de manera indirecta, los principales productos de la peroxida-ción de lípidos también pueden reaccionar con otras moléculas y dañar de estamanera a las células. Entre estos productos se incluyen los dienos conjugados, elpentano, etano, etileno, alcanos, polímeros y aldehídos, ya que algunos de éstospueden reaccionar con los grupos amino de la lisina y de otros grupos aminoáci-dos constituyentes de las proteínas formando bases de Schiff, que a su vez pue-den ser identificados por que producen fluorescencia.

Asimismo, algunos iones metálicos permiten que los peróxidos o productos deconjugación se descompongan a temperaturas fisiológicas, por ejemplo si el Fe2+

reacciona con el hidroperóxido de los ácidos linoleico y araquidónico en el quin-to átomo de carbono contando desde el extremo del metilo se produce pentanopor el proceso denominado β-escisión; mediante el mismo proceso se pueden for-mar etano y etileno a partir del hidroperóxido del ácido linoleico:

CH3-(CH2)4-CHOOH-R + Fe3+ CH3-(CH2)4-CHO••-R + Fe3+

CH3-(CH2)4-CHO••-R CH3-(CH2)3-••CH + CHO-Rβ-escisión

CH3-(CH2)3-••CH + H•• CH3-(CH2)3-CH3© E

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Otros productos de la peroxidación de lípidos, son los hidrocarburos volátilesque poseen un alto potencial toxigénico. Se ha propuesto que algunas de estas mo-léculas pequeñas pueden actuar en sistemas biológicos como segundos mensajeros.

Por otro lado se sabe que los lipoperóxidos pueden inhibir la actividad de algu-nas enzimas, los radicales ROO•• formados durante el proceso de peroxidación delípidos tienen la capacidad de inhibir la transcripción del ADN, inclusive cuandoaquellos se encuentran a tan bajas concentraciones que no promueven la reacciónen cascada de la lipoperoxidación. El gradiente de iones calcio (Ca2+) se alteracuando la enzima calcio-ATPasa pierde su actividad catalítica a consecuencia dela oxidación de los grupos tioles presentes en la molécula. Es posible que ello,aunado a la entrada excesiva de Ca2+, resultante de la pérdida de la permeabili-dad selectiva de la membrana, sean los eventos que lleven a la muerte celularobservada en casos extremos de daño por peroxidación de los lípidos.

❚ MEDICIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LA LIPOPEROXIDACIÓN

Ya que la peroxidación de lípidos es uno de los principales efectos de las ERO, sehan invertido esfuerzos considerables en el desarrollo de métodos que permitanuna estimación cuantitativa del daño a las células y los tejidos mediante la deter-minación de los principales productos de la lipoperoxidación. Existen variosmétodos para cuantificar los productos de la peroxidación de lípidos; sin embar-go, ninguno que tiene aplicación universal. En la elección del método a emplear-se para cuantificar la peroxidación de lípidos se debe tener en cuenta tanto el tipode muestra empleada, los principales productos esperados, así como las condicio-nes analíticas.

Los peróxidos lipídicos pueden ser detectados y cuantificados mediante lacolorimetría, la quimioluminisencia, la cromatografía de líquidos de alta resolu-ción (HPLC), la cromatografía de gases acoplada a detector de masas (GC/MS),y la resonancia spin electrón (ESR). Entre los marcadores usados como indicado-res de la peroxidación de lípidos se incluyen la medición del consumo de oxíge-no, hidroperóxidos fosfolipídicos, peróxidos de colesterol y peróxidos de ácidosgrasos, 4-hidroxinonenal que es un producto altamente reactivo de la peroxida-ción de los fosfolípidos de membrana y su derivado 2,4-dinitrofenilhidazina.

Entre los métodos más frecuentemente empleados son los que miden los pro-ductos de la descomposición de los hidroperóxidos lipídicos, tales como el ma-londialdehído (MDA) y otros dialdehídos que son sustancias que son capaces dereaccionar con el ácido tiobarbitúrico razón por la cual se les designa TBARS. Es-te método es espectrofotométrico y tiene la desventaja de que no es específicoya que diferentes hidroperóxidos lipídicos generan MDA en cantidades diferen-tes. La reacción de MDA con grupos amino de proteínas o aminoácidos libres da


lugar a diversos productos los que pueden ser: fluorescentes, bases Schiff conju-gadas, con la estructura general R-N=CH-CH=CH-NH-R’; otra desventaja deeste método es que los productos fluorescentes que se unen a las proteínas soninsolubles en los solventes orgánicos comunes y sus estructuras, es decir los fluo-róforos, pueden ser alteradas en el proceso de extracción de lípidos.

Otro método aplicado a tejidos animales cuantifica los ROOH debido a la for-mación de un complejo Fe2+-xilenol naranja en proporción a la concentración deROOH presentes.

La detección de dienos conjugados no es totalmente confiable ya que los die-nos formados son relativamente inestables en membranas biológicas o plasma,especialmente ante la presencia de metales de transición o proteínas con gruposhemo funcionales.

❚ CONCLUSIÓN

Los lípidos son blancos importantes para la acción de las especies reactivas deoxígeno y los radicales libres. La peroxidación de ellos es una de las principalesrazones del daño celular la que puede conducir a la célula a la pérdida de sus fun-ciones y con ello ser responsable de una gran cantidad de patologías.

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CCOONNCCEEPPTTOO EEPPIIGGEENNÉÉTTIICCOO

YY SSUUSS AALLTTEERRAACCIIOONNEESS

Félix Recillas-Targa

❚ INTRODUCCIÓN

En el transcurso del último decenio ha habido un desarrollo extraordinario en elárea de la regulación epigenética entendida como aquellos procesos hereditariosque llevan a la expresión de un gen sin que ocurran cambios en la secuencia delDNA. En otras palabras, son todos los procesos reguladores que no contemplancambios drásticos en la secuencia del DNA, como lo son las mutaciones, delecio-nes, pérdida de la información genética (cromosomas o parte de ellos), transloca-ciones, entre otros. A pesar de lo anterior, resulta importante señalar que loseventos epigenéticos no pueden llevarse a cabo ni ser comprendidos sin conside-rar la información genética codificada en la molécula de DNA. Por tanto, la regu-lación de la expresión necesita tanto a la información genética como a laepigenética para realizar sus funciones celulares normales.

Poco se sabe en relación con las especies reactivas de oxígeno, estrés oxidativoy la regulación epigenética. En la actualidad es indiscutible que tanto los proce-sos genéticos como epigenéticos, normales o anormales, ocurren en el contextode la cromatina. Por tanto, modificaciones en la organización del genoma en cro-matina trae como consecuencia el desarrollo de diversos procesos celulares como

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la transcripción, duplicación, recombinación y la reparación del daño al DNA.Con base en lo anterior, en este capítulo se pretende justificar que la epigenética,junto con la información genética, tienen una relación estrecha con los efectosque ocasionan las especies reactivas de oxígeno y el estrés oxidativo en la integri-dad del genoma y la fisiología celular.

❚ EL GENOMA EUCARIÓTICO Y LA CROMATINA

El contexto en el cual se lleva a cabo la mayor parte de los eventos de regulacióntiene una relación estrecha con la estructuración del DNA en la ccrroommaattiinnaa,, cuyafunción primaria es la de contener el genoma eucariótico en el interior del núcleo.Como consecuencia de lo anterior, se presenta una estructura de la cromatinainaccesible y, por tanto, represora para la expresión génica. La cromatina se formagracias a las interacciones entre un octámero de histonas, que en su conjunto for-man al nucleosoma, y el DNA.A cada nucleosoma se le enrollan 147 pares de bases(pb) de DNA, generando así el nivel mínimo de compactación del genoma. Estaestructuración del genoma en cromatina tiene efectos directos en la expresiónregulada de los genes, dado que debe sufrir distintos grados de remodelación para permitir la transcripción coordinada de un gen o grupo de genes en tiempoy espacio.

El templado donde ocurre la transcripción necesariamente debe contrarrestaruna estructura conocida como la fibra de 30 nm o ssoolleennooiiddee,, que consiste en ungrupo de seis nucleosomas. Ahora se sabe que los grandes ejes de regulación tie-nen en gran medida que ver con la remodelación de esta organización nucleosó-mica, y cuando se ven afectados pueden originar procesos tumorales.

La estructura del nucleosoma asociado al DNA ha sido cristalizada a una reso-lución de 2.8 Å, mostrando interacciones entre cada histona y la exposición fueradel nucleosoma de las regiones amino terminales de estos mismos. La relevanciade estas regiones expuestas se estudiará más adelante, ya que son la base de dis-tintas modificaciones postraduccionales, como la acetilación y desacetilación,metilación, fosforilación, ubiquitinización, sumoilación y ADP-ribosilación (figu-ra 10-1). Todas estas modificaciones de las histonas tienen consecuencias positi-vas y negativas sobre la expresión génica a través de la remodelación de laestructura de la cromatina.

❚ REGULACIÓN EPIGENÉTICA

En términos generales, son dos los modelos que explican las modificaciones epi-genéticas del genoma con consecuencias en la regulación génica y en su desregu-


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Concepto epigenético y sus alteraciones • 149

lación en procesos tumorales. Aunque, como se verá más adelante, se han des-cubierto nuevos componentes que forman parte de la regulación epigenética.

El primero de estos modelos tiene a la mmeettiillaacciióónn del DNA como su factormás importante con un efecto directo sobre la estructura de la cromatina. Lametilación del DNA afecta la expresión de los genes a través de dos mecanismos:la interferencia directa de la unión de un factor transcripcional a su secuenciablanco en el DNA (figura 10-2) o por medio de la unión de una familia de pro-teínas que reconocen al DNA metilado, factores que a su vez atraen cofactoresque reclutan enzimas remodeladoras de la cromatina, en particular histonas desa-cetilasas, causando la formación de una estructura de la cromatina altamentecompacta y por tanto, represora para la actividad transcripcional.

A

B

N K

Ac

27

K

Ac

23

K

Ac

18

K

Ac

14

K

Me

Ac

9

H3 S 28

P

S

P

10

NH 3 +

| CH 2 |

(CH 2 ) 3 | -X-Lis-X-Histona

CH 3 | C=O | Coenzima A

SH | Coenzima A

CH 3 | C=O |

NH |

CH 2 |

(CH 2 ) 3 | -X-Lis-X-Histona

H 2 O CH 3 | C=O | OH

H A T

H D A C

N K

Ac

16

K

Ac

12

K

Ac

8

K

Ac

5

H4 S

P

1

K 20

Me

N K

Ac

5

H2A S

P

1

N K

Ac

20

K

Ac

15

K

Ac

12

K

Ac

5

H2B

Me

K

Ac

4

Me

FFiigguurraa 1100--11.. Modificaciones postraduccionales de las histonas. AA)) Reacción de acetilación y desa-cetilación de histonas. Esquema del nucleosoma y DNA, resaltando los extremos amino terminalesde las histonas. Los números que muestran las “colas” amino terminales corresponden a la posi-ción de los residuos de lisina. BB)) Esquema de los extremos amino terminales de las histonas, indican-do algunas de las modificaciones postraduccionales. Me, metilación; Ac, acetilación, P, fosforilación.

El segundo modelo contempla cambios en la estructura de la cromatina cuyosefectos sobre la regulación epigenética dependen de distintas modificaciones pos-traduccionales de las regiones amino terminales de las hhiissttoonnaass.. Modificacionesque se presentan en diversas combinaciones, por ejemplo, la metilación y acetila-ción o fosforilación y desacetilación de residuos específicos en los extremosamino terminales de las histonas. Estas combinaciones han llevado a David Allisa proponer el CCóóddiiggoo ddee llaass hhiissttoonnaass como una forma de respuesta diferencial dela estructura de la cromatina para lograr eventos de regulación altamente especí-ficos. A continuación se presentarán los principales procesos relacionados con laregulación epigenética.

Metilación del DNA

La metilación del DNA consiste en la incorporación de un grupo metilo en laposición 5 de la citosina en el dinucleótido CpG. Los péptidos responsables de la metilación del DNA forman una familia de enzimas entre las cuales destacan laDnmt1, Dnmt3a y Dnmt3b. Estas enzimas son esenciales, y son responsables de


FT

X

C m pG metilado

CpG no-metilado X

FT

FT FT

FT FT

FFiigguurraa 1100--22.. Esquema del modelo de interferencia originado por la metilación del DNA. Los dinu-cleótidos CpG son el blanco de la metilación; cuando están presentes en el promotor de un genpueden ser metilados e interferir con el reconocimiento de factores transcripcionales a sus secuen-cias blanco en el DNA. Son posibles varios escenarios: 1) una alta densidad de CpG metiladas(hipermetilación) puede interferir con la unión de varios factores de transcripción, y 2) existenejemplos que demuestran que incluso un solo dinucleótido CpG metilado puede ocasionar el silen-ciamiento del promotor y la inactivación de la expresión del gen. Cabe señalar que no existen reglasgenerales que permitan predecir un escenario u otro, y es sólo mediante una aproximación experi-mental que se puede determinar la contribución de la metilación del DNA al silenciamiento de laexpresión de un gen.

la metilación conocida como de novo (Dnmt3a y Dnmt3b), y de mantenimien-to (Dnmt1).

La modificación epigenética mediada por la metilación del DNA es sinónimode represión o silenciamiento de la expresión génica. Como se mencionó antes,la interferencia es uno de los modelos que explican cómo un DNA metiladopuede regular negativamente la expresión de un gen (figura 10-2). Ésta es lavisión más sencilla y consiste en la incapacidad por parte de un factor transcrip-cional crítico para la expresión de un gen, para unirse al DNA en su secuencia dereconocimiento dado que el o los grupos metilo localizados en los dinucleótidosCpGs impiden directamente dicha unión (figura 10-2). Un ejemplo típico es laincapacidad del factor CTCF para reconocer a sus secuencias blanco en el alelopaterno de la región diferencial de metilación del locus Igf2/H19, mientras queen el alelo materno CTCF puede unirse dado que sus secuencias de reconoci-miento en el DNA, ricas en CpGs, no se encuentran metiladas (figura 10-4).

El segundo modelo es más complejo y participa un grupo de proteínas llama-das MeCP (del inglés, methyl-CpG-binding proteins) con la particularidad depoder unirse al DNA metilado (figura 10-3). Lo anterior implica que no requie-ren de secuencias específicas de unión al DNA, como por ejemplo los factores detranscripción. La unión de estas proteínas al DNA metilado trae consigo la inte-racción secuencial de otras proteínas básicamente por contactos proteína-proteí-na. Uno de los factores relevantes es el correpresor mSin3, el cual a través de otrasinteracciones tiene la capacidad de reclutar a histonas desacetilasas (HDAC).Todaesta serie secuencial de interacciones tiene como objetivo final inducir una es-tructura de la cromatina altamente compacta y por tanto, refractaria para la ac-tivación transcripcional.

Desde un punto de vista clínico, se sabe que defectos en los niveles y regula-ción de la metilación tienen consecuencias directas en procesos tumorales y portanto, en el cáncer. La hipometilación del DNA origina la activación anormal deprotooncogenes, activación de retrovirus, incremento de rearreglos cromosómi-cos, inestabilidades cromosómicas y pérdida de la impronta genómica. Por el con-trario, la hipermetilación puede provocar en un locus improntado la expresiónbialélica anormal, la desregulación por represión de genes que pudieran causarprocesos tumorales, como el Rb, p16, entre otros.

Impronta génica y expresión monoalélica

La metilación del DNA juega un papel central en la regulación de la expresiónde uno solo de los dos alelos con los que cuenta una célula (expresión monoalé-lica) para ciertos loci. A este fenómeno se le conoce como impronta genómica, ytiene que ver con la expresión monoalélica de un gen o un grupo de genes. El©

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locus Igf2/H19 constituye probablemente el dominio improntado mejor conoci-do (figura 10-4). Este dominio de más de 100 kilobases (kb) está compuesto porel gen Igf2, cuyo producto peptídico es necesario durante el desarrollo tempra-no, en particular en etapas embrionarias, y el gen H19 codifica para un transcritocuya función se desconoce y aparentemente no genera una proteína madura. Eneste dominio, la expresión monoalélica se encuentra principalmente regulada pordos potenciadores o enhancers localizados a 7 y 9 kb río abajo del gen H19 (figu-ra 10-4). La pregunta surge cuando se quiere entender cómo estos elementos decontrol son capaces de diferenciar entre un gen y otro de manera alelo específi-ca. Es aquí donde la metilación del DNA juega un papel clave, dado que se hademostrado que la región denominada región diferencial de metilación o DMR(por sus siglas en inglés) presente en la mayor parte de los loci improntados,puede metilar de manera diferencial uno solo de los alelos, que en este dominioes el alelo paterno. En este locus, el alelo materno no se encuentra metilado yfunge como un bloqueador de las señales provenientes de los potenciadoresmediante la unión y actividad de la proteína CTCF, concentrando su funciónactivadora sólo en el gen H19, lo que imposibilita la activación a distancia del genIgf2 (figura 10-4). Por el contrario, en el alelo paterno, la DMR y regiones aleda-ñas que incluyen al gen H19 se metilan, silenciando y eliminando la función debloqueo que además depende del factor CTCF, y permitiendo ahora la activaciónde manera monoalélica del gen Igf2.

Desde un punto de vista clínico, se puede inferir la importancia que tiene lametilación del DNA en la regulación de la impronta genómica. Fallas en este tipo


Cm

G Cm

G

x

mSin3A

HDAC1

Nucleosoma

H4

H3

NH

NH

A

A

A

DNA metilado

MeCP2

RbAp48–

–

FFiigguurraa 1100--33.. La metilación del DNA reprime la expresión génica mediante la formación de unacromatina compacta. La metilación del DNA se considera como uno de los procesos de regulaciónepigenética cuyo efecto es represor para la actividad transcripcional. En este modelo, la formaciónde una estructura de la cromatina “cerrada” se logra mediante la unión de las proteínas que reco-nocen al DNA metilado (conocidas como MeCP o MBD), cuya responsabilidad es la de atraer con-tactos moleculares con correpresores como Sin3A; correpresores que a su vez reclutan histonasdesacetilasas (HDAC), favoreciendo la compactación de la cromatina.

de regulación epigenética trae como consecuencia la expresión bialélica anormalde ciertos genes, incluyendo protooncogenes, supresores tumorales e incluso lageneración de diversos síndromes.

Modificaciones postraduccionales de las histonas en la epigenética

Las histonas forman parte de la organización del genoma en cromatina y partici-pan directamente en la regulación epigenética de la expresión de los genes. Comose mencionó antes, las histonas sufren al menos cuatro diferentes modificacionespostraduccionales en las regiones amino terminales. Las modificaciones más estu-diadas y con los efectos más claros son los que tiene que ver con la acetilaciónespecífica y diferencial de los residuos de lisina en las regiones amino terminalesde las histonas (figura 10-1). Resulta importante recalcar que la acetilación de lashistonas debe ser correlacionada directamente con una “abertura” o ddeessccoommppaacc--ttaacciióónn de la cromatina, favoreciendo así la actividad transcripcional. Por el con-©

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Igf2 H19

metilación

CTCF

CTCF

DMR

FFiigguurraa 1100--44.. Impronta genómica y el locus Igf2/H19. El dominio improntado que representa unparadigma dentro de esta área de estudio es el locus Igf2/H19. El patrón de expresión monoaléli-ca regula la transcripción del gen H19 en el alelo materno, mientras que el Igf2 posee una expre-sión específica del alelo paterno. El modelo actual propone que la metilación diferencial de la DMRprovoca que en el alelo materno la proteína CTCF pueda unirse al DNA, bloqueando la acción deenhancers localizados en el extremo 3’ del dominio. De esta forma, en el alelo materno, el gen dis-tal Igf2 no puede ser activado, y sólo el gen H19 puede ser transcrito. Por el contrario, en el alelopaterno, la región DMR se encuentra hipermetilada, inhabilitando la unión de CTCF causando quelos enhancers puedan ahora activar la transcripción del gen Igf2 localizado a más de 70 kb. Mien-tras tanto, en el alelo opuesto, la hipermetilación de la región DMR se expande invadiendo al pro-motor y cuerpo del gen H19, induciendo su silenciamiento.

trario, la desacetilación tiene las funciones opuestas y asegura una estructura dela cromatina represora para la actividad transcripcional.

Una de las demostraciones más recientes y relevantes de la importancia de lasmodificaciones postraducionales de las histonas es la metilación de las lisinas 4 y 9 de la histona H3. Este descubrimiento se origina a partir de la identificacióndel dominio SET conformado por 130 residuos en la proteína SU(VAR)3-9 deDrosophila, esta proteína es un miembro de la familia de supresores de variega-ción. El término de variegación se tomó de la variación irregular de coloración departe de las hojas o las flores debido a la supresión del pigmento por silencia-miento génico dado por un virus, y los genes SU(VAR) son los que suprimen lavariegación.

La proteína homóloga en humanos, la SUV39H1, es una histona metiltransfe-rasa cuya función es la de metilar de manera específica la lisina 9 de la regiónamino terminal de la histona H3. Esta señal postraduccional trae como conse-cuencia la interacción de la proteína asociada a heterocromatina HP1, proteínacaracterística de zonas de heterocromatina en el genoma, como lo son las regio-nes teloméricas y centroméricas, generando de esta manera una estructura de lacromatina altamente compacta (la heterocromatina es la parte de la cromatinaque no se transcribe). La relevancia de este descubrimiento vino a partir del estu-dio del promotor de la ciclina E (proteína relacionada con la progresión del ciclocelular) en el cual se sabe que el factor de transcripción E2F es responsable dereclutar a la proteína retinoblastoma (Rb, también asociada con la progresión delciclo celular) (figura 10-5). Lo interesante de esta observación es que además dela capacidad de Rb para reclutar histonas desacetilasas, ahora se demuestra queRb puede interaccionar con SUV39H1, la cual metila la lisina 9 de la región ami-no terminal de la histona H3, hecho que trae como consecuencia la asociación dela proteína HP1, y a través de un mecanismo estrictamente epigenético, reprimeo bloquea la función del promotor de la ciclina E (figura 10-5). En resumen, elpapel de la proteína Rb en cuanto a sus funciones reguladoras, está regido porcambios epigenéticos en la estructura de la cromatina de las regiones que contro-la. Lo anterior sugiere que este tipo de mecanismos se pueden extrapolar a ungran número de genes y sus respectivas regiones de control.

Complejos de remodelación ATP dependiente

Una alternativa dentro de la regulación epigenética es la acción de los complejosde remodelación dependientes de ATP, y cuya función es la de desplazar, reorga-nizar y deslizar a los nucleosomas. Como consecuencia de dicha actividad, esposible el acceso a sus secuencias blanco por parte de una variedad importantede factores de transcripción. Los complejos de remodelación poseen varias subu-


nidades que incluyen en algunos casos 16 componentes, entre los cuales destacala subunidad con actividad de ATPasa. Datos experimentales muestran que estetipo de complejos pueden actuar de manera sinérgica con otras modificaciones,como la acetilación y desacetilación de histonas, y que su función tiene un ordensecuencial específico. Una vez más nos encontramos ante un ejemplo donde sinque ocurran modificaciones genéticas se presenta una regulación de tipo epige-nético que va a favorecer o inhibir la actividad transcripcional.

Evidencias experimentales recientes sugieren que algunas subunidades deestos complejos de remodelación pueden actuar como supresores tumorales.También pueden participar activando o reprimiendo ciertos oncogenes y/o genessupresores de tumores. Por tanto, estos complejos originalmente asociados sólo ala función de remodelación de la cromatina también tienen relación con proce-sos tumorales.

Otras formas de regulación epigenética: el grupo de proteínas Polycomb/Trit-horax, RNA no-codificante y el núcleo celular

La investigación de fenómenos ligados a la regulación epigenética ha tenido undesarrollo insospechado, incorporando nuevos elementos epigenéticos como la©

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X Rb

SUV39HI HM T asa

Me Lis 9 E2F

heterocromatina

Promotor ciclina E

HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1

HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1

HP1 HP1 HP1 HP1 HP1 HP1

HP1 HP1 HP1 HP1

HP1 HP1 HP1 HP1

HP1 HP1 HP1

HP1 HP1 HP1

HP1 HP1

FFiigguurraa 1100--55.. Regulación epigenética del promotor humano del gen de la ciclina E. Por medio deinteracciones proteína-DNA (E2F) y proteína-proteína (Rb-E2F), miembros de la familia de facto-res E2F, en colaboración con la proteína Rb, reclutan a la histona metiltransferasa (HMTasa)SUV39H1, la cual de manera específica metila a la lisina 9 de la histona H3. Esta modificación pos-traduccional de la histona H3 es reconocida por la proteína de heterocromatina HP1, induciendosu acumulación y por tanto, la formación de heterocromatina de manera regulada. Éste es un claroejemplo de la regulación epigenética de un gen, la ciclina E, que participa en el control de la pro-gresión del ciclo celular.

familia de proteínas moduladoras de la estructura de la cromatina Polycomb(PcG) y Trithorax (TrxG), RNA no-codificantes y la propia dinámica nuclear.

Las proteínas Polycomb (PcG) forman complejos represores fomentando laformación de una cromatina cerrada (no hay transcripción de genes). Por el con-trario, las proteínas Trithorax (TrxG) favorecen una estructura de la cromatinaabierta (hay transcripción de genes). Al principio, las proteínas PcG/TrxG fueroncaracterizadas en la mosca de la fruta como reguladores epigenéticos de la expre-sión diferencial de los genes homeóticos (genes que durante el desarrollo embrio-nario están relacionados con la lateralidad y organización de varios órganos, enespecial el sistema nervioso). Un aspecto relevante surge del estudio de célulastumorales, en particular en cáncer de próstata, donde se observó una sobreexpre-sión del gen EHZ2, un miembro de PcG y que corresponde a una histona meti-lasa específica para la metilación de la lisina 27 de la histona H3. En estainvestigación se demostró por ensayos de expresión global por microarreglos quela sobreexpresión anormal de EZH2 causa la represión de diversos genes, entrelos cuales se encuentran genes supresores de tumores, lo que sugiere que su des-regulación puede ser causante del desarrollo del cáncer de próstata. Estos resul-tados demuestran la relevancia de los complejos PcG/TrxG en la regulaciónepigenética y su participación en procesos neoplásicos.

Otro aspecto novedoso dentro de la regulación epigenética es la participaciónde RNA no-codificante en la formación de heterocromatina. La inducción en laformación de heterocromatina está dada por mecanismos que involucran a la ma-quinaria del RNA de interferencia (RNAi), que a su vez recluta modificacionespostraduccionales en la histona H3, específicamente a través de la metilación dela lisina 9 de la histona H3, señal que favorece la incorporación de la proteína de heterocromatina HP1 (figura 10-5). Para ciertos organismos, este tipo de fenó-menos se ha visto aunado a la metilación del DNA.

En el contexto del estrés oxidativo y el efecto que las especies reactivas de oxí-geno tienen sobre la estabilidad del genoma y con la intención de especular, sepuede pensar que los RNAi pueden inducir la formación de heterocromatina enrespuesta a estas señales adversas. Una posibilidad interesante es que este tipo decomportamiento epigenético contribuya a evitar un daño mayor al DNA, o quela formación de heterocromatina fuera un proceso regulado en espera de que lamaquinaria de reparación inicie sus funciones.

Por último, el núcleo celular parece tener una mayor participación en la regu-lación epigenética, dado que el núcleo no sólo tiene como función la de conte-ner al genoma eucariótico en su interior, sino que participa de manera activa enla regulación diferencial de los genes (figura 10-6). En particular, la recientedemostración de la organización de los cromosomas en territorios ha apoyado losresultados que demuestran que zonas del genoma se relocalizan al interior delnúcleo, induciendo o reprimiendo la expresión de genes. Lo anterior sin conside-


rar que la función y morfología del núcleo de células dañadas por estrés oxidati-vo o neoplásicas se ven alteradas. En consecuencia, la estructura y dinámicanuclear deben ser consideradas como parte de los componentes epigenéticos deuna célula.

❚ EPIGENÉTICA, DAÑO AL DNA Y SU REPARACIÓN

Mantener la integridad del genoma es una necesidad central para la viabilidadcelular. Transmitir la información genética y epigenética de una generación celu-lar a otra debe ser uno de los procesos más regulados. Para lograr esto, la célulaha desarrollado sistemas especializados para vigilar y corregir defectos, en par-ticular los asociados al daño causado a la molécula de DNA.

Como se ha descrito a lo largo de varios capítulos, el daño al DNA es uno delos principales efectos ocasionados por las especies reactivas de oxígeno o ra-diación ionizante. Es claro que el daño al DNA, en su contexto in vivo, debe ocurrir en un genoma que se encuentra estructurado en cromatina y donde com-ponentes epigenéticos deben ser alterados para que dicho daño ocurra, y que ade-más en un contexto epigenético ocurra la reparación del DNA.©

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Modificaciones postraduccionales

de las histonas

Complejos de remodelaje

A TP-dependientes Metilación del DNA

P olycomb/ T r itho r ax

RNA no-codificantes

Núcleo Genética Epigenética

E f ecto sobre la secuencia del DNA

Mutaciones Deleciones

Amplificaciones T r anslocaciones

- Memo r ia celular - Herencia epigenética - Impronta genómica

- Pro gr amación de células troncales - Reparación del daño al DNA

- Senescencia - E n v ejecimiento

FFiigguurraa 1100--66.. Interdependencia de los procesos genético-epigenético en el control de la expresióngénica. La información genética se encuentra codificada en la molécula de DNA, y sus defectoscausan trastornos genéticos. Los procesos biológicos que participan en la regulación epigenética soncada vez más numerosos e interdependientes. Con mayor frecuencia, se encuentran fenómenos bio-lógicos y fisiológicos, tanto normales como anormales, que se ven influenciados conjuntamente porla regulación genética y epigenética.

Uno de los aspectos más claros en cuanto a la participación de procesos epige-néticos es el de la incorporación de una variante de histonas en respuesta a dañoal DNA. Una de las principales fuentes de daño es la radiación ionizante, la cualinduce daño oxidativo al DNA, causando el rompimiento de la doble cadena deDNA. Este daño es identificado por distintas enzimas, en particular, cinasas, lascuales fosforilan en la región carboxilo terminal a la variante de histona H2AX.En la actualidad se han caracterizado distintas cinasas con la capacidad de sensardaño al DNA, entre las que se encuentran:ATM,ATR y DNA-PK, las cuales, ademásde activar una remodelación epigenética de la cromatina de manera local, favo-recen, en respuesta al daño en el DNA, la incorporación de la histona H2AX. Laincorporación de la histona H2AX, además de contribuir a una remodelaciónespecífica de la estructura de la cromatina, induce el reclutamiento de la maqui-naria de reparación del DNA. Por si fuera poco, se fomenta una interacción entreH2AX y la ATM cinasa, provocando el arresto en la progresión del ciclo celular,proceso que facilita la incorporación de la maquinaria de reparación del DNA(figura 10-7) . En casos extremos, cuando el daño al DNA es muy extenso y queen cierta medida se vuelve irreversible, toda esta maquinaria activa vías alternas, enparticular la que lleva al suicidio de la célula, es decir, a la apoptosis. De estaforma, y mediante componentes propios de la regulación epigenética, se lograuna división celular libre de errores, permitiendo así la estabilidad genómica yuna transmisión correcta tanto de la información genética como epigenética degeneración en generación celular. En su defecto, resulta pertinente recordar quela desregulación de los procesos de reparación llevará a la célula al desarrollo deun proceso tumoral.

La célula ha evolucionado permitiendo la selección de diversas estrategias parala detección, remoción y corrección de los distintos tipos de daño causados algenoma, entre los cuales se encuentra la reparación por escisión de nucleótidos(NER; por sus siglas en inglés). La reparación del DNA por escisión de nucleóti-dos es un claro ejemplo donde la regulación genética y epigenética convergen. Elcomponente central en la reparación tipo NER es el complejo o factor general dela transcripción TFIIH, cuya función es relevante dentro del control del ciclocelular en asociación con su papel en el inicio de la transcripción con su activi-dad de cinasa fosforilando la región carboxilo terminal de la RNA polimerasa II;fosforilación que constituye una de las señales más importantes para el inicio dela transcripción. TFIIH es un complejo conformado por al menos nueve subuni-dades peptídicas, las cuales además de realizar las funciones mencionadas parti-cipa en la reparación tipo NER y por tanto, corrige daños al DNA, entre los quese encuentra el daño oxidativo. La participación de elementos que intervienen enla regulación epigenética, como los nucleosomas y las modificaciones postraduc-cionales asociadas a las histonas que los componen, complejos de remodelaciónATP dependientes, entre otros, apoyan la relevancia de TFIIH y el proceso de


reparación por NER para salvaguardar la integridad del genoma. Por ejemplo,entre las subunidades que conforman a TFIIH se encuentran RPA, XPA, y XPC,relevantes para el proceso de reparación, cuya función puede verse comprometidapor la organización nucleosómica del genoma. Por tanto, la estructuración delgenoma en cromatina debe ser relajada para permitir los procesos de reparación.Esto se ve apoyado por las interacciones entre RPA, XPA y XPC, con componen-tes de TFIIH y de complejo de remodelación ATP dependiente SWI/SNF, loscuales favorecen el desplazamiento y reposicionamiento de nucleosomas, contri-buyendo a la reparación del DNA.

Otro componente considerado como miembro de la regulación epigenética yque participa en la reparación del DNA es la proteína MBD4. Esta proteínaforma parte de la familia de proteínas que tienen la capacidad de unirse al DNAmetilado, implicadas en la formación de una cromatina compacta. Se desconocesu contribución real, pero se ha visto asociada a sitios donde ocurren procesos dereparación del DNA. La propia transcripción también juega un papel, en par-ticular cuando se asocian a la unión de factores transcripcionales y sus cofactoresque reclutan de manera local remodeladores de la cromatina, como las histonasacetilasas CREB y p300. Estas enzimas favorecen la acetilación, principalmentede residuos lisina, de las regiones amino terminales de las histonas: proceso epi-genético que lleva a relajar la estructura de la cromatina y contribuye a la repa-ración del daño causado al DNA.

Una etapa clave en el ciclo de vida de la célula es cuando, de manera coordi-nada, debe duplicarse su material genético previo a la división celular. En estamisma etapa resulta importante poder sensar y corregir daños al genoma para

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H2AX

Repa r ación del DNA NER, BER, NHEJ

A TM

Arresto en la pro g resión

del cíclo celular

M G1

S

G2

Apoptosis

DSB

p53 Repa r ación DSB

Epigenética Cromatina Cromatina

FFiigguurraa 1100--77.. Esquema de la relación entre la reparación del DNA, la incorporación de la variantede histona H2AX y la activación de la ATM cinasa responsable de la activación de distintas vías y de una respuesta al nivel del control del ciclo celular. En este contexto, son tres las respuestasposibles: reparación del DNA, arresto en la progresión del ciclo celular, y el escenario más críticotiene que ver con la activación de la vía de muerte celular o apoptosis.

asegurar su estabilidad y descendencia. Por tanto, es durante la fase S del ciclocelular y junto con la maquinaria de duplicación donde también se presentan me-canismos epigenéticos encargados de sensar y corregir daño al DNA. La proteínaPCNA es la responsable de aglutinar, en la orquilla de duplicación, múltiplesinteracciones proteína-proteína y coordinar no sólo la duplicación del DNA, sinotambién el control del ciclo celular, el ensamblaje de la cromatina de novo y lareparación del DNA. La PCNA puede asociarse con CAF-1 conocida como unachaperona de histonas, ayudando a la incorporación de las histonas H3 y H4durante el ensamblaje posduplicativo de la cromatina. La PCNA se asocia tambiéncon histonas desacetilasas y con la DNA metiltransferasa (Dnmt1), conocida co-mo la metilasa de mantenimiento. De una manera ligada a procesos epigenéticos,la PCNA junto con su asociación con CAF-1, HDAC y la Dnmt1, juegan unpapel coordinado en la reparación del DNA. De esta forma, y antes de la divisióncelular, heredar un genoma íntegro con marcas epigenéticas estables constituyeuna forma de asegurar la estabilidad y segregación correcta del genoma.

En resumen, resulta cada vez más evidente que la integridad del genomadepende en gran medida de la convergencia de mecanismos que implican la regu-lación epigenética. Es importante recordar que el daño al DNA por radiaciónionizante es uno de los más estudiados, y que se desconocen los efectos causadospor otros tipos de componentes como las especies reactivas de oxígeno y nitró-geno, abriendo un amplio y novedoso campo de investigación.

❚ SENESCENCIA, MODIFICACIONES EPIGENÉTICAS Y FORMACIÓNDE HETEROCROMATINA

Estrictamente no se ha establecido una clara relación entre las especies reactivasde oxígeno, reparación del DNA, senescencia y envejecimiento celular. A pesar deello, la predicción de que en procesos celulares como daño al DNA y senescen-cia, la regulación epigenética participe activamente es más que realista. Por estarazón, vale la pena presentar descubrimientos recientes que relacionan a la senes-cencia celular con procesos epigenéticos y que no sería sorprendente una relacióncon la presencia de radicales libres, estrés oxidativo y envejecimiento.

La familia de proteína asociada a Rb, p107 y p130, y el supresor de tumoresp53, constituyen reguladores del proceso conocido como senescencia celular. Lascélulas senescentes se caracterizan por un arresto en su ciclo celular acompañadopor la interrupción en su capacidad duplicativa. Las células senescentes, ademásde mantenerse metabólicamente activas, presentan cambios morfológicos, fisio-lógicos, al igual que en su patrón global de expresión génica. Una característicaparticular de estas células es la falta de expresión de genes ligados a la prolifera-ción celular. Uno de los parámetros más utilizados para definir a una célula senes-


cente es la actividad SA-βgal (del inglés: senescence-associated β-galactosidaseactivity).

Un estudio reciente demuestra la participación de Rb en el fenómeno desenescencia, promoviendo la formación de heterocromatina que participa en laconstitución de un estado senescente permanente de la célula. Diversos estudiosmoleculares y de inmunocitolocalización demostraron cambios en la forma ycontenido de las células senescentes. Además, se puso en evidencia la formaciónde conglomerados con características propias de secuencias de heterocromatinadenominadas SAHF (del inglés: senescence-associated heterochromatin foci). LosSAHF característicos de las células senescentes conglomeran información genéticainactiva transcripcionalmente, presentan acumulación de la histona H3 metilada enla lisina 9 y acumulación de la proteína de heterocromatina HP1. Se demostró en este mismo trabajo que la formación de heterocromatina, dependiente de laactividad de la proteína Rb, se presenta asociada en células senescentes a ciertospromotores dependientes de la familia de factores E2F, por lo que la formaciónde SAHF dependiente de Rb constituye el primer mecanismo descrito para elcontrol y arresto del ciclo celular en una célula senescente, proceso que dependeclaramente de la vía de Rb y de elementos de control epigenético.

Al parecer, Rb no es el único factor involucrado en la formación de célulassenescentes. Basados en la literatura, resalta la poca consistencia y puntos deacuerdo en cuanto a las funciones de las proteínas p107 y p130. Se ha sugeridoque p107 y p130 tienen una función, y responden a funciones específicas decélulas quiescentes. Por otra parte, existen evidencias que apoyan su función pro-moviendo la senescencia celular, al igual que Rb, mediante la heterocromatiniza-ción de promotores de genes dependientes de los factores de la familia E2F.

Por su parte, Blasco et al., han corroborado la participación de la familia deproteína Rb en la formación de heterocromatina por medio del análisis de unatriple mutante (RB1, RBL1 y RBL2) en fibroblastos embrionarios de ratón. Co-mo consecuencia de esta triple mutante se manifiesta una clara inestabilidadgenómica, coincidente con una pérdida en la metilación del DNA, aumento enla acetilación de la histona H3 y disminución en la trimetilación de la lisina 20de la histona H4. Todos estos cambios ocurren predominantemente en regionespericentroméricas y teloméricas. Los autores concluyen que los miembros de lafamilia Rb contribuyen, en parte, a mantener la estabilidad del genoma median-te la formación de heterocromatina. La relevancia clínica de estos resultadostiene que ver con procesos de inestabilidad genómica observada en aneuploidías,presentes en diversos tipos de neoplasias.

Para finalizar, hay que recordar que una célula senescente tiene per se caracte-rísticas antitumorales al no permitir su proliferación. Con base en lo anterior, sepuede predecir que los mecanismos que llevan a una célula a senescencia pudie-ran ser activos cuando se presenta daño al DNA por especies reactivas, para de©

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esta forma evitar la segregación de defectos genómicos. En consecuencia, enten-der los mecanismos de control de la senescencia, que además utiliza en parte pro-cesos epigenéticos, resulta ser un aspecto relevante para entender cómo sedesarrolla un proceso tumoral y de qué forma se puede diseñar una estrategiaterapéutica.

❚❚ CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

En la actualidad aún no se logra una visión integral de los fenómenos que permi-tan entender procesos tan básicos como la regulación genética y epigenética. Losavances han sido enormes, pero aún quedan muchas interrogantes. El conoci-miento generado hasta la fecha asegura que el campo de la epigenética se en-cuentra en una etapa inicial de gran auge, y que en breve se descubrirán nuevosfactores y redes de regulación relacionados con la formación de estructuras repre-soras de la cromatina. Como se mencionó, las especies reactivas de oxígeno y ni-trógeno, el estrés oxidativo y sus efectos a nivel fisiológico, deben tener uncomponente epigenético que hasta ahora no ha sido demostrado claramente. Apesar de ello, existen indicios que sugieren que la regulación epigenética debeconsiderarse en los procesos de reparación del DNA, senescencia, programacióny reprogramación de células totipotenciales, envejecimiento y regulación génica,abriendo de esta forma un amplio panorama para la investigación básica y bio-médica (figura 10-5). Por si fuera poco, estos procesos llevarán a entender mejorlos orígenes de ciertos tipos de cáncer. Todo lo anterior debería converger en nove-dosos protocolos de diagnóstico, y sobre todo de métodos terapéuticos que, juntocon la secuencia del genoma humano, permitirá incluso pensar en una medicinapredictiva mucho más segura. Finalmente, hay que recordar que la identificaciónde genes y sus productos peptídicos que conforman al genoma humano no serásuficiente, y que la caracterización e identificación de secuencias y elementos deregulación en regiones intergénicas del genoma humano, con mayor frecuenciadenominado epigenoma, serán críticas para el entendimiento de los mecanismosde regulación epigenética.

❚❚ REFERENCIAS

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SSEECCCCIIÓÓNN VV..AANNTTIIOOXXIIDDAANNTTEESS

11. Superóxido dismutasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

12. Catalasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183

13. Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

14. Tiorredoxinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219

15. Hemooxigenasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233

16. Glutatión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253

17. Potencial antioxidante de los carotenoides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269

18. Potencial antioxidante del ácido ascórbico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279

19. Potencial antioxidante de los α-tocoferoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291

20. Polifenoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303

SSUUPPEERRÓÓXXIIDDOO DDIISSMMUUTTAASSAA

Luis Enrique Gómez QuirozDeidry Beatriz Cuevas Bahena

❚ INTRODUCCIÓN

A lo largo de este libro se ha hablado de la toxicidad de las especies reactivas deoxígeno, siendo el radical anión superóxido (O2

•) una de las primeras especiesgeneradas por diversos sistemas celulares. Este radical es altamente tóxico por símismo, sobre todo porque daña a las proteínas que contienen centros Fe-S, comola aconitasa, la succinato deshidrogenasa y la NADH-ubiquinona oxidorreducta-sa, entre otras; sin embargo, también puede ser el generador de otras especiesreactivas aún más tóxicas que él mismo. La superóxido dismutasa (SOD) es laenzima encargada de transformar esta especie reactiva en una de menor toxici-dad, como el peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual es posteriormente transfor-mado en agua por otras enzimas.

❚ PANORAMA HISTÓRICO

El descubrimiento de la actividad de la SOD fue reportado en 1969 por McCordy Fridovich, aunque la proteína ya había sido descubierta 30 años antes por Mann

❚ 169 ❚

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y Keilin, quienes reportaron el aislamiento y purificación a partir de muestras desangre e hígado bovino de una proteína que contenía cobre y cuya actividad des-conocían. La proteína fue llamada erythrocuprein o hepatocuprein, y más tardecytocuprein. El O2

• también había sido descubierto en el decenio de 1930-39 porLinus Pauling; sin embargo, aún no se reconocía su presencia y participación enlos sistemas biológicos, y mucho menos en las patologías. En 1969, Knowles ycolaboradores, demostraron que la enzima xantina oxidasa era capaz de producirO2

•, y más tarde McCord y Fridovich mostraron que este superóxido podía sereliminado catalíticamente por la cobre-proteína de Mann y Keilin. Ahora se sabeque esa proteína descubierta por Mann y Keilin es sólo un miembro de la fami-lia de las SOD, y que además une también cinc.

❚ LA FAMILIA DE LAS SOD

Las SOD son una familia de enzimas que catalizan eficazmente la dismutacióndel O2

•, como se observa en la siguiente reacción:

2 O2• + 2 H+ → H2O2 + O2

En los mamíferos, esta familia está formada por tres miembros, los cuales se ubi-can en lugares claramente específicos, dos dentro de la célula y uno extracelular(figura 11-1). La primera enzima es una SOD que tiene en su centro catalíticoun cobre y un cinc (SOD1 o Cu/Zn-SOD) y se ubica en el citoplasma; el núcleo,en la membrana externa de la mitocondria, y es justamente la proteína descritapor Mann y Keilin. La segunda enzima está ubicada cerca de la membrana inter-na mitocondrial. Ésta es una SOD que une manganeso en su centro catalítico(SOD2 o MnSOD); y finalmente existe una más, la cual se localiza fuera de la célula y está asociada a la matriz extracelular.Al igual que la primera SOD, éstatiene asociado un cobre y un cinc (SOD3 o EC-SOD). Si bien las tres realizan la misma actividad catalítica, guardan grandes diferencias en cuanto a su estruc-tura y organización (cuadro 11-1).

La compartimentación de las diferentes SOD se explica en gran medida por elhecho de que el O2

• no puede cruzar con facilidad las membranas que separanlos compartimientos celulares y mitocondriales. Sin embargo, recientemente seha reportado que dado que el O2

• puede reaccionar con otras moléculas, es capazde originar especies intermediarias que le faciliten la permeabilidad y puedan, deesta forma, escapar de los efectos protectores de las SOD y ejercer su toxicidad.Un buen ejemplo de ello es la gran facilidad que tiene el O2

• para reaccionar conel óxido nítrico (NO•) para formar el peroxinitrito (ONOO–), el cual puede atra-vesar las membranas lipídicas utilizando algunos canales iónicos.


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Superóxido dismutasa • 171

Además, en las bacterias existen otros dos tipos de enzimas de la familia de lasSOD, una que une hierro en su centro catalítico (FeSOD) y otra que une níquel(NiSOD). Éstas no serán consideradas en el presente capítulo, que se enfocarásólo en las SOD que se expresan en los humanos, aunque son de gran interés porestar involucradas en bacterias patógenas para el ser humano.

SOD1

La SOD1 o Cu/ZnSOD se encuentra en el citoplasma, núcleo, peroxisomas, y enla membrana externa mitocondrial. La enzima es un homodímero de 32 kDa conun Cu y un Zn por cada subunidad de 153 aminoácidos. Sólo el cobre tieneimportancia catalítica, mientras que el cinc confiere estabilidad a la estructuraproteínica; sin embargo, ambos metales están muy conectados por un imidazola-to que provee la histidina 63 (figura 11-2).

El gen de la SOD1 (sod1) se ubica en el humano en el cromosoma 21, en laregión 21q22; está compuesto por 5 exones y 4 intrones, posee cajas TATA,CCAAT y regiones ricas en GC. En su región promotora posee sitios de unión

SOD3

SOD1

O 2 •

O 2 •

H 2 O

2

H 2 O

H 2 O

2 Oxidasas

Memb r ana celular

Dominio de unión a hepa r ina

SOD1

Núcleo

SOD2 O 2 • H

2 O

2

FFiigguurraa 1111--11.. Distribución de las diferentes SOD en los humanos.

para factores de transcripción que regulan su expresión, como NF1, Sp1, AP1,AP2, GRE, HSF y NF-κB, por lo que su expresión es inducida por estímulosmecánicos, químicos y biológicos como el choque térmico, radiaciones ultravio-leta (UV), metales pesados y por supuesto, el estrés oxidativo.

SOD2

La mitocondria es, sin duda alguna, el organelo celular sometido a mayor estrésoxidativo, puesto que se estima que alrededor de 4 a 5% de los electrones trans-portados por la cadena respiratoria son desviados para producir O2

•. Por ello,resulta vital la presencia de la SOD2 dentro de la mitocondria; de hecho, esto hasido probado en ratones a los cuales se les ha modificado el gen sod2, teniendocomo resultado neurodegeneración, daño en el miocardio y muerte perinatal.

La SOD2 o MnSOD, aunque se localiza en la mitocondria, está codificada enel núcleo, por lo que su expresión está regulada, en gran parte, por el estado redoxde la mitocondria. Lo anterior sugiere que existe una respuesta adaptativa al dese-quilibrio oxidativo mitocondrial. El gen sod2 está situado en el humano en el cro-mosoma 6 en la región 6q25, y está compuesto de 5 exones y 4 intrones. Elpromotor carece de las cajas TATA o CAAT, pero posee regiones ricas en GC; ade-más, contiene secuencias regulatorias para NF-κB, SP-1 y AP-2, C/EBP, NF-1. Su


CCuuaaddrroo 1111--11.. CCaarraacctteerrííssttiiccaass ddee llaass SSOODD eenn hhuummaannooss

MMeettaall eenn PPEESS UUbbiiccaacciióónn ddeellNNoommbbrree UUbbiiccaacciióónn cceennttrroo oo ggeenn eenn CCaarraacctteerrííssttiiccaass

ccaattaallííttiiccoo KKDDaa hhuummaannooss

SOD1, Citoplasma, Cu y 32 Cromosoma 21 Símero, 153CuZnSOD núcleo, peroxi- Zn aminoácidos por

somas y en la unidadmembrana ex-terna delamitocondria

SOD2, Membrana in- Mn 89 Cromosoma 6 HomotetrámeroMnSOD terna de la mi-

tocondria

SOD3, Extracelular, Cu y 135 Cromosoma 4 GlucoproteínaECSOD asociada a hepa- Zn tetramérica

rina, sangre,entre otros

expresión es inducida, como se puede deducir, por diversas citosinas y factores decrecimiento tipo proinflamatorios como el TNF-α, IL-1, IL-6, entre otras, así comopor inductores de estrés como el lipopolisacárido (LPS) o los metales pesados.

La enzima es un homotetrámero con un peso de 22 kDa por subunidad, yposee un Mn+3 por monómero.

SOD3

La SOD3 o EC-SOD es la única proteína extracelular que puede eliminar el O2•.

La SOD3 humana fue purificada en 1982, y se encontró que era una proteínatetramérica de casi 135 kDa y 222 aminoácidos que contenía un átomo de cobrey uno de cinc por subunidad. A diferencia de las otras SOD, la SOD3 presentauna glucosilación en la Asn 89 (figura 11-3).

La SOD3 está presente en la matriz extracelular, principalmente unida a laheparina y a las fibras de colágena tipo I de la mayor parte de los tejidos. Tambiénse ha encontrado en el plasma y en el fluido linfático y cefalorraquídeo; no obs-tante, la concentración de SOD3 en la matriz extracelular es 20 veces superior ala presente en el plasma.

La SOD3 posee 60% de homología con la SOD1; sin embargo, tiene muy pocahomología con la SOD2. El gen humano de la sod3 está organizado en 3 exonesy 2 intrones. El promotor del gen contiene varios elementos reguladores, inclu-yendo al elemento de respuesta antioxidante, a los sitios de unión a los factoresde transcripción AP-1 y NF-κB, y a los elementos de respuesta xenobiótica.

La enzima puede dividirse estructuralmente en tres dominios funcionales:

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His46

His118

His44

His63

Asp 81

His69

His78

Arg143

Zn Cu

FFiigguurraa 1111--22.. Centro catalítico de la SOD1.

1. La región amino terminal (residuos 1 a 95), la cual contiene el sitio deglucosilación, y contribuye a la solubilidad de la enzima.

2. La región intermedia (residuos 96 a 193), que contiene al centro catalí-tico y exhibe una fuerte homología con la SOD1.

3. La región carboxilo terminal (residuos de 194 a 222), que contiene unasecuencia de nueve aminoácidos con carga positiva (3 lisinas y 6 argininas)que le otorga afinidad por la heparina y el sulfato de heparán, permitién-dole la localización extracelular y en la matriz extracelular, este dominiose conoce como dominio carboxilo terminal de unión a heparina (DUH).

La purificación de la enzima por cromatografía de afinidad usando heparinaacoplada a sefarosa, mostró que existen tres fracciones, una que no tiene afinidadpor la heparina (fracción A), otra con afinidad débil (fracción B) y una más conafinidad muy fuerte (fracción C). La mayor parte de la SOD3 que existe en lostejidos es del tipo C. Este tipo de SOD3 está construida con cuatro subunidadesque poseen el DUH intacto, mientras que la fracción B es heterogénea y la frac-ción A carece en sus cuatro subunidades de los DUH. No es difícil pensar que lasSOD tipo A y B son especies circulantes, mientras que la tipo C permanece aso-ciada básicamente en endotelios.

La remoción del DUH en las SOD3 de las fracciones A y B se lleva a cabo porproteólisis, actividad que se ha atribuido a la tripsina en un proceso extracelular,o a proteasas, del tipo de las furinas, dentro de la célula, las cuales cortan el DUHantes de ser secretadas. Este proceso permanece aún en discusión, lo cierto es queel procesamiento proteolítico que genera los tipos A y B de SOD3 asegura teneruna adecuada protección antioxidante en plasma y tejidos.

Además de estas modificaciones, la SOD3 puede existir también en dos for-mas relacionadas con la formación de puentes disulfuro dentro de la proteína.


H2N COOH

Funciónde la región

Tetramerización Actividad catalítica Unión a MECy a heparina

FFiigguurraa 1111--33.. Relación estructura-función de la SOD3. ■ N-acetil-glucosa; ❍ manosa; galactosa;fucosa; ▲ ácido siálico.

Una de las formas es enzimáticamente activa (aEC-SOD), mientras que la otracarece de actividad (iEC-SOD). La forma activa contiene puentes disulfuro entrelas cisteínas 45 y 190, y otro más entre las cisteínas 107 y 189, que son homólo-gos a SOD1; por otro lado, la iEC-SOD forma los puentes disulfuro entre las cis-teínas 107 y 195, y el otro entre las cisteínas 189 y 190; tal vez este fenómenorepresenta el primer caso de regulación de la actividad de una enzima por varia-ción intramolecular de los puentes disulfuro.

❚ REACCIÓN CATALÍTICA DE LAS SOD

El O2• generado en la mitocondria o en otros sistemas es convertido por las SOD

en H2O2, el cual a su vez también es convertido en H2O por la catalasa o por laglutatión peroxidasa GPx (figura 11-4). La reacción enzimática (2 O2

• + 2H+ →H2O2 + O2) es llevada a cabo por la SOD en dos pasos, ambas son reaccionesenzimáticas de primer orden respecto al O2

•:

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O 2 •

SOD

H 2 O 2

H 2 O

Catalasa

GSHPx

Señalizacion

Expresión de

genes

Daño

NO

ONOO -

Nit r acion de proteínas

Estrés o xidati v o

Daño

Daño

O 2

NAD(P)H o xidasa

Ciclo o xigenasas

Xantina o xidasa

Cadena respi r ato r ia

Citocromo P450, etc

FFiigguurraa 1111--44.. Proceso de destoxificación del radical superóxido y sus posibles interacciones y efec-tos dentro de la célula.

Mox + O2• + H+ ↔ Mred (H+) + O2

Mred (H+) + O2• + H+ ↔ Mox + H2O2

donde Mox es el estado oxidado del metal en el centro catalítico (Cu2+Zn2+ oMn+3), y Mred denota el estado reducido del mismo metal (Cu+ Zn2+ o Mn2+).

Tomando a la SOD1 como modelo, el mecanismo de reacción se desarrollacomo se explica a continuación: el O2

• llega al centro de reacción y se une, poruna interacción electrostática, a la arginina 143. El O2

• requiere donar su elec-trón desapareado para poder ser convertido en oxígeno molecular, ya que es eseelectrón el que le confiere su naturaleza reactiva y tóxica. El electrón es transfe-rido al Cu2+, que transforma al metal a su estado de menor oxidación, o Cu+. Estatransferencia electrónica genera que el enlace entre el Cu y la histidina 63 serompa, lo que provoca que el nitrógeno de la histidina 63 se protone. El O2 for-mado se disocia de la arginina 143 y se libera (figura 11-5).

La segunda parte de la reacción se inicia de manera similar a la primera, el O2•

llega al centro catalítico, y una vez ahí, se une por una interacción electrostáticacon la arginina 143, aunado a esto, se genera, en la proximidad del centro catalí-tico, la protonación de una molécula de agua (H3O+). El electrón que recibió elCu en la primera parte de la reacción, es ahora transferido al segundo O2

•, per-mitiendo la oxidación del metal a Cu2+. Los dos electrones que posee en estemomento el superóxido pueden formar inmediatamente dos enlaces covalentescon dos protones, los cuales son donados, uno por la molécula de agua protona-da, y el otro por el nitrógeno de la histidina 63, lo que favorece que se restablez-ca el enlace que originalmente formaba con el Cu2+. Esto permite la liberacióndel H2O2 y la regeneración de la enzima, la cual queda preparada para otro ciclocatalítico (figura 11-6).

El mecanismo de unión del sustrato a la SOD requiere, como se explicó antes,que el O2

• se una a dos versiones diferentes del mismo sitio catalítico; sin embar-go, la atracción electrostática es preservada después de la reducción del metal (Cu+)por el acoplamiento de un protón al sitio activo, (histidina 63); de esta forma, sibien la distribución de cargas ha cambiado, la carga total permanece equilibrada.

Una pregunta que salta a la vista respecto a la reacción es ¿cómo puede la enzimacontrarrestar la repulsión electrostática de dos O2

•? La SOD libra este inconve-niente de dos formas: primero, el metal catalítico reacciona con un solo O2

•, ysegundo, la enzima usa la carga negativa del anión para aumentar la especificidadhacia el sustrato y no hacia el producto. Estructuralmente hablando, las SOD tie-nen un potencial electrostático positivo cerca del sitio activo, causado por elmetal del centro catalítico; por otro lado, la carga del metal no es completamen-te neutralizada por el ligando, esta carga contribuye a la unión del sustrato; deesta forma, la SOD también puede unir otros aniones pequeños; por el contrario,los dos productos son neutros, lo que les impide ser unidos por este mecanismo.


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His63

Arg143

Cu 2+ Zn

His63

Arg143

Zn Cu +

Nitrógeno

Oxígeno

Carbono

Hidrógeno

Electrón

FFiigguurraa 1111--55.. Mecanismo de reacción mediado por la SOD1. Primera parte de la reacción, elimina-ción del primer superóxido y reducción del cobre.

Otra pregunta que puede surgir es ¿por qué una vez formado el H2O2 no reac-ciona con el metal (p. ej. Cu+2), siguiendo el modelo clásico de la reacción deFenton? Primero, como se explicó en el párrafo anterior, una vez formado elH2O2 es repelido del centro catalítico de manera inmediata por su naturalezaneutra. Segundo, el Cu+2 que se regenera en la segunda parte de la reacción esestabilizado de inmediato por su unión a una histidina, que es, de hecho, la quedona un H+ al producto naciente, en el caso de la SOD1 es la histidina 63, la cualpuentea a los dos metales. Por último, se sabe que en casos extraordinarios y avelocidades muy bajas, la SOD1 sí puede generar al radical hidroxilo a partir delH2O2, pero dadas las características cinéticas mencionadas, carece de importan-cia fisiológica o patológica.

❚ PATOLOGÍAS RELACIONADAS CON LA DEFICIENCIA DE LAS SOD

No es difícil imaginar que el mal funcionamiento de las SOD puede generarserios problemas en el organismo, especialmente desórdenes de tipo neurológicoo vascular. A continuación se expondrán de manera breve algunas patologías quese han relacionado con las SOD.

SOD1

Por la ubicación del gen sod1 en el cromosoma 21, podría pensarse en su posible re-lación con la trisomía 21 o síndrome de Down. Sin embargo, esta idea sigue sien-do cuestionada a pesar de que estos pacientes presentan un incremento de 50%en la actividad de la enzima debido a que existe un aumento en la proteína por


His63

Arg143

Cu 2+

Zn

His63

Arg143

Zn Cu ++

Nitrógeno

Oxígeno

Carbono

Hidrógeno

Electrón

FFiigguurraa 1111--66.. Mecanismo de reacción mediado por la SOD1. Segunda parte de la reacción; transfor-mación del segundo anión peróxido en peróxido de hidrógeno y regeneración del centro catalítico.

la presencia triple del gen. Algunos estudios enfocados en la producción de enzi-mas antioxidantes en la trisomía 21 mostraron que no hay diferencias respecto alos controles en las concentraciones de la SOD1 y de la catalasa, entre otras enzi-mas antioxidantes, pero sí mostraron una disminución significativa en las enzimasrelacionadas con la síntesis del glutatión (GSH), como la GSH sintasa; además deenzimas como la tiorredoxina peroxidasa, la GSH-S-transferasa, lo que indicaque la presencia del estrés oxidativo en pacientes con esta patología puede deber-se a un decremento en la síntesis de agentes reductores como el GSH y en lasenzimas que ayudan a la eliminación del H2O2, más que un incremento en laactividad de la SOD1. Como se mencionó antes, aún se discute si la SOD1 estáinvolucrada de manera significativa en la patología, de hecho varios grupos deinvestigación han sugerido que el problema principal en esta enfermedad pudie-ra ser la sobreexpresión de otros genes, que también están codificados en el cro-mosoma 21, como la proteína β-amiloide. Aún hay mucho que estudiar sobre elsíndrome de Down, pero la falta de modelos experimentales adecuados hace queel avance sea lento.

Por otro lado, se han identificado más de 105 mutaciones diferentes del gensod1 que han sido asociadas a la esclerosis lateral amiotrófica, también conocidacomo enfermedad de Lou Gherig. La mayor parte de estas mutaciones sustitu-yen un aminoácido en al menos 64 localizaciones diferentes, dando como resul-tado el corrimiento del marco de lectura, así como interrupciones, inserciones yeliminaciones.

La esclerosis lateral amiotrófica es una patología neurodegenerativa mortal,con una prevalencia de 4 a 5 por cada 100 000 personas, la cual se inicia alrede-dor de los 50 años de edad, aunque se tienen registros en pacientes jóvenes. Laenfermedad afecta específicamente a las neuronas motoras ubicadas en el cere-bro, en el tallo encefálico y en la médula espinal; el paciente con este trastornova perdiendo la capacidad de movimiento poco a poco hasta afectar los múscu-los auxiliares respiratorios, lo que ocasiona un paro y, en consecuencia, la muer-te (véase capítulo de Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas).

La relación de las mutaciones en el gen sod1 con la esclerosis lateral amiotró-fica es clara e indiscutible; sin embargo, aún no se precisa el mecanismo por elcual estas mutaciones ocasionan la patología. Una hipótesis es que las mutacio-nes generan una proteína defectuosa, lo que permite la acumulación de especiestóxicas. Esta teoría fue rebatida cuando se creó un ratón mutante que sobreex-presaba la mutación G93A, desarrollando la enfermedad a pesar de tener niveleselevados en la actividad de la enzima. Por otro lado, existe otra teoría que propo-ne que las mutaciones en sod1 cambian la afinidad de la proteína para unir alcobre, esto deriva en un incremento en la agregación de SOD1 en las neuronasformando fibras y/o poros parecidos a las amiloides, fenómeno que se presentaen otras enfermedades parecidas como las ocasionadas por priones. El depósito©

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de estas fibras genera la pérdida de la funcionalidad de las neuronas motoras queresultan en la muerte celular y la pérdida del movimiento, este fenómeno sepuede acompañar de un incremento en el estrés oxidativo por la falta de la acti-vidad catalítica de la SOD1.

SOD2

Diversas variaciones genéticas se han observado en el gen sod2, las cuales se hanasociado a varias patologías. La sustitución de la alanina 9 por una valina en lasecuencia de localización mitocondrial se ha asociado al envejecimiento prema-turo y la progeria, así como al incremento en el riesgo de contraer patologías neu-romotoras (sobre todo en mujeres) y miocardiopatías, y recientemente en cáncermamario, pero no se ha correlacionado con la enfermedad de Parkinson o conesclerosis lateral amiotrófica.

Por otro lado, se ha observado que en diversos tipos de cáncer la enzima estáalterada en comparación con el correspondiente tejido normal. Una reducción sig-nificativa en la expresión de la SOD2 en diversos tipos de neoplasias humanas y experimentales ha colocado a la SOD2 como una nueva proteína supresora detumores. Esto está apoyado también por el hecho de que la expresión de laSOD2 se regula durante el ciclo celular, teniendo una concentración menor enlas células que están en la fase G0. En apoyo a esta idea, la inducción de la sobre-expresión de la SOD2 en células derivadas de cáncer mamario en humanos y enfibroblastos de ratón de la línea NIH3T3 genera una disminución en su prolifera-ción, lo que sugiere una relación en el mecanismo entre el contenido intracelularde la SOD2 y la proliferación celular. Más aún, la región cromosómica 6q, que esdonde se localiza sod2, se encuentra ausente en los melanomas, y la reexpresiónde SOD2 en líneas celulares de melanomas les confiere una disminución en laproliferación y neoplasia, lo que es consistente con la función de una proteínasupresora de tumores. Sin embargo, en algunos tipos de tumores, sobre todo pul-monar, cervicouterino, cerebral, gástrico, entre otros, se ha observado que laSOD2 está aumentada, esto podría resultar en contraposición de ser una proteí-na supresora de tumores; sin embargo, se reconcilia por la actividad general de laSOD2, que es la de ser una enzima antioxidante celular (tumoral) que protegeen contra del estrés oxidativo generado por la mitocondria.

SOD3

Existen diversos estudios que relacionan las deficiencias en la SOD3 con algunaspatologías, en particular con las enfermedades vasculares, puesto que la SOD3


tiene la capacidad de asociarse al endotelio. La arteriosclerosis es una de ellas, así,se ha encontrado una disminución de la enzima en pacientes que padecen estapatología, lo que contribuye a la disfunción endotelial (véase el capítulo de Estrésoxidativo y disfunción endotelial).

La activación de la NADPH oxidasa por la angiotensina II (A-II) genera unagran producción de especies reactivas de oxígeno en vasos sanguíneos, y se havisto que la hipertensión causada por la A-II puede ser disminuida por el trata-miento con la SOD3. Por otro lado, se ha reportado que A-II incrementa laexpresión y la actividad de la SOD3, lo que contrarresta el efecto oxidante de la NADPH oxidasa.

La SOD3 también influye en la diabetes. La unión a la heparina de la enzimase modula por concentraciones elevadas de glucosa, que origina la glucosilaciónde una lisina del DUH, esta modificación resulta en la pérdida de la afinidad a laheparina, pero no en su actividad catalítica. Los pacientes con diabetes presentanuna gran cantidad de SOD3 glucosilada en sangre, lo que indica también una dis-minución de la enzima en la MEC. Algunos estudios han demostrado nivelesbajos de la enzima en las arterias de la tibia en pacientes diabéticos, lo que aumen-ta la susceptibilidad al O2

•. En estudios con ratones a los que se les induce dia-betes por la destrucción de los islotes pancreáticos con O2

•, se ha observado quela regeneración de las células β está retardada en los animales que carecen de laexpresión de la SOD3 comparado con los controles que expresan correctamen-te a la enzima.

La SOD3 también se ha visto relacionada en la polineuropatía amiloide tipo1, los pacientes con esta enfermedad presentan un incremento en los niveles deSOD3 de casi 10 veces el normal. El estudio genético ha revelado que existe unamutación en la Arg213; al parecer, esta mutación no afecta la actividad, pero síla unión a heparina, lo que explica su incremento en la circulación.

❚ CONCLUSIONES

En resumen, el oportuno control del O2• representa para la célula el punto neu-

ral en el equilibrio entre oxidantes y antioxidantes, por lo que las SOD juegan talvez el papel central en este equilibrio. Un exceso de O2

• genera toxicidad, peroal mismo tiempo, el O2

• y las SOD son generadores del H2O2, el cual tiene fun-ciones muy importantes en la transducción de señales y la activación de genes,por lo que un buen funcionamiento de las SOD aseguran un correcto estadoredox, que permite una adecuada actividad celular.

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❚ REFERENCIAS

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CCAATTAALLAASSAA

Leonardo Peraza Reyes

❚ INTRODUCCIÓN

Durante el metabolismo celular de la mayoría de los seres vivos se generan nor-malmente las especies reactivas de oxígeno, como el superóxido (O2

•), peróxidode hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (•OH). Estas especies tienen unacapacidad oxidante mayor que el O2, por lo que su presencia en las células puedegenerar daños importantes. Las células cuentan con un gran repertorio de meca-nismos antioxidantes que permiten su eliminación o previenen su formación.Uno de estos mecanismos consiste en eliminar al H2O2 que, si bien es una de lasespecies reactivas de oxígeno más estables, puede reaccionar y generar otras espe-cies más reactivas, como se mencionó en el capítulo 2. Así, el principal efectotóxico del H2O2 consiste en su gran capacidad de difusión, ya que puede atrave-sar libremente las membranas celulares, y una vez dentro de la célula reaccionarcon metales de transición (como Fe2+ o Cu+) para formar al •OH. Este radical esuna de las especies químicas más reactivas que se conoce, y su reactividad oxi-dante parece estar limitada sólo por su nivel de difusión, de manera que en lascélulas reacciona rápido con prácticamente cualquier molécula.

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12

CCuuaaddrroo 1122--11.. NNoommeennccllaattuurraa ddee llaass ppeerrooxxiiddaassaass ddee aaccuueerrddoo ccoonn eell NNCC--IIUUBBMMBB

NNoommeennccllaattuurraa PPeerrooxxiiddaassaa NNoommeennccllaattuurraa PPeerrooxxiiddaassaa

EC 1.11.1.8 Ioduro peroxidasa EC 1.11.1.1 NADH peroxidasaEC 1.11.1.9 Glutatión peroxidasa EC 1.11.1.2 NADPH peroxidasaEC 1.11.1.10 Cloruro peroxidasa EC 1.11.1.3 Ácidos grasos peroxidasaEC 1.11.1.11 L-ascorbato peroxidasa EC 1.11.1.4 Triptófano peroxidasa EC 1.11.1.12 Hidroperóxido de (ahora triptófano dioxi-

fosfolípido glutatión genasa, EC 1.13.11.11)peroxidasa EC 1.11.1.5 Citocromo c peroxidasa

EC 1.11.1.13 Manganeso peroxidasa EC 1.11.1.6 CatalasaEC 1.11.1.14 Diarilpropano peroxidasa EC 1.11.1.7 PeroxidasaEC 1.11.1.15 Peroxirredoxina

❚ LAS PEROXIDASAS SON LAS ENZIMAS QUE ELIMINAN AL H2O2

Las peroxidasas son las enzimas responsables de eliminar a los hidroperóxidos.Esta descomposición ocurre por medio de una reacción de oxidorreducción queemplea una molécula específica como agente reductor. Las peroxidasas puedenutilizar agentes reductores diferentes para llevar a cabo esta reacción, y pueden te-ner mecanismos catalíticos distintos. Según el Comité de Nomenclatura de lasEnzimas de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB, por sus siglas en inglés, www.chem.qmul.ac.uk/iubmb), las peroxidasas(EC 1.11.1) se clasifican de acuerdo con su especificidad (cuadro 12-1). Sin em-bargo, en términos generales, se han agrupado tradicionalmente en ccaattaallaassaass yppeerrooxxiiddaassaass.

Las catalasas son las enzimas que descomponen al H2O2 directamente en O2y agua (reacción 1). Para ello, emplean dos moléculas iguales de H2O2, una comoagente reductor y otra como oxidante. Por su parte, las peroxidasas utilizan unamolécula distinta del H2O2 como agente reductor (reacción 2). Es común tam-bién que las peroxidasas puedan reducir a hidroperóxidos distintos del H2O2,como los peróxidos orgánicos (reacción 3).

2H2O2 → 2H2O + O2 (1)H2O2 + RH2 (o 2RH) → 2H2O + R (o R-R) (2)R-OOH + RH2 (o 2RH) → R-OH + H2O + R (o R-R) (3)

❚ PANORAMA HISTÓRICO

Louis Jacques Thénard, en 1819, fue el primer investigador que describió lo quehoy se conoce como la reacción de la catalasa. Él demostró que diferentes sus-


tancias de origen animal y vegetal tenían la capacidad de transformar al agua oxi-genada (H2O2) en agua y oxígeno. Además, sus análisis sobre la descomposicióndel agua oxigenada fueron los primeros en estudiar una reacción enzimática demanera cuantitativa. En 1901, Loew nombró como ccaattaallaassaa a esta “fuerza vital”,y sugirió que una enzima específica era la responsable de generarla. En 1923,Walburg demostró que dicha enzima se inhibía con cianuro, y concluyó que ensu sitio activo tenía asociados átomos de hierro. De modo que la catalasa fue laprimera enzima con hierro que se purificó, y en 1936 se demostró que su sitioactivo tenía asociada a la protoporfirina IX. Un año después, Sumner y Dounceobtuvieron los cristales de la enzima. En el decenio de 1940-49, el grupo de Brit-ton Chance hizo contribuciones importantes en el entendimiento del mecanismocatalítico de las catalasas, y Herbert y Pinsent describieron la primera enzima pro-cariota en Micrococcus luteus, pero fue hasta 1980 que Vainshtein et al., obtu-vieron el primer mapa de la densidad electrónica de una catalasa. En laactualidad, se sabe que las catalasas son ubicuas y se han descrito en microorga-nismos de los tres grandes dominios de los seres vivos: bacterias, arqueobacteriasy eucariotas. Por otra parte, además de estar ampliamente distribuidas en los mi-croorganismos aerobios, estas enzimas también se han encontrado en variosmicroorganismos anaerobios facultativos e incluso en algunos anaerobios estric-tos, lo que sugiere que también estos microorganismos se encuentran expuestosal oxígeno y sus formas derivadas.

❚ EXISTEN TRES TIPOS DE ENZIMAS CON ACTIVIDAD DE CATALASA

En un principio, cualquier enzima que fuera capaz de llevar a cabo la reacción decatalasa fue denominada como tal; sin embargo, con el tiempo, fue evidente queexistían distintas enzimas con esta capacidad. Estas enzimas diferían en sus pro-piedades cinéticas, así como en su estructura y sensibilidad ante diferentes inhi-bidores. La mayor parte de las catalasas eran proteínas que tenían asociado ungrupo hemo en sus sitio catalítico; no obstante, en 1961 se describió una catala-sa insensible a los inhibidores clásicos de las hemoproteínas, como la azida y elcianuro. A esta enzima se le denominó sseeuuddooccaattaallaassaa. Ahora se sabe que estasenzimas tienen átomos de manganeso en su centro catalítico, y se les ha llamadocatalasas de manganeso.

Por otra parte, en el decenio de 1980-89 se observó que existían dos grupos dehemocatalasas. Las primeras llevaban a cabo su actividad en un intervalo ampliode valores de pH, y eran altamente estables ante las altas temperaturas y los disol-ventes orgánicos como el cloroformo y el etanol. Asimismo, se observó que estasenzimas se inactivaban con el 3-amino-1,2,4-triazol, y que su grupo hemo esta-ba poco expuesto al disolvente, pues era difícil reducirlo con agentes como la©

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ditionita. En contraste, en muchos microorganismos se encontraron catalasas conlas características opuestas. Su actividad era más sensible al calor y al pH, y seinactivaban con etanol-cloroformo, pero no con el 3-amino-triazol. Además, susitio catalítico podía ser reducido con ditionita. Una de las características queresultó más destacada de estas enzimas fue que exhibían una alta actividad de pe-roxidasa. Por esa razón, a este tipo de catalasa se le denominó ccaattaallaassaa--ppeerrooxxiiddaa--ssaa. La clonación y secuenciación de los genes de las catalasa-peroxidasas y de lasmanganeso catalasas y su comparación con los de las catalasas, reveló que estasenzimas no están relacionadas, y que representan grupos de enzimas distintos.Esto quiere decir que a lo largo de la evolución surgieron enzimas con actividadde catalasa de manera independiente por lo menos en tres ocasiones.

Es importante aclarar que el grupo prostético presente en las catalasas y lascatalasa-peroxidasas, conocido como hheemmoo, es sintetizado de manera indepen-diente a la apoproteína, y después se incorpora a ella. El hemo es una molécula deporfirina tetrapirrólica que forma un complejo de quelato con un átomo de hie-rro (figura 12-1A). El hierro está coordinado por cuatro átomos de nitrógeno queprovienen, cada uno de ellos, de cada uno de los anillos pirrólicos. Las dos posicio-


A

Protohemo IX

Enzima (hemo-FeIII

) + H2O2 Compuesto I (hemo·+

-FeIV

= O) + H2O (4)

Compuesto I (hemo·+

-FeIV = O) + H2O2 Enzima (hemo-FeIII

) + H2O + O2 (5)

Compuesto I (hemo·+

-FeIV = O) + RH Compuesto II (hemo-FeIV

-OH) + R + H2O (6)

Compuesto II (hemo-FeIV

-OH) + RH Enzima (hemo-FeIII

) + R + H2O (7)

B

FFiigguurraa 1122--11.. Grupo hemo y el mecanismo de la reacción catalítica de las hemocatalasas. AA)) Estruc-tura del protohemo-IX representada en bastones y esferas. BB)) Reacciones del mecanismo catalíticoque emplean las catalasas que tienen asociado el grupo hemo.

nes restantes de coordinación del hierro son perpendiculares al plano de la porfi-rina. La quinta posición suele estar coordinada por un aminoácido, mientras que enla sexta ocurre la transferencia de los electrones durante la catálisis, en donde elhierro alterna entre sus estados Fe+3 y Fe+4. El grupo hemo por sí solo es capaz decatalizar la misma reacción que la holoenzima, aunque con mucha menor eficacia.

❚ LA FAMILIA DE CATALASAS

Catalasas monofuncionales

La familia de las catalasas más distribuida es la de las ccaattaallaassaass mmoonnooffuunncciioonnaalleess.Estas enzimas son las que exhiben la actividad de catalasa más elevada, aunquetambién pueden tener actividad moderada de peroxidasa, pero sólo en presenciade moléculas pequeñas como agentes reductores (como el etanol y metanol). Lamayor parte de estas enzimas están formadas por cuatro subunidades idénticas(figura 12-2B y D), aunque puede haber enzimas diméricas.

Cada una de las subunidades de la enzima está asociada a un grupo hemo, queen la mayor parte de los casos es el protohemo-IX (hemo-b) (figura 12-1A), aun-que se pueden encontrar otras formas de hemo, como el hemo-d, o una mezclade ambos. El espectro electrónico de las catalasas se caracteriza por la presen-cia de una banda de absorción alrededor de los 400 nm (banda de Soret), que esdebida al hemo.

Casi todas las catalasas tienen una masa de 50 a 65 kDa (cerca de 480 amino-ácidos) por subunidad (figura 12-2 A y B). Sin embargo, también hay una fami-lia de catalasas denominadas de “subunidad grande”, que tienen una masa de 80a 95 kDa (casi 700 aminoácidos) por subunidad (figura 12-2 C y D). Estructural-mente, las subunidades de las catalasas se caracterizan por cuatro dominios. Elextremo amino terminal comprende los primeros 70 aminoácidos, y a partir deél se extiende una región globular con los otros tres dominios estructurales:bbaarrrriill--ββ, un ddoommiinniioo ddee ccoonneexxiióónn y el ddoommiinniioo αα--hheelliiccooiiddaall (figura 12-2A). En lascatalasas de subunidad grande existe un dominio adicional hacia el extremo C-terminal de casi 150 aminoácidos (figura 12-2C). Se piensa que éste es undominio de unión de flavinas.

El dominio del barril-β es la parte más conservada de la molécula. Su longitudes prácticamente idéntica en todas las catalasas. Incluye una parte de la cavidaddel hemo, así como los aminoácidos que lo orientan y el canal que conduce alsitio activo. En el dominio de conexión se encuentra el ligando proximal delhemo, una tirosina conservada que es única de las catalasas. Algunas catalasaspueden unir NADPH en el dominio α-helicoidal, de manera que pueden bloque-ar una parte del canal del sustrato.©

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A B

Monómero Homotetrámero

Extremo N-terminal

Barril-

Dominio-helicoidal

Dominio de conexión

FFiigguurraa 1122--22.. Modelo de la estructura tridimensional de las catalasas monofuncionales.. AA)) Repre-sentación en listones del monómero de la catalasa monofuncional de los eritrocitos humanos en laque se ilustra su estructura secundaria. BB)) Representación en listones del tetrámero de la catalasamonofuncional de los eritrocitos humanos. CC)) Representación en listones del monómero de unacatalasa monofuncional grande del hongo Neurospora crassa. Se ilustra la estructura secundariaigual que en AA.. DD)) Representación en listones del tetrámero de la catalasa monofuncional grandede N. crassa. En todas las imágenes se muestra el grupo hemo representado en bastones y esferas.Las coordenadas de los modelos estructurales se obtuvieron de la base de datos del PDB (ProteinData Bank). Números de acceso: 1DGF (catalasa de los eritrocitos humanos) y 1SY7 (CAT-1 deN. crassa). Las imágenes se hicieron con el programa Ribbons. Las coordenadas del modelo deltetrámero en DD)) las coordenadas fueron generadas por simetría cristalográfica por A. Díaz.

Monómero

C D

Homotetrámero

Extremo N-terminal

Barril-

Dominio

-helicoidal

Dominio de conexión

Dominio

C-terminal

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La similitud en la secuencia de aminoácidos de las catalasas sugiere que susgenes tienen un origen común. Todas las catalasas tienen una región de aproxi-madamente 360 aminoácidos altamente conservada. Esta región corresponde aldominio del barril-β, así como a una parte del domino de conexión y del N-termi-nal. Por otra parte, las secuencias de aminoácidos de los dominios C-terminal adi-cionales de las catalasas de subunidades-grandes mantienen similitud entre sí. Losanálisis filogenéticos revelan la existencia de tres grandes grupos de catalasas quehan sido denominados clados 1, 2 y 3. Las enzimas de los animales forman partedel clado 1, mientras que las de las plantas del clado 3. El clado 2 corresponde a lasenzimas grandes, y comparte secuencias de bacterias, arqueobacterias, protistas yhongos. Las catalasas pequeñas de los hongos, los protistas y las arqueobacteriasse agrupan con las de los animales, mientras que las bacterias tienen enzimas delos tres clados (figura 12-3).

Catalasa • 189

Dictyosteliumdiscoideum

B

Microccus

N. crassa 4

A . nidulans

S. pombe

Candida albicans

S. cerevisiae

S. cerevisiae Pleurotus

Pleurotus

Toxoplasmagondii

Ascaris

D. melanogaster

Danio rerioRana rugosa

Homo sapiensBos

Canis familiaresMus

Dictyostelium discoideum Methanobrevibacter arboriphilus

Methanococcoides Methanosarcina barkeri

B. subtilis 1Lactobacillus

Pseudomonas syringae

H. pylori

Proteus mirabilis

Desulfovibrio

Methanosarcina mazei

Psychrobacter

Streptomyces coelicolor

Cryptococcus

A. nidulans

N. crassa E. Coli

Burkholderia cenocepaciaMethylobacillus flagellatus

Pseudomonas syringae

A . nidulans

N. crassa

DeinococcusDeinococcus

Pseudomonas syringaeZea mays Chlamydomonas reinhardtii

A . thaliana A vicennia marinaNicotiana 2

Zea mays 2

Zea mays 1

Nicotiana 1

Suaeda maritima

A . thaliana

Nicotiana 3

Methanosarcina maMethanosarcina mazeiei

StreptoStreptomycesyces

A . thaliana 1

C. elegans

C. elegans D. melanogaster C. elegans Clado 1

Clado 3

Clado 2

Methanosarcina mazei

Streptomyces

Deinococcus

FFiigguurraa 1122--33.. Análisis filogenético de las catalasas monofuncionales. Cladograma de las catalasasbasado en sus secuencias de aminoácidos. Árbol más parsimonioso, método de máxima parsimonia,búsqueda heurística con una adición de ramas aleatoria (10 réplicas) (PAUP 3.0). Se muestran lostres grandes clados en que se agrupan las catalasas. Todas las secuencias de aminoácidos se obtuvie-ron de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Catalasa-peroxidasas

La mayor parte de las catalasa-peroxidasas son homodímeros con subunidadesque van de 60 a 85 kDa (figura 12-4B); pero también existen enzimas tetramé-ricas y monoméricas, así como enzimas cuyas subunidades generan dímeros ytetrámeros interconvertibles. Cada subunidad de la enzima une un grupo hemo,que suele ser el protohemo-IX; sin embargo, también se han reportado gruposhemo distintos.

El alineamiento y la comparación de la secuencia de aminoácidos de las cata-lasa-peroxidasas reveló que la proteína está compuesta por dos segmentos queson semejantes entre sí, y cada uno de ellos lo es con la citocromo c peroxidasa(CCPx) de los hongos, una hemo-peroxidasa de la familia de peroxidasas de lasplantas y los microorganismos. Estas peroxidasas están formadas por 290 a 350aminoácidos, mientras que las catalasa-peroxidasas contienen alrededor de 730 ami-noácidos por subunidad. Con base en estas observaciones, se ha propuesto quelas catalasa-peroxidasas se originaron por la duplicación y fusión del gen de unaperoxidasa ancestral de la familia de las plantas y los microorganismos (figura 12-5).


A B

Monómero Homodímero

ExtremoN-terminal

ExtremoC-terminal

FFiigguurraa 1122--44.. Modelo de la estructura tridimensional de la catalasa-peroxidasa. AA)) Representaciónde la estructura del monómero. BB)) Representación de la estructura del dímero de la catalasa-pero-xidasa de Haloarcula marismortui. El modelo estructural se hizo y se ilustra igual que en la figura12-2. No. de acceso PDB: 1ITK.

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La familia de peroxidasas de las plantas y los microorganismos se caracterizaestructuralmente por la presencia de 10 hélices-α conservadas, dentro de las cua-les se localiza el hemo. La estructura cristalográfica demostró que tenían un arre-glo tridimensional muy parecido al de las peroxidasas. Nueve de las hélices de laCCPx y los residuos catalíticos están conservados en el extremo N-terminal de la molécula; sin embargo, en el extremo C-terminal las hélices están conservadas,pero los residuos de unión del hemo no están presentes, de manera que sólo elextremo N-terminal une el hemo (figura 12-4 A y B).

Las catalasa-peroxidasas están ampliamente distribuidas en las bacterias, perosólo se han descrito en cuatro géneros de arqueobacterias, y en los microorganis-mos eucariotas sólo se han encontrado en los hongos. La distribución de estasenzimas no sigue el patrón filogenético de los organismos en que se encuentra.Así, parece ser una enzima que se ha perdido en varios linajes y que está presen-

Catalasa • 191

E . coli HPI Salmonella

Archaeoglo b us Aspergillus

Neurospo r a

Sinorhi z obium Mesorhi z obium

Caulobacter Xylella

Bu r kholde r ia 2

Synechocystis Vib r io

Synechococcus

Bacillus Strepto m yces

Halobacte r ium Haloarcula

E.coli (plásmido) Y ersinia Legionella

Rhodobacter

Aspergillus Neurospo r a

Xylella Bu r kholde r ia Bu r kholde r ia Caulobacter

Sinorhi z obium Mesorhi z obium Strepto m yces

Mycobacte r ium Salmonella E . coli HPI

Vib r io Synechococcus

Rhodobacter

BacillusArchaeoglo b us

Y ersinia E.coli (plásmido)

Legionella Halobacter

Haloarcula

CCPx Saccharo m yces

CCPx Neurospo r a

Extremo N-te r minal

Extremo C-te r minal

Bu r k hold er ia

Synecho cystis

Citocromo c per o xidasas

Mycoba cter ium

FFiigguurraa 1122--55.. Análisis filogenético de las catalasa-peroxidasas y las citocromo c peroxidasas. Redesque muestran las relaciones de similitud entre los extremos C- y N- terminales de las catalasa-pero-xidasas con las citocromo c peroxidasas (CCPx). Método de matrices de distancias para proteínas,algoritmo Fitch-Margoliash, distancias: Dayhoff PAM 001 (PHYLIP).

te en otros, como los hongos, debido a eventos de transferencia horizontal (figu-ra 12-5).

Manganeso catalasas

Muchos microorganismos carecen de hemoproteínas, pues son incapaces de sin-tetizar el grupo hemo; sin embargo, pueden tener enzimas con actividad de cata-lasa. La primera enzima de este tipo fue caracterizada en Lactobacillusplantarum. En la actualidad también se han caracterizado Mn catalasas en bacte-rias termófilas y en arqueobacterias, y se han encontrado posibles genes de Mncatalasas en muchos otros linajes procariotas, incluso en especies que pueden sin-tetizar el grupo hemo. Estas enzimas pueden ser homohexámeros u homotetrá-meros, cuyas subunidades de 30 kDa muestran un arreglo de cuatro hélices-αantiparalelas entre las que están inmersos los dos átomos de Mn (figura 12-6). El

A B

Monómero Homoh e xámero

Centro catalítico de dimanganeso

Enzima (Mn III

2 ) + H

2 O

2 Enzima (Mn

II

2 ) + O

2 + 2H + (8)

Enzima (Mn II

2 ) + H

2 O

2 + 2H + Enzima (Mn

III

2 ) + H

2 O (9)

C

FFiigguurraa 1122--66.. Modelo de la estructura tridimensional de la manganeso catalasa. AA)) Representaciónde la estructura del monómero. BB)) Representación de la estructura del hexámero de la manganesocatalasa de Lactobacillus plantarum con sus manómeros en distinta tonalidad. CC)) Reacciones delmecanismo catalítico que emplean las manganeso catalasas.


sitio activo de dimanganeso se encuentra coordinado por los residuos de histidi-nas, glutamatos y/o aspartatos provenientes de las cuatro hélices antiparalelas.Los dos átomos de manganeso, a su vez, se encuentran unidos entre sí por un oxí-geno y su estado de reducción alterna entre Mn+3-Mn+3 y Mn+2-Mn+2 durante elciclo catalítico de la enzima. El arreglo de las hélices antiparalelas de las Mn cata-lasas es semejante al de algunas otras enzimas que tienen centros de dimangane-so, como la ribonucleótido Mn reductasa y a la Mn arginasa. Así, es posible quelas Mn catalasas hayan divergido de un ancestro común de alguna de estas dosenzimas.

❚ CATÁLISIS DEL H2O2

La catalasa es una de las enzimas más rápidas que existen. Una molécula de laenzima es capaz de catalizar la transformación de alrededor de 1 x 107 molécu-las de sustrato por segundo. Su eficacia catalítica (kcat/Km aproximadamente de106 - 108 M-1 seg-1) indica que la enzima está limitada sólo por la velocidad de difusión del sustrato (108 - 109 M-1 seg-1); es decir, la enzima debe catalizar unareacción en cuanto se encuentra con una molécula de H2O2. La eficacia catalíti-ca de las Mn catalasas y de las catalasa-peroxidasas es, en términos generales, unorden de magnitud menor, por lo que también son enzimas considerablementerápidas. La eficacia catalítica de la actividad de catalasa de las demás peroxidasases mucho menor.

La primera reacción en el mecanismo catalítico de las catalasas y las peroxida-sas es la misma: la heterólisis o rompimiento del enlace oxígeno-oxígeno delH2O2. En las enzimas que tienen hemo en su sitio activo, como resultado de estareacción se libera una molécula de agua y un átomo de oxígeno queda unido alFe del grupo hemo (figura 12-1B, reacción 4). En esta reacción se transfieren doselectrones de la enzima a un oxígeno y se forma agua. Uno de ellos proviene delFe (Fe+3 → Fe+4) y el segundo de la porfirina. A esta forma de la enzima se ledenomina ccoommppuueessttoo II,, y está formada por un ferroxilo y un radical catiónicoporfirínico. El compuesto I puede ser reducido por otra molécula de H2O2, trans-firiendo dos electrones simultáneamente (rreeaacccciióónn ddee ccaattaallaassaa,, figura 12-1B,reacción 5) o bien, ser reducido por un compuesto que transfiera un solo elec-trón en dos reacciones secuenciales (rreeaacccciióónn ddee ppeerrooxxiiddaassaa,, figura 12-1B, reac-ciones 6 y 7). Entre estas dos reacciones se forma un intermediario parcialmentereducido llamado ccoommppuueessttoo IIII (figura 12-1B, reacción 6). La formación delcompuesto II en las catalasas es irreversible y en consecuencia, inactiva a la enzi-ma. Las catalasa-peroxidasas pueden reducir de manera eficaz el compuesto I conel H2O2 (figura 12-1B, reacción 5), o bien, a través del compuesto II con agentesreductores univalentes (figura 12-1B, reacciones 6 y 7).©

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La actividad de la Mn catalasa también implica la transferencia simultánea dedos electrones de la enzima al H2O2 y viceversa. En este caso, un electrón estransferido a cada uno de los átomos de Mn del centro binuclear de manganesoy, como consecuencia, se liberan dioxígeno y dos protones (figura 12-6C, reac-ción 8). En la siguiente reacción, el centro binuclear de manganeso se oxida denuevo y se forman dos moléculas de H2O (figura 12-6C, reacción 9).

❚ FUNCIÓN DE LAS CATALASAS

Dada la afinidad de las catalasas por su sustrato, se piensa que su función primor-dial es eliminar las concentraciones altas del H2O2; por el contrario, las enzimasque tienen una afinidad mayor por el H2O2, como las peroxidasas y las peroxi-rredoxinas, actúan ante el H2O2 en bajas concentraciones. A su vez, las catalasa-peroxidasas y las Mn catalasas tienen una afinidad mayor por el H2O2 que lascatalasas, por lo que cuando más de una de estas enzimas está presente en unorganismo pueden eliminar el H2O2 en un intervalo amplio de concentración. Laeliminación del H2O2 por las peroxidasas emplea un agente reductor que seoxida como resultado de la reacción, así, para que la actividad de las peroxidasascontinúe, el estado reducido de estos sustratos se debe restablecer, y ello depen-de del poder reductor celular, principalmente del NAD(P)H. En contraste, laactividad de las catalasas no depende del estado redox de la célula, de maneraque son activas aun cuando el poder reductor celular es bajo.

Función de las catalasas en los microorganismos

Se sabe que en las bacterias existen catalasas de los tres tipos, mientras que loshongos cuentan sólo con catalasa-peroxidasas y catalasas monofuncionales. Eneste tipo de organismos, las catalasas desempeñan funciones específicas relacio-nadas con las diferentes fases del crecimiento en diversos estadios del desarrollo,además de que protegen a las estructuras ya diferenciadas.

Por otro lado, puesto que la respuesta de muchos organismos ante los patóge-nos incluye la formación de especies reactivas de oxígeno como el O2

• y el óxidonítrico (NO•), que más tarde pueden reaccionar para formar el H2O2, se ha pen-sado que las catalasas podrían actuar como factores de virulencia, al contrarres-tar la formación de las especies reactivas de oxígeno que produce el sistemainmunitario. Este hecho se ha demostrado para varios microorganismos, tantopatógenos de animales como de plantas.

Un ejemplo bien documentado es el de la bacteria Helicobacter pylori, estepatógeno humano es capaz de colonizar la mucosa gástrica aun cuando desenca-


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dena un fuerte proceso inflamatorio que conlleva una elevada formación de espe-cies reactivas de oxígeno. Se sabe que esta capacidad infectiva se debe, en buenamedida, a la fuerte respuesta antioxidante de la bacteria, de la cual forma parteuna catalasa monofuncional. Las cepas de H. pylori que carecen de esta enzimano pueden mantener una infección de largo plazo, y tienen una supervivenciareducida en los fagosomas de los macrófagos.

Las catalasa-peroxidasas también se han relacionado con la virulencia de lasbacterias. Tal es el caso de Legionella pneumophila, una bacteria que causa neu-monía y que tiene dos catalasa-peroxidasas, una de las cuales se requiere parainfectar y lisar los macrófagos del sistema inmunitario. Dada la multifuncionali-dad de las catalasa-peroxidasas, también pueden eliminar otras de las especiesreactivas de oxígeno que se forman en la respuesta de defensa ante los patóge-nos. Tal es el caso del ácido peroxinítrico (ONOOH), una molécula se formacuando el O2

• y el NO• reaccionan entre sí y se puede difundir rápidamente através de las membranas celulares. Esta especie reactiva de oxígeno es más tóxi-ca que el O2

•, el H2O2 o el NO•, y se piensa que forma parte importante de larespuesta del sistema inmunitario. Se ha demostrado que algunas catalasa-pero-xidasas, como la enzima de Mycobacterium tuberculosis, pueden ser peroxinitri-tasas muy eficaces. También se ha demostrado que las catalasas actúan comofactores de virulencia en algunas bacterias patógenas de las plantas. Por ejemplo,la ausencia de la catalasa-peroxidasa de Agrobacterium tumefaciens reduce sucapacidad de infectar y causar tumores en las plantas.

Las catalasas también actúan como factores de virulencia de los organismoseucariotas. La virulencia de algunos hongos patógenos oportunistas de los anima-les depende de sus catalasas. Éste es el caso de Candida albicans, que requiere suúnica catalasa para generar una infección a largo plazo, y Aspergillus fumigatus,cuya capacidad infectiva depende de 2 de sus 4 catalasas (una monofuncional yuna catalasa-peroxidasa). Las catalasas también son importantes para proteger a loshuéspedes de las especies reactivas de oxígeno que ellos mismos producen en la res-puesta de defensa ante los patógenos. Una de las proteínas que es regulada por elsistema inmunitario de Drosophila melanogaster es una enzima que tiene actividadde catalasa. Esta enzima es secretada en el intestino, y sin ella las moscas exhibenuna alta mortalidad cuando ingieren microorganismos. Se piensa que la enzima eli-mina las especies reactivas de oxígeno que se producen en el intestino en respues-ta a una infección, y que en su ausencia los daños que generan resultan letales.

Función de las catalasas en las plantas

La respuesta antioxidante de las plantas cuenta con un gran número de enzimasantioxidantes, dentro de las que destacan varias catalasas. Todas ellas son mono-

Catalasa • 195

funcionales y pequeñas. La mayor parte de las angiospermas estudiadas tienentres genes de catalasa con patrones de expresión semejantes. Los tres genes seexpresan en las semillas e inflorescencias. Dos de ellos también se expresan en lashojas y codifican para enzimas peroxisomales, y el tercero codifica para una enzi-ma citosólica (o posiblemente mitocondrial en plantas como el maíz) que es abun-dante en los tejidos vasculares. La expresión de algunas de estas catalasas ademásse regula por la luz, y pueden estar sujetas al reloj circadiano de las plantas.

Las catalasas protegen a las plantas de diferentes condiciones de estrés que segeneran tanto de manera exógena como endógena. Una de las dos enzimas pero-xisomales es predominante en las semillas, y es importante durante el metabolis-mo glioxisomal que ocurre en la germinación (véase la sección de Catalasas yfunción peroxisomal, más adelante), y la otra es más abundante en las hojas y protege a las plantas de diferentes tipos de estrés, como el estrés salino y el estrésoxidativo que se genera con ozono, H2O2 o paraquat. Esta enzima también esimportante en contender con el H2O2 que se genera durante la fotorrespiración.

La respuesta de la plantas ante el ataque de los patógenos incluye la formacióncontrolada de especies reactivas de oxígeno, que además de atacar directamentea los patógenos también actúan como moléculas señalizadoras en la respuesta dedefensa de las plantas. Se sabe que especies como el H2O2 y el NO• activan, juntocon el ácido salicílico, la respuesta de hipersensibilidad de las plantas. Esta res-puesta incluye procesos como la limitación de la infección mediante el engrosa-miento de las paredes celulares y la inducción de la muerte celular programadade los tejidos infectados, así como la síntesis de metabolitos secundarios y de pro-teínas antimicrobianas relacionadas con la patogénesis.

Las especies reactivas de oxígeno también participan en la respuesta ante elestrés abiótico que deriva en la aclimatación de las plantas, y son capaces de ajus-tar la expresión génica en respuesta a cambios ambientales y de modular proce-sos como la apertura de los estomas o la proliferación y expansión celular. Ya queuna misma especie reactiva de oxígeno, como es el caso del H2O2, puede gene-rar respuestas distintas en las plantas, se ha sugerido que debe existir un equili-brio muy fino en sus niveles locales y que éste modula distintas vías deseñalización. Las catalasas participan modulando los niveles del H2O2 y definien-do la respuesta de la planta.

Función de las catalasas en los animales

Al igual que las plantas, los animales cuentan sólo con catalasas monofunciona-les pequeñas en sus genomas. La mayor parte de los vertebrados sólo tiene unaenzima peroxisomal, pero en algunos invertebrados existe más de una calatasa.La deficiencia de la actividad de catalasa es conocida como acatalasemia, y es


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consecuencia de la ausencia de genes funcionales de catalasa (como la observadaen un organismo homócigo cat-/cat-), mientras que la disminución en la actividadde catalasa se conoce como hipocatalasemia, y puede resultar de genes que codi-fiquen enzimas parcialmente activas o de una condición heteróciga (cat-/cat+).

En el genoma de algunos invertebrados se ha encontrado más de un gen decatalasa. El nemátodo Caenorhabditis elegans tiene tres genes de catalasa quecodifican para dos enzimas citosólicas (ctl-1 y 3) y una peroxisomal (ctl-2). Un80% de la actividad de catalasa recae en la enzima peroxisomal, y en su ausenciala esperanza de vida y la capacidad de oviposición de los nemátodos disminuyede manera importante. La mosca de la fruta D. melanogaster también tiene másde una catalasa, y una de ellas es fundamental para su supervivencia.

En términos generales, la expresión de la catalasa en los mamíferos es muy ele-vada en hígado y eritrocitos, alta en el tejido adiposo y riñón, moderada en el pán-creas y pulmones y baja en el suero, corazón y cerebro. La catalasa está localizadaen los peroxisomas de la mayor parte de estos órganos, pero en los eritrocitos escitosólica y existen evidencias que sugieren que la enzima del corazón de la rataestá asociada con sus mitocondrias. Más de 98% de la catalasa de la sangre estáen los eritrocitos; sin embargo, también elimina el H2O2 extracelular y el que segenera en los tejidos con niveles bajos de catalasa.

Diversos experimentos con células en cultivo acatalasémicas, hipocatalasémi-cas y que sobreexpresan el gen de la catalasa, han demostrado que la catalasa pro-tege a las células de los mamíferos de la toxicidad generada por el H2O2 y de lascondiciones de hiperoxia. En el ser humano se han caracterizado tres tipos deacatalasemia (húngara, japonesa y suiza), y hasta el año 2004 se habían diagnos-ticado 113 casos en 11 países, México entre ellos. Los pacientes con acatalasemiatienen un fenotipo normal, pero pueden presentar gangrena y ulceraciones ora-les como consecuencia del H2O2 generado por las células fagocíticas durante lasinfecciones bacterianas. Asimismo, se ha sugerido que puede haber alteracionesen el metabolismo de los lípidos de estos pacientes que incrementen el riesgo deafecciones coronarias, y que la incidencia de padecimientos como la diabetespuede ser mayor, particularmente diabetes tipo 2. Se piensa que esto es conse-cuencia de que algunos tipos celulares, como las células pancreáticas productorasde la insulina, se dañan con el incremento de las especies reactivas de oxígenoque se forman en ausencia de la catalasa.

❚ CATALASAS Y FUNCIÓN PEROXISOMAL

Los peroxisomas son organelos de dimensión pequeña (< 1 μm) que están delimi-tados por una sola membrana y que contienen en su interior una gran variedadde enzimas que generan H2O2 como consecuencia de su mecanismo catalítico.

Catalasa • 197

Asimismo, contienen las enzimas antioxidantes responsables de eliminar estas es-pecies reactivas de oxígeno, como la catalasa. Estos organelos fueron descritos alprincipio por Christian de Duve, y están presentes en la mayor parte de los orga-nismos eucariotas. En ellos ocurren vías metabólicas ubicuas —como la β-oxidación de los ácidos grasos— o específicas —como el ciclo del glioxilato enlos hongos y las plantas. Las catalasas de los eucariotas generalmente están aso-ciadas con los peroxisomas, y a pesar de que muchos microorganismos tienenmás de una catalasa, la localización de por lo menos una de ellas siempre es pero-xisomal. Así, la mayor parte de las enzimas de los eucariotas que pertenecen a losclados 1 y 3 son peroxisomales.

En términos generales, las catalasas son sintetizadas en el citosol por ribosomaslibres, y los monómeros de la apoenzima son translocados al interior de los pero-xisomas. Ahí se incorporan los grupos hemo y se adquiere la estructura cuaterna-ria. En ocasiones, la catalasa puede ser la proteína más abundante de este organelo.

Un ejemplo de la importancia de la catalasa en los peroxisomas se observa enlevaduras como Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura puede emplear ácidosgrasos como única fuente de carbono gracias a la β-oxidación de los ácidos gra-sos que ocurre en los peroxisomas. Esta vía metabólica genera grandes cantidadesde H2O2, y en ausencia de la catalasa peroxisomal las levaduras son incapaces deutilizar los ácidos grasos como fuente de carbono. Esto se debe a que los nivelesde H2O2 que genera esta vía en ausencia de la catalasa resultan letales. La fun-ción de las catalasas peroxisomales también puede repercutir en el desarrollo, yse ha observado que la ausencia de estas enzimas (y no las citosólicas) acelera elenvejecimiento tanto de algunos hongos (S. cerevisiae) como de animales (C.elegans).

Por otra parte, la localización incorrecta de la catalasa también puede tenerconsecuencias graves. En el ser humano, la mayor parte de las deficiencias de lafunción peroxisomal genera daños neurológicos que varían en su grado de seve-ridad. La afección más grave se conoce como síndrome cerebrohepatorrenal deZellweger, y es consecuencia de la ausencia de peroxisomas funcionales. Estaenfermedad se manifiesta desde muy temprana edad, y la mayoría de los pacien-tes que la presentan fallece en el primer año de vida. Una afección semejantepero menos severa puede presentarse cuando la localización de la catalasa no esperoxisomal sino que es retenida en el citosol.

Otro proceso importante en el que participan la catalasa y los peroxisomas esel metabolismo del alcohol. En los mamíferos existen dos vías para la oxidacióndel alcohol, una de ellas es mediada por la alcohol deshidrogenasa, y la segundapor la catalasa. Esto es posible gracias a la actividad de peroxidasa que tienen lascatalasas ante moléculas pequeñas como el etanol y el metanol. Como la catala-sa requiere H2O2 para oxidar los alcoholes, la vía dependiente de esta enzima estámuy ligada con la función peroxisomal, en donde se genera el H2O2, principal-


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mente en la oxidación de los ácidos grasos. Se piensa que el estado nutricional delos animales define la participación de cada una de las vías implicadas en la oxi-dación del alcohol, y que la vía dependiente de la catalasa se favorece cuando elmetabolismo de los ácidos grasos es elevado, como durante el ayuno o ante dosiselevadas de alcohol.

❚ CONSIDERACIONES FINALES

Las catalasas son las enzimas responsables de descomponer el H2O2 en H2O yO2. Se conocen tres tipos de enzimas que llevan a cabo esta reacción de maneraeficaz, catalasas típicas, catalasa-peroxidasas y manganeso catalasas, y se sabe quesurgieron de manera independiente durante la evolución. Estas enzimas formanparte primordial de la respuesta antioxidante de la mayoría de los seres vivos, yaque evitan la formación de las especies reactivas de oxígeno más oxidantes quese pueden generar a partir del H2O2. Las catalasas pueden eliminar el H2O2que tiene un origen extracelular y el que se genera durante el metabolismo. ElH2O2, además de ser un producto secundario del metabolismo que puede re-sultar tóxico, desempeña un papel importante como modulador de algunos procesos celulares. Las catalasas, además de mantener el H2O2 en niveles no tóxi-cos, pueden participar en la regulación de los diferentes procesos del desarrolloen los que está involucrada esta especie reactiva de oxígeno. Recientemente se havisto que estas especies están implicadas en muchos eventos del desarrollo de losseres vivos, como la proliferación, diferenciación y muerte celular. Asimismo,existen evidencias que sugieren que las catalasas también están involucradas enla modulación de algunos de estos procesos, y esto se ha observado tanto en orga-nismos eucariotas como procariotas.

❚ REFERENCIAS

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GGLLUUTTAATTIIÓÓNN PPEERROOXXIIDDAASSAASS::UUNNAA FFAAMMIILLIIAA DDEE EENNZZIIMMAASS

Noemí Cárdenas-RodríguezOmar Noel Medina-Campos

José Pedraza-Chaverrí

❚ INTRODUCCIÓN

La enzima glutatión peroxidasa (GPx) es una selenoproteína antioxidante quefue descubierta en tejidos animales en 1957. El selenio (Se) es un elemento trazaesencial que participa en muchos procesos biológicos. La forma de Se con másrelevancia biológica es el aminoácido raro selenocisteína (figura 13-1A). Esteaminoácido es un análogo de la cisteína (figura 13-1B), pero en lugar del grupotiol, que contiene azufre, la selenocisteína posee al grupo selenol, que contieneSe. La selenocisteína forma parte de por lo menos 25 selenoproteínas, incluyen-do la GPx. Este grupo catalítico se encuentra en el sitio activo, y participa en lacatálisis redox. La GPx es una enzima que requiere de un tripéptido de bajo pesomolecular, llamado glutatión reducido (GSH) (figura 13-1C), para reducir elperóxido de hidrógeno (H2O2) a agua. El GSH es el donador de equivalentesreductores en dicha reacción; de esta manera, la reducción del H2O2 a agua y laoxidación de glutatión reducido (GSH) a glutatión oxidado (GSSG) (figura 13-1D) ocurren simultáneamente (figura 13-2):

GPxH2O2 + 2GSH GSSG + 2H2O

13

El GSH está presente en animales, plantas y en muchas bacterias aerobias (p.ej., en E. coli); su concentración intracelular es milimolar; además, rara vez seencuentra en bacterias anaerobias, mientras que la GPx prácticamente no se en-cuentra en plantas superiores ni bacterias, aunque se ha encontrado en algunostipos de algas y hongos.

La GPx también cataliza la reducción dependiente del GSH de los hidroperó-xidos de los ácidos grasos, por ejemplo, los productos de la lipoperoxidación delos ácidos linolénico y linoleico, del 7β-hidroperóxido del colesterol y varioshidroperóxidos sintéticos, como el cumeno y los t-butil hidroperóxidos. En todosestos casos el grupo peróxido (ROOH) es reducido a alcohol (ROH):

ROOH + 2GSH GSSG + H2O + ROH

Mediante el marcaje con 75Se y electroforesis en geles de poliacrilamida se han de-tectado cerca de 30 selenoproteínas en mamíferos. Sin embargo, sólo se han carac-


H 3

N +

CH 2

C H

COO –

SH

H 3 N +

CH 2

C H

COO –

SeH

Glu

Gli

Cis S S

Glu

Gli

Cis

A B

H 3 N + O –

O O

N

CH 2

SH

O

O

O –

Glu Gli

N

Cis

D

C

FFiigguurraa 1133--11.. AA)) Estructura de la selenocisteína. BB)) Estructura de la cisteína. CC)) Estructura de glu-tatión reducido. DD)) Estructura del glutatión oxidado. El glutatión reducido es un tripéptido quetiene la siguiente secuencia γ-glutamil-cisteinil-glicina y un grupo SH libre. El glutatión oxidado seforma por la unión de dos moléculas de glutatión por medio de un puente disulfuro.

terizado 10 de estas selenoproteínas en términos de su función y de su secuenciade aminoácidos; cuatro son glutatión peroxidasas (cuadro 13-1). La función delas selenoproteínas como la GPx y la tiorredoxina reductasa (TrxR) en el contex-to de su localización endotelial es prevenir eventos oxidativos en las células quepueden iniciar procesos patógenos.

❚ TIPO DE ISOENZIMAS

Glutatión peroxidasa es el nombre genérico para una familia de múltiples isoen-zimas que se caracterizan por su tríada catalítica compuesta de selenocisteína,glutamina y triptófano. El nombre sistemático de la enzima es E.C. 1.11.1.9: oxi-dorreductasa glutatión peroxidasa. La actividad de algunas isoenzimas de GPxdepende de Se. Existen cuatro isoenzimas mayoritarias en tejidos de mamíferos,todas dependientes de Se: GGPPxx cclláássiiccaa oo cciittoossóólliiccaa (GPx-1 o cGPx), GGPPxx ggaassttrrooiinn--tteessttiinnaall (GPx-2 o GPx-GI), GGPPxx ppllaassmmááttiiccaa (GPx-3 o pGPx) y GGPPxx ddee ffoossffoollííppii--ddooss (GPx-4 o PHGPx). Las primeras dos GPx son específicas a sustratos similares,y reducen rápidamente al H2O2 o a los ácidos grasos a hidroperóxidos. La GPx-3posee una débil actividad para reducir hidroperóxidos de colesterol. En contrapar-te, la GPx-4 reduce eficazmente los hidroperóxidos de fosfolípidos, pero demanera ineficaz al H2O2. La GPx-4 se describió primero en 1982, y después fueclasificada como selenoproteína cuando se determinó su secuencia de aminoácidos.

Estas cuatro isoformas de GPx pueden actuar como una peroxinitrito reduc-tasa, previniendo tanto la reacción de oxidación como la de nitración causada porel peroxinitrito (ONOO–). La GPx inactiva al ONOO– en una reacción catalíticacuya estequiometría ya se conoce (figura 13-3). El sistema de GPx y GSH traba-ja catalíticamente de una manera parecida a la destoxificación de hidroperóxidospor GPx a expensas de GSH. El residuo de selenocisteína en el sitio activo de laenzima es oxidado por el ONOO (o ácido peroxinitroso, ONOOH) a ácido selé-nico (RSeH) y reducido después a selenol (RSeOH) a expensas de dos equiva-lentes reductores proporcionados por GSH. La constante de reacción de segundo©

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Glutatión peroxidasas: una familia de enzimas • 203

2H 2 O

H 2 O 2

GSSG

2GSH

NADPH

NADP +

GPx GR G6PD

6- f os f oglucono- δ -lactona

Glucosa-6- f os f ato 2

FFiigguurraa 1133--22.. Reacciones catalizadas por glutatión peroxidasa (GPx), glutatión reductasa, (GR) yglucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PD).


CCuuaaddrroo 1133--11.. SSeelleennoopprrootteeíínnaass ddee mmaammííffeerrooss:: llooccaalliizzaacciióónn yy ffuunncciióónn

SSeelleennoopprrootteeíínnaa AAbbrreevviiaattuurraa LLooccaalliizzaacciióónn FFuunncciióónn

Glutatión peroxidasa GPx

Clásica o citosólica cGPx, GPx-1 Citosol de casi todos los Antioxidante citosólicotejidos

Gastrointestinal GI-GPx, En el citosol de hígado Antioxidante en tractoGPx-2 y tracto intestinal en gastrointestinal

humanos

Plasmática pGPx, Fluidos extracelulares Antioxidante en fluidosGPx-3 de varios tejidos, aunque extracelulares y en

es en riñón donde existe plasmauna alta concentración

De fosfolípidos PHGPx, En la membrana y cito- Antioxidante en mem-GPx-4 sol de varios tejidos brana celular. Participa en

la apoptosis y en la fun-ción reproductiva (esper-matogénesis)

Yodotironina desyodasa:

Desyodasa tipo 1 D1,5’DI En glándula tiroides, Convierte tiroxina (T4) hígado, riñón y por monodesyodaciónglándula hipófisis a 3,5,3’-tri-yodotironina

(T3)

Desyodasa tipo 2 D2,5’DII En cerebro, tejido adi- Convierte T4 por poso oscuro, glándula monodesyodación a T3

hipófisis y placenta

Desyodasa tipo 3 D3,5’DIII En sistema nervioso Convierte T4 por mono-central, placenta y piel desyodación a la forma

inversa de T3

Tiorredoxina TrxR Cumplen con múltiples reductasas: papeles incluyendo la

Tiorredoxina TrxR1 En el citosol de varios reducción de peróxidos y reductasa 1 tejidos de tiorredoxina, y mantie-Tiorredoxina TrxR2 En la mitocondria ne el equilibrio redox de reductasa 2 celular de varios tejidos factores de transcripción

Selenofosfato SPS2 En varios tejidos Síntesis de selenofosfatosintetasa 2 para la síntesis de seleno

proteínasSelenoproteína P SP En glándula tiroides y Transporta Se a las proteí-

sangre nas que lo requieren.Antioxidante endotelial

orden de las GPx tetraméricas (GPx-1, GPx-2 y GPx-3) con el ONOO– es de 8 x 106 M-1seg-1. Este dato sugiere que en el interior celular, las GPx tetraméricascompiten con los grupos tiol para reaccionar con el ONOO–, y además puedencompetir con el CO2, cuya constante de reacción de segundo orden con el ONOO–

es de 3 x 104 M-1 seg-1. Esto hace que la reacción de la GPx con el ONOO– se con-sidere como un mecanismo de destoxificación biológica eficaz in vivo. También seha demostrado que la selenoproteína P protege contra el ONOO–, lo que sugiereque sirve como una proteína protectora en circulación. Se ha demostrado que unatercera selenoproteína, la TrxR, puede ayudar en la reducción del ONOO–. Estaenzima usa NADPH para reducir las formas oxidadas de selenocisteína.

Las isoformas de GPx están presentes en la mayor parte de los tejidos anima-les, y son específicas para el GSH como donador del átomo de hidrógeno. Sinembargo, no están distribuidas de manera homogénea en el organismo, como semuestra en el cuadro 13-2, y como se describirá con detalle más adelante.

❚ CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES DE LAS ISOENZIMAS GPX

Las isoformas 1, 2 y 3 de GPx son homotetrámeros, mientras que la GPx-4 es unmonómero (cuadro 13- 3); cada una de ellas contiene un átomo de Se en su sitioactivo, en forma de selenocisteína. La selenocisteína se incorpora de maneracotraduccional a las proteínas. La incorporación de la selenocisteína requiere unpaso novedoso en el proceso de traducción en el cual el codón UGA dirige la©

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ONOO – ONO –

E-Se – + H + E-SeOH

GSSG

GSH

E-Se-SG GSH

H 2 O

FFiigguurraa 1133--33.. Mecanismo catalítico propuesto para GPx en la reducción de peroxinitrito a nitrito (oácido peroxinitroso a ácido nitroso).

inserción de selenocisteína. Como los codones UGA son reconocidos normalmen-te como señales de terminación de la traducción, se requiere precisar cómo lacélula reconoce y distingue un codón selenocisteína UGA de un codón de termi-nación UGA.

La homología en la secuencia de nucleótidos y aminoácidos entre las isoenzi-mas de GPx de los primates es de 94%. La estructura primaria de la GPx-1 enhumanos consiste de 201 aminoácidos. Los residuos que están envueltos en la


CCuuaaddrroo 1133--22.. PPrreesseenncciiaa ddee gglluuttaattiióónn yy ddee GGPPxx eenn ddiiffeerreenntteess oorrggaanniissmmooss

SSiisstteemmaa CCoonncceennttrraacciióónn RReellaacciióónn ddee GGlluuttaattiióónneessttuuddiiaaddoo ddee GGSSHH GGSSHH//GGSSSSGG ppeerrooxxiiddaassaa ((GGPPxx))Cloroplastos

de espinacas 3.0 mM > 10/1 AusenteTejidos de rata:Hígado 7 a 8 mM > 10/1 AltoEritrocito 2 mM > 10/1 ModeradoCorazón 2 mM > 10/1 ModeradoPulmones 2 mM > 10/1 ModeradoBazo 4 a 5 mM > 10/1 —Riñón 4 mM > 10/1 ModeradoCerebro 2 mM > 10/1 ModeradoMúsculo

esquelético 1 mM > 10/1 BajoPlasma

sanguíneo 20 a 30 μM ~5/1 BajoTejido adiposo 3.2 μg/106 células > 100/1 Bajo

Tejido humano:Hígado 4 μmol/ g peso húm. > 10/1 AltoRiñón 2 μmol/g > 10/1 AltoEritrocitos 240 μg/mL de sangre > 10/1 ModeradoSangre ~ 1 mM > 10/1 AltoPlasma sanguíneo 1 a 3 μM varía BajoFactor surfactante 40 a 200 μM varía (usualmente Trazas

alveolar > 10/1)

Neurospora crassa 20 μmol/ g peso seco 150/1 Ausente

E. coliCrecimiento 27 μmol/g > 10/1 Ausente

aerobioCrecimiento 7 μmol/g

anaerobio

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fijación de Se para esta isoenzima son Gln82 y Trp160, y los residuos del centrocatalítico son Arg52, Arg98, Arg179, Arg180 y Lis86. Estas características son idénti-cas en las GPx-1 de los mamíferos, indicando que las propiedades catalíticasesenciales de GPx-1 son similares entre los primates.

La GPx-1 posee en su estructura tres asas que estabilizan la estructura de laenzima. La primera asa está constituida por Asn42-Tir54, la segunda por Leu72-Gln82 y la tercera por Trp160-Fen162. Los aminoácidos que conforman estas tresasas están conservados en todas las especies de primates, al igual que los cuatroresiduos Asn77, Lis112, Glu114 y Tre143, que también son importantes para la acti-vidad de GPx-1.

La GPx-2 en los humanos está constituida por 190 aminoácidos, además, estaenzima tiene una gran similitud estructural con la GPx-1 (en 55.7%). La simili-tud de la GPx-3 y la GPx-4 con la GPx-1 es baja (en 36.8 y 28.1% para GPx-3y 4, respectivamente).

A partir de la estructura de la GPx-1 se han logrado dilucidar otras caracterís-ticas estructurales comunes a todas las isoenzimas de GPx. Se ha demostrado quelos residuos de aminoácidos Gln82 y Trp160 se han conservado, puesto que estáninvolucrados en la generación de los puentes de hidrógeno para fijar al Se. Laarquitectura electrostática del centro activo está formada por Arg52, Lis86, Arg98,Arg179 y Arg180 en GPx-1. De esos residuos, la Arg180 está presente en todas lasGPx. En contraparte, la presencia de los aminoácidos Arg52, Lis86 y Arg179 no esfrecuente, lo que sugiere que son aminoácidos menos esenciales para el centroactivo. La Asn77 y la Lis112 están presentes en todas las isoenzimas de GPx, mien-tras que la Arg52 y la Glu114 están sólo en GPx-1 y GPx-2, lo cual indica la gran


CCuuaaddrroo 1133--33.. IIssooffoorrmmaass ddee GGPPxx eenn mmaammííffeerrooss:: llooccaalliizzaacciióónn,, ppeessoo mmoolleeccuullaarr,, eessttrruuccttuurraa yy KKmm

IIssooeennzziimmaa LLooccaalliizzaacciióónn TTiippoo ddee eessttrruuccttuurraa PPeessoo mmoolleeccuullaarr KKmm ((μμMM))11

cceelluullaarr ((kkDDaa)) [[GGSSHH]] == 11 mmMM

GPx-1 Citosol homotetrámero 22 por subunidad 12 para H2O2(88 en total)

GPx-2 Citosol homotetrámero 22 por subunidad 3 para H2O2 (88 en total)

GPx-3 Fluidos extra- homotetrámero 23 por subunidad 3.3 para H2O2 celulares (92 en total)

GPx-4 En citosol y monómero 19.7 11 para hidro-membrana peróxidos decelular fosfolípidos

1 Los valores de Km son para la GPx de humanos.

similitud entre las características enzimáticas de estas dos isoenzimas. Las tresasas constituidas por Asn42-Tir54, Tir72-Gln82 y Trp160-Fen162 están presentes entodas las isoenzimas de GPx, lo que muestra la importancia de esas asas en laestructura de la GPx.

❚ JERARQUÍA DE LAS ISOENZIMAS GPX

La jerarquía de las isoenzimas GPx se refiere al orden de importancia de cada unade ellas en función de la biodisponibilidad de Se, de la velocidad de síntesis y dela cantidad de cada isoenzima en los organismos. La biosíntesis de las selenopro-teínas depende de la disponibilidad de Se. A concentraciones limitantes, el Se esresguardado selectivamente al interior de algunas selenoproteínas, mientras queen otras el resguardo es mucho menor. En consecuencia, algunas selenoproteínasresponden rápido a la deficiencia de Se con una pérdida en su actividad, otraspermanecen estables con una moderada deficiencia de Se y sólo disminuyen suactividad cuando esta deficiencia es sustancial y prolongada. Por otro lado, lasproteínas que responden con lentitud a la deficiencia de Se se restauran rápidodespués de una suplementación con este mineral.

La disminución en la síntesis de ciertas selenoproteínas por deficiencia de Sese acompaña de una disminución en los niveles de los mRNA. En términos cuan-titativos, la disminución en el mRNA es menos pronunciada que la disminuciónen la síntesis de la proteína o de la pérdida de la actividad de la proteína. La esta-bilidad del mRNA contribuye al resguardo preferencial de Se al interior de algu-nas selenoproteínas en particular, por ello esta estabilidad en el mRNA esutilizada como un criterio adicional para la jerarquía de las GPx.

Los estudios en la estabilidad del RNA han colocado a la GPx-1 como la iso-enzima de más baja jerarquía (por la cantidad de esta isoenzima presente en losorganismos). En contraste, los niveles de mRNA de la GPx-4 permanecen esta-bles durante la deficiencia de Se. El orden jerárquico de las GPx es el siguiente:

GPx-2 > GPx-4 > GPx-1 = GPx-3

❚ PARTICULARIDADES DE LAS ISOENZIMAS DE GPX: DISTRIBUCIÓN Y FUNCIÓN

GPx-1 o GPx-citosólica

aa)) DDiissttrriibbuucciióónn.. La isoenzima GPx-1 se conoce desde hace más de 40 años, y sudistribución se ha estudiado en muchas especies de manera amplia. Bajo concen-


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traciones adecuadas de Se, todas las células expresan a la GPx-1. Las concentra-ciones de esta isoenzima se encuentran particularmente altas en tejidos comohígado, riñón, pulmón y eritrocitos sometidos a estrés oxidativo por largo tiem-po. Se han encontrado valores bajos de GPx-1 en el testículo de rata.

bb)) FFuunncciióónn.. Muchas de las evidencias apoyan la función de los hidroperóxidosen la señalización celular, y se basan en los estudios con líneas celulares derivadasde linfocitos a través de la activación del factor de transcripción NF-κB (un com-plejo multiproteínico que regula una gran variedad de genes relacionados con lainmunidad, inflamación y cáncer). Es posible que la GPx-1 participe en la modu-lación de la activación del factor NF-κB, ya que su activación se ha visto inhibi-da en las células suplementadas con Se y facilitada durante la deficiencia de Se. De la misma forma, la GPx-1 está involucrada en la modulación de la muer-te celular programada o apoptosis. Durante la apoptosis se eliminan células queya no son necesarias o están alteradas, por lo que este proceso biológico juega unpapel importante durante el desarrollo embrionario, la reparación de un tejido, eldesarrollo de la carcinogénesis y durante el equilibrio del sistema de defensa enla célula. Además, se ha observado un incremento en la actividad de GPx-1 cuan-do la apoptosis es inhibida bajo condiciones en que se producen especies reacti-vas de oxígeno, lo cual parece demostrar la habilidad de las GPx para modular lasrespuestas apoptóticas en las células.

GPx-2 o GPx gastrointestinal

aa)) DDiissttrriibbuucciióónn.. La expresión de GPx-2 parece estar restringida al epitelio deltracto gastrointestinal en las ratas, mientras que en los humanos también se haencontrado en el hígado. Esta distribución tan inusual en los humanos ha permi-tido sugerir la hipótesis de que la GPx-2 representa un primer punto de defensacontra los hidroperóxidos lipídicos producidos de la ingesta de lípidos en la dieta.A favor de esta hipótesis se ha encontrado que el GSH reduce la cantidad dehidroperóxidos transportados del lumen a la linfa. En las ratas, el mRNA de laGPx-2 está presente en forma significativa en las células epiteliales de todo eltracto digestivo (desde el esófago hasta el colon distal). Aunque la actividad totalde la GPx-2 en el intestino representa sólo la décima parte de lo que representasu actividad en el hígado, se ha concluido que es en el intestino en donde existeun mecanismo más eficaz de destoxificación contra los hidroperóxidos, por ello,la GPx-2 aparece como el mejor sistema antioxidante de defensa en el epiteliointestinal.

bb)) FFuunncciióónn.. Se ha sugerido un efecto protector de la GPx-2 contra el cáncerde colon. En los estudios epidemiológicos se ha observado la asociación entre laingesta de Se y la susceptibilidad al cáncer de colon. El tracto gastrointestinal es


el único sistema que expresa las cuatro isoenzimas de la GPx, aunque la GPx-2es el sistema de defensa antioxidante más importante en este sitio, pues su papelno sólo consiste en la defensa contra la producción de los hidroperóxidos despuésde la ingesta de alimentos, sino que también es un sistema de defensa contra elH2O2 en el hígado, ya que esta especie reactiva de oxígeno es un producto secun-dario del metabolismo oxidativo de agentes xenobióticos (agentes no producidosen los organismos). En ambas funciones, la GPx-2 equilibraría el potencial muta-génico de los hidroperóxidos, por lo que puede ser vista como un instrumentoprotector contra el inicio y desarrollo de procesos malignos en el aparato gas-trointestinal.

GPx-3 o GPx plasmática

aa)) DDiissttrriibbuucciióónn.. La GPx-3 se detectó primero en el plasma sanguíneo. Sin embar-go, la concentración del GSH plasmático es tan sólo de 30 μM, por lo que no essuficiente para mantener la actividad de GPx plasmática por un tiempo razona-ble, razón por la cual aún no se ha comprendido por completo la función de estaisoenzima extracelular. Tal vez ésta es la principal razón por la que la GPx-3 noha sido tan estudiada como los otros miembros de la familia de la GPx.

La fuente más significativa de la GPx-3 es el riñón, ya que es producida por lascélulas epiteliales del túbulo proximal y por las células parietales de la cápsula deBowman para ser liberada a la circulación sanguínea. El riñón es el órgano quecontiene los niveles más altos de mRNA de GPx-3; en concentraciones menoresse encuentra en el hígado, músculo esquelético, páncreas, cerebro, pulmones,corazón, epitelio ciliar del ojo, células epiteliales del intestino delgado, epidídimo,placenta y las glándulas mamarias de ratones hembras embarazadas. La GPx-3 essecretada extracelularmente, y se ha encontrado en leche materna, líquido am-niótico, líquido pleural y el humor acuoso. Aunque la GPx-3 también es expre-sada en el epidídimo, no se ha encontrado en la luz de los vasos deferentes.Durante el desarrollo fetal humano, la GPx-3 es sintetizada en las células en laetapa de trofoblasto en la placenta. La posibilidad de expresión durante el desa-rrollo embrionario se investigó para determinar los sitios de la expresión de estaisoenzima en diferentes estados embrionales y en tejidos adultos de ratón. Enratones preñados se ha encontrado en la piel y vísceras fetales. En tejidos adultos,aparte de los órganos conocidos también se ha encontrado en la piel, vello intes-tinal y en tejido adiposo.

bb)) FFuunncciióónn.. La presencia de la GPx-3 en casi todos los puntos de frontera celu-lares, sugiere que su función es la de ser una barrera contra la transferencia dehidroperóxidos. Sin embargo, todavía no se ha aclarado si la GPx-3 funciona sólocomo un antioxidante.


GPx-4 o GPx de fosfolípidos

aa)) DDiissttrriibbuucciióónn.. Una de las peculiaridades de la GPx-4 es su distribución pococomún. Su actividad por lo general es más baja respecto a la actividad de la GPx-1 en todos los órganos, con excepción de los testículos, donde su actividad es másalta. En los testículos de la rata, la GPx-4 es 15 veces más activa que en el híga-do y riñón, y 25 veces más que en el corazón y pulmón.

bb)) FFuunncciióónn.. El resguardo preferencial del Se al interior de la GPx-4 en el apa-rato reproductor y endocrino, parece indicar que la GPx-4 no sólo tiene funcio-nes antioxidantes, sino que también juega un papel importante en la regulaciónde los procesos de oxidorreducción, maduración sexual y diferenciación. La GPx-4 fue descubierta como un factor contra la prevención de la peroxidación lipídi-ca, además de proteger a las membranas biológicas contra el estrés oxidativo. Dela misma forma, también desempeña una función muy importante en la biosín-tesis de los leucotrienos, los tromboxanos y las prostaglandinas, así como en lareducción de los hidroperóxidos de las proteínas y las lipoproteínas de alta y bajadensidad (HDL y LDL) (figuras 13-4 y 13-5). De acuerdo con los puntos ante-riores, la GPx-4 parece tener una función preventiva de la aterogénesis y en elcontrol de la espermatogénesis.

❚ EFECTOS DE LA DEFICIENCIA DE SE EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICADE LAS GPX SELENODEPENDIENTES

El Se es un micronutrimento esencial para el mantenimiento óptimo del sistemainmunitario. Muchas enfermedades están asociadas a la deficiencia de Se juntocon la deficiencia de vitamina E, esta conexión ha permitido proponer la hipóte-sis de que el Se y la vitamina E tienen una actividad antioxidante similar. Hacetres decenios se demostró que la deficiencia de Se disminuye la actividad microbi-

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R OOH

Prot-SSG GSSG PHGPx-Se - R OH

Prot-SH

PHGPx-SeOH PHGPx-Se-S-Prot

Prot-SH GSH PHGPx-Se-SG GSH

Prot-SH

FFiigguurraa 1133--44.. Ciclo catalítico de la PHGPx y las posibles reacciones que permiten la modificaciónde proteínas por hidroperóxidos (ROOH), GSH y PHGPx.

cida de los neutrófilos, los cuales tienen a su vez una disminución de la actividadde las GPx selenodependientes. Este hecho sugiere que las GPx selenodepen-dientes juegan un papel en la modulación de la respuesta inflamatoria. La defi-ciencia de Se puede asociarse con muchos tipos de cáncer, incluyendo el deesófago, estómago, colon y próstata. Dicha deficiencia también resulta en unapérdida de la actividad de otras selenoproteínas, además de pérdida de la estabi-lidad de los mRNA y la traducción de las proteínas. De acuerdo con diferentesestudios realizados con ratones knockout para GPx-1 y GPx-2 (ratones que noposeen estas enzimas y se denominan GPx1/2-KO), la deficiencia de Se está liga-da a la inflamación en el tracto gastrointestinal. Estos ratones también presentanuna severa ileocolitis a temprana edad, y una pérdida completa de la actividad deGPx de la mucosa intestinal a partir de los 11 días de edad. De la misma forma,se encontró que los ratones GPx1/2-KO desarrollaron cáncer en la parte baja deltracto gastrointestinal (restringida a colon e íleon). Por otro lado, en experimen-tos con células Jurkat cultivadas de en un medio deficiente de Se, se indujo la dis-minución en la actividad enzimática de la GPx-4 y la GPx-1 a 36% en un periodo


PGG 2 GPx GPx

PGH 2 15-OOH-PGF

GPx GPx PGF2

Ácido a r aquidónico

Lipo o xigenasa

12-HEPTE GPx

12-HETE

8,11,12-THETE

15-HPETE 15-HETE

Prostaciclina sintetasa

Prostaciclina T romb o xano

Lipo o xigenasa

GPx

A

B

C

FFiigguurraa 1133--55.. Influencia de GPx-4 en la formación de prostaglandinas AA)), leucotrienos BB)) y trom-boxanos CC)). PGG2, PGH2, 15-OOH-PGF y PGF2α: endoperóxidos, 12-HEPTE, 12-HETE,15-HETE y 8,11,12-THETE: leucotrienos, 15-HPETE: intermediario de la biosíntesis de prosta-glandinas Y tromboxanos.

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de 24 h. Asimismo, la eliminación de Se del medio de cultivo indujo la produc-ción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (figura 13-6).

En conclusión, se ha demostrado que la deficiencia de Se disminuye la activi-dad de las isoformas de GPx, lo que trae como consecuencia un aumento de laperoxidación lipídica en las membranas y un aumento en la producción de espe-cies reactivas de oxígeno, lo que finalmente induce la muerte celular. Estos resul-tados sugieren que los hidroperóxidos lipídicos tienen una función importante enel daño oxidativo celular inducido por deficiencia de Se. De la misma forma, ladeficiencia de GPx incrementa el riesgo de cáncer.

❚ MECANISMO CATALÍTICO DE LAS ISOENZIMAS GPX: SISTEMA GSH/GPX

El sistema del glutatión es un mecanismo central para la reducción de H2O2 y/operóxidos lipídicos, la responsable de esta reducción es la enzima GPx junto conla oxidación del GSH. Este sistema funciona para proteger a las células del dañooxidativo. La capacidad reductora de las isoenzimas GPx se basa en altas concen-traciones de GSH. La molécula de GSH es un tripéptido celular con un gruposulfhidrilo con capacidad antioxidante, razón por la cual juega un papel muyimportante en el metabolismo celular. La molécula de GSH destoxifica de radi-cales libres y toxinas exógenas, además de ser importante para mantener el equi-librio oxidorreductivo intra y extracelularmente (capítulo 16).


O 2

e –

O 2 . –

SOD

H 2 O 2

O 2

O 2 + 2H +

2H 2 O GPx

Se

2GSH GSSG

NO

2GSH GSSG

ONOO –

GPx

Se ONO – + H 2 O

FFiigguurraa 1133--66.. Participación del Se en la defensa citosólica contra especies reactivas de oxígeno ynitrógeno.

Durante el mecanismo catalítico de las GPx, un selenol (proteína Se-) reaccio-na con peróxido para dar ácido selénico (proteína SeOH):

Proteína Se– + ROOH + H+ ROH + Proteína SeOH

El primer-GSH es entonces enlazado:

Proteína-SeOH-GSH H2O + Proteína-Se-SG

El segundo-GSH es enlazado:

Proteína-Se-SG-GSH Proteína-SeH-GSSG Proteína Se– + H+ + GSSG

La relación entre el glutatión reducido y el glutatión oxidado (GSH/GSSG) enlas células normales por lo general es alta, ya que existe un mecanismo para regene-rar al GSH (figura 13-3). La molécula de GSSG que se forma durante la reacciónenseguida es reducida por la enzima glutatión reductasa, una enzima intracelularque cataliza la siguiente reacción:

GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+

Como se observa en la reacción anterior, la glutatión reductasa utiliza NADPHcomo cofactor. El NADPH requerido es proporcionado por tejidos animales yvegetales por muchos sistemas enzimáticos, aunque el mejor conocido es la víade las pentosas fosfato en su fase oxidativa (cuadro 13-4). La primera enzima deesta vía es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que cataliza la primera reacciónde la fase oxidativa de la vía de las pentosas fosfato:

Glucosa-6-fosfato + NADP+ CO2 + NADPH + H+ + ribulosa-5-fosfato

La vía de las pentosas fosfato es controlada por la concentración de NADP+,el cual es sustrato de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Cuando la glutatión reductasa opera, se disminuye la relación de NADPH/NADP+ (ya que incremen-tan los niveles de NADPH), por lo que la vía de las pentosas fosfato se hace cadavez más rápida para reemplazar el NADPH.

Cabe mencionar que se ha observado que la exposición de las células al estrésoxidativo trae como consecuencia cambios rápidos en las concentraciones de GSHy GSSG, y con ello alteraciones en el ambiente oxidorreductivo. En varias investi-gaciones se ha observado que existe un rápido incremento de GSH intracelular enrespuesta al estrés oxidativo. De acuerdo con lo anterior, la exposición a pirogalolocasiona una disminución de GSH, seguida de una elevación prolongada en los va-lores de GSH intracelular.Además, la enzima γ-glutamil cisteína sintetasa (γ-GCS),


la cual determina la velocidad de síntesis de GSH, está constituida por una subu-nidad pesada (γ-GCS-HS) y por una subunidad ligera (γ-GCS-LS). Algunos estu-dios han demostrado que las especies reactivas de oxígeno incrementan los nivelesde GSH a través de la inducción de la γ-GCS. Otras respuestas de protección aestrés oxidativo incluyen el transporte de GSH al interior celular y exportación deGSSG, con una acumulación de esta última forma en el citosol celular.

❚ ESTUDIOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

En el laboratorio de los autores se han estudiado los cambios de la actividad de laGPx-1 y de la GPx-3 en el daño renal ocasionado por el antibiótico gentamicina elcual induce estrés oxidativo y nitrosativo, y se encontró que la disminución deambas isoenzimas de GPx se previno por la administración de antioxidantescomo dialil disulfuro, dialil sulfuro y S-alilcisteína. De esta manera, la determi-nación de la actividad de la GPx-3 se puede considerar también como un mar-cador de daño a los túbulos proximales renales.

Asimismo, se estudió el efecto de la deficiencia y la complementación dietariade Se y vitamina E sobre el desarrollo del síndrome nefrótico experimental indu-cido por aminonucleósido de puromicina. La dieta deficiente en Se y vitamina Edisminuye la actividad de GPx-1, aumenta la peroxidación de lípidos y el dañorenal funcional y estructural. Por otro lado, la dieta complementada en Se y vita-mina E aumenta la actividad de GPx-1, disminuye la peroxidación de lípidos y eldaño renal funcional y estructural. Lo anterior indica la importancia de la acti-vidad de GPx-1 en la modulación del daño renal ocasionado por aminonucleó-sido de puromicina.

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CCuuaaddrroo 1133--44.. RReeaacccciioonneess ddee pprroodduucccciióónn ddee NNAADDPPHH eenn ssiisstteemmaass bbiioollóóggiiccooss

EEnnzziimmaa RReeaacccciióónn VVííaa mmeettaabbóólliiccaaGlucosa-6-fosfato Glucosa-6-fosfato + NADP+ → Vía de las pentosas-deshidrogenasa 6-fosfoglucono-δ-lactona + fosfato (fase oxidativa)

NADPH + H+

6-fosfogluconato 6-fosfogluconato + NADP+ → Vía de las pentosas-deshidrogenasa D-ribulosa-5-fosfato + NADPH fosfato (fase oxidativa)

+ H+

Enzima málica Malato + NADP+ ↔ Piruvato + —HCO3

– + NADPH + H+

❚ AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue posible gracias a los donativos del Consejo Nacional de Cienciay Tecnología (CONACYT, 40009-M) y de la Dirección General de Asuntos delPersonal Académico (DGAPA, PAPIIT IN227103) de la Universidad NacionalAutónoma de México (UNAM).

❚ REFERENCIAS

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TTIIOORRRREEDDOOXXIINNAASS

Elizabeth Hernández PérezLeticia Bucio Ortiz

❚ INTRODUCCIÓN

Las tiorredoxinas (Trx) son una familia de proteínas pequeñas (12 kDa) encon-tradas en un gran número de especies, tanto de procariotas como de eucariotas.Laurent T.C. en 1963, obtuvo la primera Trx al extraerla de E. coli, pero fueMoore E.C., en 1967, quien describió primero la Trx de mamífero al purificarlade un hepatoma de Novikoff. Más tarde, otros investigadores las han reportadocon diferentes nombres como: interleucina-1 (IL-1), citocina producida por elvirus de Epstein-Barr, factor derivado de leucemia de células T adultas o factortemprano de embarazo; sin embargo, todas estas proteínas presentan la mismasecuencia de aminoácidos, por lo que todas son tiorredoxinas.

La Trx está implicada en un gran número de funciones celulares en los mamí-feros. Dentro de la célula, su actividad puede analizarse dependiendo de su loca-lización; así, en el citoplasma actúa como antioxidante y cofactor; en el núcleomodula la regulación de la actividad de factores de transcripción, y en la mito-condria desempeña una función importante en la supervivencia celular duranteel desarrollo embriogénico. La Trx también puede ejercer su actividad fuera de lacélula al estimular el crecimiento celular y la quimiotaxis.

Las proteínas de la familia de las Trx presentan un sitio catalítico conservado,en el cual dos cisteínas, la 32 y la 35 se encuentran en forma de ditiol (-SH)2 en

14

la enzima reducida (Trx-[SH]2). Estas cisteínas son las encargadas de experimen-tar el proceso de oxidación reversible a disulfito de cisteína mediante la trans-ferencia de equivalentes reductores, y generar la especie oxidada de la enzima(Trx-S2).

La reacción para regenerar a la Trx reducida (Trx-[SH]2) es catalizada por laenzima Trx reductasa (Trx-R), que es una flavoproteína dependiente deNADPH+H (figura 14-1).

El mecanismo de acción de la enzima Trx es el siguiente: la proteína sustrato(X-S2) que se va a reducir, se une a la superficie hidrofóbica de la Trx-[SH]2; eneste sitio, en el que hay un ambiente hidrofóbico, el grupo tiol de la Cis32 actúacomo un nucleófilo, ya que se combina con el X-S2 de forma covalente (Trx-Cis32 –S-S-X). Posteriormente, la Cis35 dona su protón y reacciona con la Cis32–S-S-X, liberando la proteína sustrato reducida (X-[SH]2), y formando a la Trx oxi-dada (Trx-[S]2), la cual es entonces reducida por la Trx-R, dependiente deNADPH. El NADPH +H se oxida a NADP+ al ceder los protones a la Trx-[S]2 pararegenerarla a la forma Trx-[SH]2 (figura 14-1).

❚ ESTRUCTURA DE LA TRX

Existen varios miembros de la familia de las Trx en los mamíferos y en otras espe-cies (figura 14-2), se sabe que la Trx es una proteína globular compacta con cincocadenas β plegadas que posee un centro hidrofóbico rodeado por cuatro hélices


T r p Cis Gli

Pro Cis L is

SH

SH T rx (reducida)

X-S 2

X(SH) 2

+

T rx-R (Se)

T r p Cis Gli

Pro Cis L is

+

T r p Cis Gli

Pro Cis L is

SH

SH T rx (reducida)

+

T rx ( o xidada)

NADP NADPH+H

S

S

+

FFiigguurraa 1144--11.. Mecanismo de acción de la Trx. La Trx presenta dos cisteínas con grupos tiol en suforma, las cuales al ser oxidadas por la Trx-R formarán un puente disulfuro al ceder los equivalen-tes de hidrógeno a una proteína blanco (X-S2). Posteriormente, la Trx oxidada será reducida al reci-bir equivalentes de hidrógeno provenientes del NADPH+H mediante la Trx-R.

α sobre la superficie externa. Los residuos aminoacídicos del sitio activo son muyconservados: –Trp-Cis32- Gli- Pro-Cis35-Lis-. Se ha visto que sirven para unir lasegunda cadena β plegada a la segunda hélice α y formar la primera vuelta de la segunda hélice. Esta estructura terciaria es muy estable y se conoce como laTTrrxx pplleeggaaddaa (figura 14-3).

Trx-1

Se ha clonado la Trx-1 humana, así como la de pollo, ratón, rata y bovino, y se haencontrado que es una proteína de 104 aminoácidos con un peso molecular de12 kDa. Una característica es que algunas de ellas presentan a la metionina en ellado N-terminal. La Trx-1 humana y de otros mamíferos contienen, además delos dos residuos de Cis en el sitio catalítico, otros tres residuos de cisteína, lasCis62, Cis69 y Cis73, las cuales pueden conferir propiedades biológicas únicas a laTrx-1 de mamíferos.

El gen para la Trx-1 humana se localiza sobre las bandas 9q32 en el cromoso-ma 9, mientras que el gen de la Trx-1 de ratón se encuentra sobre el segundocuarto proximal del cromosoma 4, que es homólogo a la localización 9q32 delcromosoma humano.

La estructura cristalina de la Trx-1 humana ha revelado una conformacióndimérica en la cual los monómeros están unidos a través de un puente disulfuroentre las Cis73 de cada subunidad, mientras que los residuos del sitio activo estánreducidos (figura 14-4). El dímero contiene una interfase hidrofóbica grande (100 Å), con cinco puentes de hidrógeno además del enlace disulfuro. En la in-terfase dimérica se localizan 12 aminoácidos de cada monómero, 10 de los cua-les no varían en animales superiores, incluyendo Cis73. La aparente constante dedisociación para la formación de dímeros no covalentes bajo condiciones de re-ducción varía entre 6 y 166 μM a pH de 3.8 y 8, respectivamente.

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Tiorredoxinas • 221

CGPC

T rx-1 humana

T rx-2 humana

p32 T rxL

humana

T rx de E.coli.

P .M . (kDa) N o . de aa

12

18

289

Sitio acti v o

104

166

FFiigguurraa 1144--22.. Miembros de la familia de tiorredoxinas.

Se desconoce si la formación del dímero ocurre bajo condiciones fisiológicasdebido a que la asociación es relativamente débil, y no es claro cuál es el papeldel dímero de Trx-1, ya que el sitio activo, al permanecer encerrado, no es un sus-trato para la reducción por la Trx-R y no estimula el crecimiento celular. Por otraparte, aún no se ha logrado determinar la concentración local de Trx-1 humanaen tejidos, pero se cree que los valores son aproximadamente de 2 a 12 μM.

Trx-2

Se identificó una segunda Trx un poco más larga en las mitocondrias del corazóndel cerdo, y se le denominó Trx-2. Esta enzima posee 166 aminoácidos, y pesa 18kDa. Presenta el sitio catalítico conservado, pero sin los tres residuos extras de Cisencontrados en la Trx-1 de mamíferos. La extensión N-terminal de 60 aminoáci-dos de la Trx-2 exhibe características consistentes con una señal de translocaciónmitocondrial. Al parecer, tiene un sitio de probable ruptura, lo que daría dos frag-mentos: una proteína de unos 12.2 kDa, y otro fragmento que contendría al sitiocatalítico. Se ha demostrado que este fragmento pequeño tiene actividad catalí-tica y reduce a la insulina, y es reducido a su vez por la Trx-R y NADPH+H.

p32TrxL

Un tercer tipo de tiorredoxina es la p32TrxL, formada por una Trx a la que se uneuna proteína citosólica de 32 kDa, esta Trx fue clonada de una biblioteca de


Hélices α Hélices β

Centro hidrofóbico

Monomeros de T rx

Cis 73

Cis 35 Cis 32

FFiigguurraa 1144--33.. Estructura de la Trx. La figura muestra un dímero de Trx, cada monómero está forma-do por cinco cadenas ß plegadas y cuatro α hélices, el sitio activo se encuentra en el interior de unaα hélice, formando un centro hidrofóbico. Se observan las Cis32 y Cis35.

cDNA de testículo humano. La proteína tiene una secuencia de 289 aminoáci-dos, con un dominio Trx N-terminal de 105 aminoácidos, un sitio activo Trxconservado (-Cis-Gli-Pro-Cis-) y un alto grado de homología con la Trx-1 huma-na. La secuencia del remanente es de 184 aminoácidos en el lado C-terminal, yéste no muestra homología a otras proteínas consultadas en una base de datos. Laproteína p32TrxL se expresa en todos los tejidos humanos, con concentracionesmás altas en el estómago, testículo y la médula ósea. Sin embargo, ni la longitudcompleta de p32TrxL ni el fragmento N-terminal de 105 o 107 aminoácidos sonreducidos por la Trx-R y NADPH+H, lo que sugiere que no está involucrada enprocesos antioxidantes.

Localización subcelular de las Trx

La Trx-1 es predominantemente una proteína citosólica, y aunque no tiene unasecuencia de localización nuclear, se ha detectado en el núcleo de las células delestroma del endometrio normal, en las células tumorales y en tumores sólidosprimarios. El tratamiento de las células con H2O2, PMA (parametoxianfetamina),radiaciones UV, hipoxia y el anticancerígeno cisplatino, causan la translocación dela Trx-1 desde el citoplasma hacia el núcleo. El mecanismo de esta translocaciónno es bien conocido, pero puede ser una consecuencia de que la Trx-1 sea acarre-ada y enlazada a otras proteínas con una secuencia nuclear. La Trx-1 también seasocia con membranas celulares o plasmáticas presumiblemente en el lado de lasuperficie externa. La Trx-2 se encuentra de preferencia en las mitocondrias,mientras que la p32TrxL es una proteína citosólica.

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Monomeros de T rx

FFiigguurraa 1144--44.. Dímero de Trx-1. Se muestran los dos monómeros.

❚ TIORREDOXINA REDUCTASAS

Las tiorredoxina reductasas (Trx-R) son las únicas enzimas conocidas capaces dereducir el sitio activo de las Trx. Las Trx-R de mamíferos son proteínas homodí-meras que contienen dinucleótidos de flavina y adenina con un residuo de seleno-cisteína en el penúltimo C-terminal, un sitio activo -Cis-Val-Asn-Val-Gli-Cis-, yexperimentan reacciones de oxidorreducción. La selenocisteína es esencial parala actividad de la Trx-R en mamíferos, aunque la Trx humana puede ser relativa-mente reducida por la Trx-R bacteriana que no contiene selenocisteína.

Dos Trx-R humanas se han clonado en toda su longitud: la Trx-R-1 de 54.4kDa, la cual es predominantemente citosólica, y la Trx-R-2 de 56.2 kDa, con unaextensión de 33 aminoácidos en el lado N-terminal identificada como una im-portante secuencia mitocondrial.


T r p Cis

Gli Pro

Cis

S

S T rx ( o xidada)

Ascorbato ( o xidado)

T r p Cis

Gli Pro

Cis

SH

SH T rx (reducida)

Ribo n ucleótido reductasa

NADP +

NADPH+H

Ascorbato (reducido)

H 2 O

T rx-P (Se)

H 2 O 2

T r ansc r ipción

Inhibidor de apoptosis

Crecimiento celular

ANTI O XI D ANTE SÍNTESIS DE DNA TRANSCRIPCIÓN DE GENES

T rx-R (Se)

FFiigguurraa 1144--55.. Reacciones y funciones de la tiorredoxina reductasa.

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Además de las Trx, se ha reportado que también son sustratos de la Trx-R lossiguientes: ácido lipoico, hidroperóxidos lipídicos, péptido citotóxico, Lisina-NK,vitamina K3, ácido deshidroascórbico, radical ascorbilo y la proteína supresora detumores p53. No obstante, el papel fisiológico que desempeña la Trx-R en lareducción de la mayor parte de estos sustratos aún no se conoce. Algunas de lasfunciones de la Trx-R se indican en la figura 14-5.

❚ TIORREDOXINA PEROXIDASAS

Las tiorredoxina peroxidasas (Trx-P) pertenecen a una familia de proteínas con-servadas que tienen funciones antioxidantes a las que se les ha denominado pero-xirredoxinas (Prx).

Las Prx se encuentran distribuidas en organismos de todos los reinos, y formanparte de 0.1 a 0.8% del total de proteínas solubles. Existen como homodímerosy contienen un residuo de Cis conservado en la región N-terminal, que es el pri-mer sitio de oxidación por el H2O2. En su mecanismo de acción, las Prx utilizanequivalentes de reducción que son suministrados por las proteínas que contienengrupos tiol. Hasta la fecha, se han identificado seis isoformas de Prx en los mamí-feros, y se han clasificado en tres subgrupos de proteínas: 2-Cis (Prx I, II, III y IV),2-Cis atípicos (Prx V) y 1-Cis (Prx VI). En cuanto al subgrupo de 2-Cis, se conoceque la I y II se localizan en el citosol, la III en la mitocondria y la IV en el retícu-lo endoplasmático y el espacio extracelular.

La primera Prx en ser identificada fue la proteína antioxidante específica degrupos tiol (TSA, por sus siglas en inglés) en levaduras y mamíferos, la cual pro-tege la actividad de la glutamina sintetasa y la integridad del DNA. En 1994, laTrx fue reconocida como un donador de electrones para la TSA, y fue renombra-da como tiorredoxina peroxidasa, la cual pertenece al grupo 2-Cis.

❚ ACTIVIDADES BIOLÓGICAS DE LAS TRX

Actividad antioxidante

La principal actividad de la Trx es la capacidad de actuar como agente antioxi-dante debido a que puede funcionar como cofactor manteniendo diversas Trx-Pen una forma reducida. Otra propiedad de la Trx resulta de la reducción de la glu-tatión peroxidasa (GPx), la inducción de la superóxido dismutasa de manganeso(MnSOD) y de alguna manera, de la reducción directa del H2O2. La S-nitrosila-ción de la Cis69 de la Trx es una importante modificación postransduccional, locual incrementa su actividad antioxidante.


Además de eliminar al H2O2 en forma directa, la Trx-1 puede donar electro-nes a la GPx del plasma humano, donde la concentración de Trx-1 es cercana a 6 nM. Sin embargo, no hay que olvidar que el plasma contiene niveles del ordende 1 μM de glutatión reducido (GSH) y de proteínas reducidas que proveen unacapacidad amortiguadora adicional a los grupos tiol, por lo que la Trx-1 en elplasma contribuye en menor escala a la actividad antioxidante.

La forma reducida de la Trx (Trx-[SH]2) actúa sobre especies oxidantes comoel H2O2 y los peróxidos alquílicos, y durante el proceso se forman homodímeroso heterodímeros con otros miembros de la familia a través de enlaces disulfuroentre los residuos de cisteína conservados. Posteriormente, la Trx-R transforma laTrx oxidada a una forma monomérica. Se tienen registros de que células endotelia-les humanas transfectadas con Trx-1 presentan una protección contra la citotoxici-dad inducida por el H2O2 y la adhesión de monocitos ocasionada por inflamación.

Se ha pensado que la Trx-1 ejerce la mayor parte de sus propiedades antioxi-dantes en las células a través de la Trx-P. Se han encontrado Trx-P como protec-tores antioxidantes en eritrocitos de sangre humana. Asimismo, la transfección decélulas leucémicas Molt-4 con la Trx-P–2 las protege de apoptosis inducida porprivación de suero, ceramida y etopóside, e inhibe la liberación del citocromo cdesde la mitocondria durante la apoptosis.

Como se mencionó en el capítulo 13, otro mecanismo para eliminar al H2O2

de células es a través de la glutatión peroxidasa (GPx) que contiene selenociste-ína, la cual usa GSH como fuente de equivalentes reductores (figura 14-6). Porlo que se sabe, el sistema redox de GSH y la Trx no están acoplados dentro de lacélula, pero el selenio tiene diferentes efectos sobre los sistemas de la Trx y la GPx. El Se incrementa la actividad de la Trx-R, pero no de la Trx-P, mientrasque eleva la actividad de la GPx, pero no de la glutatión reductasa (GR). Así, enpresencia excesiva de peróxidos, un incremento en la disponibilidad del sele-nio puede predecir elevados niveles de Trx reducida relativa a GSH.

Factor de crecimiento

La Trx-1 actúa como un factor de crecimiento, y es producida por una variedadde células, incluyendo las células B transformadas-EBV, hibridoma de células TMP6 y células de hepatoma. La Trx-1 es secretada por linfocitos, hepatocitos,fibroblastos y una variedad de células cancerosas. Como la Trx-1 no tiene una se-cuencia guía, el mecanismo por el cual la secreción ocurre parece implicar un ca-mino independiente del realizado a través del retículo endoplasmático-Golgi. Sinembargo, aunque la Trx-1 estimula el crecimiento de linfocitos, fibroblastos nor-males y una variedad de líneas celulares tumorales, al parecer el mecanismo deestimulación es distinto al de un factor de crecimiento convencional, ya que no


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se han encontrado receptores Trx-1. Por otra parte, la Trx-1 también parece sen-sibilizar a las células hacia algunos factores de crecimiento producidos por lamisma célula. Por ejemplo, en las células de cáncer mamario MCF-7, la Trx-1evita que proliferen cuando se les administra insulina 1 y el factor de crecimien-to epidérmico, mientras que con la IL-2 la proliferación aumenta 1 000 veces ycon el factor de crecimiento de fibroblastos básicos, 100 veces.

La Trx-1 también incrementa la expresión celular de una variedad de citocinasque incluyen a las interleucinas: IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 y al factor de necrosistumoral α (TNF-α).

Cofactor

En las bacterias, la Trx actúa como cofactor de varias enzimas, ya que intervieneen la reducción de equivalentes por la ribonucleótido reductasa, enzima encarga-da de catalizar la conversión de los nucleótidos en desoxinucleótidos requeridospara la síntesis de DNA. En el caso de la ribonucleótido reductasa de los euca-riotas, se conoce poco respecto al papel de la Trx-1 en la reducción de equivalen-tes, ya que puede haber otras fuentes para ello.


T r p Cis

Gli Pro

Cis

S

S T rx ( o xidada)

GSH

H 2 O

T r p Cis

Gli Pro

Cis

SH

SH T rx (reducida)

GSSG

GPx (Se)

GR (Se)

H 2 O 2

T rx-R (Se)

T rx-P (Se)

FFiigguurraa 1144--66.. Mecanismos para remover H2O2 en las células. Se muestra el sistema de oxidorreduc-ción tanto del glutatión (GSH) como de la tiorredoxina (Trx).

Regulador de factores de transcripción

Se ha reportado que la Trx-1 es capaz de promover la unión de algunos factoresde transcripción al DNA. Entre estos factores se ha determinado al factor nuclearκB (NF-κB), el cual, como ya se ha visto a lo largo del libro, es un factor impor-tante en la respuesta celular al estrés oxidativo, a la apoptosis y a los procesos detumorigenicidad.

Otro de los factores de transcripción más estudiados es la proteína activadora 1(AP-1), que al activarse incrementa el crecimiento celular. Dicha activación se da mediante la reducción de un residuo de Cis, y aunque al parecer la Trx-1 nola reduce directamente, sino a través de otra proteína nuclear (la Ref-1), se hareportado que las células que sobreexpresan a la Trx-1 incrementan la activaciónde AP-1. Otros factores en los que se ha determinado que la Trx-1 aumenta suunión al DNA son AP-2, proteína p53, receptor de estrógeno, receptor de gluco-corticoides y el factor de transcripción PEBP2/CBF.

Proteína de enlace

La Trx-1 se enlaza a una variedad de proteínas celulares (Ref-1, ASK1, PKC α, δ,ε y ζ, NF-κB, receptores de glucocorticoides, p40 phox, lipocalina). El enlace seda con la Trx reducida, pero no con la oxidada; el mecanismo no se conoce deltodo, pero implica la formación de puentes disulfuro entre las cisteínas del sitiocatalítico de la Trx y de las otras proteínas.

Inhibición de la apoptosis

Se ha encontrado que al agregar a la Trx-1 al medio de células linfoides en cultivose previene la apoptosis inducida por L-cisteína y el consumo de GSH. Tambiénse ha reportado que la Trx-1 protege a las células de leucemia linfocítica crónicatipo B, contra la apoptosis asociada con un incremento en la secreción del factorde necrosis tumoral α (TNF-α), el cual es un factor de crecimiento autócrinopara estas células. Además, en células linfoides WEHI7.2 de ratón que sobreex-presan Trx-1 humana se inhibió la apoptosis inducida por agentes como: dexa-metasona, taurosporina, tapsigargina o etopóside. La inhibición de la apoptosisocasionada por la transfección con Trx-1 es similar a la ocasionada por la trans-fección del oncogén antiapoptótico bcl-2; sin embargo, se desconoce cómo se da el mecanismo y sólo se ha establecido que la Trx-1 interactúa con ASK1 y elNF-κB, como ya se mencionó antes.


❚ FUNCIÓN DE LA TRX EN LAS ENFERMEDADES HUMANAS

Trx y cáncer

Estudios recientes han demostrado una sobreexpresión de la Trx en algunostumores cancerosos, en comparación con los tejidos normales. Al parecer, en eta-pas tempranas del desarrollo del cáncer, la Trx ejerce una acción benéfica, ya queneutraliza el estrés oxidativo, el cual se asocia con los diferentes agentes que pro-mueven el cáncer. Sin embargo, en estados avanzados de esta enfermedad, la Trxpromueve el crecimiento celular de los tumores, anulando de esta manera y aunsobrepasando, el efecto benéfico que ejerció en un principio.

Además, dado que diversos agentes anticancerígenos actúan induciendo laapoptosis en las células neoplásicas, los efectos antiapoptóticos que ejerce la Trxreducen la efectividad de las estrategias de la quimioterapia. De hecho, actual-mente diversos agentes quimioterapéuticos tienen como blanco algunos de loscomponentes del sistema de las Trx, y se encuentran bajo estudio otros agentesanticancerígenos con actividad inhibitoria sobre las Trx.

Trx en enfermedades virales

La participación de las Trx en enfermedades de origen viral, y en particular en ladel virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), es compleja. Al igual que en eldesarrollo del cáncer, la Trx se presenta como un agente que puede ejercer tantoefectos protectores como efectos que pueden llegar a ser deletéreos.

Los individuos infectados por VIH sufren serias alteraciones en el equilibrioredox y en consecuencia, los niveles de estrés oxidativo son altos. Una de las pri-meras observaciones en relación con los niveles de la Trx en pacientes con VIHfue que disminuyen de manera rápida con una infección aguda. Una posibleexplicación de este hecho es que los virus evaden las defensas inmunes del hués-ped y escapan a la eliminación por los macrófagos, ocasionando una pérdidamasiva de sulfuro, lo cual altera la síntesis de las proteínas que contienen cisteí-na. Precisamente, tal es el caso de la Trx y de la Trx-R; sin embargo, y de maneracontrastante, en estados avanzados de la infección por VIH, la concentración dela Trx en el plasma se incrementa, ya que el virus induce la expresión de la Trx.Se ha reportado que cerca de 25% de los pacientes con VIH presentan nivelesincrementados de Trx-1, en comparación con los encontrados en el plasma de lospacientes control. Las concentraciones elevadas de la Trx podrían inhibir la repli-cación viral, en parte por cambios en el estado redox y en los enlaces bisulfito deCD4, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas que además es unreceptor primario para VIH-1. Sin embargo, las altas concentraciones de la Trx en©

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pacientes inmunocomprometidos pueden resultar perjudiciales, dado que impi-den la función de los neutrófilos, disminuyendo la resistencia a la infección.

Trx en enfermedades cardiacas

Existen diferentes estudios respecto a la función de la Trx en diversas patologíascardiacas, como: miocarditis, hipertrofia cardiaca e infarto de miocardio; sin em-bargo, no existe un consenso sobre el papel de la Trx en estas patologías, ya quesu función puede variar. Así, la dicotomía o el efecto dual de la Trx se ponen demanifiesto en el caso de la hipertrofia cardiaca. La actividad antioxidante de laTrx protege al corazón contra el estrés oxidativo. Sin embargo, la Trx también es un mediador esencial en el crecimiento de los cardiomiocitos, contribuyendode esta manera a la hipertrofia del corazón.

Kishimoto et al. (2001), reportaron que las concentraciones de la Trx en elsuero se encuentran incrementados en los pacientes con síndromes coronariosagudos, y esto correlaciona de manera positiva con la severidad de la enfermedad,según la clasificación de la asociación para enfermedades cardiacas: New YorkHeart Association. Estos resultados sugieren una posible asociación entre lasecreción de la Trx y la severidad del daño en el corazón.

Trx y envejecimiento

El estrés oxidativo se encuentra ligado al proceso del envejecimiento; en conse-cuencia, los efectos antioxidantes de las Trx, junto con los efectos antiapoptóti-cos, así como la acción de las Trx en la promoción del crecimiento, parecen ejercerprotección contra los cambios celulares relacionados con la edad. Stadman et al.(2003), reportaron que la Trx es responsable de la reducción de la metionil sul-fóxido reductasa, enzima que tiene un papel clave en el mantenimiento de lametionina, la cual es activa en su forma reducida. La pérdida de este procesonatural de reducción está asociada con el desarrollo de enfermedades neurológi-cas como la de Alzheimer.

Trx y sistema nervioso

Se ha reportado que la Trx ejerce un efecto citoprotector en el sistema nerviosopor un incremento en la acción del factor de crecimiento neuronal (NGF) media-do por la regulación anti-apoptótica, así como por la actividad antioxidante. ElNGF tiene profundos efectos en las neuronas, incluyendo la promoción de la vía


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de señalización de supervivencia y diferenciación. La Trx parece ser un cofactorneurotrófico que incrementa el efecto del NGF en la regeneración y en la dife-renciación neuronal.

Los individuos con enfermedad de Alzheimer presentan una disminución enlas concentraciones de Trx-1, particularmente en la amígdala y en el hipocampo,y al mismo tiempo, la Trx reductasa se incrementa. Se ha sugerido que estos cam-bios pueden contribuir al aumento del estrés oxidativo y en consecuencia, a laneurodegeneración observada en esta enfermedad.

❚ CONCLUSIONES

Aun cuando la familia de las Trx posee un papel importante dentro del sistemade defensa antioxidante de las células, todavía queda mucho por estudiar sobreeste tipo de enzimas. En cuanto a su función en las patologías humanas, existeuna gran cantidad de estudios que relacionan a la Trx con diversas enfermedades;no obstante, al parecer su papel es dual. La presencia de la Trx en etapas inicia-les del desarrollo de la enfermedad tiene efectos benéficos, mientras que en etapasmás avanzadas puede incrementar su concentración con consecuencias perju-diciales.

❚ REFERENCIAS

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HHEEMMOOOOXXIIGGEENNAASSAA

Marisol Orozco-IbarraJosé Pedraza-Chaverrí

❚ INTRODUCCIÓN

La hemooxigenasa (HO, EC 1.14.99.3) es la enzima que cataliza el paso quelimita la velocidad de degradación del grupo hemo, donde se produce monóxidode carbono (CO), hierro y biliverdina. En un siguiente paso, la biliverdina reduc-tasa convierte la biliverdina a bilirrubina (figura 15-1). En los mamíferos se hadescrito la expresión de al menos dos isoformas de la HO codificadas por dosdiferentes genes, denominadas HO-1 y HO-2. En el cuadro 15-1 se mencionanalgunas características de estas enzimas. Además, se había descrito una terceraisoforma, la HO-3, pero recientemente se ha demostrado en la rata que esta iso-forma en realidad no existe; pues no se encontraron ni genes funcionales, nimRNA, ni la proteína HO-3.

La HO-2 es constitutiva, y la HO-1 es una isoforma inducible; su similitud enla secuencia de aminoácidos es de 45%. Estas isoformas se regulan y se expresan en tejidos de manera diferencial. La isoforma HO-2 se expresa en el cerebro, tes-tículos, endotelio, hígado y la porción distal de la nefrona. Se piensa que esta iso-forma funciona como un regulador fisiológico de las funciones celulares. Encambio, bajo condiciones fisiológicas, en la mayor parte de las células no se detec-

15

ta la expresión de HO-1 o se detecta en niveles muy bajos. La expresión de laHO-1 ocurre como respuesta a una gran variedad de estímulos, entre los que seencuentran el grupo hemo, radiación UV, hipoxia, hiperoxia, hipertermia, isque-mia, H2O2 y la eliminación del GSH, entre otros (cuadro 15-2). La hemina(grupo hemo que contiene Fe3+) es un inductor potente de HO-1 que se ha uti-lizado mucho en diversos estudios. Además, existen compuestos que inhiben laactividad de la HO (cuadro 15-3). Se ha comprobado que el gen de la HO-1posee sitios de unión a factores de transcripción que se activan como respuestaal estrés oxidativo, como AP-1, AP-2, NF-kB y Nrf2. También se ha encontradoque la actividad del promotor de HO-1 se modula a través de la variabilidad enla longitud de nucleótidos de guanina y timina repetidos (GT)n. Los repetidoscortos de (GT)n presentan mayor susceptibilidad a la inducción de HO-1 quelos repetidos largos.

Como además se han encontrado evidencias acerca del efecto citoprotector deHO-1 en varios modelos in vitro e in vivo asociados con el estrés oxidativo, ladetección de HO-1 se ha usado como evidencia de estrés oxidativo, y se ha suge-rido que la HO-1 juega un papel citoprotector en la modulación de la respuestade los tejidos al daño en varios estados fisiopatológicos.

❚ IMPORTANCIA DEL GRUPO HEMO

El grupo hemo es un complejo de Fe2+ con protoporfirina IX, esencial para lafunción de las células aerobias. Sirve como grupo prostético de numerosas hemo-proteínas con funciones biológicas diversas. Por ejemplo, la hemoglobina y la


CCuuaaddrroo 1155--11.. CCaarraacctteerrííssttiiccaass ddee llaass iissooffoorrmmaass ddee llaa HHOO

CCaarraacctteerrííssttiiccaa HHOO--11 HHOO--22

PM (kDa) 32 36Km1 0.24 μM 0.67 μM

Vmax1 3.4 μmol/mg/h 0.24 μmol/mg/hExpresión Inducible ConstitutivaIntrones 4 4Exones 5 5

Sitios regulatorios2 NFkB, Nrf2, AP-1, AP-4, GlucocorticoidesC/EBP, USF, MRE, HSE

1 Datos obtenidos usando como sustrato el grupo hemo.2 C/EBP, proteínas de unión al intensificador CCAAT; USF, factor de estimulación en el extremo 5’; MRE, ele-mento de respuesta a metales; HSE, elemento de respuesta a choque térmico.

mioglobina (transporte de oxígeno), citocromos (transferencia de electrones),oxidasas, peroxidasas y catalasas (metabolismo del oxígeno), óxido nítrico sinta-sa, guanilato ciclasa y la NADPH oxidasa. En las células dañadas, la producciónde especies reactivas de oxígeno podría tener como consecuencia la desestabili-zación de hemoproteínas, lo que a su vez podría conducir a la liberación delgrupo hemo.

Cuando se encuentra libre en altas concentraciones, el grupo hemo es un pro-oxidante lipofílico que promueve la lipoperoxidación de las membranas lipídicasy organelos como la mitocondria y el núcleo, también desestabiliza el citoesque-leto y las proteínas asociadas a la membrana, con lo que compromete la estruc-tura y el transporte. Además, interfiere con la actividad de las enzimas citosólicasy mitocondriales, y activa las enzimas proteolíticas. En experimentos in vitro seha demostrado que el grupo hemo es capaz de oxidar al DNA. Por otra parte, hayobservaciones clínicas que prueban su marcada nefrotoxicidad cuando se admi-nistra en dosis elevadas a pacientes con la enfermedad de las porfirias. En las célu-©

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Hemooxigenasa • 235

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N N

N

COOH HOOC

F e 2+

O 2

CO F e 2+ H 2 O ,

HOOC

NH

N NH

NH

COOH

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HOOC

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COOH

NH NH

NH

H H

, NADPH + H

NADP +

NADPH + H

NADP +

G r upo hemo

Bili v erdina

Bilir r ubina

Biliverdina

Reductasa Hemooxigenasa

FFiigguurraa 1155--11.. Reacción que catalizan la hemooxigenasa y la biliverdina reductasa.

las dañadas, la inducción de la HO-1 acelera la degradación del grupo hemo libe-rado de las hemoproteínas, protegiendo así contra la citotoxicidad oxidativasecundaria a dicho grupo.

❚ IMPORTANCIA FISIOLÓGICA DE LA HO-1

Además de su papel clave en el catabolismo del grupo hemo, se ha sugerido quela HO-1 desempeña una función muy importante en la protección contra elestrés oxidativo debido a que la HO-1 responde de inmediato ante una granvariedad de estímulos oxidativos. Asimismo, se ha observado en varios modelos,tanto in vitro como in vivo, que la expresión de esta enzima disminuye el dañocelular. Por ejemplo, se ha demostrado que la sobreexpresión de HO-1 atenúa losefectos tóxicos del grupo hemo en células endoteliales, y que protege al riñón dela nefrotoxicidad por dicromato de potasio.

La importancia fisiológica de la HO-1 se demostró de manera contundentepor medio de estudios en un paciente con deficiencia congénita de HO-1, y delos estudios con ratones transgénicos deficientes en HO-1.

En 1999 se informó de un caso de deficiencia de HO-1 en un niño japonés de26 meses de edad que sufría de fiebre recurrente y retraso severo en el crecimien-to. Este niño presentaba un nivel bajo de bilirrubina (cerca de 0.3 mg/dL, normal0.2 a 1.3), asociado con anemia hemolítica persistente y concentraciones extre-madamente altas de grupo hemo en plasma (490 µM, cuando por lo general no


CCuuaaddrroo 1155--22.. AAllgguunnooss eessttíímmuullooss qquuee iinndduucceenn llaa eexxpprreessiióónn ddee llaa HHOO--11

QQuuíímmiiccooss GGeenneerraalleess

Metaloporfirinas (CoPP1, hemina) HipoxiaMetales pesados (Co, Pb, Cd) HiperoxiaProstaglandinas Hipertermia(NEPP112, 15d-PGJ(2)3)Flavonoides Isquemia(quercetina, curcumina, ácido cafeico)Lipopolisacárido bacteriano Depleción de GSH4

H2O2 Radiación UVSnCl2NO• y ONOO–

1 Protoporfirina de cobalto.2 Prostaglandina promotora del desarrollo neurítico-11.3 Prostaglandina (J)2 15-desoxi-δ (12,14).4 GSH: Glutatión.

se detecta o es <1 µM), lo que sugería un defecto en el catabolismo del grupohemo. La secuencia de nucleótidos del gen de HO-1 del paciente reveló la dele-ción del exón 2 en el alelo materno y la deleción de dos bases dentro del exón 3en el alelo paterno. La combinación de estas dos mutaciones resultó en la impo-sibilidad de sintetizar HO-1 funcional. Otras consecuencias de la falta de estaenzima fueron hiperlipidemia, altos niveles de haptoglobina, niveles indetecta-bles de hemopexina, depósitos de hierro en el tejido renal y hepático, proteinu-ria y hematuria persistentes debido al daño tubular renal, hepatomegalia,asplenia y producción excesiva de glóbulos blancos y plaquetas. La mayor partede estos síntomas fueron similares a los observados en ratones deficientes en HO-1.

Los ratones deficientes en HO-1 desarrollan hepatomegalia, anemia, deposi-ción de hierro, mayor lipoperoxidación y mayor concentración de proteínas oxi-dadas en hígado y riñón que los ratones normales.

Se ha propuesto que los depósitos de hierro contribuyen al daño oxidativomediante la producción de especies reactivas de oxígeno mediante la reacción deFenton, lo que ocasiona inflamación crónica y daño al tejido. Además, estos ratonesdeficientes en HO-1 son más sensibles al daño por isquemia y endotoxinas que losratones silvestres. En contraste con los ratones deficientes en HO-1, los ratonesdeficientes en HO-2 presentan menos alteraciones, aunque se caracterizan pormayor susceptibilidad al daño pulmonar inducido por hiperoxia. En conjunto, estosdatos apoyan que la HO-1 tiene una función esencial en la defensa del individuocontra el estrés oxidativo y en el metabolismo del hierro. Así, se apoya que la HO-1 constituye un mecanismo protector de las células contra el estrés oxidativo.

❚ EFECTOS CITOPROTECTORES DE LOS PRODUCTOSDE LA REACCIÓN DE HO-1

En el pasado, los productos de degradación del grupo hemo se considerabanmetabolitos tóxicos debido a que sólo se conocían los efectos adversos del Fe2+ yel CO, y se sabía que la biliverdina era convertida en bilirrubina para después ser©

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CCuuaaddrroo 1155--33.. CCoommppuueessttooss qquuee iinnhhiibbeenn llaa aaccttiivviiddaadd ddee llaa HHOO

Mesoporfirina de estaño (SnMP)Protoporfirina de estaño (SnPP)Protoporfirina de cinc (ZnPP)Mesoporfirina de cinc (ZnMP)Mesoporfirina de cromo (CrMP)

excretada. Sin embargo, se ha comprobado que dichos compuestos también ejer-cen efectos biológicos como antioxidantes, antiinflamatorios y antiapoptóticos.En el cuadro 15-4 se resumen los efectos biológicos de los productos de la acti-vidad de HO-1.

Fe2+

La inducción de la HO-1 tiene como resultado el aumento en la cantidad de Fe2+,al ser liberado del grupo hemo, este metal cataliza la producción de especies reac-tivas de oxígeno. Sin embargo, en varios casos se ha demostrado que la inducciónde HO-1 se acompaña de un aumento en la expresión de la ferritina, una proteí-na intracelular de alto peso molecular que almacena el exceso de hierro celular.También se ha observado que al inhibir la expresión de la HO-1 se disminuye laexpresión de ferritina. Esto es, la inducción de la HO-1 se encuentra acompaña-da de un mecanismo que impide que el Fe2+ participe en la generación de espe-


CCuuaaddrroo 1155--44.. EEffeeccttooss bbiioollóóggiiccooss ddee llooss pprroodduuccttooss ddee llaa HHOO

BBeennééffiiccooss PPeerrjjuuddiicciiaalleess

CO Actúa como vasodilatador Se une a hemoglobina, con loInhibe genes proinflamatorios que impide la oxigenación deAumenta la producción de los tejidoscitocinas antiinflamatoriasInhibe la agregación plaquetaria Inhibe a la citocromo oxidasa,Actúa como antiapoptótico con lo que impide el trans-Actúa como neuromodulador porte de electrones

Fe2+ Incrementa la biosíntesis de Cataliza la producción deferritina •OHIncrementa la actividad de la ATPasa que transporta el Fe al exterior celular

Biliverdina Es una molécula antioxidante, —que actúa sobre LOO•, 1O2,

Bilirrubina ROO•, •OH, HOCl, NO•, Puede producir ictericia,ONOO– y radical α-tocoferoxilo. hiperbilirrubinemia y kernic-

terus

* LOO•, radical lipoperoxilo; 1O2, oxígeno singulete; ROO•, radical peroxilo; •OH, radical hidroxilo; NO•,óxido nítrico; ONOO–, peroxinitrito.

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cies reactivas de oxígeno. Se ha calculado que cada molécula de ferritina de 450kDa puede almacenar alrededor de 4 500 átomos de hierro.

Además, se ha comprobado que la sobreexpresión de HO-1 acelera el flujo dehierro, promoviendo mayor actividad de la ATPasa, que disminuye el nivel intra-celular de hierro. Lo anterior es consistente con la deposición de hierro en rato-nes deficientes en HO-1, y con la disminución en el flujo de hierro que se dacuando se inhibe la actividad de la HO-1.

No se tiene claro qué tanto el incremento de ferritina y de la actividad de laATPasa de hierro contribuyen al efecto citoprotector global de la HO-1, pero seha sugerido que ambos mecanismos afectan en forma crucial el efecto antioxi-dante global que se da como resultado del incremento de la expresión de la HO-1.

CO

Recientemente, el CO ha atraído la atención, ya que se ha demostrado que setrata de un neuromodulador con efectos similares a los del óxido nítrico, quetambién posee funciones antiapoptóticas, antiinflamatorias y vasodilatadoras. Seha demostrado que el CO modula la regulación del tono de los vasos in vitro yla presión sanguínea in vivo. Algunos autores han llamado a la HO-1, CCOO ssiinnttaa--ssaa para establecer una analogía con la óxido nítrico sintasa. También se ha obser-vado que en bajas concentraciones (10 a 250 ppm), el CO puede inhibir lainflamación y la apoptosis tanto in vivo como in vitro. Por otra parte, el CO pre-viene la activación y agregación plaquetaria, por lo que suprime la trombosis y larespuesta proinflamatoria estimulada por las plaquetas activadas. Además, modu-la en forma negativa la expresión del inhibidor del activador de plasminógeno detipo 1 (PAI-1) en monocitos y macrófagos, lo cual parece ser crucial en la capaci-dad del CO para ejercer un efecto protector en un modelo de isquemia-reperfu-sión en el pulmón. Adicionalmente, el CO previene la apoptosis en varios tiposcelulares, incluyendo células endoteliales, fibroblastos, hepatocitos y células β delpáncreas. Este gas también suprime la respuesta proliferativa de las células delmúsculo liso que contribuyen a la proliferación de la neoíntima asociada conlesiones inflamatorias in vivo.

Se sabe que la unión del CO a la guanilato ciclasa soluble (sGC) activa a estaenzima, estimulando la producción de monofosfato de guanosina-3,5-cíclico(cGMP). Se ha encontrado que esta vía sGC/cGMP actúa mediando los efectosdel CO en numerosos modelos, incluyendo trasplante de órganos, inflamaciónpulmonar, hepatitis, daño por isquemia y reperfusión y daño vascular. Por tanto,se ha sugerido que el efecto citoprotector que confiere la HO-1 se debe, en parte,a la producción de CO.


Biliverdina y bilirrubina

La bilirrubina es un pigmento amarillo lipofílico que parece ser uno de los antio-xidantes endógenos más abundantes en los mamíferos, y es el compuesto conmayor actividad antioxidante en el suero humano.Al igual que la biliverdina, estecompuesto posee una potente actividad atrapadora de varias especies reactivas deoxígeno, incluyendo al superóxido, al radical peroxilo y al peroxinitrito. Cuandola concentración de la bilirrubina en los tejidos es baja (20 a 50 nM), la bilirru-bina entra en un ciclo de amplificación en donde es oxidada a biliverdina, yentonces es reciclada por la enzima biliverdina reductasa nuevamente a bilirru-bina, con lo que la concentración efectiva de bilirrubina se mantiene. Como con-secuencia, la biliverdina reductasa protege contra concentraciones de casi 10 000veces de H2O2. Este ciclo explica el potencial antioxidante de la bilirrubina másallá de la estequiometría 1:1, y su importancia fisiológica al atrapar las especiesreactivas de oxígeno. Por tanto, es razonable pensar que la capacidad antioxidan-te de la bilirrubina pueda ejercer el efecto antiapoptótico de la HO-1 al atraparlas especies reactivas de oxígeno.

❚ EFECTOS NOCIVOS DE LOS PRODUCTOS DE LA REACCIÓN DE HO-1

A pesar de los efectos favorables de los productos de la HO-1 mencionados antes,la actividad de esta enzima no siempre es cciittoopprrootteeccttoorraa,, se ha observado que tieneun papel dual, ya que cada uno de los productos puede ser potencialmente dañino.

Fe2+

El hierro libre en estado ferroso puede ocasionar estrés oxidativo, ya que facilitala descomposición de los peróxidos lipídicos a radicales alcoxilo y peroxilo, ycataliza la formación del radical hidroxilo (•OH) a partir de peróxido de hidró-geno (H2O2) en la reacción de Fenton. Además, este metal está implicado en laformación de radical superóxido y H2O2 debido a su actividad potenciadora dereacciones de oxidación no enzimática de varias moléculas como el glutatión.

CO

Durante mucho tiempo, el CO se ha considerado como un gas tóxico y peligroso.Este gas se une al hierro en su estado reducido (Fe2+), por lo que interfiere con lafunción de las hemoproteínas. Por ejemplo, al unirse a la hemoglobina (con 200


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veces más afinidad que el oxígeno), forma carboxihemoglobina, y con ello dismi-nuye el transporte de oxígeno a los tejidos. Además, al unirse a citocromos dificul-ta la transferencia de electrones, lo que explica su capacidad de inhibir el transportede electrones en la mitocondria. El CO también se puede unir a las proteínas quecontienen otros metales de transición en su sitio activo, como el cobre. También seha demostrado que altas concentraciones de CO incrementan la producción intra-celular del H2O2 en el cerebro, evento que se acompaña por el incremento en laproducción del •OH y disminución de la relación GSH/ GSSG en la mitocondria.

Bilirrubina

La bilirrubina en altas concentraciones (>3 mg/dL en suero humano) es un com-puesto potencialmente tóxico, y cuando se acumula en el suero de neonatoscausa ictericia. Si la concentración de bilirrubina es demasiado alta, atraviesa labarrera hematoencefálica y puede causar daño neuronal asociado con kernicte-rus. El tratamiento más común para la hiperbilirrubinemia es la fototerapia(exposición a luz azul); sin embargo, recientemente se han utilizado inhibidorescompetitivos de la actividad de HO-1, como la SnMP.

Tomando en cuenta este comportamiento dual de los productos de la reacciónde la HO-1, se ha sugerido que un nivel apropiado de inducción de HO-1 es bené-fico, mientras que una inducción excesiva de HO-1 puede causar daño a tejidos.

❚ ENFERMEDADES ASOCIADAS CON HO-1

La expresión de HO-1 se ha implicado en varios estados patológicos, como ate-rosclerosis, hipertensión, rechazo al trasplante, daño renal agudo, daño pulmonaragudo inducido por hiperoxia o hipoxia y cáncer, entre otros. En el cuadro 15-5se describen algunos de los modelos experimentales donde se ha demostrado quela HO-1 ejerce un papel protector. Además, debe destacarse que la expresión deHO-1 modula varios procesos biológicos muy importantes, como la isquemia yreperfusión, inflamación, disfunción inmune y trasplante de órganos. Por tanto,en la actualidad, el estudio de la función de la HO-1 y sus productos es un áreade investigación muy activa.

Isquemia y reperfusión

La isquemia y reperfusión ocurren cuando se interrumpe la oxigenación de lostejidos (isquemia), y se restablece después de un periodo (reperfusión). Este pro-


ceso conduce a daño celular, que se ha involucrado con la formación de especiesreactivas de oxígeno.

La HO-1 ha mostrado tener una función protectora en el daño por isquemiay reperfusión en el corazón, riñón, hígado, cerebro y pulmón. El efecto citopro-tector de la HO-1 se ha reproducido mediante la administración de CO y bili-rrubina, por lo que se ha sugerido que la citoprotección que se ha observado porla sobreexpresión de HO-1 se debe a diversos factores, entre los que se incluyenfunción antioxidante, mantenimiento de la microcirculación, función antiapop-tótica y antiinflamatoria.

Inflamación

La inflamación es un sistema de defensa que el organismo utiliza principalmen-te para protegerse de invasores patógenos, eliminar las células dañadas y prevenirlos daños posteriores. Se ha demostrado que la HO-1 juega un papel importanteen la respuesta inflamatoria.

En algunos modelos de inflamación, la inhibición de HO-1 aumenta signifi-cativamente el infiltrado inflamatorio, mientras que por el contrario, la inducciónprevia de HO-1 reduce de manera notable la inflamación. Por tanto, se ha su-


CCuuaaddrroo 1155--55.. MMooddeellooss aassoocciiaaddooss ccoonn eell eessttrrééss ooxxiiddaattiivvoo ddoonnddee llaa ssoobbrreeeexxpprreessiióónn ddee HHOO--11 hhaa mmoossttrraaddoo eeffeeccttoo pprrootteeccttoorr

MMooddeelloo EEffeeccttoo ddee llaa HHOO--11

Nefrotoxicidad por K2Cr2O7 (ratas) Previene parcialmente la proteinuria y la nitración de proteínas. Previene el aumento de BUN y creatinina

Nefrotoxicidad por ciclosporina (ratas) Previene la fibrosis túbulo-intersticialI/R en hígado (ratas) Previene el aumento de AST en suero y la

expresión de la caspasa-3, aumenta la expre-sión de Bcl-2

Toxicidad por etanol (hepatocitos) Previene la muerte celular, el incremento de MDA y la disminución de GSH

Toxicidad por β-amiloide y H2O2 Previene la muerte celular(células SN56)Toxicidad por glutamato y H2O2 Previene la muerte celular y disminuye la (NGC) formación de ERO

Abreviaturas. I/R, isquemia-reperfusión; NGC, neuronas granulares del cerebelo; AST, aspartato aminotransfe-rasa; MDA, malondialdehído; GSH, glutatión reducido; ERO, especies reactivas de oxígeno.

gerido que la actividad de HO-1 modula la respuesta inflamatoria. Así, se ha demostrado que la inducción de HO-1 reduce la inflamación del intestino y disminuye el daño de la mucosa en un modelo animal de isquemia del intesti-no delgado.

La importancia de la HO-1 en la inflamación se apoya por el fenotipo proin-flamatorio que presentan los animales deficientes en HO-1. Por otra parte, variosmediadores proinflamatorios se activan por la deficiencia o la sobreexpresión deHO-1, y se ha demostrado que algunos de estos mediadores confieren proteccióna través de sobreexpresión de HO-1. Por ejemplo, la interleucina 10 (IL-10) enun modelo murino de sepsis y la IL-13 en aloinjertos cardiacos.

Sin embargo, algunos mediadores proinflamatorios como el factor de necrosistumoral α (TNF-α), IL-1, lipopolisacáridos (LPS) y los lípidos oxidados, tambiéninducen la expresión de HO-1 en las células endoteliales y en macrófagos. Ade-más, varias moléculas de adhesión que son mediadores clave de la inflamación,como ICAM-1, VCAM-1 y selectina, también son activadas por inductores de laHO-1. Por último, se ha demostrado que la inducción de HO-1 inhibe la adhe-sión de leucocitos en las células endoteliales vasculares a través de la acción desus metabolitos bilirrubina y CO.

Trasplante

El trasplante es un procedimiento quirúrgico para extirpar un órgano lesionadoo enfermo y reemplazarlo por el órgano sano de un donante. Se llama alotras-plante cuando el órgano procede de un individuo de la misma especie, mientrasque el xenotrasplante consiste en trasplantar un órgano de un donante animal aun receptor humano. El área de trasplantes es una de las áreas que ha generadomás interés en la investigación de HO-1.

La HO-1 se induce en varios modelos de rechazo agudo al trasplante, y se halocalizado predominantemente en células infiltradas. Tal inducción es relevanteen el aspecto funcional, ya que la ausencia de HO-1 conduce a un rechazo ace-lerado del injerto en el alotrasplante y el xenotrasplante. La inducción de HO-1también atenúa el daño por isquemia y reperfusión que afecta la calidad del órga-no donado y el trasplante subsiguiente. Por ejemplo, la inducción de HO-1 conprotoporfirina de cobalto (CoPP) o por la transferencia génica adenoviral deHO-1, ha atenuado el daño por isquemia y reperfusión y prolongado la supervi-vencia después de la isquemia y trasplante de hígado. En un estudio más recien-te se encontró que la sobreexpresión de HO-1 por la administración de CoPPatenuó significativamente el rechazo crónico de los aloinjertos renales.

La exposición del donador y del injerto a CO confiere un efecto protectorhacia el daño por isquemia y reperfusión asociado con el trasplante de corazón.©

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Además, el CO (250 ppm) mejora la función de injertos renales y tiene un efec-to protector contra el daño inducido por isquemia y reperfusión renal. Tambiénse ha demostrado que un péptido derivado de las cadenas pesadas de los antíge-nos de leucocitos humanos clase I (HLA), denominado RDP1258, posee funcio-nes inmunorregulatorias mediante la modulación de la actividad de HO-1. Estosdesarrollos recientes proporcionan nuevos enfoques terapéuticos en el éxitogeneral del trasplante de órganos y la prolongación de la supervivencia del injer-to. Así, la modulación de la HO-1 podría servir como un nuevo tratamiento enel trasplante.

Aterosclerosis

La aterosclerosis se clasifica como una enfermedad inflamatoria que se ha asocia-do con depósitos de ácidos grasos, colesterol y calcio, entre otras sustancias, sobrelas paredes arteriales. Como resultado, se produce el engrosamiento, endureci-miento y por último, la obstrucción de las arterias. La expresión de HO-1 en la ate-rosclerosis parece ser una respuesta protectora. Esta aseveración es apoyada porlos siguientes hallazgos: en primer lugar, se ha encontrado un aumento de la pro-teína y del mRNA de HO-1 en las placas ateroscleróticas de humanos, lo cual esuna evidencia in vivo de que la expresión de la HO-1 está implicada en la ate-rosclerosis. Un aumento en la expresión de HO-1 también está presente en laslesiones avanzadas en modelos animales de aterosclerosis. En segundo lugar, lasobreexpresión de HO-1 en la vasculatura de ratones deficientes en apolipopro-teína E (apoE) atenúa el desarrollo de la aterosclerosis. En tercer lugar, la inhibi-ción de la actividad enzimática de HO-1 en los conejos hiperlipidémicosWatanabe conduce a una aterosclerosis acelerada. En cuarto lugar, los ratonesdeficientes de HO-1 y de apoE desarrollan más aterosclerosis que los ratones detipo silvestre. Por último, las lipoproteínas aterogénicas que han sido implicadasen la patogénesis de la aterosclerosis, como las lipoproteínas de baja densidad(LDL) oxidadas, son potentes inductores de HO-1 en las células vasculares y enlas células epiteliales renales. Aún más importante es que las LDL oxidadas, quemedian la inducción de HO-1, también inhiben la quimiotaxis, un evento infla-matorio clave de la aterosclerosis. Se ha encontrado que el estímulo más impor-tante de la inducción de HO-1 en la placa aterosclerótica lo constituyen las LDLoxidadas. Más específicamente, el hidroperóxido de linoleilo, que forma parte dedichas LDL, es el que estimula la HO-1 por un mecanismo transcripcional. Sesabe que las LDL oxidadas causan la acumulación nuclear del factor de transcrip-ción Nrf2 (factor 2 relacionado con el factor nuclear de transcripción eritroidep45 NF-E2), el cual, a su vez, activa la HO-1. Esto se debe a que la unión del fac-tor Nrf2 a la secuencia promotora de elementos de respuesta antioxidante con-


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duce a una sobrerregulación coordinada de genes antioxidantes y destoxificantescontrolados por la respuesta antioxidante, entre los que se encuentra la HO-1.

Reestenosis vascular y otras enfermedades cardiacas

Se llama reestenosis al proceso en el que se cierra una arteria que ha sido abier-ta antes por un procedimiento como la angioplastia. Varias evidencias sugierenque la sobrerregulación de la HO-1 puede ser un factor protector importantedespués de la angioplastia de globo en las enfermedades cardiovasculares comola reestenosis vascular. Por ejemplo, se ha demostrado que la preinducción deHO-1 atenúa la proliferación de neoíntima vascular después de la angioplastia deglobo, mientras que la inhibición de la actividad enzimática de HO empeora lalesión. Por otro lado, los ratones transgénicos deficientes en HO-1 manifiestanuna proliferación de neoíntima vascular muy exagerada después del daño indu-cido por un tubo. Además, se ha sugerido que los efectos antiproliferativos de larapamicina en las células de músculo liso vascular son mediados a través de la in-ducción de HO-1. Por tanto, como las endoprótesis cubiertas de rapamicina pre-vienen la reestenosis después de la angioplastia, se ha sugerido que la HO-1 juegaun papel fundamental en el efecto benéfico de la rapamicina en el daño vascular.

Los estudios que se han enfocado sobre las regiones de repetición polimórfica(GT)n en el promotor proximal de HO-1 de humanos han producido resultadosinteresantes en la reestenosis vascular. En un estudio de la asociación de la longi-tud del polimorfismo del promotor del HO-1 de humanos y la reestenosis vascu-lar periférica, se demostró una disminución de la inflamación después de laangioplastia de globo en pacientes con repetidas cortas de (GT)n, en comparacióncon pacientes con repetidas largas. Estos hallazgos fueron confirmados en la rees-tenosis de la arteria coronaria, donde los portadores de repetidas largas de (GT)ntuvieron un riesgo de casi cuatro veces mayor de reestenosis comparado con losportadores de repetidas cortas. También se observó una asociación significativaentre el polimorfismo de (GT)n de HO-1 y el aneurisma aórtico abdominal. Sinembargo, no se ha encontrado asociación entre el polimorfismo de las repetidas de(GT)n de HO-1 y la enfermedad de Kawasaki o la vasculitis en niños japoneses.

Enfermedades renales

Las enfermedades renales son todos aquellos trastornos que afectan el funciona-miento de los riñones. Los estudios utilizando inductores e inhibidores químicos,así como ratones transgénicos deficientes en HO-1, han demostrado que laexpresión de esta enzima es citoprotectora en modelos de daño renal asociados o


no con la liberación de grupo hemo. Por ejemplo, en un estudio se encontró queel daño por isquemia y reperfusión en riñón se acompañó de la inducción signi-ficativa del mRNA y del aumento de la actividad de HO-1, lo cual se relacionócon un aumento en la concentración del grupo hemo en el retículo endoplasmá-tico. La inhibición de HO con SnMP exacerbó el daño renal y aumentó la con-centración del grupo hemo. Por el contrario, el pretratamiento con SnCl2 previnoambos efectos. También se ha observado que el mRNA de HO-1 se induce en elriñón después de la administración del agente antineoplásico conocido como cis-platino, fármaco cuyo efecto colateral es la nefrotoxicidad. Se ha demostrado quela inhibición de la HO-1 agrava el daño renal inducido por cisplatino, mientrasque su inducción disminuye claramente dicho daño.

Daño pulmonar

La hipoxia se refiere a la falta de suministro de oxígeno, mientras que la hipero-xia es el estado que presenta un organismo sometido a un régimen respiratoriocon exceso de oxígeno. Se ha encontrado que la inducción de HO-1 protege deldaño pulmonar secundario a la hiperoxia y a la hipoxia. Parece ser que la gene-ración de CO es el mecanismo involucrado en estos modelos, ya que la adminis-tración exógena de CO también protege contra el daño pulmonar. Además, en eldaño por isquemia y reperfusión pulmonar de ratón, así como en cultivos pri-marios de células endoteliales de arteria pulmonar de rata, la sobreexpresión de HO-1 atenúa la apoptosis.

Hipertensión

La hipertensión se refiere al hecho de que la sangre viaje por las arterias a unapresión mayor que la normal. En ratas Dahl sensibles a sal, la expresión arterialcoronaria de HO-1 condujo a vasodilatación coronaria y cardioprotección. Usan-do un inhibidor de HO-1, el cual previene la producción endógena de CO, sedemostró que la hipertensión inducida por acetato de desoxicorticosterona(DOCA) y sal está asociada con el aumento en la generación endógena de CO,el cual puede tener una función en la disfunción endotelial. La sobreexpresión deHO-1 conduce a una reducción en la respuesta presora a angiotensina II. Quizáesto se debe al aumento en la generación de uno de los metabolitos de HO-1,posiblemente el CO, el cual tiene la habilidad de inhibir la reactividad vascular alos estímulos constrictores. Varios estudios han documentado la inducción renal,cardiaca y vascular de HO-1 en la respuesta a angiotensina II tanto in vivo comoin vitro. También se ha demostrado que el CO derivado de la actividad de HO-1


juega un papel en la supresión de la respuesta hipertensiva aguda in vivo, y quela hipertensión renovascular y la insuficiencia renal aguda se exacerban en ratonesdeficientes en HO-1, sugiriendo un papel protector de HO-1 en la hipertensión.

Preeclampsia

La preeclampsia es una alteración hipertensiva que se presenta durante el emba-razo; se caracteriza por el aumento en la presión arterial, hinchazón en la cara,manos, pies y proteinuria. El desarrollo de esta condición se ha asociado, entreotros factores, con el estrés oxidativo endotelial y la expresión de HO-1. Porejemplo, se ha encontrado que las concentraciones de HO-1 son significativa-mente menores en la placenta de mujeres con preeclampsia, en comparación conla placenta de mujeres sanas en el mismo tiempo de gestación. Además, la induc-ción de HO-1 con TNF-α atenuó de manera significativa el daño celular y la res-puesta inflamatoria en explantes vellosos de placenta. También se ha encontradoque la regulación de HO-1 puede modular la expresión de moléculas de adhe-sión, ya que el tratamiento de células endoteliales con un inhibidor de HO-1acabó con el aumento en la expresión de las moléculas de adhesión.

Diabetes

La diabetes se caracteriza por la presencia de concentraciones elevadas de gluco-sa en la sangre, también llamada hiperglucemia, que puede ser producida por de-ficiencia en la secreción de insulina o por la pérdida de respuesta a la acción de la insulina, o por ambas. Se ha demostrado que la diabetes está asociada con un aumento en el estrés oxidativo y en la expresión de HO-1 en hígado yriñón. También se ha reportado que existe una disminución en la actividad deHO-1 en las etapas tempranas de la diabetes, y un aumento del número de célu-las endoteliales circulantes en las ratas con diabetes inducida por estreptozotoci-na. La sobreexpresión de HO-1 en ratas diabéticas resultó en un aumento debilirrubina sérica, reducción en la producción de especies reactivas de oxígeno ydisminución del número de células endoteliales en la circulación. Además, lahiperglucemia per se reprime la expresión génica de HO-1, mientras que la dis-minución de la glucosa la aumenta. Por otra parte, en modelos de trasplante deislotes en roedores, la preinducción de HO-1 protege del estímulo proapoptóti-co y mejora la función de los islotes. Los estudios realizados en ratones HO-1-/-y +/+ diabéticos y no diabéticos han demostrado que los animales que carecende HO-1 son más susceptibles al daño por isquemia y reperfusión del miocardio,y la presencia de la diabetes empeora el daño. El tamaño del infarto de miocar-©

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dio es significativamente mayor en ratones deficientes en HO-1, mientras que lasobreexpresión de HO-1 protege contra el daño al miocardio en ratas diabéticas.

Cáncer

Se sabe que la HO-1 se expresa en una gran variedad de tumores, contribuyendodirectamente a su crecimiento rápido debido a sus efectos antioxidantes y antia-poptóticos. Se piensa que la acción antiapoptótica de HO-1 se debe a múltiplesmecanismos, como la disminución de los niveles de prooxidantes intracelulares yun aumento de los niveles de bilirrubina y de CO. El CO ejerce sus efectos antia-poptóticos inhibiendo la expresión de la proteína supresora de tumores p53 y laliberación de citocromo c mitocondrial. Se ha demostrado que el tratamiento conZnPP en células de carcinoma de colon humano aumenta la respuesta quimiote-rapéutica de las células tumorales y reduce el crecimiento de tumores, lo quesugiere que la modulación de HO-1 puede ser un blanco atractivo en las inter-venciones quimioterapéuticas. Por otra parte, se ha demostrado en células de car-cinoma papilar tiroideo que la inducción de HO-1 reduce de manera notable lasensibilidad de las células a los estímulos apoptóticos. Esto refuerza la idea de quela HO-1 puede ser un blanco efectivo para el tratamiento anticáncer.

En contraste, también se ha demostrado que la inducción de la HO-1 tiene unefecto citoprotector en el cáncer. Por ejemplo, se ha descrito una asociación entrela susceptibilidad al desarrollo de adenocarcinoma de pulmón y el polimorfismodel promotor del gen de HO-1 en fumadores japoneses de sexo masculino. Laproporción de la frecuencia de repetidas largas fue mayor en pacientes con ade-nocarcinoma en comparación con sujetos sanos. Debido a que los alelos tipolargo del polimorfismo (GT)n están asociados negativamente con la expresión deHO-1, se deduce que en estos pacientes la falta de respuesta de HO-1 ante el estrésse relaciona con el cáncer, sugiriendo que la HO-1 tendría un papel anticanceríge-no. Esto podría deberse a que la actividad de HO-1 tiene un efecto citoprotectorno sólo contra agentes oxidantes, sino contra algunos agentes carcinógenos comoel benzopireno, mientras que la bilirrubina puede proteger el DNA del daño cau-sado por el humo de cigarro. Estudios adicionales seguramente delinearán el papelque juega la inducción de la HO-1 en el cáncer y sus mecanismos.

Enfermedades neurodegenerativas

La HO-1 también se ha relacionado con evento vascular cerebral o ictus, asícomo con las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington debido a quese ha demostrado una importante participación de los radicales libres y las espe-


cies reactivas de oxígeno en el desarrollo de este tipo de padecimientos (véasecapítulo de Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas).

❚ ESTUDIOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

En el laboratorio de los autores se ha estudiado la expresión y función de la HO-1 en la nefrotoxicidad inducida por dicromato de potasio, utilizando SnCl2 comoun inductor y ZnPP como un inhibidor de esta enzima. La presencia de HO-1 enel riñón se valoró midiendo su actividad y mediante técnicas de inmunohistoquí-mica y de western blot. La actividad de la HO-1 se mide espectrofotométrica-mente en microsomas aislados del homogenado renal; la mezcla reaccióncontiene, además de los microsomas, hemina, glucosa 6-fosfato, glucosa 6-fosfatodeshidrogenasa, NADPH y citosol de hígado de ratón como fuente de biliverdi-na reductasa. Esta mezcla se incuba sin luz y después se utiliza cloroformo paraextraer la bilirrubina formada, la cual se mide realizando un barrido de 550 a 450 nm. Para el cálculo se usa la diferencia de densidades ópticas a 464 nm y 530 nm, y el coeficiente de extinción molar de la bilirrubina (ε=40 mM-1cm-1).Por su parte, la nefrotoxicidad inducida por dicromato de potasio se determinómediante marcadores de daño renal como la depuración de creatinina, concen-tración de nitrógeno ureico sanguíneo, excreción urinaria de proteínas totales yde la enzima N-acetil-β-D-glucosaminidasa y mediante análisis histológicos. Elestrés oxidativo inducido por el dicromato de potasio se midió por la presenciade proteínas oxidadas, y el estrés nitrosativo mediante la presencia de 3 nitroti-rosina. El dicromato de potasio per se indujo un aumento leve en la concentra-ción de HO-1 en el riñón. La inducción previa de HO-1 con SnCl2 antes de laadministración del dicromato de potasio previno la nefrotoxicidad y estrés oxida-tivo y nitrosativo. Además, la administración conjunta del inductor y del inhibidor(ZnPP) evitó el efecto protector del SnCl2, sugiriendo que dicha protección se debea la inducción previa de HO-1. Además, la inducción de HO-1 al mismo tiempoo después de la administración del dicromato de potasio no pudo mejorar el dañorenal inducido por este tóxico. Actualmente, en el laboratorio de los autores secontinúa estudiando el papel de la HO-1 en otros modelos experimentales.

❚ CONCLUSIONES

La inducción de HO-1 tiene una función importante en la fisiopatología de variasenfermedades, como aterosclerosis, hipertensión, daño renal agudo, daño pulmo-nar, cáncer, así como otras enfermedades multisistémicas. La sobrerregulación deHO-1 por varios estímulos también modula procesos biológicos clave como la©

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inflamación, daño isquémico y rechazo al trasplante. Las implicaciones biológicasde la reacción catalizada por HO-1 han ido más allá de la descripción inicial desu función, como la enzima que cataliza la degradación del grupo hemo. En losúltimos años se ha enfatizado la consideración de que los productos de reacciónde HO-1 presentan efectos tanto benéficos como potencialmente dañinos. Ade-más, hay una heterogeneidad considerable en la respuesta de los tejidos al daño,y la inducción de HO-1 puede no ser siempre benéfica.

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José C. Fernández ChecaCarmen García Ruiz

❚ INTRODUCCIÓN

El glutatión (GSH) es uno de los tioles no proteínicos más estudiados a nivelintracelular debido al papel crítico que juega en la fisiología y bioquímica celular.El GSH es un tripéptido que se encuentra en altas concentraciones en todas lascélulas. Se sintetiza a partir de los aminoácidos glutamato, cisteína y glicina. ElGSH tiene ciertas características estructurales que son las responsables de su es-tabilidad, así como de sus funciones biológicas (figura 16-1). Por ejemplo, el enla-ce peptídico que une el amino terminal del glutamato al residuo de cisteínadentro del GSH es a través del grupo γ-carboxilo del glutamato, y no por el grupoα-carboxilo, que es el que normalmente se une de manera convencional. Estearreglo tan poco frecuente le permite a la molécula resistir la degradación porpeptidasas intracelulares y sólo puede ser hidrolizada por una enzima conocida:la γ-glutamiltranspeptidasa (GGT). Por si fuera poco, el segmento del carboxiloterminal de la glicina del GSH protege a la molécula del rompimiento por la en-zima γ-glutamilciclotransferasa intracelular. Como consecuencia, el GSH es me-tabolizado de manera extracelular úúnniiccaammeennttee por la GGT, que actúa en la caraexterna de ciertos tipos celulares, además de que se protege el grupo sulfhidrilo

16

(-SH) de la cisteína, que es requerido para las funciones que realiza el GSH (enparticular la regulación de los puentes o enlaces disulfuro de las proteínas y paradeshacerse de moléculas oxidantes y electrófilos).

A pesar de que el GSH se sintetiza de manera exclusiva en el citosol, esta mo-lécula se distribuye en los organelos intracelulares, incluyendo el retículo endo-plasmático y la mitocondria. El GSH se encuentra de manera predominante ensu forma reducida (GSH), excepto en el retículo endoplasmático, en donde existeprincipalmente como glutatión oxidado (GSSG), quizá debido a la necesidad deque exista un ambiente adecuado para el manejo de las proteínas, puesto que de encontrase en su forma reducida, el GSH podría reducir a la enzima isomera-sa encargada de formar los puentes disulfuro en las proteínas.

En la mitocondria, el GSH por lo general sí se encuentra en la forma reduci-da, aunque representa una fracción minoritaria del GSH total (10 a 15%). Con-siderando el volumen de la matriz mitocondrial, la concentración del GSHmitocondrial (GSHm) se considera similar a la concentración de este tripéptidoen el citosol (10 a 14 mM).

Dada la gran variedad de papeles que juega el GSH en la fisiología celular, loscambios en la homeostasia del GSH se han visto implicados en la etiología y pro-gresión de una gran cantidad de enfermedades humanas. En este capítulo se tra-tará tanto la regulación como las funciones del GSH, así como su papel en elestrés oxidativo y la muerte celular.


γ-glutamato

Glicina

Cisteína

Glutatión reducido (GSH)-Glutamil-cisteinil-glicina

O

CO

H

+NH3

C O

HN

NH

O

O

C

H SH

O

–

–

FFiigguurraa 1166--11.. Estructura del GSH y sus aminoácidos constituyentes. El enlace entre el glutamato yla cisteína determina la estabilidad del GSH y su resistencia frente a la hidrólisis, mientras que suefecto antioxidante es determinado principalmente por el grupo SH reducido de la cisteína.

❚ HOMEOSTASIA DEL GSH

Biosíntesis del GSH

El GSH existe en altas concentraciones en todos los tipos celulares, y es sintetizadoen el citosol a partir de los aminoácidos precursores. La regulación de la biosíntesisdel GSH depende principalmente, y como factor limitante, de la disponibilidad dela cisteína. El hígado tiene características únicas que regulan la síntesis del GSHdebido a que los hepatocitos son capaces de convertir a la metionina en cisteínaa través de la transulfuración. Además, la velocidad de biosíntesis del GSH en loshepatocitos está regulada por su tasa de exportación, principalmente hacia el plas-ma y la bilis. La síntesis del GSH se realiza a partir de sus constituyentes aminoa-cídicos: L-glutamato, L-cisteína y L-glicina, y comprende dos eventos enzimáticosque son dependientes de la hidrólisis de ATP (figura 16-2). El primer paso de labiosíntesis del GSH es el paso limitante, y está catalizado por la enzima γ-gluta-milcisteína sintetasa (GCS), que depende totalmente de Mg2+ o Mn2+. La GCSestá compuesta de una subunidad pesada (GCS-HS Mr cerca de 73 000) y unaligera (GCS-LS Mr casi 30 000), que son codificadas por diferentes genes, tantoen el humano como en la rata. La subunidad pesada es la que presenta toda la acti-vidad catalítica de la enzima aislada, y es susceptible de inhibirse por retroalimen-tación por las concentraciones de GSH. Por otro lado, la subunidad ligera juega unpapel importante en la regulación de la función global de la enzima, y permite ala holoenzima ser catalíticamente más eficaz y estar menos expuesta a la inhibi-ción por el GSH que la subunidad pesada sola.

La GCS está regulada fisiológicamente por dos factores importantes:

a) Inhibición competitiva por retroalimentación por el GSH. La inhibición porel GSH es no alostérica, e implica la unión del GSH al sitio de la enzimadonde se une el glutamato.

b) La disponibilidad del precursor de L-cisteína también regula a la GCS. Losvalores aparentes de la Km del GCS por el glutamato y la cisteína son 1.8 y0.1 a 0.3 mM, respectivamente. La concentración intracelular de glutamatoes varios órdenes de magnitud mayor que el valor de Km que tiene la GCS,por lo que su disponibilidad no sería un factor limitante, mientras que laconcentración intracelular de cisteína se aproxima a los valores aparentes deKm de la enzima para este aminoácido. De modo que, en este caso, tanto ladisponibilidad intracelular de la cisteína como la actividad de la enzimainfluyen en gran medida la tasa de síntesis del GSH.

El segundo paso en la síntesis del GSH está catalizado por la enzima glutatiónsintetasa (GS) (figura 16-2). Esta enzima no ha sido estudiada de manera tan©

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exhaustiva como la GCS. Se han usado análogos de los sustratos para determinarlos sitios de unión de la enzima, y se ha reportado que las regiones del sitio acti-vo que unen a la glicina y al segmento cisteinil de la γ-glutamilcisteína son alta-mente específicos. Aunque se ha visto que el segmento L-γ-glutamil puede serreemplazado por varios análogos moleculares, lo que indica que este sitio de uniónno es tan específico. La GS no está sujeta a inhibición por retroalimentación direc-tamente por el GSH. Se ha encontrado que la sobreexpresión de la enzima GS noincrementa los valores de GSH, mientras que la sobreexpresión de GCS sí lo hace;sin embargo, la deficiencia de la enzima GS en los humanos puede tener conse-cuencias drásticas en el metabolismo, ya que la γ-glutamilcisteína acumulada se convierte en 5-oxoprolina, la cual causa acidosis metabólica severa.

Una vez establecido que la disponibilidad de la cisteína es un factor crítico ydeterminante para la síntesis del GSH, se entiende que los factores que regulanlos niveles intracelulares de este aminoácido, regulan la biosíntesis del GSH y portanto, también a los niveles intracelulares del mismo. Entre estos factores seencuentra el transporte de la cisteína, así como de otros aminoácidos que puedentransformarse en dicho aminoácido, como la cistina (mediante reducción) o lametionina (vía transulfuración en hepatocitos) (figura 16-3).

En cuanto a la regulación de la GCS, se sabe que esta enzima puede ser regu-lada a nivel transcripcional y postranscripcional, y ya se han descrito algunas hor-monas que modulan los niveles de GSH hepático mediante su acción sobre laenzima GCS.

Degradación del GSH

En contraste con la síntesis del GSH que ocurre a nivel intracelular, la degrada-ción del mismo ocurre exclusivamente en el espacio extracelular y sólo en las


-glutamil -L-cisteína GSH

L-cisteína

ATP ADP+ ATP ADP+

L-glutamato-GCS GS

L-glicina

FFiigguurraa 1166--22.. Síntesis de GSH. La biosíntesis del GSH requiere de glutamato, cisteína y glicina, loscuales se unen en dos pasos catalizados por las enzimas γ-glutamilcisteína sintetasa (GCS) y gluta-tión sintetasa (GS). Estas enzimas adicionan la glicina a la γ-glutamilcisteína. Ambas requieren dela energía proveniente de la hidrólisis del ATP, por lo que la síntesis del GSH es un mecanismo con-sumidor de energía. Además de la presencia de la GCS, que es la enzima limitante, la disposiciónde la cisteína regula la síntesis del GSH.

células que expresan a la enzima GGT. Como se mencionó antes, ésta es la únicaenzima que puede iniciar el catabolismo del GSH, de los conjugados S-glutatión(glutathione S-conjugates) y de los complejos asociados al GSH en condicionesfisiológicas. En particular, la GGT es abundante en la superficie apical de lamayor parte de los epitelios transportadores, incluyendo a las membranas hepá-ticas canaliculares y los ductos biliares. Debido a que la GGT es una enzimaunida a la membrana con su sitio activo expuesto hacia la superficie extracelularde la membrana, la exportación del GSH y sus aductos hacia el espacio extrace-lular es el paso inicial y quizá el más regulado en su interconversión en las célu-las de los mamíferos. La GGT remueve el segmento que contiene al glutamil delGSH (y de los compuestos que contienen GSH), para dar lugar a la cisteinilgli-cina o a los conjugados cisteilglicina-S. Posteriormente, estos compuestos son sus-tratos de dipeptidasas, las cuales hidrolizan el enlace peptídico entre la cisteína yla glicina. Las dipeptidasas también son ectoproteínas, por lo que estas reaccio-©

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Metionina

S-adenosil-L-metionina, SAM

M A T 1A

GSH

ALCOHOL

(LPS)

TNF

SAM

Metionina

SAM

SAH

Homocisteína

Cistationina

Cisteína -glutamilcisteina GSH

Ot r as funciones

E R O

FFiigguurraa 1166--33.. La vía de la transulfuración en los hepatocitos. Si la disponibilidad de cisteína es limi-tada, la metionina puede convertirse en cisteína para ser usada en la biosíntesis del GSH mediante latransulfuración. Un componente clave en este proceso es el metabolito S-adenosil-L-metionina(SAM), que actúa como un precursor de GSH en los hepatocitos, y además previene la supresióno eliminación del GSH por agentes como el alcohol.

nes también ocurren en el espacio extracelular. El transporte hepático del GSHhacia el plasma y la bilis contribuyen a su metabolismo extrahepático.

❚ FUNCIONES BIOLÓGICAS DEL GSH

Destoxificación de electrófilos de Michael y metales

La destoxificación de los xenobióticos o de sus metabolitos es una de las funcio-nes principales del GSH. Siendo el GSH un nucleófilo, tiene como blanco a seg-mentos electrófilos del tipo de los carbonilos α y β insaturados, o bien electrófilosdel tipo de Michael. Estos compuestos forman conjugados con el GSH, ya sea demanera espontánea o gracias a la intervención de algunas enzimas, en reaccionescatalizadas por la GSH S-transferasa. Esta reacción da como resultado no sólo laremoción del electrófilo vía su metabolismo subsiguiente o transporte fuera de la célula, sino que también contribuye a la eliminación potencial del GSH, sobretodo si la biosíntesis del GSH no se encuentra en equilibrio con la tasa o veloci-dad de supresión del electrófilo. El metabolismo de los conjugados del GSHcomienza con el rompimiento del segmento γ-glutamil por la enzima GGT, loque hace que del tripéptido original sólo quede el segmento del conjugado de dosresiduos de aminoácidos: cisteinil-glicina. El enlace del dipéptido cisteinil-glicinaes roto por la dipeptidasa, resultando en un conjugado cisteinilo, el cual sufre unaN-acetilación formando el ácido mercaptúrico. El metabolismo de los conjugadosdel GSH hasta llegar al ácido mercaptúrico comienza ya sea en el árbol biliar, elintestino o el riñón, pero la formación del conjugado N-acetilcisteína por lo gene-ral sólo ocurre en este último tejido. Además de los compuestos exógenos,muchos compuestos endógenos siguen una vía metabólica similar. Algunos ejem-plos incluyen al 17β–estradiol, a los leucotrienos y a las prostaglandinas. El GSHtambién forma complejos con metales mediante reacciones no enzimáticas.

Otro papel del GSH está relacionado con el metabolismo de diversos metales,como son mercurio, plata, cadmio, arsénico, plomo, oro, cinc y cobre. Este tripép-tido es uno de los ligandos unidores de metales más versátiles, y funciona en lamovilización y distribución de los mismos entre sus diversos ligandos, así comoen su transporte a través de las membranas celulares. De igual manera, el GSHpuede funcionar como agente reductor o cofactor en las reacciones redox queinvolucran metales. Lo anterior se debe a que el grupo sulfhidrilo del segmentode cisteína tiene una alta afinidad por metales, y puede formar compuestos tipomercáptidos con los metales antes mencionados. Estos compuestos son termodi-námicamente estables, pero cinéticamente lábiles.


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Mantenimiento del estatus de los tioles

El GSH es esencial en mantener el equilibrio redox intracelular, y el estatus delos tioles proteínicos esenciales. Para lograrlo, dos moléculas de GSH son oxida-das en una reacción en la que se intercambia el grupo tiol de cada una de las cis-teínas por un enlace disulfuro, dando como resultado el glutatión reducido(GSSG). Esta reacción es catalizada por la enzima tiol transferasa de la manerasiguiente:

Proteína-S-S-proteína + 2 GSH-→ proteína-SH + HS-proteína + GSSG

Como esta reacción es irreversible, el equilibrio se determina por el estadoredox de la célula, que a su vez depende de las concentraciones del GSH y delGSSG (proporcional al logaritmo de [GSH]2/[GSSG]). Por lo general, el GSSGse mantiene en concentraciones muy bajas (<1% del total de GSH), de maneraque la formación de disulfuros en las proteínas es limitado. Se sabe que el equi-librio tiol disulfuro dentro de la célula regula diversos procesos metabóli-cos, incluyendo la actividad enzimática, el transporte y la expresión de genesmediante la alteración de factores activadores trans, sensibles a las alteracio-nes redox.

Función antioxidante

Como consecuencia del metabolismo aeróbico, los organismos están sujetos a uncierto nivel de estrés oxidativo fisiológico. La respiración mitocondrial, la trans-formación de xenobióticos por el sistema del citocromo P450 y otros procesos queproducen especies reactivas de oxígeno y especies reactivas de nitrógeno puedena su vez generar lipoperoxidación y daño celular. El H2O2 producido de maneraendógena se reduce por el GSH en presencia de la GSH-peroxidasa (GPx)dependiente de selenio. Como resultado, el GSH se oxida a GSSG, por lo quepara volver a tener actividad antioxidante, éste debe volver a reducirse otra veza GSH, lo que se lleva a cabo por la enzima GSSG reductasa a expensas deNADPH, en lo que se conoce como un ciclo redox.

Por otro lado, tanto la GPx como la GSH-S-transferasa pueden reducir a losperóxidos orgánicos. El H2O2 también puede reducirse por acción de la enzimacatalasa, que se encuentra en los peroxisomas (véase el capítulo Catalasa). Sinembargo, dentro de la mitocondria, el GSH es particularmente importante debi-do a que este organelo no posee catalasa. Puesto que la mitocondria es un orga-nelo esencial para el mantenimiento de la función celular, el GSH mitocondriales reconocido como un antioxidante vital que regula las vías de muerte celular,

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así como la progresión significativa de las enfermedades. Además, el GSH tam-bién funciona como coenzima para otras enzimas antioxidantes, como las gluta-rredoxinas y las tiorredoxinas.

Almacenamiento de cisteína y ciclo del γ-glutamil

Otra de las funciones primordiales del GSH es el almacenamiento de la cisteína.La cisteína es un aminoácido extremadamente inestable cuando se encuentra enel ambiente extracelular y rápidamente se autooxida hacia cistina en un procesoque potencialmente produce radicales libres de oxígeno.

El ciclo del γ-glutamil fue descrito a principios del decenio de 1970-79 porMeister, e indica que el GSH sirve como una fuente continua de cisteína. Du-rante el ciclo, el GSH es transportado fuera de la célula por transportadores. Unavez en el espacio extracelular, la enzima GGT transfiere el segmento γ-glutamila un aminoácido (el mejor aceptor es la cistina) para formar un γ-glutamil-ami-noácido y una cisteinil-glicina. El γ-glutamil-aminoácido puede entonces sertransportado de regreso a la célula para completar el ciclo. Dentro de la célula, elγ-glutamil-aminoácido más tarde es metabolizado para liberar al aminoácido y unfragmento 5-oxoprolina, que puede convertirse en el glutamato y volver a usarsepara la síntesis de GSH. En cuanto a la cisteinil-glicina, ésta se rompe gracias a laacción de las dipeptidasas para regenerar a la glicina y la cisteína; esta última sevuelve a utilizar para formar más GSH. Dicho proceso se lleva a cabo en la mayorparte de las células como una fuente continua de cisteína, en la cual la mayor partede este aminoácido se utiliza para la generación del GSH, aunque también sepuede incorporar a las proteínas, e incluso puede llegar a degradarse hasta sulfatoo taurina. El camino que siga la cisteína depende de las necesidades celulares.

❚ GSH MITOCONDRIAL

Como ya se mencionó antes, el GSH se sintetiza exclusivamente en el citosol yse distribuye a los organelos celulares como el retículo endoplasmático y la mito-condria; Mientras que el GSH en el retículo endoplasmático es importante parael correcto ensamblaje y secreción de las proteínas, en la mitocondria el glutatiónmitocondrial (GSHm) juega un papel esencial para mantener la funcionalidad deeste organelo, y recientemente se ha reconocido su importancia en la regulaciónde las vías de muerte y supervivencia celular. Las mitocondrias son las principa-les consumidoras de oxígeno molecular en la célula, y este proceso funcionacomo un dispositivo de transducción para proveer la energía requerida para lasíntesis de ATP durante la fosforilación oxidativa. Aunque la mayor parte del oxí-


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geno consumido durante la fosforilación oxidativa se convierte en agua, parte deloxígeno genera especies reactivas de oxígeno como el radical superóxido y elperóxido de hidrógeno (H2O2) (véase Sección III). A pesar de que la mitocondriase encuentra constantemente expuesta a las especies reactivas de oxígeno, esteorganelo se mantiene estable y funcional gracias a la existencia del sistema dedefensa antioxidante que contrarresta los efectos nocivos de los radicales libres,como es el caso de la enzima MnSOD, que convierte al superóxido en H2O2(véase el capítulo Superóxido dismutasa). Una de las moléculas que participa demanera más activa en esta defensa antioxidante es precisamente el GSHm.Recordando que las mitocondrias carecen de catalasa para eliminar al H2O2, seaprecia la importancia del GSH como componente integral dentro del cicloredox con la participación de la enzima GPx y la GSSG reductasa dependientede NADPH. Asimismo, debe existir un equilibrio entre la actividad de laMnSOD y el ciclo redox del GSH para asegurar la eliminación eficaz del H2O2.Cuando se disminuye la concentración del GSHm por debajo de un nivel críticocompromete la reducción adecuada del H2O2, particularmente en las condicio-nes en las que se encuentra aumentada la generación de las especies reactivas deoxígeno por la cadena respiratoria mitocondrial. Por ejemplo, durante la inhibi-ción del complejo III mitocondrial con antimicina A, la generación de H2O2 sólose observa cuando el GSH se reduce hasta 2 a 3 nmol/mg proteína, lo que corres-ponde al rango de la Km de la GPx por el GSH (3 mM). La disminución deGSHm por debajo de 40% conlleva también a la generación de H2O2 a partir delcomplejo I mitocondrial. Por si fuera poco, debido a la existencia de GSH-S-transferasas (GST) en la mitocondria, el GSH también participa en la reducciónde los hidroperóxidos orgánicos, incluyendo los productos de la lipoperoxida-ción. Por tanto, como se infiere de su versatilidad tanto para reducir oxidantescomo para conjugar electrófilos, el GSHm tiene un papel importante para man-tener la integridad mitocondrial, y su carencia es un evento clave en la progre-sión de la patogénesis. Además, al modular el estado redox, el GSHm seencuentra involucrado en la regulación de la muerte celular programada posible-mente a través de la permeabilización de la membrana mitocondrial (PMM), quees reconocida por su importancia en la fisiopatología.

Transporte de GSHm

La concentración del GSH mitocondrial se encuentra en un rango similar a loque se ha reportado para el GSH citosólico. No obstante, a diferencia de lo queocurre en el citosol, la mitocondria no cuenta con la maquinaria enzimática parasintetizar al GSH a partir de sus constituyentes aminoacídicos, por lo que elGSHm debe provenir del citosol gracias al transporte desfavorable en contra de

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gradiente, mediado por transportadores localizados en la membrana internamitocondrial. La caracterización del transporte de GSH hacia las mitocondrias dehígado de rata ha indicado que esto se lleva a cabo por un proceso activo quedepende de la energía proporcionada por la hidrólisis del ATP y es inhibido porel glutamato, y que también puede abatirse cuando colapsa la fuerza motriz condesacoplantes protonóforos. Aunque se ha logrado expresar al sistema de trans-porte de GSHm en ovocitos de Xenopus laevis, no se ha logrado identificar altransportador responsable del mismo.

Recientemente se ha encontrado que algunos transportadores en la membranamitocondrial, como los que transportan dicarboxilato y 2-oxoglutarato, son capa-ces de funcionar como transportadores de polipéptidos de GSH. Se ha demostra-do que la sobreexpresión del transportador de dicarboxilato de riñón de rata enuna línea celular derivada de los túbulos proximales de riñón (NRK-52E), incre-mentó el nivel de GSHm de 2 a 10 veces respecto a las células silvestres NRK-52E,confirmando la participación de este transportador en el transporte mitocondrialde GSH en intercambio con fosfato inorgánico.

Asimismo, la evidencia del papel del transportador de 2-oxoglutarato como untransportador de GSH se ha basado en la especificidad por el sustrato y los patro-nes de inhibición encontrados en mitocondrias de riñón de conejo. En contrastecon el transporte de GSH en la mitocondria de riñón, que ocurre con un compo-nente cinético único, la cinética del transporte de GSH en mitocondrias de hígadode rata presenta dos componentes, uno de alta y otro de baja afinidad. Se obser-vó que el transporte de GSH en las mitocondrias hepáticas es aparentementedependiente de la fluidez de la membrana. Estos estudios sugieren que el 2-oxo-glutarato puede ser el responsable del transporte de baja afinidad del GSH en lamitocondria del hígado, en un intercambio con 2-oxoglutarato. Sin embargo, aúnquedan por identificarse los transportadores de alta afinidad. Un estudio recienteha propuesto al transportador UCP2 como regulador de los niveles de GSHm,implicando que funciona también en el transporte, pero esto aún es especulativo.

Regulación del transporte mitocondrial de GSH

Evidencia reciente obtenida de experimentos con hepatocitos y mitocondrias aisla-das, muestra que el transporte mitocondrial de GSH depende en gran medida delas propiedades físicas de la membrana. La función de las proteínas membranales,incluyendo a los transportadores, puede ser modulada por el microambiente delas membranas en las cuales están insertadas. La composición lipídica es la quedetermina las propiedades dinámicas de las membranas biológicas. Tanto la rela-ción molar entre la concentración del colesterol y los fosfolípidos, así como elgrado de insaturaciones que presentan los ácidos grasos dentro de estos últimos,


contribuyen a los cambios en la fluidez de la membrana, y al mismo tiempo a latransición de los estados en los que se puede encontrar: gel o líquido cristalino.Se ha descubierto que el enriquecimiento de colesterol en las membranas celu-lares, o bien la presencia de liposomas multilamelares grandes, disminuye la flui-dez. Por otro lado, la presencia de cadenas de ácidos grasos altamente insaturadas(p. ej., los ácidos grasos 20:4 y 22:6, con 4 y 6 dobles enlaces, respectivamente)en los fosfolípidos hace que difícilmente se asocien al colesterol, por lo que creandominios de membrana muy fluidos.

Se sabe que si se incrementa el contenido de colesterol de 2 a 3 veces sobre elcontenido normal de las membranas, éste disminuye la incorporación de GSH alas mitocondrias. Sin embargo, el transporte de otros sustratos mitocondrialescomo el ADP, por medio del transportador de adenín nucleótidos, no se afectapor el aumento del colesterol. Si se agregan agentes que restablecen la fluidez dela membrana, como el A2C, se restablece el transporte de GSH. De modo queahora se sabe que, además de la fuerza motriz de los protones, la hidrólisis delATP y las concentraciones de glutamato, el transporte de GSH mitocon-drial depende en gran medida de la apropiada fluidez de la membrana.

❚ GSH Y REGULACIÓN DE LA MUERTE CELULAR

A través del mantenimiento de los grupos sulfhidrilos de las proteínas en el estadoredox apropiado, el GSH puede regular importantes vías de muerte y supervi-vencia que modulan el destino de las células en respuesta a los diversos estímu-los. Una gran cantidad de estudios han demostrado que la pérdida del GSHintracelular sensibiliza a las células a una gran variedad de estímulos apoptóticos.

El aplidín, un agente antitumoral aislado de Aplidium albicans mediterráneo,induce apoptosis en la altamente invasiva y proliferativa línea celular de cáncermamario MDA-MB-231 que tiene mutados a los genes p53 y ras. Se sabe queesto se debe a que la aplidina induce activación sustancial en el receptor del fac-tor de crecimiento epidérmico, así como sobre las proteínas que regulan vías detransducción, como Src, JNK, y p38 MAPK mediante la disminución de las con-centraciones de GSH.

Otros estudios realizados en hepatocitos de ratón, en los que se suprimieronlos niveles de GSH por los agentes dietilmalato o acetaminofén, muestran queestas células fueron más susceptibles a la apoptosis inducida por el factor denecrosis tumoral (TNF). Se encontró que el TNF activaba a la proteína cinasaJNK, que a su vez activaba a las cinasas dependientes de estrés y a los genes desupervivencia inducidos por el factor de transcripción κB (NF-κB), cuando habíauna disminución del GSH en el citosol y en el núcleo. Mientras que la disminu-ción del GSH no afectaba la unión del NF-κB al DNA, sí prevenía la inducción©

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de algunos de los genes de supervivencia que se inducen por NF-κB, como lasóxido nítrico sintasas (iNOS). Estos resultados muestran una dependencia dife-rencial en los valores de GSH entre la actividad del NF-κB al unirse al DNA y sutransactivación, que al parecer sí depende de ciertos niveles críticos de GSH.Aunque la unión del NF-κB al DNA puede ser modulada por el ambiente redox,datos recientes proponen una nueva vía en la regulación redox del NF-κB. Demodo que dependiendo de la cantidad del GSH presente y de la manera en quese agotó (ya sea por eflujo de la célula o porque disminuye el cociente GSH/GSSG), el que sólo haya una pequeña cantidad de GSH almacenado puede pro-mover la muerte celular mediante la activación sostenida de la cinasa JNK y/o lasupresión de las vías de supervivencia dependientes de NF-κB.

El papel del GSH mitocondrial en la susceptibilidad a la muerte celular

Recientemente se han usado diversos fármacos para disminuir o eliminar de ma-nera selectiva al GSHm y examinar su papel en la susceptibilidad a los estímulosde muerte. Para ello se ha usado la biotransformación selectiva del aceptor de Mi-chael (R,S)-3-hidroxi-4-pentenoato (HP) por la enzima (R)-3-hidroxibutanoato:NAD+ oxidorreductasa (3-HBD) (figura 16-4), que permite eliminar al GSH enmitocondrias de hepatocitos intactos sin afectar las concentraciones de GSHcitosólico. Cuando se preincubaron los hepatocitos con HP se observó un aumen-to en la sensibilización a la muerte mediada por el TNF, presentando un incre-


3-hidr o xi-4-pentanoato (HP)

GSH GSH

GS GS - X X

Mitocond r ia

o o xidorreductasa xidorreductasa

X

GSH GSH

3-HBD O

O

GS

O

S-(3- o xo-4-carb o xi b util) GSH

-

O

O O

3- o xo-4-pentanoato

-

+ NADH NAD

O

OH O HP

-

GS X

GSH o xidorreductasa

GSH

FFiigguurraa 1166--44.. Eliminación del GSH mitocondrial. La biotransformación del HP hacia el electrófilode Michael: 3-oxo-4-pentenoato, ocurre de manera selectiva en la matriz mitocondrial gracias al 3-HBD. Este carbonilo insaturado es conjugado con el GSH produciendo al S-3-oxo-4-carboxibuti-lo, lo cual resulta en la eliminación del GSH. Esta aproximación farmacológica ha sido muy útilpara estudiar la relevancia del GSHm en la regulación de la muerte celular.

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mento significativo. Asimismo, se encontró una aparición temprana de peróxidosque precedió a la pérdida del potencial de membrana, salida del citocromo c ymuerte tanto apoptótica como necrótica. Resultados similares se observaron aleliminar al GSHm por ingesta crónica de etanol. Por otro lado, la sobreexpresióndel transportador mitocondrial de GSH, el transportador dicarboxilato, aumentólos niveles de GSHm, lo que protegió de manera sustancial a las células NKK-52E de la apoptosis inducida por agentes oxidantes.

De manera adicional, se ha sugerido que el GSHm puede tener una función vitalen resguardar la integridad de los lípidos de la membrana interna de este organelo,e impedir así la pérdida de la permeabilidad. Se ha reportado que la peroxidaciónde la cardiolipina (un fosfolípido integral de la membrana interna mitocondrial)es un factor contribuyente en la pérdida de la permeabilidad y la liberación delcitocromo c; sin embargo, se propone que un aspecto adicional en el papel pro-tector del GSHm es el de prevenir el ataque de las especies reactivas de oxígenosobre la cardiolipina.

❚ SUPRESIÓN DE GLUTATIÓN Y ENFERMEDADES HEPÁTICAS

Puesto que el GSH es un antioxidante crítico y las especies reactivas de oxígenose han asociado a la fisiopatología de las enfermedades hepáticas, la disminucióno supresión del GSH se ha planteado como un evento determinante en la pro-gresión de las alteraciones hepáticas inducidas por ácidos biliares durante laisquemia-reperfusión, así como en el daño por hepatitis B y C.

Quizá una de las enfermedades mejor caracterizadas desde este punto de vistaes el daño hepático inducido por etanol. En el laboratorio de los autores se haestudiado ampliamente este evento y se ha demostrado que la ingesta crónica deetanol reduce de manera selectiva las concentraciones de GSHm. Dicha supre-sión del GSHm precede todos los signos de daño hepático, y se puede prevenircuando se sobreexpresa a la enzima Mn-SOD. El alcohol también estimula elincremento en el colesterol y su deposición en las membranas mitocondriales, porlo que esto afecta el transporte del GSH hacia la mitocondria, y se ha sugeridocomo una causa en la disminución del GSHm.

La cirrosis, que también se ha relacionado con la disfunción mitocondrial, pre-senta eventos semejantes en la desregulación de los niveles de GSHm.

❚ CONCLUSIONES

Debido a la importancia que posee el GSH en la fisiología celular, las modifica-ciones en su regulación y homeostasia se ha asociado a la etiología y progresión

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de múltiples patologías. Asimismo, se ha reportado que la disminución prolonga-da en los valores de GSH, y dependiendo de su distribución (citosólica o mito-condrial), pudieran favorecer la muerte por apoptosis. Sin embargo, la existenciade agentes adicionales como la presencia de otras enzimas antioxidantes, puedenser factores determinantes en el resultado final, ya que éste se define por un deli-cado equilibrio entre antioxidantes filológicos (entre los que destaca el GSH) y losoxidantes producidos de manera endógena (especies reactivas de oxígeno y nitró-geno), todo ello para decidir entre la progresión de la señalización de la apoptosis.

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Glutatión • 267

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PPOOTTEENNCCIIAALL AANNTTIIOOXXIIDDAANNTTEE

DDEE LLOOSS CCAARROOTTEENNOOIIDDEESS

Egle Machado de Almeida SiquieraSandra Fernandes Arruda

❚ INTRODUCCIÓN

Es claro que existe una relación entre las especies reactivas de oxígeno y la etio-logía de diversos procesos patológicos, como enfermedades coronarias, diabetes ycáncer, e incluso los procesos del envejecimiento. Es por ello que se han realiza-do una gran cantidad de estudios epidemiológicos para conocer el efecto de laingesta de vitaminas sobre los daños inducidos por las especies reactivas de oxí-geno. Diferentes estudios han demostrado una correlación entre el aumento delconsumo de la provitamina A dietética y la disminución en la incidencia de lamortalidad por enfermedades isquémicas.

El potencial antioxidante ejercido tanto por la vitamina A como por los caro-tenoides fue descrito por primera vez en 1932, por Monaghan y Schmitt, alobservar un efecto protector de estas moléculas en contra de la ranciedad de loslípidos.

Barber et al., en el año 2000, demostraron que las mitocondrias de hepatocitosde ratones tratados durante 50 días con una dieta ssiinn vitamina A presentabanmenor razón molar para el glutatión reducido y el glutatión oxidado (GSH/GSSG),y mayores concentraciones de malonaldehído y de 8-oxo-desoxiguanosina (8OHdG),

17

productos de la oxidación de los lípidos y el DNA, respectivamente. En ese estu-dio, al introducir de nuevo la vitamina A en la dieta de los ratones durante 30días, se encontró un aumento significativo del cociente GSH/GSSG y en unareducción de la concentración de 8OHdG, aunque los niveles de malonaldehídopermanecieron estables. Hasta hace poco, los estudios que evidencian el efectosupresor de los carotenoides sobre el estrés oxidativo in vivo utilizaban sólo lasformas purificadas. En 2005, sin embargo, el grupo de trabajo de los autores veri-ficó el efecto antioxidante del extracto de carotenoides de malanga sobre la pero-xidación lipídica y la oxidación de proteínas en el hígado y corazón de ratones(figura 17-1).


B - Malanga carotenoids extract

neoxanthin + violaxanthin+ lutein

(4.9 + 0.9%)Am

plitu

de: 4

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6 V

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0.08

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B

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Minutes

12 14 16 16 20

FFiigguurraa 1177--11.. AA)) Hoja de Xanthosoma sagittifolium, conocida como malanga o yatía (español) otaioba (portugués), típica de América Central y América del Sur. Las hojas nuevas se consumen demanera similar a la espinaca. BB)) Perfil cromatográfico del extracto de carotenoides de malanga.

❚ EFECTOS ANTIOXIDANTES DE LOS CAROTENOIDES

En 1984, Burton e Ingold propusieron un mecanismo por el cual los carotenoi-des actúan como antioxidantes. Los radicales peróxidos son secuestrados e incorpo-rados al sistema de dobles enlaces conjugados de la molécula del carotenoide, demodo que el electrón desapareado forma un radical dentro del carotenoide, que seestabiliza en la estructura del mismo por resonancia.

Los mecanismos de acción de los carotenoides capaces de proteger a las célu-las contra los daños oxidativos se resumen en la habilidad de estas moléculas defuncionar tanto como agentes fotoprotectores contra los efectos nocivos de la luzy del oxígeno singulete (1O2), o como moléculas reactivas contra especies quími-cas generadas dentro de las células, capaces de inducir daños oxidativos.

Efecto fotosensible

Como agentes fotosensibles, los carotenoides poseen la habilidad de suprimir aloxígeno singulete (1O2) generado en la células mediante la absorción de energía,transformándolo en moléculas de oxígeno en estado fundamental o triplete(3O2). La energía absorbida entonces por el carotenoide (3carotenoide) es disipa-da en forma de calor, volviendo la célula a su estado basal. La habilidad de loscarotenoides de extinguir el 1O2 se relaciona con el número de dobles enlaces

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Potencial antioxidante de los carotenoides • 271

HO

OH

-caroteno

Zeaxantina

Licopeno

FFiigguurraa 1177--22.. Estructura química de algunos carotenoides.

conjugados en su estructura, variando, por ende, entre las distintas formas de caro-tenoides (figura 17-2). Esta capacidad de suprimir el 1O2 ha sido descrita comouno de los posibles mecanismos de protección que algunos carotenoides ejercenen la retina humana. El pigmento macular, un punto amarillo visible ubicado enel centro de la retina humana, tiene la función de proteger a la retina de los dañosinducidos por la luz y de la degeneración macular relacionada con la edad. Estepigmento está constituido principalmente por luteína, zeaxantina y mesozeaxan-tina, y otros carotenoides en menor concentración. El mecanismo por el cual loscarotenoides protegen a la retina no ha sido establecido, y se postula que estoocurre de dos maneras: directamente, a través de la absorción de energía de losfotones de la luz azul que incide sobre la retina, o mediante la extinción del 1O2producido durante el proceso de fotooxidación. Estudios epidemiológicos indi-can una correlación negativa entre la ingestión y las concentraciones séricas dezeaxantina y luteína (figura 17-2), con el riesgo de degeneración macular relacio-nada con la edad.

Efectos directos en contra de las especies reactivas de oxígeno

En cuanto a las especies reactivas de oxígeno, los carotenoides pueden interactuarcon ellas esencialmente de tres maneras.

RReeaacccciióónn 11:: transferencia de electrón.RReeaacccciióónn 22:: remoción de iones hidrógeno,RReeaacccciióónn 33:: adición de especies radicales.

Los tres tipos de reacciones se describen a continuación.

ROO• + CAR → ROO- + CAR+ (1)ROO• + CAR → ROOH + CAR• (2)ROO• + CAR → ROO-CAR• (3)

La reacción 1 representa una de las reacciones de transferencia de electronesque resultan en la formación de carotenoides radicales en forma de catión(CAR+•), anión (CAR-•) o de un radical alquilo (CAR•). El catión radical (CAR+•)fue observado en estudios relacionados con el fotosistema II, y se le adjudicó unafunción fotoprotectora en este sistema. Por otro lado, la formación del anión radi-cal CAR-· también fue descrita en la reacción del radical superóxido (O2

•) conlicopeno, representada a continuación:

O2• + licopeno ⇔ O2 + licopeno• (4)


Un ejemplo de la reacción 2 de remoción de iones de hidrógeno fue descritapor Baker et al. (1999), al encontrar el compuesto 4-nitro-β-caroteno, productode la exposición de la molécula de β-caroteno al humo del cigarrillo, supuesta-mente resultante de la abstracción de hidrógeno del carbono alílico.

La reacción 3 de adición de una especie radical se da entre los radicales peró-xidos (ROO•) y el carotenoide (CAR), y puede ocurrir en cualquier punto de lamolécula del carotenoide, resultando en la formación de un aducto, es decir, uncarotenoide radical. El radical ROO-CAR• se estabiliza por resonancia, lo queinterfiere, por tanto, en la fase de propagación de la peroxidación lipídica, hechoque podría explicar el efecto antioxidante de los carotenoides en solución,ampliamente divulgado en la literatura. El paso subsiguiente a la formación deladucto radical aún no se ha aclarado de manera apropiada.

La habilidad de los carotenoides de la dieta de actuar como antioxidantes enlos sistemas biológicos depende de varios factores. En los alimentos de origenvegetal, por ejemplo, los carotenoides se encuentran en diversas formas y propor-ciones, incluso asociados a las xantofilas. Dichas moléculas pueden interferir enlos mecanismos de reacción de los carotenoides con las especies reactivas de oxí-geno, potenciando o suprimiendo su capacidad antioxidante.

Otro factor que influye en la acción antioxidante de los carotenoides in vivoes su estructura química, sobre todo el sistema de dobles enlaces conjugados, queademás de otorgar varias propiedades a estas moléculas, también afecta el modoen que son incorporadas en las membranas biológicas. Esto, por su lado, influyeel modo en que interactúan con las especies reactivas de oxígeno. Por ende, elcomportamiento de los carotenoides in vivo es muy distinto al comportamientoen solución. Distintos factores, como su concentración y la presión parcial de oxí-geno (pO2), pueden alterar la eficacia de los carotenoides como antioxidantes enlos sistemas biológicos. Burton e Ingold (1984) demostraron que ante una pO2baja, el β-caroteno actúa como un antioxidante, interrumpiendo las reacciones depropagación de los radicales libres en cadena, extinguiendo a los radicales peró-xidos. Por otro lado, ante una pO2 alta, el carotenoide radical puede reaccionar conel oxígeno originando un radical peroxilo de carotenoide (reacción 5), que puedepromover la peroxidación de lípidos (R) insaturados (reacción 6), y la propaga-ción en cadena de la peroxidación de lípidos (reacción 7). Este efecto puedepotenciarse en presencia de concentraciones elevadas de carotenoides.

CAR• + O2 → CAR-OO• (5)CAR-OO• + RH → CAR-OOH + R• (6)R• + O2 → R-OO• (7)

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❚ EFECTOS PROOXIDANTES DE LOS CAROTENOIDES

Motivados por las innumerables evidencias de que el alto consumo de frutas yvegetales ricos en carotenoides y vitaminas tendrían propiedades antioxidantes y,por ende, auxiliarían a la prevención de las enfermedades como el cáncer en loshumanos, en el decenio de 1990-99 se realizaron estudios de intervención y gru-pos de riesgo con el objeto de verificar la eficacia de complementos de vitaminasaisladas o combinadas para combatir el desarrollo del cáncer en los individuos.

En 1994 se publicó un estudio epidemiológico de intervención, doble ciego,realizado en fumadores y trabajadores de minas de asbesto. Ese estudio, conoci-do como CCAARREETT, apuntaba a verificar la eficacia de la complementación con β-caroteno y retinol en la prevención del cáncer de pulmón. Luego de seis añosde intervención, durante los cuales los individuos del grupo control recibían uncomplemento de 30 mg de β-caroteno y 25 000 UI de retinol al día, éstos pre-sentaron una mayor incidencia de cáncer de pulmón en comparación con elgrupo placebo. Dos años después se publicó un segundo estudio, realizado en Fin-landia, conocido como AATTBBCC, en fumadores. En ese estudio, los individuos (todoshombres) fueron separados en cuatro grupos que recibían 50 mg de α-tocoferolo 20 mg de β-caroteno, o bien 50 mg de α-tocoferol + 20 mg de β-caroteno oplacebo al día. Al cabo de dos a seis años, el resultado no fue menos trágico queen el estudio anterior. Se comprobó que la alta ingesta de β-caroteno, α-tocofe-rol y retinol no disminuyó la incidencia de tumores en los individuos tratados, y,más grave todavía, que los grupos complementados con β-caroteno presentaronun incremento significativo en la incidencia de cáncer de pulmón y en la mortan-dad en relación con el grupo placebo (The α-Tocopherol, β-Carotene CancerPrevention Study Group, 1994). Los resultados presentados en estos dos estudios(CARET y ATBC)) generaron una enorme polémica en cuanto al putativo efectoantioxidante del β-caroteno in vivo, dado que tales resultados apuntaban en ladirección de un efecto prooxidante del β-caroteno en el organismo humano.

Desde entonces, surgieron varias hipótesis para explicar la aparente acciónprooxidante del β-caroteno, observada en los estudios ATBC y CARET. Nyberget al. (2003), estudiando el efecto de la cantidad de β-caroteno de la dieta, obser-varon in vivo una correlación en forma de U entre la cantidad de carotenoidestotales o de β-caroteno consumido en la dieta y la frecuencia de mutación del genHPRT (gen de la hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa) de linfocitoshumanos, que es utilizado como marcador humano para mutagénesis. Este resul-tado sugiere que los carotenoides poseen un efecto protector sobre la mutageni-cidad cuando se consumen en niveles moderados, y que este efecto decrece enindividuos con bajo o alto consumo de carotenoides. Algunos autores creen en lageneración de productos de la oxidación del β-caroteno provocada por la expo-sición a las especies reactivas de oxígeno encontradas de manera abundante en el


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humo del cigarrillo o producidas en la infección pulmonar provocada por el as-besto (asbestosis), como responsables de la acción oxidante del β-caroteno obser-vada en estos dos estudios. Diversos productos de la reacción de carotenoides conespecies radicales ya han sido identificados, los apocarotenoles más conocidos sonel β-apo-8’-carotenal; β-apo-10’-carotenal; β-apo-12’-carotenal; β-apo-14’-caro-tenal; β-apo-13’-carotenona; β-apo-15’-carotenal (retinal). Así, una explicaciónaceptada para el efecto oxidante del β-caroteno en estos dos estudios es quepodría deberse a la alta generación de carotenos radicales, mayor que la concen-tración de otros antioxidantes como el ascorbato y el tocoferol, superando lacapacidad del organismo de neutralizar eficazmente el estrés oxidativo.

❚ LOS CAROTENOIDES Y EL CIGARRILLO

El cigarrillo es el responsable de tres millones de muertes (6% del total de muer-tes) en el mundo (OMS, 1997). Los fumadores tienen mayor incidencia de cán-cer, particularmente en el pulmón, siendo responsable de 90% de los casos decáncer de pulmón en hombres y 79% en mujeres. Los fumadores, en general,poseen menores niveles de carotenoides plasmáticos, y esta asociación está rela-cionada con el número de cigarrillos fumados por día.

La extensa estructura de polienos conjugados de los carotenoides propicia unaconsiderable reactividad con la luz, calor, oxígeno y otros radicales reactivos. Lafase gaseosa del humo del cigarrillo contiene varios radicales libres orgánicos,como el alquilo, alcoxilo, peroxilo, además de aldehídos y óxidos de nitrógeno. Enfumadores, los carotenoides se ven expuestos a los radicales libres del humo delcigarrillo, y también a las formas reactivas del oxígeno producidas por el recluta-miento y activación de los fagocitos debido al humo. La exposición de los caro-tenoides a estas especies altamente reactivas de oxígeno endógenas y exógenas, enpresencia de relativamente alta presión de oxígeno en el pulmón, pueden provo-car la degradación in vivo de estas moléculas, y la formación de especies radica-les de carotenoides que, a su vez, podrían potenciar el efecto de las especiesreactivas de oxígeno del humo del cigarrillo en el pulmón de los fumadores.

Estudios más recientes sugieren que el mecanismo pro-oxidante del β-carotenopuede estar relacionado con la inducción de las enzimas de la familia de citrocro-mo P450 (CYP), involucradas en la generación de especies reactivas de oxígeno yla activación de procarcinógenos. En 2001, Paolini et al. observaron un incremen-to en la actividad de los citocromos P450 en el hígado, intestino, riñones y pul-mones de ratones tratados con dosis farmacológicas de β-caroteno (250 o 500 mgβ-caroteno/kg peso corporal). Este incremento parecía estar asociado a la induc-ción de la transcripción o estabilización de algunos citocromos P450. En ese mis-mo trabajo se observó además un incremento en la producción de especies


reactivas de oxígeno por la fracción microsomal del pulmón, hígado, riñones y elintestino de los animales suplementados con β-caroteno. Liu et al. (2003) demos-traron que la fracción microsomal del pulmón en hurones expuestos al humo delcigarrillo, con complementación farmacológica de β-caroteno, o la asociación deestos tratamientos (dosis equivalente a la utilizada en los estudios de interven-ción en humanos) presentó una mayor oxidación de ácido retinoico (RA) a meta-bolitos más polares (4-oxo-RA y 18-hidroxi-RA) a través de la inducción de loscitocromos oxidasa CYP1A1 y CYP1A2 en relación con el control. Estos resul-tados asociados a las evidencias de que el ácido retinoico puede actuar comoagente supresor de algunos tipos de cáncer, sugieren que complementaciones far-macológicas de β-caroteno pueden inducir alteraciones en el metabolismo delácido retinoico, potencializando el desarrollo de procesos neoplásicos.

Otra hipótesis que intentó explicar el efecto oxidante de dosis farmacológicasde β-caroteno proponía un mecanismo de acción antineoplásico del ácido reti-noico; mediada por sus dos receptores nucleares (RAR y RXR). Una vez formadoel complejo RA-RAR-RXR, éste se ligaría a los genes c-Fos y c-Jun, impidien-do la expresión de la proteína activadora 1 (AP-1). Esta proteína AP-1 consta deun complejo proteínico que regula la síntesis de factores de crecimiento, oncoge-nes y promotores de tumores, responsables de la proliferación celular. De estamanera, la pérdida de la homeostasia del ácido retinoico por la oxidación indu-cida por las CYP incrementaría la susceptibilidad a la carcinogénesis en general.

❚ EFECTO SINÉRGICO DE LOS CAROTENOIDES Y LAS VITAMINAS C Y E

La eficacia de los carotenoides también depende de su interacción con otrasmoléculas antioxidantes, en especial con las vitaminas E y C. Las moléculas antio-xidantes, aunque poseen mecanismos distintos para contrarrestar a las especiesreactivas de oxígeno, pueden interferir en el potencial antioxidante de los caro-tenoides, dependiendo de su estructura y ubicación dentro de la célula. Los ca-rotenoides, en función de su naturaleza apolar, permanecen inmersos en lasmembranas, pudiendo secuestrar principalmente radicales generados dentro delas mismas, mientras que la vitamina C, por ser hidrosoluble, no logra interactuarcon esos radicales.

Las moléculas antioxidantes pueden actuar de modo sinérgico formando unabarrera contra la oxidación. Un mecanismo de interacción entre el β-caroteno, lavitamina E y la vitamina C fue propuesto por Truscott (1996). En ese modelo,la molécula de carotenoide elimina el radical de la vitamina E o radical tocoferi-lo (TOH•+), resultando en la formación del radical carotenoide (reacción 8), quea su turno es eliminado por acción de la vitamina C (ASCH2), la que es transfor-mada en el radical ascorbilo (A•-) (reacción 9). La regeneración de la molécula


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de ascorbato (ASC) a partir del radical ascorbilo (A•-), producida en las reaccio-nes 9 y 10, se describirá con detalle en el próximo capítulo.

CAR + TOH•+ → TOH + CAR•+ (8)CAR•+ + ASCH2 → CAR + A• + H+ (9)CAR•+ + ASC → CAR + A•- + H+ (10)

El efecto sinérgico entre los diversos antioxidantes depende del cociente molarentre los mismos. Un incremento o disminución de uno de estos componentesproporciona un desequilibrio, pudiendo generar una acción prooxidante. El incre-mento excesivo de la concentración de carotenoides resulta en la formación decarotenoides radicales (CAR•) muy por encima de la concentración del ascorba-to y tocoferol. La acumulación del CAR• propicia la reacción con los CAR pre-sentes (reacción 11), lo que puede ocasionar el efecto prooxidante de las célulasobservado en los estudios ATBC y CARET.

CAR1•+ + CAR2 → CAR1 + CAR2

•+ (11)

❚ CONCLUSIONES

Existe un gran número de estudios que evidencian una correlación negativa entreniveles de carotenoides en la sangre y el riesgo de enfermedades asociadas con elestrés oxidativo, como el cáncer y aterosclerosis; sin embargo, un exceso de estavitamina está asociado a un efecto prooxidante. En el capítulo Aspectos nutrio-lógicos de los carotenos de este mismo libro, se tratarán de manera profunda lostemas relacionados con los requerimientos de los carotenos, las fuentes de ladieta, su digestión y absorción, así como los efectos de su deficiencia.

❚ REFERENCIAS

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DDEELL ÁÁCCIIDDOO AASSCCÓÓRRBBIICCOO

Egle Machado de Almeida SiquieraSandra Fernandes Arruda

❚ INTRODUCCIÓN

Las plantas y la mayor parte de los animales son capaces de sintetizar al ácidoascórbico (C6H12O6) partiendo de D-glucosa o de D-galactosa. La presencia dedos grupos hidroxilo (-OH) ionizables (pKa1 4.25 y pKa2 11.8) le confiere a estamolécula su carácter ácido y la denominación ascorbato (ASC) por la predomi-nancia de la forma aniónica a pH fisiológico. Debido a la ausencia de la enzimagulonolactona oxidasa, que cataliza la última reacción de síntesis del ácidoascórbico (reacción 1), los seres humanos, así como los gorilas, cobayos y mur-ciélagos frugívoros son incapaces de sintetizar el ácido ascórbico partiendo de laD-glucosa, por lo que necesitan ingerir esta vitamina en su dieta. Debido a quedurante esta reacción existe una producción de H2O2, un incremento en la velo-cidad de síntesis del ascorbato puede llevar a una condición de estrés oxidativoen animales.

L-gulona-γ-lactona + O2 → L-ascorbato + H2O2 (reacción 1)

18

❚ EFECTOS ANTIOXIDANTES DEL ASCORBATO

Las funciones fisiológicas del ASC dependen en gran medida de su potencial deoxidorreducción. En la biosíntesis del colágeno, la carnitina y algunos neurotrans-misores, el ASC actúa como un cofactor de las enzimas hidroxilasas y oxigena-sas, manteniendo a los iones metálicos en el centro activo de estas enzimas en suforma reducida (Fe+2, Cu+1) y activando estas metaloenzimas.

El déficit de ASC en la dieta provoca la enfermedad conocida como escorbu-to, cuyas consecuencias son la insuficiencia en la síntesis de colágeno, las cualesse describen de manera detallada en el capítulo:Aspectos nutriológicos de la vita-mina C.

Además de su importante papel en la biosíntesis del colágeno, el ASC ha sidoseñalado como un potente antioxidante hidrosoluble en los fluidos biológicos,como secuestrador de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, como radicalhidroxilo (•OH), radical peroxilo (ROO•), superóxido (O2

•), bióxido de nitróge-no (NOO•) y oxígeno singulete (1O2), producidas naturalmente en los organis-mos animales. Al reaccionar con las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, elASC genera la especie radical denominada radical ascorbilo (A•) (reacción 2).

ASC + ROO• → A• + ROOH (reacción 2)

Otro mecanismo antioxidante propuesto para el ASC se asocia con su capaci-dad de regenerar antioxidantes de bajo peso molecular como el α-tocoferol, glu-tatión (GSH) y β-caroteno, partiendo de sus especies radicales (reacción 3, dondeX• representa a un antioxidante de bajo peso molecular en su forma radical y XH es la forma reducida del antioxidante de bajo peso molecular.

ASC + X• → A• + XH (reacción 3)

Regeneración del radical ascorbilo

Varias características hacen de la molécula de ascorbato un antioxidante eficaz.Tanto la forma ASC como el radical A•• (este último resultante de la oxidaciónparcial de la molécula de ascorbato) poseen un potencial de oxidorreducciónbajo, ya que fácilmente donan sus electrones a otras moléculas radicales y oxi-dantes de mayor potencial. La forma ascorbilo constituye una molécula radical,aunque de baja reactividad, dado que su electrón desapareado se encuentra esta-bilizado por resonancia. Además, esta molécula sufre rápidamente una dismuta-ción para convertirse en ASC o en ácido dehidroascórbico (DHA), formas noradicales del ascorbato (figura 18-1). La regeneración del ASC partiendo del A··


o del DHA se da tanto por procesos enzimáticos como no enzimáticos. El radi-cal ascorbilo, por ejemplo, puede ser reducido otra vez a ascorbato por acción delas enzimas semidehidroascorbato reductasa dependiente de NAPDH, o la sele-noenzima tiorredoxina reductasa (Trx), también dependiente de NAPDH, mien-tras que la forma DHA se reduce a ascorbato no enzimáticamente gracias a laacción del GSH y por la molécula de ácido lipoico, o enzimáticamente por acciónde las enzimas tiorredoxina reductasa o glutarredoxina dependientes de GSH(figura 18-2). Tanto la capacidad de regeneración del ascorbato a partir de A•• yDHA (figura 18-2), como la propiedad del A•• de estabilizar el electrón desapa-reado en su estructura molecular, hacen del ASC una molécula de menor reacti-vidad en comparación con otras especies reactivas de oxígeno, y en consecuencia, uneficaz antioxidante biológico no enzimático. Sin embargo, la reducción de gran-des cantidades de DHA a la forma ASC resulta en la reducción drástica de lasconcentraciones intracelulares de NADPH y GSH (figura 18-2), lo que resultaen la reducción de la capacidad reductora total de la célula. En algunos tipos decélulas, como las neuronas, la disminución de NADPH y GSH como consecuen-cia de la regeneración de ASC puede desencadenar un proceso de estrés oxidati-vo, resultando en la muerte de la célula, mientras que otros tipos de células, comolos astrocitos y osteoblastos, regeneran el ASC de manera abundante sin sufrirdaños. El mecanismo de regeneración del ASC es importante para el sistema bio-lógico, dado que mantiene vivo el potencial reductor celular, propiciando la re-ducción de varios equivalentes de oxidantes por cada equivalente de ASC.

Papel sinérgico del ascorbato con otras vitaminas

Otro mecanismo antioxidante sugerido para la molécula del ASC es un papelsinérgico con antioxidantes no enzimáticos, como el α-tocoferol (α-Toc) y loscarotenoides (CAR). El radical α-tocoferilo (α-Toc•), generado en la membranacelular como consecuencia de la acción del α-Toc como antioxidante, reacciona©

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Potencial antioxidante del ácido ascórbico • 281

Ascorbato (ASC) Ácido dehidroascórbico (DHA)Radical ascorbilo (A••)

HOCH2

HOCH

HOCH2 HOCH2

HOCH HOCH

OH-O

O O O

O O

OO

OO

O

e- H+ e- H+

e- H+

I II

e- H+

FFiigguurraa 1188--11.. Oxidación del ascorbato (ASC) a través de la donación sucesiva de dos electrones,produciendo el radical ascorbil (A••--) (reacción I) y ácido dehidroascórbico (DHA) (reacción II).

con el ASC regenerando el α-Toc y transfiriendo así el daño oxidativo a la faseacuosa. El A•• producido se regenera entonces a ASC por la acción de los sistemasNADPH y GSH dependientes ya descritos, eliminando el daño oxidativo de lamembrana (figura 18-3). Aunque el mecanismo descrito antes está bien caracte-rizado in vitro, la interacción entre las vitaminas C y E in vivo sigue siendo con-troversial.


1/2 NADP+

1/2 NADP+

1/2 NAD+

1/2 NADH1/2 NADPH

1/2 NADPH

Tiorredoxinareductasa

ASC

ASC

ASC

DHAGSH

GSSG

A reductasamitocondrialesy microsomales

X•

X•

A

A

X

X

II

III

VIV

IV

I

Directamente por víade la glutarredoxina por PDI

•

•

•

Tiorredoxina reductasay 3α-hidroxiesteroidedeshidrogenasa

FFiigguurraa 1188--22.. Esquema de reciclado intracelular del ascorbato (ASC). El radical ascorbilo (A•) for-mado a partir de la reacción del ASC con especies radicales (X•) puede ser reciclado nuevamentea ASC por acción de las enzimas tiorredoxina reductasa dependiente de NAPDH (reacción I) oascorbil reductasas dependientes de NADH mitocondriales o microsomales (reacción II). El A•

también puede ser reciclado a ácido dehidroascórbico (DHA) por dismutación de dos moléculasde A• (reacción III), o a través del ataque de otra molécula radical al A• (reacción IV). El DHAresultante puede entonces ser reducido a ASC directamente por el GSH, por acción de las enzi-mas GSH dependientes (glutarredoxina y proteína disulfito isomerasa-DI) (reacción V).Asimismo,el DHA puede ser reducido a ASC por las enzimas tiorredoxina reductasa y 3α-hidroxiesteroidedeshidrogenasa NAPDH dependientes (reacción VI).

En un estudio realizado recientemente en ratones portadores de la enfermedadllamada ddeessoorrddeenn oosstteeooggéénniiccoo ddee SShhiioonnooggii ((OODDSS)), caracterizada por la incapaci-dad de sintetizar ascorbato partiendo de glucosa, sometidos a dietas deficientesen vitamina C, vitamina E o ambas vitaminas simultáneamente, se observó quela deficiencia de vitamina C reducía significativamente la concentración de α-tocoferol en los tejidos (plasma, corazón, pulmón, hígado y riñones) en relacióncon el grupo control. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la vitamina Cpuede regenerar al radical α-Toc• in vivo de modo semejante al observado invitro. De forma recíproca, los ratones ODS sometidos a la dieta deficiente envitamina E presentaron bajas concentraciones de vitamina C en sus tejidos, sugi-riendo que la deficiencia de vitamina E acelera el consumo de ASC. Como laregeneración directa del ASC partiendo del A•• y DHA por el tocoferol no es posi-ble debido al menor potencial redox del último, se sugirió que la deficiencia devitamina E aumenta la generación de radicales en las regiones hidrofóbicas de lacélula, lo que resultaría en un aumento del estrés oxidativo en la fase acuosa, yen un consecuente mayor consumo de vitamina C. Estos datos refuerzan la hipó-tesis de interacciones in vivo entre las reacciones de generación de radicales libres©

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VII

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III IVROOH

ROOH RH

II

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RO2•

RO2•

DHAASC

ASC•

Toc•

R•X•

XH

RH

Toc

I

FFiigguurraa 1188--33.. Regeneración del α-tocoferol (α-Toc) partiendo de un radical α-tocoferil (α-Toc•) porel ascorbato (ASC). La molécula del lípido origina, tras el ataque de una molécula radical (X•), aun lípido radical (R•) (reacción I), que reacciona rápido con el oxígeno formando un radical pero-xilo del lípido (RO2

•) (reacción II) que inicia una reacción en cadena. El tocoferol (α-Toc) secues-tra el radical peroxilo (RO2

•), interrumpiendo la propagación de la reacción de oxidación encadena (reacción III). El radical α-Toc• puede secuestrar a otro radical peroxilo, originando unaducto terminal en el radical (TocOOR) (reacción IV), y también puede ser regenerado a α-Tocpor acción del ascorbato (ASC) (reacción V). El radical ascorbilo (A•) formado puede ser regene-rado a ácido dehidroascórbico (DHA) (reacción VI), y posteriormente a ASC por reducción enzi-mática o no enzimática.

en las fases acuosa e hidrofóbica de la célula mediada por la acción sinérgica entreantioxidantes como las vitaminas C y E. Una asociación entre el ASC y el GSHse sugirió en ese mismo estudio. Kojo (2004) verificó que los niveles de ASC yGSH plasmático y hepático disminuían gradualmente durante la eliminación deASC en los ratones ODS. El autor sugiere que esta reducción es una consecuen-cia de un incremento de la demanda de GSH, como consecuencia del estrés oxi-dativo o del aumento del reciclaje del ascorbato.

❚ EFECTOS PROOXIDANTES DEL ASCORBATO

Paradójicamente, este mismo potencial reductor de las especies reactivas de oxí-geno o de los metales de transición asociados al sitio activo de las enzimas bio-sintéticas, que hace del ascorbato una molécula imprescindible para la mayoríade los seres vivos, también puede desencadenar procesos prooxidantes en los sis-temas biológicos. A causa de su potencial reductor, el ascorbato puede participarindirectamente en las reacciones de producción de especies reactivas de oxígenoa través de la reducción de iones Fe+3 (reacción 4) o de Cu+2 (reacción 5), meta-les involucrados en reacciones como la de Fenton, generadoras de radicales •OH(reacciones 6 y 7), o radicales alcoxilo de lípidos (RO•) (reacciones 8 y 9).

ASC + Fe+3 → A•• + Fe+2 + H+ (reacción 4)ASC + Cu+2 → A•• + Cu+1 + H+ (reacción 5)H2O2 + Fe+2 → Fe+3 + OH– + •OH (reacción de Fenton) (reacción 6)H2O2 + Cu+1 → Cu+2 + OH– + •OH (reacción de Fenton) (reacción 7)ROOH + Fe+2 → RO• + Fe+3 + –OH (reacción 8)ROOH + Cu+ → RO• + Cu+2 + –OH (reacción 9)

Debido a la existencia de varias proteínas unidoras de metales como la ferriti-na, transferrina, ceruloplasmina y otras, cuya función es justamente la de almace-nar y transportar estos metales a través del plasma de manera segura, se cree quelas reacciones descritas antes no son tan significativas in vivo. Sin embargo, lostejidos dañados pueden presentar iones metálicos libres, disponibles para la catá-lisis de las reacciones mencionadas. Las especies reactivas de oxígeno y los radi-cales libres generados, pueden entonces promover la oxidación de cualquiercomponente celular como los lípidos, proteínas y DNA. Los lípidos de membra-na parecen ser más susceptibles a las reacciones de oxidación, y la determinaciónde la concentración de los lípidos oxidados en los tejidos constituye una de lastécnicas experimentales más utilizadas para evaluar daños oxidativos in vivo. Noobstante, la oxidación de nucleótidos o bases nitrogenadas y proteínas tambiénpuede ser determinada en fluidos y tejidos biológicos.


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Entre los diversos productos de la oxidación de las bases nitrogenadas identi-ficados, la 8-oxoguanina (8-oxogua) y la 8-oxo-2’-desoxiguanosina (8-oxodG u8OHdG) parecen ser los más abundantes y mutagénicos (véase capítulo deDaño al DNA). El agregado de vitamina C en presencia de metales de transicióna núcleos aislados o DNA purificado promueve la ruptura del DNA y la oxida-ción de las bases nitrogenadas con el consecuente incremento de la concentraciónde la 8-oxodG, sugiriendo que la vitamina C presenta un potencial prooxidante.Con todo, en ausencia de estos metales, la vitamina C presenta una actividadantioxidante, expresada en la disminución de la producción de 8-oxodG en elDNA purificado al ser expuesto a peróxido de nitrito o a luz ultravioleta. La vita-mina C actúa asimismo como antioxidante en las células, inhibiendo el daño oxi-dativo en el DNA aislado o en los cultivos de células expuestos al peróxido dehidrógeno y a la luz UV. Contrariamente a estos hallazgos, varios estudios hanreportado un incremento en la producción de daños oxidativos al DNA en cul-tivos de células y en linfocitos humanos en presencia de vitamina C. Sin embar-go, se sospecha que en dichos estudios el efecto prooxidante del ASC puededeberse a la presencia de iones metálicos contaminantes en el medio de cultivo.

En animales, un estudio realizado en cobayos suplementados con vitamina C,demostró que variaciones drásticas en la cantidad de vitamina C dietética (defi-ciencia, dosis recomendada o megadosis) no afectó la concentración hepática de8-oxodG. Sin embargo, un estudio subsiguiente realizado por otro grupo, revelóque el complemento con vitamina C redujo de manera significativa la ruptura dela hebra de DNA del epitelio ocular de cobayos expuestos a radiación UV, mien-tras que la deficiencia de vitamina C resultó en un aumento de estos daños.

Un artículo publicado en la revista Nature, en 1998, en el cual se verificó unadisminución significativa en la concentración de 8-oxogua y un aumento de 8-oxoade en relación con el grupo placebo, en linfocitos humanos de individuossanos suplementados con 500 mg de vitamina C al día, ocasionó una gran polé-mica al sugerir un efecto prooxidante del ASC en humanos. El diseño experi-mental de este artículo fue duramente criticado por varios autores, que señalabanentre otras cosas la oxidación inherente a la cromatografía gaseosa-espectrome-tría de masas, técnica utilizada en el estudio de Podmore et al. para determinarla oxidación en bases nitrogenadas, dado que los niveles de 8-oxogua presentadosen el estudio eran de 10 a 100 veces superiores a los reportados por otros auto-res para linfocitos humanos; la suplementación con ASC en individuos sanos nodebería afectar los niveles de ASC en los linfocitos, dado que los niveles plasmá-ticos basales de ASC eran ya saturantes (51 μmol/L) al inicio del estudio, y porúltimo, se criticó la ausencia de un grupo placebo durante todo el estudio.

Rehman et al. (1998), evaluando el posible efecto prooxidante de la suple-mentación de vitamina C (60 y 260 mg/día), verificaron una correlación inversaentre los niveles de daños totales en el DNA y la concentración de ASC plasmáti-


co, y una correlación directa entre el ASC plasmático y la saturación de transfe-rrina. Estos resultados confirman el efecto de la vitamina C sobre el metabolis-mo del hierro, y su acción antioxidante sobre la molécula del DNA, incluso enindividuos con complemento simultáneo de hierro.

Se ha establecido una relación inversa entre los niveles plasmáticos y en teji-dos de vitamina C y los biomarcadores de peroxidación lipídica (malonaldehído(MDA) y 4-hidroxinonenal (4HNE), aldehídos producidos a partir de la degra-dación de lípidos peroxidados). Cobayos y ratones ODS suplementados con vita-mina C presentaron menores niveles endógenos de MDA. El efecto antioxidantede la vitamina C también se observó en animales suplementados con ASC yexpuestos a endotoxinas y humo de cigarrillo. Estudios en cobayos, empleando lasuplementación simultánea con vitamina C y hierro, mostraron una reducción enlos niveles de MDA, sugiriendo un efecto antioxidante del ASC y no un efectoprooxidante, a pesar de la presencia adicional de hierro en la dieta. Muchos tra-bajos en la literatura presentan incluso resultados controversiales en cuanto a laexistencia de una correlación entre el estado nutricional en relación con la vita-mina C y daños oxidativos a lípidos en seres humanos.

❚ ASCORBATO Y CÁNCER

Los datos obtenidos acerca del uso de ácido ascórbico en el tratamiento del cán-cer también son bastante controversiales. Algunos estudios en humanos handemostrado que dosis farmacológicas (10 mg/día) aumentan la supervivencia depacientes con cáncer, mientras que en otros estudios, utilizando dosis semejantes,no se observó esta mejoría. En estos estudios se utilizaron diferentes vías deadministración de la vitamina, oral e intravenosa, las que promueven concentra-ciones plasmáticas muy distintas. Estudios farmacocinéticos mostraron que laadministración intravenosa de 10 mg de ácido ascórbico, en hombres y mujeres,produce una concentración plasmática cercana a 6 mM, cerca de 25 veces mayorque la obtenida con la misma dosis por vía oral. Aunque los resultados sean aúninconsistentes, los practicantes de medicina alternativa utilizan la complementa-ción de vitamina C por vía intravenosa en algunos pacientes, en parte porque noexiste un prejuicio aparente.

En un estudio reciente realizado en mitocondrias aisladas de células 293T(células renales humanas) tratadas antes con DHA en concentraciones crecien-tes, se observó que el ASC entra en la mitocondria como DHA a través del trans-portador de glucosa 1 (Glut1), y que la concentración de DHA en este organelodepende de la dosis. Los autores verificaron además que el tratamiento de lascélulas con ASC, en presencia o ausencia de agentes antioxidantes, resultó en unareducción en la concentración de O2

•, •OH y H2O2 mitocondrial. Estos resulta-


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dos sugieren que la molécula de ASC ejerce una acción antioxidante tanto encondiciones fisiológicas como en condiciones de mayor estrés oxidativo. Con baseen estos resultados, los autores resaltan la relevancia del uso farmacológico de lavitamina C en la protección del genoma mitocondrial contra daños oxidativos.

❚ ASCORBATO Y ÓXIDO NÍTRICO

El óxido nítrico (NO•) producido en el endotelio vascular a partir de L-argininapor acción de la enzima óxido nítrico sintetasa es una molécula crucial para elcontrol del tono vascular, presión arterial, proliferación de las células musculareslisas y adhesión plaquetaria a la superficie del endotelio. Una característicacomún de las enfermedades cardiovasculares es el descenso de la actividad bioló-gica del NO•. Parece ser que el ASC estimula la producción del NO• a través desu acción como antioxidante. Las células endoteliales de la aorta de cerdos, trata-dos con dosis crecientes de ácido ascórbico (0.1 a 5 mM), presentaron un aumen-to proporcional en la concentración de la 3’5’ monofosfato de guanosina cíclico(cGMP) provocado por el incremento de la actividad enzimática de la óxidonítrico sintetasa endotelial (eNOS). El incremento de la actividad enzimática dela eNOS depende de la concentración de tetrahidrobiopterina (BH4), en suforma reducida. Se cree que el ácido ascórbico ejerce un papel importante en la reducción de la molécula de biopterina, que resultaría en un incremento de labiosíntesis de NO• en los tejidos y, consecuentemente, en una mayor proteccióndel organismo contra las miocardiopatías. Esta acción del NO• en el sistema car-diovascular, por otro lado, es sensible a la presencia del radical O2

•. Los animaleshipercolesterolémicos e hipertensos presentan un exceso de producción vascularde O2

• asociado a una menor actividad del NO•. Así, tanto la enzima superóxidodismutasa, que cataliza la reacción de dismutación del O2

•, como el ASC, soncapaces de eliminar esta especie reactiva de oxígeno del plasma. Dosis farmaco-lógicas de ASC (cerca de 10 mM) aumentan la actividad del NO• en condicio-nes como diabetes, hipercolesterolemia e hipertensión.

❚ ASCORBATO Y ENVEJECIMIENTO

Por último, se ha estudiado la función del ASC en el proceso de envejecimiento.Según varios autores, el envejecimiento consiste en una acumulación de dañosoxidativos en las células y tejidos, quizá como consecuencia de la pérdida gradualde la capacidad antioxidante total del organismo, que resulta en un aumento dela morbilidad y mortalidad del individuo. Loo et al. (2003), al estudiar los valo-res de ASC en plasma y tejidos de ratones seniles y jóvenes, observaron que la


concentración de ese antioxidante en el plasma presentaba una disminución sig-nificativa en el plasma, corazón, músculo esquelético, hígado, riñones y pulmonesde los animales seniles en relación con los jóvenes. Al analizar el nivel de peroxi-dación lipídica en el corazón de los animales, los autores observaron una reduc-ción en los valores de ASC y un incremento en la peroxidación lipídica del tejidocardiaco de ratones seniles. Estos resultados evidencian una reducción en la acti-vidad antioxidante de animales seniles, y sugieren un papel antioxidante para elácido ascórbico in vivo.

❚ CONCLUSIONES

Como se mencionó a lo largo de este capítulo, el ASC es una molécula impres-cindible para los organismos, ya sea que la sinteticen o la tengan que consumir dela dieta, como en el caso de los humanos. Aun cuando sus efectos como antioxi-dante y como vitamina sinérgica con las vitaminas A y E ya han sido aceptadospor la comunidad científica, queda por entender su mecanismo en distintos sis-temas, así como aclarar su posible efecto prooxidante.

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DDEE LLOOSS αα--TTOOCCOOFFEERROOLLEESS

Yolanda Saldaña Balmori

❚ INTRODUCCIÓN

En 1922, Hebert Evans y Katherine Bishop realizaron una serie de investigacio-nes para estudiar la influencia de la nutrición sobre la reproducción en animalesde laboratorio. A partir de sus resultados, encontraron que cuando los anima-les eran alimentados con dietas a base de manteca rancia se presentaban trastornosen la reproducción, esto se corregía cuando agregaban trigo entero o vegetalesfrescos a esa dieta. Posteriormente, encontraron que en el aceite del germen detrigo había componentes con propiedades vitamínicas; Evans, en 1925, sugirióque a este factor dietético se le designara la letra E, que es lo que hoy se conocecomo vitamina E.

En 1937, Emerson aisló, purificó y reportó al factor E como un antioxidantenatural al cual llamó tocoferol (del griego tokos, que significa nacimiento, yphero fortaleza), el sufijo “ol” indica la naturaleza alcohólica de la sustancia. Des-pués de muchos estudios para su identificación, purificación y síntesis, se aceptóde manera universal a la vitamina E como el genérico de un conjunto de deriva-dos tocoferoles y tocotrienoles.

Estructuralmente, todos los componentes de este grupo poseen un núcleoheterocíclico oxigenado, el núcleo ccrroommaannoo, con un grupo OH, además de poseer

19

grupos metilo y una cadena lateral fitilo de origen terpénico. Los distintos toco-feroles o tocotrienoles son designados por las letras griegas α, β, γ y δ, respectiva-mente, y sólo difieren entre sí por la cantidad y posición de los grupos metilo delcromano. Los tocoferoles y tocotrienoles poseen estructuras similares, la diferen-cia entre ellos está en que los primeros poseen una cadena lateral saturada y enlos segundos ésta es insaturada (cuadro 19-1 y figuras 19-1 y 39-1 del capítuloAspectos nutriológicos de la vitamina E). Dada su naturaleza hidrofóbica, estasmoléculas presentan un carácter lipofílico, por tal razón se acumulan en lipopro-teínas circulantes, membranas celulares y en depósitos de grasa, en donde reac-cionan muy fácilmente con oxígeno molecular y con los radicales libres de losácidos grasos poliinsaturados que por diferentes mecanismos se producen enlipoproteínas, fosfolípidos y triacilglicéridos.

Este capítulo se enfocará a describir y analizar las propiedades del d-α-tocofe-rol (α-Toc), ya que es la molécula de vitamina E que posee la mayor capacidadantioxidante, su fórmula empírica es C31H52O3, tiene un peso molecular de472.8 y se encuentra en una gran variedad de alimentos. La fuente principal sonlos aceites de soya, cacahuate, algodón y girasol, se encuentra también en chícha-ros, garbanzos, lentejas, así como en cereales como trigo, avena y arroz inte-gral; al igual que el resto de las vitaminas, debe ingerirse vía dietética o comocomplemento debido a que no puede ser sintetizada por los animales. Los reque-rimientos dietéticos de esta vitamina, su absorción y excreción, así como lo queocurre en caso de una deficiencia en su ingesta, se tratarán con más detalle en elcapítulo Aspectos nutriológicos de la vitamina E.

❚ EFECTOS ANTIOXIDANTES DEL αα-TOCOFEROL

El α-tocoferol es el principal antioxidante liposoluble que protege a la célula delos radicales libres. A diferencia de la mayor parte de las vitaminas, el α-Toc noreacciona acoplado a enzima alguna, sino a través de su sitio activo, que es el –OHen la posición 6 del anillo cromano. Su función principal es la de destruir la


CCuuaaddrroo 1199--11.. GGrruuppooss mmeettiilloo ddeell aanniilllloo ccrroommaannoo ddee llooss ttooccooffeerroolleess yy llooss ttooccoottrriieennoolleess

TTooccooffeerroolleess yy ttooccoottrriieennoolleess

RR11 RR22 RR33

α CH3 CH3 CH3β CH3 H CH3γ H CH3 CH3δ H H CH3

mayor parte de las formas reactivas de radicales libres del oxígeno y de otros radi-cales libres, protegiendo a los ácidos grasos insaturados de la oxidación, con loque se previene el daño oxidativo de los lípidos de la membrana, lo que ocasio-naría fragilidad y lisis celular. Asimismo, la vitamina E desempeña una funciónimportante en el sistema inmunológico, en la reparación de DNA y otros proce-sos del metabolismo; puede prevenir eritemas solares al reducir el proceso infla-matorio y el incremento de la permeabilidad vascular, así como la formación demanchas cutáneas de lipofucsina, además poseer un efecto protector sobre losdaños degenerativos que sufre el tejido conjuntivo (elastosis y pérdida de funcio-nalidad de las fibras de colágena).

Inhibición de la lipoperoxidación

Como se mencionó, la principal actividad biológica de la vitamina E es la pro-tección de la membrana celular debida al núcleo cromanol del α-Toc. La vitami-na E reacciona con el radical peroxilo (ROO••) y forma el radical α-tocoferilo(α-Toc•), el electrón desapareado se deslocaliza sobre el anillo aromático, lo quehace que sea insuficientemente reactivo para abstraer al hidrógeno del grupometileno de los ácidos grasos poliinsaturados presentes en los fosfolípidos de lamembrana, por esta razón la reacción en cadena de la lipoperoxidación se detie-ne, el radical α-Toc• actúa como agente de terminación. Éste es un radical libre©

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Potencial antioxidante de los α-tocoferoles • 293

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FFiigguurraa 1199--11.. Estructuras de ((II)) d-α-tocoferol y ((IIII)) d-α-tocotrienol.

estable, ya que tiene una vida media muy larga, porque el electrón desapareadodel átomo del oxígeno puede ser deslocalizado en el anillo aromático, de ahí quesu regeneración se logra con la participación de la vitamina C plasmática, que alceder dos electrones, uno por uno forma el ácido dehidroascórbico, una moléculatotalmente oxidada que se reduce por la participación del NADH (figura 19-2).

En 1968, Tappel propuso un sinergismo entre el ácido ascórbico y el radical α-Toc• para atrapar radicales libres altamente reactivos. El ascorbato (ASC) es elúnico antioxidante endógeno en el plasma que puede proteger contra el dañoperoxidativo inducido por radicales peroxilo. Frei et al., sugirieron que la patolo-gía relacionada con los peróxidos derivados de los lípidos que resulta de la acti-vación aguda o crónica de los leucocitos puede prevenirse por la administracióncomplementaria de ácido ascórbico. Por otro lado, pocos temas han sido tan con-trovertidos como el de que el ácido ascórbico previene o cura el catarro común;desde el punto de vista bioquímico puede mencionarse que la vitamina C proporciona una protección contra los agentes oxidantes que son producidos porlos neutrófilos activados.

La actividad más importante del ASC es su capacidad para actuar como dona-dor de electrones al reducir el Fe3+ a Fe2+. La donación de un electrón por el ASCforma el radical semidehidroascorbato, el cual después puede ser oxidado a dehi-droascorbato (véase capítulo 18).

Por otro lado, el radical α-Toc• formado puede unirse a otro radical, o bienactuar de nuevo como antioxidante, cediendo un segundo átomo de hidrógeno aotro radical, y convirtiéndose por último en la tocoferil-quinona, una sustanciaestable. En general, todos los antioxidantes que actúan de esta forma tienen comopropiedades estructurales comunes el grupo fenólico, que cede el hidrógeno ypermite la deslocalización del electrón sobre el anillo aromático y la presencia degrupos voluminosos unidos al anillo, cuyo impedimento estérico también contri-buye a disminuir la reactividad del radical.

La vitamina E, además de actuar sobre el radical ROO•, puede participar conlos radicales triclorometil (•CCl3), hidroxilo (•OH), superóxido (O2

•), y con eloxígeno singulete (1O2).

Hay evidencia de que un aumento de la concentración de aldehídos, peróxi-dos y lipofucsina en los tejidos, así como en los niveles de etano y pentano en elaire exhalado por las ratas, coincide con una deficiencia de vitamina E. Se tienenalgunos reportes en los que la producción de especies reactivas de oxígeno en elmiocardio dañado inducido por isquemia, se ve significativamente disminuidacuando hay un tratamiento previo con vitamina E. El contenido de vitamina Edetermina la susceptibilidad al daño por agentes oxidantes, como son los radica-les hidroxilo, alcoxilo, peroxilo, el oxígeno singulete y quizás varios complejos demetales unidos al oxígeno en los microsomas, hepatocitos u órganos enteros.


Protección contra el estrés oxidativo

A partir de los estudios realizados sobre el estado de oxidación de la célula, sellegó a la conclusión de que tres reacciones celulares dependen del α-Toc: launión del factor de transcripción AP-1 al DNA, la inhibición de la proteína cina-sa C y la proliferación celular. A partir de estos estudios, se llegó a la conclusiónde la existencia de una proteína que une al α-Toc. Ha sido postulado que en con-centraciones fisiológicas, el α-tocoferol se une con una proteína receptora, a suvez provoca la activación de AP-1, y luego la activación de una proteína fosfata-sa que conduce a la desfosforilación de la proteína cinasa C (PKC). Esto traecomo consecuencia la inhibición de la PKC y por tanto, la inhibición final de laproliferación celular. Sin embargo, cuando hay una deficiencia de vitamina E,como puede presentarse durante el estrés oxidativo, ocurre una disminución dela unión del α-Toc al receptor proteínico, una acción disminuida de la proteínafosfatasa, y una mayor actividad de la PKC, y como resultado final, un aumentoen la proliferación celular. En conclusión, el α-Toc parece actuar como mensaje-ro del estado oxidativo de la célula y como un transductor capaz de informar alas células de su situación.

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Efecto cooperativo del α-tocoferol y de la vitamina C

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Vit C

FFiigguurraa 1199--22.. Efecto cooperativo del α-tocoferol y del ácido ascórbico protegiendo de la lipopero-xidación. Cuando el α-tocoferol reacciona con un radical lipoperoxilo (ROO••) se forma el radicalα-tocoferilo (α-Toc••), el electrón desapareado es fácilmente deslocalizado en el anillo aromático,esto lo torna en un radical estable. El ácido ascórbico puede reducir al radical α-tocoferilo transfor-mándose en el radical semidehidroascórbico en la superficie de la membrana.

❚ PARTICIPACIÓN DE LA VITAMINA E EN PROCESOS PATOLÓGICOS

Se han realizado numerosos estudios para determinar si la vitamina E, a través desu habilidad para limitar la producción de radicales libres, podría ayudar a preve-nir o retrasar el desarrollo de las siguientes enfermedades.

Intervención en la aterosclerosis

La aterosclerosis se caracteriza por el depósito de ateromas en la íntima de lasarterias, que es el resultado de la unión de células del músculo liso, macrófagosy residuos celulares; los macrófagos se llenan de lípidos, especialmente coleste-rol y ésteres del colesterol de los depósitos de LDL de la pared arterial, mástarde la placa aterosclerótica se calcifica, disminuye el paso de luz en la arteriaimpidiendo el paso de la sangre y ocurre la enfermedad arterial coronaria. Encondiciones normales, la función del receptor de las LDL está muy regulada,cuando entra un número elevado de partículas de LDL se produce un descensoen la síntesis de sus receptores; por el contrario, los macrófagos que partici-pan en el ateroma poseen concentraciones elevadas de receptores de LDL y launión de ellos a la LDL existente desencadena la endocitosis. El α-tocoferol,en unión conel ácido ascórbico, pueden retrasar o detener el proceso de la for-mación de los ateromas.

Prevención de enfermedades coronarias

Se han realizado investigaciones que conducen a pensar que la vitamina E puedeayudar a prevenir o retrasar enfermedades coronarias. Como resultado de talesinvestigaciones se ha detectado que cambios oxidativos en el colesterol LDL promueve las obstrucciones en las arterias coronarias que pueden conducir a losataques del corazón, y que la vitamina E puede ayudar a prevenir o retrasar la en-fermedad cardiaca coronaria limitando la oxidación del LDL-colesterol. Delmismo modo, la vitamina E puede ayudar a prevenir la formación de los coágu-los de la sangre, que podrían conducir a un ataque del corazón. Hay varios estu-dios de observación que han asociado índices más bajos de la enfermedadcardiaca a la ingesta más alta de vitamina E como complemento dietético, y quela cantidad de la vitamina presente en los alimentos no está asociada a la reduc-ción significativa del riesgo cardiaco. Una revisión en 1994 de 5 133 hombres ymujeres finlandeses entre 30 a 69 años también sugirió que la ingesta dietéticacreciente de la vitamina E se relacionaba con una mortalidad disminuida de laenfermedad cardiaca.


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Aunque estas observaciones son prometedoras, en otros estudios se cuestionanla eficacia de los complementos de la vitamina E en la prevención de la enferme-dad cardiaca. El estudio The Heart Outcomes Prevention Evaluation (HOPE)observó a casi 10 000 pacientes durante 4 a 5 años que estaban en alto riesgo deun ataque al corazón; en este estudio, los individuos que recibieron diario mag-nesio y 400 UI de vitamina E no experimentaron diferencias perceptibles en suscomportamientos cardiovasculares comparados con los que recibieron un place-bo. Los investigadores sugirieron que era inverosímil que el complemento de lavitamina E proporcionara alguna protección contra la enfermedad cardiovascu-lar. Al mismo tiempo, un estudio multinacional realizado en 11 países reportóuna relación inversa entre la concentración sérica de tocoferol y la probabilidadde muerte por enfermedad coronaria. Por otro lado, hay que tener en cuenta quelos requerimientos de vitamina E se incrementan en ciertas situaciones: ejerciciomuy intenso, consumo de dietas ricas en ácidos grasos poliinsaturados, exposicióna contaminación ambiental, aumento de la edad, entre otras.

Participación en la prevención del cáncer

Se cree que los antioxidantes como la vitamina E pueden ayudar a proteger lasmembranas de la células contra los efectos perjudiciales de los radicales libres,que pueden contribuir al desarrollo de enfermedades crónicas como cáncer;puede bloquear la formación de las nitrosaminas que son agentes cancerígenosformados en el estómago a partir de los nitritos consumidos en la dieta; puedeproteger contra el desarrollo de cánceres realzando la función inmunitaria. Unacierta evidencia asocia una ingesta más alta de vitamina E con una incidenciamenor de cáncer de próstata. La American Cancer Society ha presentado resul-tados de un estudio a largo plazo que evaluó el efecto del uso regular de la vita-mina C y la vitamina E en la mortalidad del cáncer de vejiga en casi 1 000 000de adultos en EUA. El estudio, llevado a cabo entre 1982 a 1998, reportó quelos individuos que consumieron regularmente un complemento de vitamina Epor más de 10 años tenían un riesgo reducido de muerte por cáncer de vejiga.Por desgracia, los ensayos y exámenes humanos que han intentado asociar laingesta de la vitamina E con la incidencia del cáncer por lo general han sidopoco concluyentes; un análisis del efecto de factores dietéticos, incluyendo lavitamina E, en la incidencia del cáncer mamario en 18 000 mujeres posmeno-páusicas del estado de Nueva York, no asoció una mayor ingesta de vitamina Econ un riesgo reducido de desarrollar el cáncer. Por el momento, los investiga-dores cuentan con una evidencia limitada y esperan que nuevas investigacionespuedan aclarar más al respecto.


Lesiones por isquemia y repercusión

Cuando se ha producido un infarto de miocardio y se ha realizado el tratamientocorrespondiente, el tejido previamente isquémico (en donde existe un ambienteoxidativo considerable) y después revascularizado (ya sea mediante tratamientofibrinolítico o mediante cirugía de derivación coronaria), libera a la circulaciónsanguínea general una gran cantidad de radicales libres con los consecuentes efec-tos adversos a nivel sistémico. Se ha demostrado que el tratamiento con dosis elevadas de vitamina E antes del tratamiento quirúrgico para la revascularización,tiene efectos protectores.

Participación en el sistema inmunológico

Las bajas concentraciones de vitamina E se asocian con la desestabilización delas membranas de las células encargadas del sistema inmunitario, disminuciónde la hipersensibilidad retardada y con la disminución de la producción deinmunoglobulina, así como con la disminución de la inmunidad mediada porcélulas y la producción de interleucina-2 (IL-2). Estos efectos adquieren rele-vancia en el envejecimiento, ya que se ha reconocido que con la edad, losmamíferos presentan una disminución progresiva de la actividad del sistemainmunitario. Con la edad se alteran las concentraciones de las citosinas IL-2 eIL-6. La IL-2 se encuentra disminuida, mientras que el incremento de la IL-6se ha sido relacionado con un aumento del estrés oxidativo, y éste a su vez conuna deficiencia de vitamina E. La disminución de la hipersensibilidad retarda-da de la respuesta inmunitaria celular y de la producción de inmunoglobulinasdurante un déficit de vitamina E, no parece relacionarse con la capacidad antio-xidante de la vitamina, pero sí con la inducción de la proliferación celular. Porotro lado, se ha demostrado en humanos que con la vitamina E aumenta elpoder bactericida de los leucocitos.

Efectos sobre la apoptosis

Desde hace años se viene investigando sobre el posible papel preventivo de lavitamina E en relación con el cáncer. En este sentido resulta interesante el efec-to de la vitamina E sobre la apoptosis, la cual puede estar involucrada en la eli-minación de células tumorales y se caracteriza por la retención de la integridadestructural de las membranas y organelos, reducción del volumen celular, con-densación de la cromatina, fragmentación nuclear y por último, fragmentacióncelular en forma de cuerpos apoptóticos. La vitamina E, específicamente el suc-


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cinato de α-tocoferol (α-Toc-Suc), que es una forma muy activa, puede inducirapoptosis directa o indirecta en células tumorales. Estos efectos dependen de ladosis, el periodo de exposición y el tipo de células, ya que incluso se ha descritola inducción de eventos antiapoptóticos en algunas células neoplásicas. Sinembargo, estudios realizados en animales y en humanos a los que se les han sumi-nistrado altas dosis de vitamina E, no se ha podido demostrar la inducción deapoptosis en células normales. Este efecto selectivo proporciona nuevas perspec-tivas sobre el uso de la vitamina E en la prevención del cáncer. El α-Toc-Suc enuna concentración de 10 mg/mL es letal para las células del melanoma B-16 demurinos en un período de 24 h en cultivo, pero en concentraciones menores (6 a 8 mg/mL), induce diferenciación celular e inhibición del crecimiento. El usode mezclas de vitaminas produjo de manera consistente efectos inhibitorios delcrecimiento en dosis en las que cada vitamina por separado no es suficiente paraafectar el crecimiento de las células. Los mecanismos moleculares que se han pro-puesto para la inducción de la apoptosis por la vitamina E incluyen la conversiónde la forma latente del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) a su formabiológicamente activa, que a su vez incrementa la expresión de c-jun, así comola unión de AP-1 al DNA. Otra vía activada por la vitamina E es la de señaliza-ción FAS/FAS ligando. Se ha informado en la literatura que el α-tocoferol pro-viene de la apoptosis inducida por luz ultravioleta en células de la epidermis. Noexiste evidencia de que la vitamina E interfiera con la muerte apoptótica queocurre durante el proceso posterior al desarrollo y crecimiento celular normal.

Contaminación ambiental

El ozono (O3) y el bióxido de nitrógeno (NO2) son contaminantes ambientalesmuy comunes, con un poderoso efecto oxidante que afecta el funcionamientopulmonar, se ha demostrado que en casos de deficiencia de vitamina E tanto enanimales de laboratorio como en los humanos incrementan considerablemente elriesgo de lesión pulmonar. Por otro lado, al inspirar estos gases pueden interac-tuar como agentes desencadenantes de la lipoperoxidación de las membranas.

Tabaquismo

No existe relación directa alguna entre el uso del tabaco y la concentración san-guínea de tocoferol; sin embargo, a nivel pulmonar, la concentración de tocoferoldisminuye considerablemente en el caso del tabaquismo. En algunos estudios sesugiere que el cáncer pulmonar es más frecuente en personas fumadoras con defi-ciencia adicional de vitamina E en la sangre.


Exceso de ejercicio físico

Packer, en California, comprobó que el ejercicio físico eleva la cantidad de pen-tano espirado –que es uno de los productos de la lipoperoxidación– y que laadministración complementaria de vitamina E durante dos semanas redujo signi-ficativamente la cantidad de pentano expelido tanto en reposo como durante elejercicio.

❚ CONCLUSIONES

Se puede concluir que la profundización en las variadas funciones de la vitaminaE podrá ampliar en un futuro sus potencialidades de aplicación terapéutica en el amplio campo de las enfermedades. La gran variedad de trastornos en cuya fisiopatología desempeña un papel central son estrés oxidativo, mecanismosinmunológicos, fenómeno de la apoptosis, desarrollo de cataratas, aterosclerosis,cáncer, entre otros, y en todos los casos la reacción desencadenante es la lipope-roxidación, lo cual ha logrado que se incremente el interés por el estudio de laspropiedades farmacológicas de este compuesto.

❚ REFERENCIAS

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PPOOLLIIFFEENNOOLLEESS

Rafael Díaz Sobac

❚ INTRODUCCIÓN

Las tendencias mundiales de la alimentación en los últimos años indican uninterés acentuado de los consumidores hacia el consumo de frutas y vegetales,que además del valor nutritivo aporten beneficios a las funciones fisiológicas delorganismo humano. Estas variaciones en los patrones de alimentación han gene-rado una nueva área de desarrollo en la que la ciencia de los alimentos y de lanutrición, junto con la investigación clínica y biomédica, interactúan de unaforma innovadora en el estudio de los llamados “alimentos funcionales”. Éstos sehan definido como cualquier alimento en forma natural o procesada, que ade-más de sus componentes nutritivos contienen componentes adicionales quefavorecen la salud, la capacidad física y el estado mental de una persona. Uncampo importante en la investigación de los alimentos funcionales lo constitu-yen los ppoolliiffeennoolleess presentes en frutos y vegetales. En este sentido, en los últi-mos 10 años las frutas, por su contenido y variedad de polifenoles, se hanreconocido científicamente como fuente de biomoléculas funcionales con acti-vidad antioxidante que actúan como mediadores de diversos efectos benéficosen la salud. Las propiedades antioxidantes han encontrado una gran aceptación

20

debido a que en la actualidad se le ha dado gran difusión a la necesidad de con-sumir sustancias para evitar que los radicales libres puedan causar enfermeda-des, principalmente el cáncer.

❚ CLASIFICACIÓN Y CARACTERÍSTICAS QUÍMICASDE LOS COMPUESTOS POLIFENÓLICOS

Los compuestos de tipo fenólico constituyen uno de los diferentes grupos de biomoléculas presentes en un gran número de frutas y verduras. Son sustanciasquímicas que poseen un anillo aromático, con uno o más grupos hidroxilos, in-cluyendo derivados funcionales ésteres, metil ésteres y glucósidos, entre otros. Lanaturaleza de los fenoles varía desde moléculas simples (como los ácidos fenóli-cos), hasta compuestos altamente polimerizados, como los taninos. La forma máscomún de encontrarlos en las frutas y vegetales es como glucósidos, en formaconjugada con uno o más residuos de azúcar unidos a los grupos hidroxilos, aun-que en algunos casos se pueden producir uniones directas entre una molécula deazúcar y un carbono aromático. Los azúcares asociados pueden ser de tipo mono-sacárido, disacárido o incluso oligosacárido, los más comunes son glucosa, galac-tosa, arabinosa, ramnosa, xilosa y ácidos glucurónico y galacturónico. Tambiénpueden encontrarse unidos a ácidos carboxílicos, ácidos orgánicos, aminas, lípi-dos y a otros compuestos fenólicos.

Los compuestos fenólicos se pueden agrupar en diferentes clases, como semuestra en el cuadro 20-1.

Compuestos fenólicos no flavonoides

Dentro de este grupo, los ácidos fenólicos como el gálico, vainillínico, p-hidroxi-benzoico, y los de tipo aldehídico como la vainillina, son abundantes en el reinovegetal. Los ácidos cinámicos como el cafeico, ferúlico, p-cumárico y sináptico,


CCuuaaddrroo 2200--11.. GGrruuppooss qquuíímmiiccooss mmááss iimmppoorrttaanntteess ccoonn aaccttiivviiddaadd aannttiimmiiccrroobbiiaannaa

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Fenoles sencillos PolifenolesCumarinas Taninos hidrolizablesÁcidos cinámicos Taninos condensadosÁcidos benzoicos Ligninas

rara vez se encuentran libres, y por lo general están presentes en forma de deri-vados. Así, por ejemplo, el ácido cafeico se encuentra unido por enlace éster conel ácido químico, formando el ácido clorogénico y sus isómeros: isoclorogénico,neoclorogénico y criptoclorogénico. Las cumarinas e isocumarinas se encuentranunidas por enlaces glucosílico a monosacáridos, mientras que los cromonoles, com-puestos responsables de una amplia variedad de colores en frutas y vegetales, sonmenos conocidos tanto en su estructura como en su actividad funcional, y se for-man a partir de las antocianidinas.

Lignanos y neolignanos

Son metabolitos presentes principalmente en las plantas y en partes no comestiblesde frutas y vegetales. Son de bajo peso molecular, formados por el acoplamientooxidativo de unidades de p-hidroxi fenilpropano, las cuales se unen mediantepuentes de hidrógeno. Son monómeros y dímeros del ácido hidroxicinámico, ytambién del alcohol cinámico, propenilbenceno y alilbenceno. El término ligna-no se aplica cuando el compuesto está formado a partir de uniones entre el ácidoy/o el alcohol, mientras que cuando se unen las moléculas de propenilbenceno y/oalilbenceno, la molécula resultante se denomina neolignano.

Taninos

Los taninos son compuestos fenólicos hidrosolubles con un peso molecular com-prendido entre 500 y 3 000 D, que contribuyen al sabor amargo y a las astringen-cia de algunas frutas y vegetales inmaduros. Estos compuestos contienen un grannúmero de grupos hidroxilo, entre otros grupos funcionales (1 a 2 por l00 D),por tanto, son capaces de unirse a proteínas y a otras macromoléculas.

Flavonoides

Los flavonoides constituyen el grupo más importante dentro de esta clasificacióncon más de 5 000 compuestos, los polifenoles se distribuyen más en las plantas.

Los flavonoides fueron descubiertos por el premio Nobel Szent-György, quienen 1930 aisló de la cáscara del limón una sustancia, la citrina, que regulaba la per-meabilidad de los capilares. Los flavonoides se denominaron en un principio vita-mina P (por la permeabilidad capilar del sistema circulatorio humano), ytambién vitamina C2 (porque se comprobó que algunos flavonoides tenían pro-piedades similares a la vitamina C). Sin embargo, el hecho de que los flavonoides©

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Polifenoles • 305

fueran vitaminas no pudo ser confirmado, y ambas denominaciones se abandona-ron alrededor de 1950.

Los flavonoides se encuentran ampliamente distribuidos en las plantas verdes,sobre todo en las angiospermas, y sólo algunos se han detectado en hongos yalgas. Se han encontrado en las diferentes partes de las plantas, especialmente enlas partes aéreas; y se les encuentra en forma libre, como agliconas-flavonoides,glucósidos, sulfatos y algunas veces como dímeros y polímeros. Los glucósidospueden ser de dos clases: con los carbohidratos ligados a través de átomos de oxí-geno (enlace hemiacetal), es decir como O-glucósidos; o con los carbohidratosligados a través de enlaces C-C, como C-glucósidos.

A los flavonoles y las flavonas se unen azúcares, de preferencia a la posición C3y con menor frecuencia al C7 del anillo A, de forma que estos compuestos suelen encontrase como O-glucósidos, la D-glucosa es el residuo de azúcar másfrecuente. Otros residuos de azúcares son la D-galactosa, L-ramnosa, L-arabino-sa, D-xilosa, así como el ácido D-glucurónico.

Las antocianinas, por su parte, se encuentran como sales principalmente en flo-res, frutos y tejidos con coloraciones que van del rojo hasta el violeta y el azul. Muypocas veces se encuentran varias clases de flavonoides en un mismo tejido vegetal;sin embargo, de las raíces de Lonchocarpus subglauscescens (Leguminosae) se ais-laron varias flavonas, flavonoles, isoflavonas, rotenoides, chalconas y flavanoles.

Biosíntesis de los flavonoides

Los flavonoides son metabolitos secundarios vegetales de origen biosintéticomixto: el anillo A proviene de la vía de la malonilcoenzima A, y el anillo B y lacadena C3 provienen de la vía del ácido shikímico. Un tricétido se cicliza y secondensa con una molécula de ácido p-cumárico. La enolización del ciclo prove-niente de la vía de la malonilCoA da origen al anillo aromático A en las chalco-nas y flavanonas. Éstas, a su vez, son los precursores de las demás clases deflavonoides (figura 20-1). Es importante destacar que este proceso de biosíntesissustenta el hecho de que en la mayor parte de flavonoides el anillo A sea meta-oxigenado, característica de los anillos aromáticos originados por la vía de lamalonilCoA; y por otro lado, el anillo B proveniente de la vía del ácido shikími-co, por lo general es ortooxigenado.

Estructura básica

Los flavonoides son compuestos que comparten un esqueleto común de difenil-piranos (C6-C3-C6), compuesto por dos anillos de fenilos (A y B) ligados a través


de un anillo C de pirano (heterocíclico). Los átomos de carbono en los anillos Cy A se numeran del 2 al 8, y los del anillo B desde el 2’ al 6’ (figura 20-2). La acti-vidad de los flavonoides como antioxidante depende de las propiedades redox desus grupos hidroxifenólicos y de la relación estructural entre las diferentes partesde la estructura química.©

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Acido shikimico

FFiigguurraa 2200--11.. Biosíntesis de los flavonoides.

Estructuras específicas

Esta estructura básica permite una multitud de patrones de sustitución y varia-ciones en el anillo C, como se muestra en la figura 20-3. En función de sus carac-terísticas estructurales se pueden clasificar en:

• FFllaavvaannooll,, representados por la catequina, los ésteres gálicos, llamados epica-tequinas (EC), galato de epicatequina (GEC) y el galato de epigalocatequi-nas (GEGC), con un grupo -OH en posición 3 del anillo C.

• FFllaavvoonnoolleess, como la quercitina, que posee un grupo carbonilo en posición 4y un grupo -OH en posición 3 del anillo C.

• FFllaavvoonnaass, como la diosmetina, que poseen un grupo carbonilo en posición 4del anillo C y carecen del grupo hidroxilo en posición C3.

• AAnnttoocciiaanniiddiinnaass, que tienen unido el grupo -OH en posición 3, pero ademásposeen un doble enlace entre los carbonos 3 y 4 del anillo C.

❚ PROPIEDADES FUNCIONALES DE LOS FLAVONOIDES

Actividad antioxidante

La capacidad de los polifenoles vegetales para actuar como antioxidantes en lossistemas biológicos fue reconocida en el decenio de 1930-39; sin embargo, elmecanismo antioxidante fue ignorado en gran medida hasta hace poco tiempo.El creciente interés en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia acti-vidad farmacológica. Pueden unirse a los polímeros biológicos, como enzimas,transportadores de hormonas y DNA; quelar iones metálicos transitorios, comoFe2+, Cu2+, Zn2+, catalizar el transporte de electrones, y depurar radicales libres.


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Flavonoide

FFiigguurraa 2200--22.. Estructura básica de los flavonoides.

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Debido a este hecho, se han descrito sus efectos protectores en patologíascomo diabetes mellitus, cáncer, cardiopatías, infecciones víricas, úlcera gástrica yduodenal, e inflamaciones. Otras actividades que merecen destacarse son susacciones antivirales y antialérgicas, así como sus propiedades antitrombóticas yantiinflamatorias.

Los flavonoides retiran oxígeno reactivo, especialmente en forma de anionessuperóxidos (O2

•), radicales hidroxilos (•OH), peróxidos lipídicos o hidroperó-xidos (ROO•). De esta manera, bloquean la acción tóxica de dichas sustanciassobre las células. Sus efectos citoprotectores son patentes en fibroblastos de lapiel humana, queratinocitos, células endoteliales y ganglios sensoriales cultiva-dos en presencia de sulfoxina-butionina, un inhibidor irreversible de la glutatiónsintetasa.

Diversos flavonoides han mostrado su eficacia para eliminar los procesos deperoxidación lipídica del ácido linoleico o de los fosfolípidos de las membranas,la peroxidación de los glóbulos rojos o la autooxidación de los homogeneizadosde cerebro.

Asimismo, se ha comprobado su potente capacidad de inhibir in vitro la oxi-dación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) por los macrófagos, y reducirla citotoxicidad de las LDL oxidadas. De hecho, las poblaciones que consumenproductos ricos en flavonoides estadísticamente presentan menores riesgos deafecciones cardiovasculares.

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Flavonoide

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Flavanol

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Antocianidina

FFiigguurraa 2200--33.. Clasificación de los flavonoides.

Características estructurales de los flavonoides que les confieren funcionalidad

Los flavonoides son potentes antioxidantes que atrapan a los radicales libres bio-lógicamente inducidos o de la oxidación de lípidos catalizada por metales. Suactividad antioxidante es mayor que la producida por las vitaminas C y E, y seha demostrado que la diferencia en la capacidad antioxidante está determinadapor la estructura molecular (figura 20-4).

El mayor número de grupos hidroxilos puede incrementar la actividad antio-xidante.

La ortodihidroxiestructura en el anillo B confiere estabilidad a la forma radi-cal y participa en la deslocalización electrónica.

La dihidroxilación en las posiciones 3’,4’ del anillo B juega un papel importan-te en la función de la actividad antioxidante.

La glucosilación de los flavonoides puede reducir su actividad comparada consu correspondiente aglicón.

La instauración del anillo C provoca una deslocalización electrónica en lamolécula por estabilización de ariloxi radicales debido a la conjugación.

Los grupos 3 y 5 hidroxilos con función 4-oxo en los anillos A y C dan máxi-mo poder inhibidor de radicales libres.

Los flavonoides presentan una reacción de transferencia de electrones y for-man un intermediario estable que los ayuda a unirse a los radicales libres, rom-pen la reacción en cadena de peroxidación de radicales libres de ácidos grasosinsaturados.

Los grupos ortodihidroxifenil son excelentes quelantes de metales de transi-ción, como el Fe+3, Al+3, Cu+2, que juegan un papel fundamental en la formaciónde radicales libres y favorecen la peroxidación de lípidos.


OH

OH

OH

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OHOH

OH

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C C

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Catequina

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Quercitina

FFiigguurraa 2200--44.. Características estructurales de los principales tipos de flavonoides. ((AA)) Presencia enel anillo B de la estructura catecol u O-dihidroxi. ((BB)) Presencia de un doble enlace en posición 2,3.((CC)) Presencia de grupos hidroxilo en posición 3 y 5.

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Actividad moduladora del sistema inmunitario

Las biomoléculas inmunomoduladoras comprenden un grupo de moléculas natu-rales que tienen la capacidad de incrementar la respuesta inmunitaria de un orga-nismo. En un principio, para su evaluación se tomó como referencia a lasenfermedades oncológicas y a la inmunodeficiencia que las acompaña. A partirde aquí se comprendió la necesidad del tratamiento también de las infeccionesagudas o crónicas subyacentes, ya sean virales o bacterianas, y los estados y enfer-medades caracterizados por inmunodeficiencia adquirida, como es el SIDA.

Los flavonoides estimulan la inmunidad inespecífica y la específica, tantoinmunidad celular (linfocitos T) como humoral (linfocitos B). En ratones infec-tados con el virus de influenza tipo A y tratados con flavonoides, se constató unaumento de los linfocitos T, un mayor nivel de fagocitosis y una menor mortali-dad, en comparación con animales testigo no tratados.

También se ha estudiado cómo los flavonoides estimulan la actividad de losmacrófagos a casi el doble, y aumenta el número de linfocitos incrementándosela respuesta inmunitaria, evaluando esta respuesta en niños con síndrome respi-ratorio alto o bajo recurrente y con inmunodepresión celular o mixta, lográndo-se primero una mejoría clínica y luego la normalización paraclínica.

Trabajos específicos donde se ha estudiado el efecto de extractos de la cortezade mango (Mangifera indica L.), han reportado un aumento en la proliferación delos linfocitos humanos tanto de los controles sanos como de los enfermos condiagnóstico de inmunodeficiencia celular, lo que coincide con otro reporte dondese indica que a dosis inferiores a 30 mg/mL aumenta la proliferación de los linfo-citos, y se comprobó que estos resultados podían obtenerse tanto en donantessanos como en pacientes con inmunodeficiencia celular. Esto podría deberse a lapropia composición de la corteza, que tiene entre sus constituyentes al Se-2, Mg+2,Zn+2, Cu+2, Ca+2, Fe+3, los cuales se sabe que participan en diferentes vías metabó-licas como cofactores de enzimas y componentes de otras proteínas. El Zn+2 esnecesario para varios procesos celulares, como interacciones celulares, etapas del ci-clo celular, metabolismo del mRNA y la función de más de 70 enzimas, algunascomo la timidita cinasa DNA polimerasa, que interviene en la síntesis del DNA, porlo que este metal tiene un efecto estimulante sobre las células en división activa.

También podría deberse a otros componentes como los polifenoles, en especialla mangiferina y los ácidos grasos poliinsaturados que participan también en laactividad antioxidante y la acción beneficiosa de estas sustancias para la respues-ta inmunitaria.

Estos resultados dan la posibilidad de usar la corteza de mango en pacientescon trastornos del sistema inmunitario, teniendo en cuenta que no es ni tóxico nimutagénico, y abre nuevas posibilidades terapéuticas para el tratamiento de lasinmunodeficiencias.

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Actividad antimicrobiana

Las plantas tienen una capacidad ilimitada para sintetizar compuestos, la mayorparte relacionados con grupos de tipo fenol y sus derivados. Los principales gru-pos de compuestos generados por plantas se presentan en el cuadro 20-2. Una delas propiedades más importante en las plantas es su actividad antimicrobiana, lacual se le atribuye fundamentalmente a los flavonoides.

Se considera la existencia de alrededor de 18 componentes, y se señala queentre éstos los principales son compuestos del tipo flavonoide, como, las flavonas,flavones y flavononas. Se han reportado alrededor de 38 flavonas, 12 derivadosdel ácido benzoico, 14 derivados del alcohol cinamílico y el ácido cinámico, 12componentes entre alcoholes, cetonas y fenoles, 7 terpenos, 11 esteroides, 7 azú-cares y 2 aminoácidos. Los extractos de plantas han sido evaluados sobre bacte-rias grampositivas y gramnegativas, encontrándose una mayor efectividad sobrelos flavonoides.

La actividad antimicrobiana de los flavonoides está asociada a los lugares y alnúmero de grupos hidroxilo (–OH) en el anillo. Parece que existe relación direc-ta con la toxicidad frente a los microorganismos, de forma que un aumento en lahidroxilación está ligado a una mayor toxicidad. El mecanismo parece estar rela-cionado con la inhibición enzimática por los compuestos oxidados, posiblemen-te mediante reacciones de grupos sulfhidrilo o por interacciones no específicascon proteínas.


CCuuaaddrroo 2200--22.. GGrruuppooss qquuíímmiiccooss mmááss iimmppoorrttaanntteess ccoonn aaccttiivviiddaadd aannttiimmiiccrroobbiiaannaa

GGrruuppoo qquuíímmiiccoo CCoommppuueessttoo AAccttiivviiddaadd aannttiimmiiccrroobbiiaannaa

Fenoles Timol GeneralÁcido antémico S. aureus, S. thyphimuriumTerpenoide Salmonella

Quinonas Hipericina VIHTaninos Bacterias y virusCumarinas VirusFlavonoides Flaconas Shigella

Catequiza VibrioIsoflavona S. mutansQuercitina Schistosoma

Alcaloides Coca Cocos grampositivosPiperina Hongos, Lactobacillus

Las flavonas son estructuras fenólicas que contiene un grupo carbonilo. Cons-tituyen la familia más amplia de fenoles naturales. Su actividad frente a los mi-croorganismos probablemente se debe a que forman complejos con las proteínassolubles y extracelulares y con las células de pared bacteriana.

❚ OTRAS ACTIVIDADES IMPORTANTES DE LOS FLAVONOIDES

Los flavonoides inhiben numerosas variedades de enzimas, entre las cuales están lashidrolasas, liasas, transferasas, hidroxilasas, oxidorreductasas y las hexocinasas.

Los flavonoides también actúan activando algunas enzimas, el caso más cono-cido de activación enzimática es el ejercido sobre la enzima prolina hidroxilasacuando se realiza ejercicio. Este efecto de los flavonoides sobre esta enzima quizáse debe a que se presenta un potencial electroquímico. Los flavonoides se oxidancon facilidad, este proceso está acompañado por la apertura del anillo α-pirona.La función de los flavonoides en el transporte de electrones puede explicar suinterferencia en la acción de las oxidorreductasas, por ejemplo la aldolasa reduc-tasa y la prolina hidroxilasa.

La actividad desacopladora de las chalconas y dihidrochalconas en la fosforila-ción oxidativa se asocia con la presencia de hidrógeno o hidroxilo en las posicio-nes 2’ y 4’.

Los flavonoides disminuyen la fragilidad capilar y previenen la formación devaricosidades, mejorando la circulación periférica, lo cual es la primera manifes-tación en los procesos inflamatorios. Inhiben la agregación y adhesión plaqueta-ria e inducen vasodilatación del endotelio dependiente.

Los flavonoles y sus glucósidos inhiben la oxidación de LDL (colesterol de bajadensidad); incrementan el transporte del colesterol en reversa, disminuyendo elcolesterol total y LDL y previniendo de accidentes cardiovasculares.

El número y la posición de los grupos hidroxilos tienen un efecto marcado enla actividad antiarrítmica, su potencia es mayor cuando presentan hidroxilos en posición 4 y 5 al mismo tiempo. Esta actividad se ha encontrado que aumen-ta en las flavonas a medida que aumenta el grado de metilación, la más activa esla 3, 5, 6, 7, 8, 3’ y 4’-heptametoxiflavona.

Los flavonoides pueden presentar acción antialergénica, que está relacionadacon la interferencia en la actividad de las ATPasa transportadoras en las membra-nas, incluyendo las calciodependientes. Tienen cierta analogía con el fármacoantialergénico cromoglicato, que previene la secreción de histamina respecto a un antígeno.

Las isoflavonas presentan actividad estrogénica y tienen estructura similar alestibestrol. Las agliconas presentan mayor actividad que sus correspondientes

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glucósidos y está en relación con el número de hidroxilos; se necesitan hidroxi-los en las posiciones 5 y 7.

La actividad antimicótica es mayor en aquellos compuestos flavonoides en los cuales la molécula está completamente metilada, como en el caso de la tan-geretina.

Las flavonas muy metoxiladas son las que presentan mayor actividad antitu-moral, así como algunos de sus glucósidos.

❚ CONCLUSIONES

Cada día se publican más reportes describiendo los efectos benéficos de los com-puestos fenólicos, en especial los flavonoides, por lo que cada vez hay más adep-tos que deciden consumirlos o utilizarlos para obtener dichos beneficios. Sinembargo, aún hay que realizar una gran cantidad de experimentos para lograrcomprender del todo sus funciones y efectos.

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21. Concepto de estrés oxidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331

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DDEETTEERRMMIINNAACCIIÓÓNN DDEELL EESSTTRRÉÉSS

OOXXIIDDAATTIIVVOO EENN SSEERREESS HHUUMMAANNOOSS

EENN SSIITTUUAACCIIOONNEESS CCLLÍÍNNIICCAASS

Alberto BoverisMarisa G. Repetto

Alejandro D. BoverisLaura B. Valdéz

❚ INTRODUCCIÓN

En el periodo de 1956-1966, Rebeca Gerschman, como parte de su teoría de latoxicidad del oxígeno, formuló el concepto de que: “un aumento de la presiónparcial de oxígeno o una disminución de las defensas antioxidantes llevan igual-mente a daño celular”.

Con base en esas ideas, en 1985 Helmut Sies elaboró el concepto de eessttrrééss ooxxii--ddaattiivvoo (oxidative stress) ccoommoo uunnaa ssiittuuaacciióónn ddee ddeesseeqquuiilliibbrriioo ccoonn uunn aauummeennttoo ddeeooxxiiddaanntteess o ccoonn uunnaa ddiissmmiinnuucciióónn ddee aannttiiooxxiiddaanntteess.

El concepto de estrés oxidativo como desequilibrio implica que en condicio-nes fisiológicas normales debería existir un equilibrio o una situación de casiequilibrio, entre oxidantes y antioxidantes. Sin embargo, la situación real es alta-mente dinámica, y está muy lejos de parecerse a un equilibrio estático: los oxi-dantes son producidos de manera continua como productos secundarios de larespiración y del metabolismo oxidativo, y los antioxidantes se encuentran enconstante relación con ellos, mientras que en la condición de estrés oxidativo, losoxidantes aumentan o los antioxidantes disminuyen en forma progresiva y con-tinua, incluyendo respuestas adaptativas de los antioxidantes, lo que le confiere

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elasticidad y reversibilidad a la situación biológica. Respecto a estas característi-cas, Sies tomó la palabra “estrés” y la inspiración del concepto de stress o síndro-me general de adaptación de Hans Selye, de gran aplicación en fisiología por losefectos reguladores normales que se extienden a efectos tóxicos por la hiperacti-vación del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenales.

El éxito de este nuevo concepto fue instantáneo, la idea de estrés oxidativocomo desequilibrio fue adoptada en forma inmediata, y ordenó la actividadexperimental y la interpretación de resultados, contribuyendo así a la publica-ción de miles de investigaciones en animales experimentales y en seres humanos.Una de las razones de dicho éxito es su extendida aplicabilidad que abarca desdesistemas bioquímicos subcelulares, organelos, células aisladas, tejidos y organis-mos enteros, incluyendo seres humanos. La última condición es la que permitióuna rápida utilización de los antioxidantes en pacientes, como tratamiento ocomo parte de tratamientos complejos.

El concepto de estrés oxidativo tiene la gran utilidad de permitir la elabora-ción de la idea de desequilibrio con los oxidantes y antioxidantes que son opera-tivos en el sistema biológico considerado. De esa manera, se incorporaron lostérminos prooxidante, oxidante y antioxidante que se ejemplifican en el cuadro21-1, y varían según los sistemas biológicos considerados y según los autores. Sinembargo, existe un consensum scholarum acerca de los oxidantes y antioxidan-tes más importantes en las células de los mamíferos.

Así, el concepto de estrés oxidativo es central en la actividad científica en el


CCuuaaddrroo 2211--11.. PPrriinncciippaalleess ooxxiiddaanntteess,, pprrooooxxiiddaanntteess yy aannttiiooxxiiddaanntteess eenn llaass ccéélluullaass ddee llooss mmaammííffeerrooss

OOxxiiddaanntteess AAnnttiiooxxiiddaanntteess

Peroxinitrito EEnnzziimmááttiiccoossRadical hidroxilo Superóxido dismutasasRadical alquilo (Mn-SOD y Cu, Zn-SOD)Radical peroxilo CatalasaRadical alcoxilo Glutatión peroxidasasHidroperóxidos orgánicos (Se-dependiente y Oxígeno singulete Se-independiente)PPrrooooxxiiddaanntteess NNoo eennzziimmááttiiccoossRadical superóxido Glutatión reducidoPeróxido de hidrógeno α-tocoferolÓxido nítrico Ácido ascórbicoUbisemiquinona

campo de los radicales libres en biología y medicina, y es común encontrar sesio-nes de estrés oxidativo tanto en los congresos científicos de las ciencias básicascomo de las especialidades de la medicina.

❚ ESTRÉS OXIDATIVO EN CÉLULAS Y TEJIDOS

A principios de el decenio 1980-89 ya se había reconocido el papel central de lasespecies de la reducción parcial del oxígeno en las reacciones mediadas por radi-cales libres que ocurren en los seres vivos, y que la formación del radical •OHexplicaba la reacción de inicio del proceso de peroxidación lipídica. Se establecíaasí la importancia y aplicabilidad biológica de las reacciones de Fenton/Haber-Weiss y de la peroxidación de los lípidos, que eran procesos químicos conocidosdesde medio siglo atrás.

Las principales reacciones en cadena mediadas por radicales libres que ocurrenen sistemas biológicos se resumen en la figura 21-1, en donde a las reacciones ori-ginales se han adicionado los caminos de Beckman-Radi-Freeman y de Cadenas-Poderoso que incorporan al NO• y al ONOO– a las reacciones bioquímicas deradicales libres.

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Determinación del estrés oxidativo en seres humanos... • 321

Camino de Be c kman-Radi- F reeman

UQH 2

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NO

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O 2 •

H 2 O

2

O 2

O 2 •

Atajo de Cadenas– P oderoso

Camino de F enton/Haber- W eiss

Proceso de per o xidacion lipídica

NO 2 •

FFiigguurraa 2211--11.. Cadena de reacciones de radicales libres en bioquímica. O2•, radical superóxido; H2O2,

peróxido de hidrógeno; •OH, radical hidroxilo; NO•, óxido nítrico; ONOO–, peroxinitrito; •NO2,bióxido de nitrógeno; UQH2, ubiquinol; UQ•, ubisemiquinona; R•, radical alquilo; ROO•, radicalperoxilo; 1O2, oxígeno singulete.

Estados estacionarios intracelulares

La aproximación de los múltiples estados estacionarios se ha utilizado para calcu-lar las concentraciones intracelulares de las especies químicas de la cadena bio-química de reacciones mediadas por radicales libres (figura 21-1). En esteenfoque, para cada especie química (A) se igualan las velocidades de formación(+dA/dt) y de utilización (- A/dt), con lo que la velocidad de la reacción de uti-lización (A + B => productos) define la concentración en estado estacionario deA ([A]), de acuerdo con [A] = (-dA/dt)/k × [B]. El espacio intracelular es sim-plificado y considerado homogéneo, y se utilizan constantes de reacción determi-nadas en sistemas químicos definidos. Para la vía de Fenton/Haber-Weiss,la velocidad celular de producción de O2

• (+ dO2-/dt) se toma como igual a la

producción de O2• por las mitocondrias (corazón) o por las mitocondrias y el

citosol (hígado). De manera similar, para la vía de Beckman-Radi-Freeman,la velocidad celular de producción de NO• (+ dNO/dt) se toma como igual a lasuma de la producción de NO• por las mitocondrias y el citosol. A partir de losestados estacionarios de O2

• y de NO• se calculan los estados estacionarios de los otros intermediarios. Los estados estacionarios de algunos intermediarios difu-sibles como H2O2, NO• y ROOH y del malondialdehído (MDA) pueden deter-minarse experimentalmente en células aisladas y aportan a la confirmación de losórdenes de magnitud de los niveles calculados. La quimioluminiscencia espontá-nea de órganos in situ o perfundidos y de células aisladas provee una estimaciónindependiente del estado estacionario del 1O2. El cuadro 21-2 presenta una listade las concentraciones en estado estacionario de las principales especies quími-cas que participan de la reacción bioquímica en cadena mediada por radicaleslibres, y además provee una estimación de los tiempos de vida media de los inter-mediarios (t½) calculados por ecuaciones cinéticas simples. Es de notar que los t½indican que estos intermediarios son de rápido recambio y que deben considerar-se como especies muy reactivas e inestables en los sistemas biológicos. Con estaconcepción global de reacción en cadena y con reacciones individuales de segun-do orden, la ley de acción de las masas indica que un aumento en la concentra-ción de cualquiera de los intermediarios aumenta las velocidades de reacción yde todos los intermediarios cuesta abajo. En ese sentido, se ha formulado unadefinición alternativa al considerar que el estrés oxidativo intracelular es una si-tuación en la que el aumento de la concentración en estado estacionario de unode los intermediarios incrementa la velocidad de la reacción en cadena y el con-sumo de los antioxidantes endógenos.


❚ ESTRÉS OXIDATIVO SISTÉMICO

Desde la aceptación del concepto de estrés oxidativo se ha estado buscando unamedida simple para determinar estrés oxidativo en seres humanos en situacionesclínicas. En estos casos se habla de estrés oxidativo sistémico o periférico, y lasdeterminaciones se hacen en el plasma. Como siempre, dada la naturaleza com-parativa de la situación de estrés oxidativo, es necesario contar con valores dereferencia en sujetos normales. Cabe mencionar el extenso trabajo con pacientesllevado a cabo en Sao Paulo por Junqueira y Deucher, que a su vez, permitió esta-blecer valores de referencia para los controles sanos y su dependencia con laedad. En el cuadro 21-3 se presentan los valores de TBARS y α-tocoferol parasujetos humanos sanos.

En la actualidad, los niveles plasmáticos de productos de oxidación, derivadosde reacciones mediadas por radicales libres, y de antioxidantes se utilizan comoindicadores de estrés oxidativo sistémico en seres humanos y en animales expe-rimentales. El producto de oxidación más utilizado es el MDA, determinado enforma algo inespecífica, pero altamente útil, como TBARS (sustancias reactivasal ácido tiobarbitúrico, por sus siglas en inglés) mediante espectrofotometría oespectrofluorometría. Los niveles plasmáticos normales de TBARS son 2 a 3 μM.El MDA puede determinarse de manera específica por HPLC, con niveles normales de 1.5 a 2.2 μM. Se han determinado los hidroperóxidos (ROOH) plas-máticos, pero los ensayos son altamente interferidos y producen resultados con-troversiales. Productos secundarios menores de la peroxidación lipídica y de las©

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CCuuaaddrroo 2211--22.. CCoonncceennttrraacciioonneess eenn eessttaaddoo eessttaacciioonnaarriioo yy vviiddaa mmeeddiiaa ddee iinntteerrmmeeddiiaarriiooss ddee llaa ccaaddeennaa ddee rreeaacccciioonneess

ddee rraaddiiccaalleess lliibbrreess eenn ccéélluullaass ddee mmaammííffeerrooss

EEssttaaddoo eessttaacciioonnaarriioo VViiddaa mmeeddiiaa ((tt11//22))EEssppeecciiee qquuíímmiiccaa ((MM)) ((sseegg))

O2• (intramitocondrial) 10-10 10-4

O2• (citosólico) 10-11 10-3

H2O2 10-7 0.1·OH 10-16 10-9

NO• 10-7 10-2

ONOO- 10-8 0.5UQ• 10-7 0.2R• 10-10 10-7

ROO• 10-9 10-5

ROOH 10-6 0.11O2 10-15 10-6

oxidaciones celulares, con concentraciones plasmáticas que son órdenes de mag-nitud menores a las de los TBARS, como el 4-hidroxinonenal, 8-isoprostano,oxo-coleteroles y la 8-hidroxi desoxiguanosina, también se han usado como indi-cadores plasmáticos de oxidaciones mediadas por radicales libres. Su uso comoindicadores de estrés oxidativo sistémico debería acompañarse por la determina-ción de los productos de oxidación mayoritarios, como los TBARS o el MDA.

En cuanto a los antioxidantes plasmáticos, por lo general se determinan α-tocoferol, ácido ascórbico y β-caroteno. Estos antioxidantes plasmáticos sedeterminan por HPLC, con los valores normales indicados entre paréntesis, el α-tocoferol (20 a 35 μM) y el β-caroteno (0.9 a 1.3 μM) son estables y de fácilmanipulación, y el ácido ascórbico (50 a 60 μM) inestable y autooxidable.

El ensayo de la quimioluminiscencia iniciada por hidroperóxido de terbutilo(BOOH-CL) en eritrocitos humanos requiere una muestra de sangre mínima, yes muy sensible para determinar situaciones de estrés oxidativo sistémico. Se inter-preta que la quimioluminiscencia está limitada por el α-tocoferol del estroma delos eritrocitos, el que a su vez está en equilibrio con el α-tocoferol plasmático.

La determinación de capacidad antioxidante total del plasma (TRAP) se hautilizado en forma extendida. La determinación, cuyo punto final es la reacciónquimioluminiscente de oxidación del luminol, agrupa en una sola determina-ción al α-tocoferol, ácido ascórbico, ácido úrico, β-caroteno y bilirrubina, todoscomponentes plasmáticos con capacidad antioxidante. Por desgracia, la mayorparte (70 a 80%) del TRAP (300 a 320 U Trolox) está dada por el urato plasmá-tico, que es inerte como antioxidante intracelular.

Hay dos hipótesis sobre el origen de los oxidantes y prooxidantes que inicianla cadena de reacciones en cadena del espacio intravascular: la del origen tisulary la del origen intravascular, aunque es probable el doble origen. En la hipótesisdel origen tisular, intermediarios solubles y difusibles como el H2O2, NO•,


CCuuaaddrroo 2211--33.. CCoonntteenniiddooss ddee TTBBAARRSS yy ddee αα--ttooccooffeerrooll eenn eell ppllaassmmaa ddee sseerreess hhuummaannooss ssaannooss

TTBBAARRSS αα--ttooccooffeerroollEEddaadd ((aaññooss)) ((μμMM)) ((μμMM))

20 a 29 2.0 ± 0.1 21.0 ± 0.830 a 39 2.3 ± 0.1 26.2 ± 1.140 a 49 2.3 ± 0.1 29.0 ± 1.250 a 59 2.4 ± 0.1 34.9 ± 1.560 a 69 2.5 ± 0.1 30.9 ± 1.1> 70 2.9 ± 0.1 22.2 ± 2.1

Datos tomados de Junqueira et al.

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ROOH y el MDA difunden al espacio extracelular y a la sangre. Esta hipótesisrecibe el apoyo del aumento de los TBARS plasmáticos en situaciones experi-mentales de estrés oxidativo localizado principalmente en un órgano, como porejemplo, el hígado, en la intoxicación por tetracloruro de carbono y en la defi-ciencia en colina. Además, tiene el interés del aumento de los TBARS plasmáti-cos en pacientes humanos con enfermedades crónicas. En la hipótesis del origenvascular, la reacción de inicio se da por el •OH proveniente de la homólisis delH2O2 y ONOO– producidos por los fagocitos del espacio extracelular, o de losROOH absorbidos desde el intestino. Se considera que el proceso de homólisises catalizado por metales y metaloproteínas del plasma, con los metales involu-crados, Fe2+ o Cu2+, en estado reducido. Las lipoproteínas plasmáticas; LDL yHDL, y los quilomicrones, proveen los lípidos insaturados para las reacciones depropagación.

También se han llevado a cabo determinaciones de productos de oxidación enla orina, de las que se puede citar a las de 8-hidroxidesoxiguanosina y a la qui-mioluminiscencia espontánea en medio alcalino, debida a carbonilos excitadosgenerados en la autooxidación de productos metabólicos inestables.

Para la determinación o estimación del estrés oxidativo sistémico es aconseja-ble recurrir a la determinación de más de un indicador. Por ejemplo, el cuadro21-4 muestra los valores plasmáticos de TBARS y de TRAP, y la BOOH-CL delos eritrocitos en pacientes con enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkin-son y con demencia vascular. Los valores normales se encuentran alterados 21 a35% (TBARS), 28 a 39% (TRAP) y 50 a 73% (BOOH-CL).


CCuuaaddrroo 2211--44.. IInnddiiccaaddoorreess ddee eessttrrééss ooxxiiddaattiivvoo ssiissttéémmiiccoo eenn eennffeerrmmeeddaaddeess nneeuurrooddeeggeenneerraattiivvaass eenn hhuummaannooss

TTBBAARRSS TTRRAAPP BBOOOOHH--CCLLEEssttaaddoo//eennffeerrmmeeddaadd ((μμMM)) ((μμMM)) ((ccppmm//mmgg HHbb))××1100--22

Controles sanos 2.9 ± 0.1 344 ± 18 117 ± 7(70 ± 1 años)Enfermedad de Alzheimer 3.9 ± 0.1 227 ± 12 178 ± 10(72 ± 1 años)Enfermedad de Parkinson 3.5 ± 0.2 248 ± 18 202 ± 10(71 ± 2 años)Demencia vascular 3.5 ± 0.1 210 ± 14 175 ± 8(73 ± 1 años)

Datos tomados de Repetto et al.

❚ DETERMINACIÓN DE ESTRÉS OXIDATIVO: ¿OXIDANTES, ANTIOXIDANTES O PRODUCTOS DE LA OXIDACIÓN?

A partir del enunciado del concepto de estrés oxidativo como desequilibrio conaumento de oxidantes o disminución de antioxidantes, se mantiene la interrogan-te acerca de cuál o cuáles son las determinaciones que resultan más prácticas yefectivas para determinar una situación de estrés oxidativo. No existe una res-puesta única, y las posibilidades dependen del material biológico experimental ydel equipamiento disponible. La naturaleza dinámica y continua de la reacciónen cadena mediada por radicales libres plantea la posibilidad de estimar la velo-cidad del proceso por los niveles de: a) oxidantes e intermediarios de la cadenade reacciones mediada por radicales libres (cuadro 21-1); b) antioxidantes (enzi-máticos o no enzimáticos) (cuadro 21-1); y c) productos de oxidación. En cual-quier caso, la determinación es comparativa tomando en cuenta los parámetrosmencionados en el apartado anterior, y requiere una muestra experimental con-trol, con una situación normal o equilibrada para ser comparada con la muestraexperimental incógnita, con una eventual situación desequilibrada de estrés oxidativo.

❚ CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

Después de más de 20 años, el concepto de estrés oxidativo, con su simpleza yaplicabilidad, conserva la misma fuerza y validez original, por lo que habrá querecordar que el concepto de estrés oxidativo en sí mismo no es sinónimo de dañocelular, ya que se sabe que varios eventos fisiológicos requieren un aumento enel consumo de oxígeno, como por ejemplo la mitosis, y en consecuencia, se generaun estado de estrés oxidativo tteemmppoorraall o aaddaappttaattiivvoo que se considera fisiológico, yes compensado por un aumento en la actividad de los sistemas antioxidantes. Espor ello que recientemente se ha comenzado a distinguir entre eessttrrééss ooxxiiddaattiivvoocomo situación reversible, y ddaaññoo ooxxiiddaattiivvoo como situación irreversible.

Dalton et al., han sugerido que una buena forma de definir estrés oxidativodebe incluir una indicación de la severidad del cambio redox celular y de su dura-ción, lo que pone al estrés oxidativo dentro de la máxima de Paracelso: “la dosishace al veneno”, y no sólo la concentración, sino la duración en la generación delas especies reactivas de oxígeno. Concretando, la concentración y duración en elfenómeno oxidativo puede conducir a la célula de un estado funcional basalpasando por un proceso fisiológico o adaptativo, hasta la muerte celular porapoptosis o necrosis. De modo que en este libro se considerará el concepto estrésoxidativo como el desequilibrio entre las especies oxidantes y antioxidantes, enel cual abundan las primeras. Para definir las diversas fluctuaciones fisiológicas


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que ocurren en las células o tejidos en cuanto a las especies reactivas de oxígenoy nitrógeno ocasionadas por diversas funciones, mecanismos y vías de señaliza-ción, se utilizará el concepto de eessttaaddoo rreeddooxx cceelluullaarr..

Lo anterior deja claro que el desarrollo de ensayos para evaluar el estrés oxi-dativo sistémico en pacientes es el desafío del próximo lustro. El tratamientoantioxidante ofrece la posibilidad de mejorar la salud de pacientes con enferme-dades crónicas, neurodegenerativas o infecciosas, o que reciben quimioterapia oradioterapia y la determinación que la evaluación del estrés oxidativo sistémicoprovee al diagnóstico y al control del tratamiento.

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SSEECCCCIIÓÓNN VVIIII..EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASS YY EENNFFEERRMMEEDDAADDEESS

22. Hipoxia y reperfusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331

23. ERO y cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347

24. Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas . . . . . . . . . . . . . . 359

25. Daño oxidativo y enfermedades hepáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377

26. Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda . . . . . . . . 395

27. ERO y disfunción endotelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415

28. El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído . . . . . . . . . . . . . . . . 423

29. Estrés oxidativo y retinopatías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435

30. ERO, envejecimiento y senescencia celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 447

31. Daño oxidativo y enfermedades crónico-degenerativas asociadas a la contaminación ambiental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459

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HHIIPPOOXXIIAA YY RREEPPEERRFFUUSSIIÓÓNN

Josep Maria LluisAlbert Morales

❚ INTRODUCCIÓN

Vivir en una atmósfera rica en oxígeno tiene varias ventajas, particularmente parala generación de energía en forma de ATP a través de la fosforilación oxidativa(véase el capítulo de Cadena respiratoria). Sin embargo, en condiciones fisiológi-cas, la reducción del oxígeno a agua en la cadena respiratoria mitocondrial no escompleta, y forma radicales libres muy reactivos que tienen la capacidad de oxi-dar proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Aunque se sabe que las especies reacti-vas de oxígeno juegan un papel fisiológico importante, como por ejemplo en lacélulas fagocitarias durante las reacciones de defensa celular frente infeccionesmicrobianas, estas especies han sido consideradas como subproductos del metabo-lismo aeróbico, lo que ha obligado a las células a desarrollar diferentes estrategiasen la defensa antioxidante. Asimismo, se ha descrito el papel de los radicales librescomo mediadores o mensajeros secundarios en diversos procesos celulares.

Todo ello ha contribuido a que las concentraciones de oxígeno, tanto a nivelsistémico como celular, estén estrechamente reguladas por vías de transducciónde señales que incluyen la participación de diferentes factores de transcripción yla expresión de casi 1% de los genes que contiene el genoma.

22

El grado de oxigenación de los diferentes tejidos del organismo se mueve enun rango de concentración que incluye desde 21% de O2 (muy cercano al nivelde O2 atmosférico) en el pulmón, a entre 2 a 8% en el cartílago y la médula ósea.Este margen tan amplio en la tensión de oxígeno en los diferentes tejidos hacedifícil establecer un valor universal para considerar condiciones hipóxicas (con-centraciones bajas de oxígeno). A pesar de ello, una definición más funcional seríaque la hipoxia existe cuando el suministro de oxígeno no alcanza la demanda deconsumo del tejido. Este desequilibrio en el cociente suministro/demanda pue-de ocurrir en condiciones fisiológicas cuando el aporte de oxígeno por el torren-te sanguíneo no es suficiente para suplir el aumento en su consumo por elmúsculo en condiciones de actividad física severa, o bien, en condiciones fisiopa-tológicas, como en el desarrollo del tumor sólido y la enfermedad de la arteriacoronaria, donde se produce una reducción en el suministro de oxígeno debido auna vascularización insuficiente.

La hipoxia está implicada en el desarrollo de enfermedades con gran impactopara la sociedad, como isquemia cerebral y de miocardio, cáncer, hipertensiónpulmonar, retinopatías, enfermedad congénita del corazón, obstrucción crónica pul-monar y hepatopatía alcohólica.

❚ FACTOR NUCLEAR INDUCTIBLE POR HIPOXIA

Un gran paso para esclarecer los mecanismos involucrados en la homeostasia deloxígeno fue el descubrimiento del factor inducible por hipoxia (HIF) en 1992por el grupo del Dr. Semenza. Este factor de transcripción, que tan sólo es esta-ble en concentraciones bajas de oxígeno (0 a 5% de O2), representa la uniónentre el sensor de oxígeno y los efectores celulares tanto a nivel local como sisté-mico. El HIF es un factor de transcripción heterodimérico, compuesto por lasubunidad constitutiva HIF-1β y la subunidad inducible HIF-1α, donde su esta-bilidad y actividad transcripcional está regulada por la concentración de oxígeno.Aunque hasta el momento se han identificado tres isoformas de la subunidad α,se le atribuye la mayor parte de la respuesta adaptativa de la célula frente a lahipoxia al factor HIF-1α. De hecho, el ratón con un alelo mutado para el HIF-1αtiene un desarrollo normal, pero muestra una respuesta alterada frente a la hipo-xia crónica. La proteína HIF-1α tiene una vida media extremadamente corta(inferior a 5 min), y su nivel basal es indetectable, mientras que durante la hipo-xia se almacena en el citosol en función del tiempo, de la exposición y del gradode hipoxia. Las responsables de esta regulación proteolítica del factor HIF-1α,son una nueva familia de enzimas prolil/asparragin hidroxilasas que requierenoxígeno para ejercer su actividad catalítica; por tanto, en la normoxia (condicio-nes normales de oxígeno), la hidroxilación del factor HIF-1 α es la modificación


que permite su ubiquitinación y su posterior degradación por el proteosoma. Encambio, al disminuir la concentración de oxígeno, el factor HIF-1α se acumula enel citoplasma y dimeriza con la subunidad HIF-1β, lo que facilita su translocaciónal núcleo y la activación de la expresión de sus genes blanco. Entre ellos cabe des-tacar a la hormona eritropoyetina (EPO), que estimula la producción de glóbu-los rojos, y al factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), responsable dela formación de nuevos vasos sanguíneos o angiogénesis. Ambos factores tienen lamisión de aumentar el aporte de oxígeno al tejido. Por otro lado, la falta de oxí-geno provoca que la generación de ATP celular se obtenga a través de la vía glu-colítica, en lugar de la respiratoria, siendo el HIF-1α el responsable del aumentode la expresión de transportadores de glucosa y de diferentes enzimas glucolíti-cas. Por último, este factor nuclear también se ha visto implicado en la expresiónde genes involucrados en la proliferación y supervivencia celular, función cardio-vascular y homeostasia del hierro.

❚ SENSOR CELULAR FRENTE A LA HIPOXIA

A pesar de que se ha aprendido mucho del papel del HIF en el control de laexpresión de los genes que participan en la respuesta adaptativa frente a la hipo-xia, el mecanismo por el que la célula detecta una disminución en la concentra-ción de oxígeno continúa siendo un tema que se está investigando activamente,dada su importancia tanto en el desarrollo y supervivencia celular como en latumorogénesis. Desde un punto de vista fisiológico, este sensor celular debe sersensible a un amplio rango en la concentración de oxígeno, que incluye desde la hipoxia moderada a la anoxia total (0% de oxígeno). Esta capacidad de res-puesta frente a una hipoxia moderada es importante porque parte de la respues-ta adaptativa consiste en preparar a la célula para afrontar una hipoxia mássevera.

El hecho de que las enzimas hidroxilasas requieran como cofactor al oxígeno,hace que sean unos de los mecanismos implicados en la transducción de señalesfrente a la hipoxia. Pero el hecho de que se activen otros factores de transcrip-ción como el factor nuclear κB (NF-κB) o la proteína activadora-1 (AP-1), juntocon la posibilidad de que estas hidroxilasas estén reguladas por los radicaleslibres, indica la presencia de otros sistemas de detección celular frente a los cam-bios en los niveles de oxígeno. Queda por definir la Km por el oxígeno de estashidroxilasas, porque aunque está claro que en la anoxia no son activas, se desco-noce la concentración mínima de oxígeno a partir de la cual son funcionales.

La cuestión que permanece por aclarar en este campo es si existen múltiplessensores en una misma célula, si depende del tipo celular o si un único sensoruniversal media las respuestas celulares frente a la hipoxia.©

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Hipoxia y reperfusión • 333

Inicialmente se presentó como sensor la enzima NNAADDPPHH ooxxiiddaassaa, pero expe-rimentos posteriores mostraron que células deficientes en la subunidad gp91 dela NADPH oxidasa (imprescindible para su funcionalidad), mostraban una res-puesta normal frente a la hipoxia. También se involucró al cciittooccrroommoo PP445500 reduc-tasa, ya que su regulación durante la hipoxia modulaba los niveles de la hormonaeritropoyetina. Pero esta hipótesis se descartó al no intervenir ni en la regulaciónde HIF y VEGF y tras no confirmarse su participación por análisis espectrofoto-métrico.

Se ha especulado sobre la existencia de una proteína con un ggrruuppoo hheemmoo o unccoommpplleejjoo hhiieerrrroo//aazzuuffrree que pudiera sufrir un cambio conformacional al variar lasconcentraciones de oxígeno, lo que permitiría la respuesta transcripcional obser-vada durante la hipoxia. Estos modelos justificarían la estabilización del HIF-1αen condiciones de hipoxia química al tratar las células con agentes quelantes delhierro o con el compuesto CoCl2. Sin embargo, hasta la actualidad no se ha iden-tificado ninguna proteína con este papel en células de mamíferos.

Por último, diversos grupos independientes concluían que la mmiittooccoonnddrriiaaactuaba como sistema de detección frente a los cambios en la concentración deoxígeno. De hecho, células ρo, que tienen el DNA mitocondrial dañado (lo queprovoca que no tengan la cadena respiratoria ni la fosforilación oxidativa funcio-nal) no son capaces de estabilizar al factor HIF-1α durante la hipoxia. Para corro-borar esta hipótesis se ha utilizado un modelo genético donde se aislaron lascélulas embrionarias de un ratón que mediante mutagénesis dirigida se le habíainactivado el citocromo c. Esto tenía como consecuencia que estas células no pre-sentaran ningún tipo de respuesta frente a la hipoxia, indicando el papel de lamitocondria como sensor frente a la hipoxia.

❚ HIPOXIA Y ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO

El uso de fluorocromos sensibles al estado redox de la célula como la dicloroflue-resceína (DCF), han mostrado un aumento en la producción de especies reacti-vas de oxígeno en condiciones de hipoxia. Por lo general, el uso de esta sonda seha utilizado para la detección de los niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2),pero en diversos trabajos se demuestra que también puede detectar la presenciade peroxinitritos (ONOO–). Recientemente se ha utilizado la técnica de transfe-rencia de energía por resonancia de fluorescencia, que consiste en el traspaso deenergía de una sonda fluorescente a otro fluorocromo en estado basal, situado auna distancia en el rango de los nanómetros (nm). Estos estudios demostraron laproducción de radicales libres durante la hipoxia. Con el fin de localizar el ori-gen de estos radicales libres se han utilizado aproximaciones tanto farmacológi-cas como moleculares.


Las dos posibles fuentes de producción de anión superóxido en la cadena res-piratoria mitocondrial son el complejo I y el III (véase capítulo de Cadena respi-ratoria). Mientras que el primero genera especies reactivas del oxígeno sólo en lamatriz mitocondrial, el complejo III es capaz generar el anión superóxido (O2

•)tanto en la matriz como en el citosol.

En los estudios farmacológicos, el uso de inhibidores específicos del complejoI (rotenona), complejo II (tenoiltrifluoroacetona) y del complejo III (antimicinaA), indicaron que estos radicales libres detectados durante la hipoxia, proveníandel complejo III de la cadena respiratoria. Además, en una aproximación mo-lecular con el bloqueo de la expresión génica de una subunidad esencial del com-plejo III, usando la novedosa técnica del RNA de interferencia, muestra undescenso en la generación de especies reactivas de oxígeno y en la estabilizacióndel factor HIF en condiciones hipóxicas. El mecanismo por el cual la hipoxia pro-voca un aumento en la generación de radicales libres se desconoce, podría invo-lucrar cambios estructurales que prolonguen la vida media de la subunidadubisemiquinona del complejo III, incrementando la accesibilidad del oxígeno acapturar electrones singulete o que desvíe la producción del radical superóxidode la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.

Por último, experimentos con fibroblastos de pacientes con el síndrome deLeigh´s (mal funcionamiento de la enzima citocromo oxidasa) que mantienenactiva la cadena respiratoria pero no la fosforilación oxidativa, son sensibles a lahipoxia, indicando que la fosforilación oxidativa no es necesaria para la mitocon-dria en su función de sensor frente a la hipoxia.

Para determinar si estos radicales libres son necesarios en la respuesta celularfrente a la hipoxia se utilizaron los inhibidores de la cadena respiratoria y antio-xidantes como el glutatión (GSH). Con el uso de estos compuestos se observóun paralelismo entre la generación de especies reactivas de oxígeno y los nivelesdel factor nuclear HIF-1α, mostrando que estos radicales libres actúan comosegundos mensajeros durante la hipoxia.

Los experimentos sobreexpresando la enzima catalasa (CAT), inhibieron laproducción de radicales libres, mientras que la inducción de la enzima superóxi-do dismutasa (SOD) no produjo cambios en la generación de especies reactivasde oxígeno, indicado que el peróxido de hidrógeno, y no el anión superóxido, esla especie reactiva que actúa como segundo mensajero estabilizando el factorHIF-1α. Con todo ello, se puede concluir que en condiciones de un descenso enlos niveles de oxígeno, el complejo III de la cadena respiratoria mitocondrialaumenta el radical O2

•, que a través de los canales iónicos pasará al citosol paraser transformado al H2O2 por la SOD y poder actuar sobre la estabilización delfactor HIF-1α.

Además, esta producción de especies reactivas de oxígeno mitocondrialesdurante la hipoxia se ha visto implicada como segundos mensajeros responsables©

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de la contracción de los miocitos de la arteria pulmonar, inhibición en la diferen-ciación de los adipocitos, disminución de la actividad de la bomba Na+, K+-ATPa-sa en células epiteliales alveolares, activación de NF-κB en hepatocitos y de p38en cardiomiocitos, y por último, el aumento de la producción de la citosina inter-leucina 6 (IL-6) en células endoteliales.

❚ HIPOXIA Y HEPATOPATÍA ALCOHÓLICA

En condiciones fisiológicas, en el hígado hay un gradiente de oxígeno entre lavena porta (cercano a 16% de O2) y la zona pericentral o centrilobular (casi 10%de O2). Como consecuencia del metabolismo del etanol, la demanda de oxígenopor parte del hígado aumenta debido al estado hipermetabólico del hepatocito,y provoca un aumento de 30% en el gradiente intralobular de oxígeno, alcanzán-dose estados de hipoxia en la zona centrilobular del hígado. Este efecto se obser-va a pesar de que el alcohol induce un efecto compensatorio al aumentar el flujosanguíneo hepático, y por tanto, la disponibilidad de oxígeno en el hígado.

El área hipóxica pericentral es la zona más afectada por el consumo crónico deetanol. El hecho de que el agente propiltiouracil que reduce el consumo hepáti-co de oxígeno debido al metabolismo del etanol prevenga el daño hepático indu-cido por el alcohol, indica que la hipoxia interviene de forma relevante en eldesarrollo de la enfermedad hepática alcohólica. Por otro lado, los hepatocitos dela zona pericentral del hígado muestran una disminución selectiva de los nivelesde glutatión mitocondrial (GSHm), debido a los efectos del alcohol.

La mitocondria presenta diferentes defensas antioxidantes implicadas en ladestoxificación de las especies reactivas de oxígeno. Entre ellas cabe destacartanto a las enzimas antioxidantes como MnSOD, glutatión peroxidasa (GPx),CAT, y la peroxirredoxina, así como las moléculas antioxidantes, principalmenteel GSH y la vitamina E.

Como las mitocondrias de células hepáticas carecen de la enzima CAT, la desto-xificación del H2O2 depende sólo del GSHm y de la actividad de la enzima GPx.

❚ FUNCIÓN DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENOEN LA ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN

En diferentes patologías humanas se desencadenan condiciones en las que diver-sos órganos se encuentran sometidos a un periodo más o menos prolongado deflujo sanguíneo reducido o incluso de flujo nulo llamado iissqquueemmiiaa. En el momen-to en el cual se recupera el riego normal se inicia el proceso de rreeppeerrffuussiióónn. Lascélulas de todos los tejidos son dañadas de forma irreversible al ser privadas de


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oxígeno y nutrientes. Sin embargo, pese a ser compartidas las respuestas biológi-cas a la isquemia por un gran número de tipos celulares, el grado y la cinética deldaño isquémico presenta características propias para cada célula específica, inclu-so dentro de un mismo tejido. Resultaría complicado pretender analizar en estecapítulo cada uno de los mecanismos afectados para cada tipo celular en particu-lar, por ello se comentará primordialmente la participación de los radicales libresen esta patología y las vías metabólicas más afectadas por el daño isquémico, cen-trando la atención en la lesión hepática causada tras su reperfusión.

La isquemia de los órganos no sólo es una consecuencia inevitable duranteoperaciones de trasplante y resecciones quirúrgicas, sino que es además un pro-ceso biológico asociado a patologías producidas por procesos obstructivos delflujo sanguíneo normal o por un cese total debido a un paro cardiaco. En todacélula, inmediatamente después del cese del flujo sanguíneo, la concentración deATP y el pH disminuyen mientras se produce la transición de un metabolismooxidativo a glucólisis anaeróbica. En las primeras horas de reperfusión, durante lafase aguda del proceso de daño tisular se produce una sobreproducción de radi-cales libres que genera estrés oxidativo en los órganos afectados. Aunque histórica-mente se ha considerado esta elevada generación de radicales como el principalcausante de la lesión causada por la isquemia y reperfusión a través de la degra-dación de lípidos de membrana y/o proteínas, las investigaciones más recientesindican que la oxidación en macromoléculas causada por estos radicales ni alcan-zan el nivel necesario para justificar el daño observado, ni coinciden temporal-mente con la aparición de éste. Ello no significa que los radicales libres hayandejado de ser considerados como elemento crítico en el daño causado por isque-mia y reperfusión, sino que ahora hay una tendencia a considerar su participaciónen esta etapa inicial de la lesión como mediadores en transcripción y activaciónde genes sensibles al estrés con una conocida contribución en las vías de muertecelular. En este sentido, aunque durante años se asumió que todo estrés oxidati-vo posisquémico causaba muerte celular por peroxidación lipídica, el moderadonivel de peroxidación lipídica contabilizado resulta insuficiente para justificar eldaño causado. En contrapartida, los radicales producidos podrían estar inactivan-do antiproteasas específicas del plasma por el ambiente oxidativo que crean enlas inmediaciones de los neutrófilos, permitiendo a las proteasas derivadas de losneutrófilos actuar localmente sin la interferencia de antiproteasas. Asimismo, seha demostrado una acción citotóxica directa de los radicales después de isquemiay reperfusión en diversos tipos celulares. En particular, las células de Kupffer, ma-crófagos residentes en el hígado, son activadas con rapidez al iniciarse la reperfu-sión generando radicales libres y matando hepatocitos próximos por un mecanismoque involucra a la mitocondria y la pérdida de su potencial de membrana. Jun-to con la acción mediada por antiproteasas y su acción directa, el estrés oxidativocelular causado por isquemia y reperfusión promueve mecanismos de muerte


celular a través de la estimulación de factores de transcripción como NF-κB o AP-1. Estas proteínas, después de su interacción con secuencias específicas de DNA lo-calizadas en promotores de diversos genes, aumenta la expresión de RNA (mRNA)de gran importancia en la señalización celular, como el TNF-α, interleucina-1β(IL-1β), la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), hemooxigenasa-1, CXC qui-miosinas o moléculas de adhesión.

Durante una fase subaguda, que se podría localizar entre las 6 y 24 h posre-perfusión, los radicales libres siguen desempeñando una función crítica en eldaño causado por la isquemia y reperfusión. En esta etapa, la producción de radi-cales observada parece ser básicamente mediada por los elevados niveles alcan-zados de citocinas (TNF-α, IL-1β, interferón-γ) y quimiosinas. Existen ampliasevidencias que indican que estos mediadores inflamatorios causan la sobreexpre-sión de moléculas de adhesión en células del endotelio, la formación de gradien-tes quimiotácticos que promoverían la invasión de leucocitos polimorfonucleares(PMN) y la liberación de reactivos metabólicos de oxígeno y nitrógeno con ele-vada capacidad citotóxica. En el caso de la isquemia y reperfusión hepática, se hacaracterizado cómo los PMN se activan después de su interacción con moléculasde adhesión expresadas en las células endoteliales. Tras ello, los PMN metabólica-mente activados transmigran a través del sinusoide hepático hasta contactar con loshepatocitos, induciéndoles una generación de radicales libres y la liberación deenzimas extracelulares degradadores de la matriz, como la colagenasa o las meta-loproteinasas de matriz, proceso que resulta en la amplificación del daño causa-do por la inflamación del tejido.

❚ MECANISMOS POSISQUÉMICOS DE GENERACIÓN DE RADICALES

Después de ser sometidas a bajos niveles de estrés oxidativo, las células tratan deadaptarse. Este proceso es efectivo hasta un determinado límite del estímulo, apartir del cual la célula no puede recuperarse. Este fenómeno se ha demostradoen el caso del daño causado por isquemia y reperfusión, donde se ha observadoque breves episodios de isquemia son capaces de activar la respuesta celularantioxidante y proteger al órgano afectado frente a periodos más largos de isque-mia ante a los cuales, sin este preacondicionamiento, existiría una elevada morta-lidad celular.Análogamente, diversos estudios han indicado el potencial protectorde diferentes antioxidantes como la N-acetilcisteína o el GSH, entre otros, en lalesión causada por isquemia y reperfusión, apuntando hacia los radicales librescomo uno de los principales y más tempranos responsables del daño isquémico.A pesar de ello, las fuentes intracelulares de este estrés aún son motivo de estu-dio y controversia.


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Xantina oxidasa

Estudios iniciales mostraron la función de la conversión de la xantina deshidro-genasa en xxaannttiinnaa ooxxiiddaassaa durante la producción posisquémica de radicales libres.La xantina oxidasa se genera como producto de la degradación proteolítica o poroxidación de la molibdeno Fe-S flavina hidroxilasa. Esta enzima, que normal-mente participa en las reacciones finales del metabolismo de las purinas, catalizala conversión de hipoxantina y xantina a ácido úrico utilizando NAD+ comoaceptor final de electrones. La xantina oxidasa, en cambio, utiliza el oxígenomolecular como aceptor de electrones produciendo en su acción importantescantidades de O2

• y H2O2, aparentemente después de la proteólisis u oxidaciónde grupos sulfhidrilos específicos de su estructura (capítulo 6).

La detección en el suero de niveles elevados de O2• y H2O2 durante la reper-

fusión, así como el efecto protector conseguido con el pretratamiento con allu-purinol, un inhibidor específico de la xantina oxidasa, apoyan la participación deesta enzima en la generación posisquémica del estrés. Sin embargo, estudios másrecientes parecen indicar que esta enzima podría no ser tan crítica, puesto que lacantidad de xantina oxidasa detectada después de la isquemia no parece ser degran magnitud, y suele observarse en tiempos posteriores a la detección inicial de la lesión. Este hecho tampoco debe ser razón para descartar su participación,ya que como ocurre tras la isquemia hepática, la conversión a xantina oxidasa seproduce sólo en unas células determinadas del órgano afectado, las células deKupffer, fuente de la mayor parte del estrés observado en el hígado después de lareperfusión. Hay que recordar que el tratamiento con cloruro de gadolinio, agen-te inactivador de las células de Kupffer, protege en gran medida al hígado frenteal daño isquémico, por tanto, la xantina oxidasa puede desempeñar una funciónlocal, pero importante, en la producción de O2

• y H2O2.

Mitocondria

Contrario a lo ocurrido con la xantina oxidasa, la función de la mmiittooccoonnddrriiaa en lageneración de radicales y la inducción de daño causado por la isquemia y reper-fusión ha ido incrementándose en los últimos años (véase Cadena respiratoriamitocondrial). La mitocondria, principal fuente celular de generación de radica-les libres debido a la pérdida puntual (0.5%) de electrones que transitan por sucadena respiratoria, ve alterado su transporte de electrones incluso después debreves periodos de isquemia. En condiciones normales, en la mitocondria segenera la formación de agua tras el paso por la cadena respiratoria de cuatro elec-trones hasta su aceptor final, el O2. Sin embargo, la disrupción de este tránsitoacaecida con la isquemia contribuye, cuando menos parcialmente, a la produc-


ción de radicales producida en este organelo por la isquemia y reperfusión. Otrafuente del estrés oxidativo observado desde la mitocondria son los mediadoresintracelulares de la acción de ciertas citocinas y quimiosinas. Así, por ejemplo, elTNF-α y IL-1β se han asociado con la producción mitocondrial de radicaleslibres. Para el TNF-α, en particular, se ha estudiado su señalización intracelular, yse ha podido comprobar la existencia de un dominio citoplasmático de su recep-tor que activa esfingomielinasas específicas capaces de generar ceramida.

La ceramida, considerada durante años un esfingolípido con mera funciónestructural, ha devenido en el último decenio como un potencial mediador en laseñalización de numerosos estímulos proapoptóticos. En su acción intracelular,la ceramida, aparte de participar en la activación de vías proapoptóticas e inhibi-ción de proliferativas, interacciona de forma directa con el complejo III de lacadena respiratoria mitocondrial generando radicales libres, causando la pérdidadel potencial de membrana mitocondrial y la liberación de proteínas apoptogé-nicas mitocondriales como el citocromo c, Smac/DIABLO o el factor inductor deapoptosis (AIF). Estudios realizados en el laboratorio de los autores utilizando unmodelo murino de isquemia y reperfusión hepática han permitido comprobarque inmediatamente después de la reperfusión se observan elevadas concentra-ciones sanguíneas de TNF y elevación de los niveles de ceramida en hígado. Estageneración de ceramida es responsable, cuando menos en parte, de la muerte através de un mecanismo mitocondrial. Confirmando estos datos, la inhibiciónfarmacológica o mediante RNA de interferencia de la enzima causante de laacumulación de ceramida, la esfingomielinasa, protege en gran medida del dañoocasionado por la isquemia y reperfusión, aumentando de manera significativala supervivencia animal en un modelo de isquemia hepática total.

La ceramida es uno de los numerosos mediadores intracelulares que en los últi-mos años se han descrito que interaccionan con la mitocondria y afectan su fun-cionalidad. Otros potenciales intermediarios de esta acción se han relacionadoantes con la inducción de estrés oxidativo. Así, por ejemplo, durante el procesode reperfusión se ha demostrado la activación de las vías de señalización de p53y de c-Jun cinasa o la disminución de las concentraciones de las proteínas an-tiapoptóticas de la familia de Bcl-2 o el aumento de las proapoptóticas comoBax, Bad, Bid o Bim.Aunque la contribución relativa de cada uno de estos media-dores y del efecto directo de la isquemia sobre la cadena mitocondrial resta toda-vía por establecer, la función clave de la mitocondria en la muerte posisquémicaes indudable. Esta importancia se ha manifestado en modelos de ratón con defi-ciencia en proteínas que participan en el mantenimiento del potencial de mem-brana mitocondrial o en la expresión de las proteínas de la familia de Bcl-2. Portodo ello, numerosas terapias en desarrollo para controlar los efectos dañinos cau-sados por la isquemia y reperfusión están siendo encaminadas a la actuación fren-te a mecanismos situados por encima o en la misma mitocondria. Esto ha llevado


a que muchos investigadores consideren a la mitocondria como el punto de noretorno en el daño posisquémico, pasado el cual la célula está destinada a unamuerte segura, independientemente de que lo sea a través de vías señalizadorasapoptóticas o necróticas. Ambos mecanismos, apoptosis y necrosis, parecen sermediados por la mitocondria en la muerte causada por isquemia y reperfusión,los factores como niveles mínimos de ATP, imprescindible para la muerte apop-tótica, o un excesivo estrés celular capaz de inactivar las caspasas efectoras me-diante la oxidación de cisteínas específicas, son los que decidirán por qué víadiscurrirá la muerte celular. Los tratamientos basados en el uso de antioxidantes,y en especial los que buscan el mantenimiento de la capacidad mitocondrial deeliminación de radicales, permitirían el mantenimiento de la integridad mitocon-drial y la reducción del daño causado por isquemia y reperfusión, independien-temente del mecanismo, necrótico o apoptótico, por el que cursará.

NADPH oxidasa

Durante la inflamación que aparece en la isquemia y reperfusión también se gene-ra el radical O2

•, principalmente desde una NNAADDPPHH ooxxiiddaassaa unida a la membra-na citoplasmática. Esta flavoproteína, presente en los leucocitos fagocíticos(monocitos, macrófagos, neutrófilos) y en las células endoteliales, es capaz degenerar grandes cantidades de O2

• a través de la reducción de O2 utilizandoNADPH como donador de electrones. Tras su estimulación, esta enzima multi-componente libera O2

• al espacio extracelular induciendo estrés oxidativo en eltejido adyacente (véase capítulo de NADPH oxidasa). La inexistencia de inhibi-dores específicos ha dificultado su estudio en modelos in vivo de la isquemia yreperfusión; sin embargo, su participación se ha demostrado en modelos de ratóngenéticamente deficiente en una subunidad de la NADPH oxidasa (gp91). Estosanimales experimentan una clara protección frente a isquemias largas, no tan evi-dente en periodos inferiores a 1 h, hecho que parecería indicar que diferentes víasinductoras del daño isquémico podrían activarse en mayor o menor medida enfunción de la gravedad del estímulo.

Otras sustancias que pueden inducir estrés oxidativo celular, como el HOCl–o el óxido nítrico (NO•), también se han involucrado en el daño posisquémico.En el caso del NO•, se le atribuyen efectos tanto benéficos (cuando es generadoen dosis bajas) como nocivos (cuando sus niveles sobrepasan un determinadoumbral). En el caso del hígado, el NO• se genera a través de dos enzimas: la NO•

sintasa constitutiva (eNOS) presente en células endoteliales, y la NO sintasainducible (iNOS) localizada también en células endoteliales y hepatocitos. ElNO• es un potente vasodilatador que puede mantener la microcirculación san-guínea y una fuente de formación de peroxinitritos a través de su reacción con©

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superóxidos. En general, se asume que el NO• derivado del eNOS es responsabledel mantenimiento del flujo de sangre hepático después de isquemia y reperfu-sión, mientras que la excesiva formación de NO• a través de la inducción deiNOS conduce a daño inducido por peroxinitritos. Estudios realizados con rato-nes deficientes en estos enzimas parecerían apoyar esta hipótesis.

❚ EXPERIMENTOS REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

Una de las líneas de investigación de los autores se ha enfocado a evaluar la fun-ción del GSHm en la supervivencia celular durante la hipoxia. Sus resultadosmuestran que la hipoxia moderada (5% de O2) puede activar la respuesta adap-tativa mediada por la generación de especies reactivas de oxígeno mitocondrialesen hepatocitos primarios de rata y de la línea de hepatoblastoma humanoHepG2. Estas especies actúan como segundos mensajeros al incrementar, depen-


Activación delcomplemento

Radicales Ceramida

Bid

Citocromo c

Caspasa 9

Caspasa 3

Muerte celular

Caspasa 8

FragmentaciónDNA

TNFReceptor de TNF

Linfocito

Plaquetas

Célula deKupffer

RadicaleRadicalesRadicales

FFiigguurraa 2222--11.. Mecanismos de daño hepático por isquemia y reperfusión. Los radicales libres de unaforma directa, generados principalmente por las células de Kupffer y los leucocitos polimorfonu-cleados, o indirectamente, a través de su participación en la señalización intracelular de citocinas comoel TNF, tienen un papel crítico en el daño posisquémico. En la mitocondria confluyen diversas víasgeneradoras de estrés activadas por la isquemia y reperfusión, el equilibrio entre ellas y la capacidadantioxidante mitocondrial determinará su funcionalidad. La pérdida de su potencial de membrana yla liberación de proteínas apoptogénicas conducirá al hepatocito a la muerte. Por ello, se considera ala mitocondria como el punto de no retorno en la señalización de la isquemia y reperfusión.

diendo del tiempo, tanto las concentraciones de los factores HIF-1α y NF-κB enel núcleo celular. Ambos factores no sólo translocan al núcleo, sino que mantie-nen su actividad al estimular la expresión de sus genes blanco. Pero cuando encondiciones hipóxicas se disminuyeron los niveles de GSHm, encontraron unasobreproducción de especies reactivas de oxígeno que provocaron una muertecelular predominantemente necrótica. Por tanto, sugieren que en condiciones dehipoxia moderada, dichas especies podrían jugar un papel benéfico al actuarcomo segundos mensajeros y formar parte de la transducción de señal frente a lahipoxia; en cambio, cuando existe una disminución en el principal sistema antio-xidante de la mitocondria (GSHm), el exceso de estas especies podría oxidar alas biomoléculas, ocasionando la muerte celular. Estas observaciones indican queel sinergismo entre el bajo contenido de GSHm y la hipoxia en los hepatocitosperivenosos durante el consumo crónico de alcohol podría contribuir a su suscep-tibilidad frente a la toxicidad del etanol.

❚ CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS

La participación de los radicales libres en el daño posisquémico no parece serobjeto de controversia. En cambio, sí es controversial cuáles son sus fuentes intra-celulares y sus contribuciones relativas, la participación directa de los radicales oinductores de moléculas señalizadoras, e incluso la capacidad de antioxidantesespecíficos de controlar su efectos nocivos.

Los radicales libres son reconocidos como responsables de la señalización deuna importante cantidad de vías celulares. Numerosas evidencias demuestranque, como en el caso del preacondicionamiento antes de la isquemia y reperfusión,la señalización activada por oxidantes puede proteger contra los estímulos nocivos.Por ello, hay que ser cautos en la aplicación de los tratamientos basados en la alte-ración del delicado equilibrio redox celular, ya que varias funciones celulares crí-ticas están bajo el control de genes inducibles por estrés oxidativo. Entre estasproteínas destacan antioxidantes como la MnSOD, la catalasa, la GPx, así comosistemas protectores como NF-κB, glutarredoxina, receptores de insulina o pro-teínas de choque térmico. Un buen ejemplo de ello es cómo pueden eliminarselos efectos benéficos del preacondicionamiento (que lo convierten en la másaceptada maniobra clínica para preservar órganos que han someterse a isquemiay reperfusión) por el uso de antioxidantes. Así, varios laboratorios han demostra-do que atenuar con antioxidantes la generación de radicales producida despuésde una breve isquemia (10 a 15 min) elimina la protección que ésta supone fren-te a una isquemia de mayor duración.

Otro aspecto a comentar es la posibilidad de realizar tratamientos basados enel aporte de antioxidantes a órganos isquémicos. Durante la isquemia, el flujo©

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sanguíneo está impedido. Debido a ello, el tratamiento de tejidos isquémicos confármacos está limitado. De hecho, la mayor parte de tratamientos efectivos con antioxidantes han sido con pretratamientos realizados inmediatamente des-pués del inicio de la reperfusión, procedimiento que dificulta en muchos casos suaplicación clínica. Sin embargo, el progresivo conocimiento de los radicales espe-cíficos generados, sus puntos de generación y las localizaciones intracelulares enlas que actúan, han de permitir futuros tratamientos efectivos dirigidos haciaradicales y compartimientos subcelulares concretos.

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EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASS

DDEE OOXXÍÍGGEENNOO YY CCÁÁNNCCEERR

Luis Enrique Gómez Quiroz

❚ INTRODUCCIÓN

Lo que se conoce comúnmente como cáncer, comprende en realidad a más de200 enfermedades, que juntas representan 50% de las muertes en los paísesindustrializados; entre éstas se pueden mencionar a los carcinomas de próstata,mamario, pulmón, e intestino como los que presentan mayor mortalidad por añoen el mundo.

Desde el punto de vista celular y molecular, un tejido canceroso presenta variascaracterísticas comunes, como son el incremento en la proliferación y autonomíacelular, deficiencia en la apoptosis, diferenciación y metabolismo alterado, inesta-bilidad genómica, inmortalización celular, y por último, metástasis e invasión.Todosestos fenómenos llevan a la pérdida de la funcionalidad normal del tejido y, final-mente, a insuficiencia orgánica y muerte.

Los factores de riesgo reconocidos para el desarrollo de las neoplasias incluyenlos factores hereditarios o genéticos, y ambientales, así como el tipo de agentecarcinógeno de que se trate, sea qquuíímmiiccoo (metales pesados como el cadmio, aflo-toxinas, tricloroetileno, asbesto, entre otros), ffííssiiccoo (radiaciones ionizantes, luzUVB), bbiioollóóggiiccoo (virus de la hepatitis o del papiloma humano, bacterias) o bien

23

aalltteerraacciioonneess ffiissiioollóóggiiccaass, como problemas en la replicación del DNA o reaccionesmetabólicas.

❚ EFECTO DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENOSOBRE EL DESARROLLO DE LA PATOLOGÍA

Es importante definir que el cáncer es un fenómeno de etapas y funciones múl-tiples, se han delineado tres estados para el desarrollo de la patología, que son ini-cio, promoción y progresión del tumor, y en todas ellas los radicales libres jueganun papel importante.

Inicio del proceso neoplásico

En la actualidad es bien conocido que la evolución celular a la neoplasia com-prende la alteración secuencial de oonnccooggeenneess y/o ggeenneess ssuupprreessoorreess ddee ttuummoorreess,cuyos productos proteínicos participan críticamente en las vías de transducciónde señales y en la regulación de la expresión génica, sobre todo de las proteínasencargadas del mantenimiento celular, reparación del DNA, y regulación deapoptosis, entre otras.

Los oonnccooggeenneess por lo general son formas alteradas de genes normales conoci-dos como pprroottoooonnccooggeenneess. Como la mayor parte de ellos codifica para proteínasque están relacionadas con el control del ciclo celular o la apoptosis, su alteracióno su expresión excesiva trae como consecuencia desórdenes en estos niveles fisio-lógicos que son determinantes para el desarrollo de la patología. Algunos ejem-plos de oncogenes son src, myc, Ha-ras, entre otros.

Los ssuupprreessoorreess ddee ttuummoorreess son genes que codifican para proteínas que supri-men o inhiben los procesos que favorecen la formación de tumores, por ejemplo,una proliferación excesiva, y también regulan el ciclo celular para que no se salgade control, para los genes que codifican para p16 y Rb. Dentro de este grupo tam-bién se encuentran proteínas que se dedican a sensar y activar la reparación delDNA si éste se encuentra dañado (genes BRCA1, MLH1, p53). Los genes supre-sores de tumores son recesivos, es decir, que para que se altere su función se nece-sita que los dos alelos o copias del gen se pierdan o muten. Los pacientes concáncer hereditario son más susceptibles a este fenómeno, ya que con frecuenciapresentan uno de los dos alelos mutados.

Una de las consecuencias del daño oxidativo a los nucleótidos es la generaciónde una mutación o bien, la alteración en la expresión de un gen; por esta razón,la célula tiene sistemas que le permiten por un lado prevenir que el daño ocurra,y por otro, una reparación rápida y eficaz. Sin embargo, una frecuencia elevada


en el daño oxidativo de nucleótidos libres o en el DNA hacen que los sistemasde protección fallen.

Ya en el presente libro se ha mencionado de manera clara las modificacionesque inducen los radicales libres sobre las bases nitrogenadas de los nucleótidos,sea en el DNA o como monómeros, y ha quedado bien definido que las especiesreactivas de oxígeno pueden dañar significativamente al DNA genómico. Estosdaños ocasionan mutaciones, y éstas activan a los oncogenes, y producen la inac-tivación de genes supresores de tumores y, en consecuencia, el inicio de la neo-plasia o del tumor. La etapa de inicio es resultado tanto de una lesión persistenteen el DNA como de una remoción deficiente de estas lesiones por los sistemasde reparación. Todo esto sucede antes del inicio de la síntesis del material gené-tico en la etapa S del ciclo celular, lo que genera la introducción de alteracionesmutagénicas en el DNA de las células recién generadas. Así, el proceso carcinó-genos surge de la omisión en la reparación de las bases dañadas o como conse-cuencia de una serie de eventos genéticos de eliminaciones o translocacionesasociadas con rupturas de cadenas del material genético que no fueron reparadas.Las translocaciones están asociadas al inicio de varias neoplasias en humanos através de la activación de oncogenes, uno de los ejemplos más estudiados es el lin-foma de Burkitt, donde el oncogén myc es activado por una translocación entreel cromosoma 2 y 8. Otros ejemplos de oncogenes asociados al inicio de neopla-sias por translocación o eliminación son N-ras, Ha-ras, myb, sis, abl, implicadosen patologías como neuroblastoma, cáncer mamario y varios tipos de leucemias.

Las especies altamente reactivas como el radical hidroxilo (•OH), causanoxidación en el DNA, mientras que el peroxinitrito (ONOO–) causa tanto oxi-dación como nitración en las bases nitrogenadas. La vida media del •OH es muycorta, por lo que todavía es un enigma el mecanismo exacto por el cual este radi-cal llega hasta el DNA. Necesariamente tendría que generarse cerca del ácidonucleico para lograr oxidarlo, mientras que el ONOO– difunde con facilidad enlas membranas, por lo que resulta más comprensible su efecto sobre las basesnitrogenadas, esto aunado a que es una de las principales especies reactivas gene-radas en procesos inflamatorios.

Uno los primeros estudios que demostraron que los radicales libres dañan alDNA proviene de la observación de que el peróxido de hidrógeno (H2O2), enpresencia de sulfato de hierro, induce fragmentación de los cromosomas, desdeentonces se ha estudiado la interacción de los radicales libres no sólo con elDNA, sino también con las proteínas, los lípidos y el RNA, entre otras biomo-léculas. Básicamente, la modificación oxidativa de estas moléculas genera la des-regulación de la homeostasia celular, lo que deriva en carcinogénesis; de hecho,la presencia aductos en el DNA como la 8-dihidro-2’-desoxiguanosina (8-oxod-Guo o bien 8OHdG), están considerados como biomarcadores de daño oxidati-vo y de carcinogénesis debido a su alta mutagenicidad en células humanas. Se han©

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Especies reactivas de oxígeno y cáncer • 349

reportado modificaciones oxidativas en prácticamente todos los nucleótidos, tantopolimerizados en ácidos nucleicos, como en sus formas monoméricas libres. Se havisto que la transversión GC→ TA se relaciona con la presencia de 8-OH-dG enoncogenes como ras y en genes supresores de tumores como p53 tanto en cáncerhepático como de pulmón, algunos autores han propuesto que la simple presenciade 8-OH-dG en el DNA es suficiente para propiciar la formación de tumores.

En cuanto a los genes supresores de tumores, se mencionó que para que el pro-ducto de dichos genes influya en un proceso carcinógeno es necesario que los dosalelos sufran mutaciones o eliminaciones. Varios grupos de investigación handemostrado que el NO• y sus derivados modifican postraduccionalmente a losresiduos funcionales de algunas proteínas como p53, que son fundamentales paraconferir la actividad.

Promoción de tumores

Una vez que se ha iniciado la modificación oxidativa del DNA, los radicales librestoman mayor relevancia, como moduladores de la promoción de los tumores.

Básicamente, la promoción consiste en la activación de las vías de señalizaciónque controlan la proliferación, ciclo celular, apoptosis o la síntesis de proteínas deprotección, como las proteínas antioxidantes o las proteínas de choque térmico.Varios agentes promotores de tumores regulan estas vías, entre ellos están las espe-cies reactivas de oxígeno, así como los productos de la lipoperoxidación, como elmalondialdehído (MDA) o el 4-hidroxinonenal (4HNE), entre otros metabolitos.

El mecanismo molecular por el cual los radicales libres inducen la promociónde tumores no se conoce con exactitud. Se han postulado mecanismos tantogenéticos como epigenéticos (véase capítulo de Concepto epigenético y sus alte-raciones). La inducción de un estado celular prooxidante permite la expresiónalterada de genes o la deficiente actividad de varias proteínas de señalizacióndebido a una modificación oxidativa en sus grupos sulfhidrilos, los cuales se ubi-can principalmente en los centros catalíticos, todo esto conduce a un fenotipocelular alterado.

Como ejemplo de lo anterior, se puede mencionar a la proteína cinasa C(PKC), la cual media la activación de varias vías involucradas en la proliferación,diferenciación y transformación oncogénica. La PKC puede ser regulada por laoxidación directa de las cisteínas en su centro catalítico; de hecho, este efectoocasiona que la cinasa sea activada sin el requerimiento fisiológico de Ca2+, o defosfolípidos. Por otro lado, se ha reportado que el H2O2 induce la redistribuciónde PKC, lo que modifica sustancialmente su función normal. Otras proteínas quereciben modificación directa por las especies reactivas de oxígeno y que influyenen la progresión de tumores son c-jun y c-fos, ambas componentes del factor de


transcripción AP-1, el cual regula la expresión de genes relacionados con prolife-ración celular. De hecho, el AP-1 ha sido considerado como uno de los factoresde transcripción seriamente modificados en varios tipos de cáncer.

Otro factor de transcripción regulado por las especies reactivas de oxígeno ycon gran repercusión en el cáncer es el factor nuclear κB (NF-κB), el cual regulala expresión de varias proteínas involucradas en las vías de supervivencia y muer-te. Se ha observado en varios tipos de cáncer una activación incrementada delNF-κB, generando un aumento en la síntesis de proteínas antiapoptóticas, comoson Bcl-2 y FLIP, entre otras. Es bien sabido que la activación de este factor detranscripción es el responsable de la resistencia a terapias anticáncer en variostipos de tumores, lo que ha puesto al NF-κB como uno de los principales blan-cos para el control molecular del cáncer.

En gran medida, la promoción y progresión de tumores por las especies reac-tivas de oxígeno depende de la activación de los sistemas endógenos de genera-ción de estas especies reactivas, como la NADPH oxidasa, óxido nítrico sintetasainducible (iNOS), xantina oxidasa, y la cadena respiratoria mitocondrial; prácti-camente todas ellas se han abordado de manera detallada en el presente libro.Existe suficiente evidencia experimental de la participación de estas enzimas enlos procesos carcinógenos.

La mayor parte de los sistemas enzimáticos productores de radicales libresestán regulados por vías de señalización que los activan o los inhiben según losrequerimientos fisiológicos.

Además de los sistemas antes mencionados existen otras vías endógenas quetambién pueden de generar especies reactivas de oxígeno. El sistema de las ciclo-oxigenasas (COX) está formado por tres enzimas que catalizan la transformacióndel ácido araquidónico en prostaglandina H2, la cual es al mismo tiempo la mo-lécula precursora de otras prostaglandinas, lo que pone a las COX como enzimasfundamentales en los procesos inflamatorios, sobre todo la isoforma inducibleCOX-2. En estudios recientes se ha corroborado la participación de la COX enla carcinogénesis, por ejemplo, la inhibición de la COX-2 suprimió la poliposisintestinal, que permite el desarrollo del cáncer de colon. Otro estudio llevado acabo en ratones genéticamente modificados deficientes de COX-1 y COX-2,(cox1-/-, cox2-/-) mostró una reducción en la diferenciación epidérmica y en lapromoción de tumores de piel.

Por otra parte, la iNOS produce cantidades micromolares de NO•, y se hademostrado que es una enzima involucrada también en procesos carcinógenosmediados por inflamación crónica. En la actualidad existe cierta controversiasobre el papel que juega el NO• en los procesos carcinógenos, esto debido a quelos efectos del NO• dependen de su concentración, de la interacción con otrosradicales libres, metales y proteínas, así como del tipo celular, y de los blancosgenéticos que suele afectar. Si bien para muchos investigadores está claro el papel©

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del NO• en procesos angiogénicos, los cuales son fundamentales para la progre-sión de tumores, este radical libre también puede dañar directamente al DNApor un lado, y al mismo tiempo presentar protección contra citotoxicidad, inhi-bir o promover la proliferación celular, y puede ser proapoptótico o antiapoptó-tico. Esto hace que los resultados experimentales de la función del NO• encarcinógenos se evalúen con extremo cuidado debido a la ambigüedad de las fun-ciones que despliega.

Aún así, la evidencia experimental obtenida en ratones deficientes en iNOS(iNOS-/-) muestra una clara correlación positiva en la promoción y progresión detumores. Estos ratones presentaron mayor resistencia al daño en colon inducidopor el trinitrobenceno y una menor letalidad, reduciendo la modificación postra-duccional de proteínas como la formación de nitrotirosinas, así como la forma-ción de MDA y otros productos de la lipoperoxidación. Al someter a estosanimales a una dieta con dextrán sulfato de sodio, el cual genera inflamación en colon y cáncer, se encontró que mostraron menos signos y síntomas de coli-tis comparados con el grupo control. Por otro lado, la inoculación de los ratonescon células de melanoma B16-F1 desarrolló menos tumores que el grupo control,lo que deja claro la participación de iNOS en la progresión de tumores.

Progresión de los tumores

Durante el evento de progresión siguen presentes varios de los eventos que sepresentaron en la etapa de promoción, pero de manera exacerbada. Las especiesreactivas de oxígeno ahora tienen un efecto a nivel del genoma, induciendo elrearreglo de los oncogenes que fueron inicialmente mutados, lo que permite laprogresión del tumor. Se ha observado que el tratamiento con antioxidantescomo glutatión (GSH) o disulfiram inhiben la progresión maligna de papilomasa carcinoma escamoso invasivo en modelos murinos de cáncer de piel. Por otrolado, el tratamiento con un inhibidor de la síntesis de GSH como el dietilmalato,incrementa significativamente la progresión del tumor, lo que deja claro la parti-cipación de los radicales libres en la progresión de tumores.

❚ INFLAMACIÓN, RADICALES LIBRES Y CARCINOGÉNESIS

El daño crónico generado tanto por agentes infecciosos como por bacterias ovirus, así como por irritaciones, inicia una respuesta inflamatoria caracterizadapor la infiltración a la zona de daño de células inmunológicas. Como se mencio-nó en capítulos anteriores, una medida de defensa para eliminar al agente agre-sor y a las células dañadas es la eexxpplloossiióónn ooxxiiddaattiivvaa en la que dichas células


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generan radicales libres de oxígeno y nitrógeno. Sin embargo, el efecto no es total-mente focalizado, y sus secuelas van más allá de la zona afectada, ocasionandodaño en las células epiteliales y del estroma de la vecindad.

Una vez iniciado el fenómeno de estrés oxidativo, el daño molecular es inminen-te, presentándose prácticamente en todas las moléculas como en DNA, proteínas ylípidos, los cuales de una u otra forma influyen en el proceso carcinógeno, comoya se ha mencionado a lo largo del libro (figura 23-1).

Se ha comprobado que la sobrecarga oxidativa en diversas patologías es lacausa principal de la generación de tumores malignos, como ejemplo de ellas sepueden mencionar la hemocromatosis, hepatitis viral B y C en el hígado, enfer-medad de Crohn y colitis ulcerosa en el colon, infección por virus del papilomahumano en el cérvix, y la infección por Helicobacter pylori en el estómago, porcitar solo algunas (cuadro 23-1). Se ha demostrado que la inflamación crónicacontribuye en 25% en los casos totales de cáncer.

El cáncer de colon puede ser un buen ejemplo de la carcinogénesis inducidapor inflamación crónica. Este cáncer es 30 veces más frecuente que el cáncer deintestino delgado debido a que, en contraste con este último, el colon presenta


Daño, inflamación

Reclutamiento de célulasinflamatorias

Explosión oxidativaERO y ERN

Daño a proteínasproteínas de reparación

Lipoperoxidación

MDA, 4-HNE

Cascada del ácidoaraquidónico

Daño al DNA8-OH-G

Aductos de etenoRupturas de DNA

Otras oxidaciones a bases

Eicosanoides

Proliferación celular

FFiigguurraa 2233--11.. Mecanismo de daño molecular en procesos de inicio de tumores en inflamación cróni-ca. MDA, malondialdehído; 4-HNE, 4 hidroxi-nonenal.

por un lado niveles muy elevados de bacterias fecales y por otro una infiltraciónde células inmunológicas ocasionada por las primeras.

La actividad respiratoria de las bacterias es una fuente muy importante de peró-xidos y radical superóxido (O2

•) que en presencia de hierro genera •OH, esto seagrava si se toma en cuenta que el hierro derivado de la dieta no se absorbe del todoy se concentra en las heces fecales en niveles 10 veces mayores que en la mayorparte de los tejidos. Los pigmentos biliares, como la bilirrubina y la biliverdina, pue-den unir hierro en una forma que es capaz de dirigir la reacción de Fenton.

❚ P53 Y LAS PROTEÍNAS SUPRESORAS DE TUMORES

Varias de las proteínas que controlan la apoptosis también regulan el ciclo celu-lar, una de ellas es p53. La sobreexpresión de p53 conduce a la célula a entrar enapoptosis, lo que explica que en los procesos tumorales la actividad de p53 estáprácticamente inhibida. Esto permite a las células transformadas tener mayorresistencia a la apoptosis y en consecuencia, ser invulnerables a las terapias anti-cáncer que justamente eliminan a las células malignas por medio de la apoptosis.La proteína p53 es un factor de transcripción que regula la expresión de variosgenes cuyos productos resultantes se encargan del mantenimiento de la integri-dad del genoma. Como es sabido, la translocación de p53 al núcleo es fundamen-tal para la expresión de los genes que controla.

En estudios in vitro se ha observado que p53 se transloca al núcleo tras un tra-tamiento con radiaciones UV en tiempos cortos (1 a 2 h), abandonando el núcleopara localizarse una vez más en él a las 12 h. El pretratamiento con antioxidan-tes bloquea la localización nuclear temprana, esta evidencia sugiere fuertementeque p53 es requerido bajo condiciones de estrés oxidativo para una eventualreparación al DNA tras el daño por radicales libres. Por otro lado, estos estudios


CCuuaaddrroo 2233--11.. CCáánncceerreess aattrriibbuuiiddooss aa iinnffeecccciioonneess

AAggeennttee iinnffeecccciioossoo CCáánncceerr

Virus del papiloma humano CervicouterinoVirus de hepatitis B o C HepáticoVirus de Epstein Barr Linfoma de Burkitt, enfermedad de

Hodgkin, cáncer nasofaríngeoVirus de inmunodeficiencia humana Sarcoma de KaposiVirus del herpes Sarcoma de KaposiHelicobacter pylori Carcinoma y linfoma gástricoSchistosoma hematobium Cáncer de vejigaSchistosoma japonicum Colon

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mostraron que el tratamiento con agentes carcinógenos que no generan estrésoxidativo no indujeron la translocación nuclear temprana de p53, sino hasta 12 h después del tratamiento.

Como se mencionó antes, los radicales libres pueden modificar postraduccio-nalmente la actividad de p53, pero también se ha reportado que el gen que codi-fica para p53 es un blanco común de mutaciones inducidas por radicales libres, loque conduce a una deficiente o nula producción de la proteína.

❚ ANTIOXIDANTES Y CÁNCER

Tal vez la evidencia más contundente en cuanto a la importancia de la participaciónde los radicales libres en el cáncer sean los efectos protectores de los antioxidantes.

El GSH, N-acetil cisteína, vitamina E y C, y los antioxidantes fenólicos, handemostrado experimentalmente tener una fuerte función en la inhibición del ini-cio, promoción y propagación de los tumores. Como se mencionó antes, aunque el efecto anticarcinógeno de los antioxidantes es indiscutible, el mecanismo por elcual actúan no está del todo establecido. Se ha sugerido una interacción directacon los agentes iniciadores o promotores de cáncer, o con los metabolitos activa-dos, así como a nivel de la regulación de las vías que promueven el proceso, comoaquellas involucradas en la proliferación y ciclo celular, por citar algunas.

Los antioxidantes fenólicos hidroxitolueno butílico (BHT) e hidroxianisol butí-lico (BHA) han tomado particular interés debido a su uso como preservativos enalimentos. Estudios en animales de experimentación que recibieron estos compues-tos en la dieta, mostraron que BHT y BHA antagonizaron los efectos carcinógenosinducidos por el 7,12-dimetil benzo (a) antraceno(DMBA) y del benzopireno enel estómago de ratones y en la glándula mamaria de ratas, y previnieron las neo-plasias en el pulmón en ratas expuestas agudamente a DMBA. Básicamente, estoscompuestos actúan interfiriendo con el metabolismo del agente carcinógeno. Seha propuesto que otros antioxidantes como la vitamina E y C, disulfiram, selenio,entre otros, actúan de manera similar a los antioxidantes fenólicos.

Tal vez el selenio tenga un mecanismo diferente inhibiendo la carcinogénesisquímicamente inducida, ya que forma parte de la glutatión peroxidasa (GPx),enzima encargada en la eliminación del H2O2; esta enzima, como se ha explicadoen el presente libro, utiliza dos moléculas de GSH para llevar a cabo su efecto.

❚ ESTUDIOS REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

El autor ha realizado estudios respecto a uno de los sistemas que regulan lahomeostasia redox, que es la señalización mediada por el factor de crecimiento


de hepatocitos y su receptor c-met. Datos producidos en el laboratorio de carci-nogénesis experimental, de los Institutos Nacionales de Salud en EUA (NIH, porsus siglas en inglés) mostraron que la eliminación de la señalización de c-met por la supresión condicional del exón 16 del receptor c-met en hepatocitos incre-menta la actividad de la NADPH oxidasa y la producción de especies reactivasde oxígeno por un mecanismo dependiente en la activación de PKC. En estemismo laboratorio reportó que los ratones deficientes en c-met presentan mayorpromoción y progresión de tumores hepáticos y mayor inestabilidad genómicacuando son tratados con dietilnitrosamina (DEN) por un mecanismo presumi-blemente mediado por estrés oxidativo.

❚ CONCLUSIONES

Es importante dejar claro que si bien el presente capítulo trata de la participa-ción de los radicales libres en el inicio, promoción y progresión de los tumores,estas moléculas también pueden presentar efectos positivos en el tratamiento delcáncer. Si bien los radicales libres actúan activando oncogenes y desactivandogenes de las proteínas supresoras de tumores, o promoviendo el tumor, tambiénse ha demostrado que el estrés oxidativo puede sensibilizar a las células paraentrar en apoptosis o tener un efecto citotóxico en las células transformadas, locual es el principio de la radioterapia.

Los efectos de los radicales libres están en función de su concentración, asícomo del tiempo que dure el estrés oxidativo. Es importante señalar que, aunquemuchos de los protocolos clínicos donde se han usado antioxidantes para el tra-tamiento contra el cáncer no han tenido los resultados esperados, se ha confirma-do que la estrategia para el control de estas patologías debe ser un tratamientomultifactorial, atacando varias vías que han sido modificadas en las células trans-formadas, pudiendo ser los sistemas generadores de estrés oxidativo, eliminado elagente iniciador, inhibiendo los procesos angiogénicos, y las vías que promuevenla proliferación celular, sin afectar las células normales. Esto pues, refrenda ungran reto aun para las ciencias de la salud.

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Abel Santamaría del Ángel

❚ INTRODUCCIÓN

Múltiples alteraciones neurodegenerativas en humanos comparten una caracte-rística en común: la vulnerabilidad de las células neuronales a las acciones noci-vas de las especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno, resultando en el estrésoxidativo y nitrosativo en el tejido nervioso. En la actualidad, se reconoce quetanto el estrés oxidativo como el nitrosativo juegan un papel determinante comofactores causales primarios en estas neuropatías, entre las que se encuentran laenfermedad de Alzheimer, de Parkinson, de Huntington y la esclerosis lateralamiotrófica, no sólo debido a que son responsables de alteraciones estructuralesy funcionales oxidativas de cualquier biomolécula disponible, sino además comomediadores potenciales de necrosis y apoptosis a través del inicio de cascadas deeventos de muerte celular señalizadas a partir de vías de factores de transcripcióny respuestas inflamatorias (figura 24-1).

Es de gran importancia el hecho de que diversos grupos de investigación handesarrollado en los últimos decenios una serie de herramientas experimentalespara estudiar el impacto de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno en elcerebro. Así, hoy se cuenta con un número considerable de toxinas capaces de

24

inducir daño celular degenerativo en el sistema nervioso de animales de labo-ratorio o en cultivos celulares para generar modelos experimentales que repro-duzcan las principales alteraciones morfológicas, bioquímicas, moleculares yconductuales de las diferentes neuropatías humanas. En este capítulo se trataráde manera general los eventos involucrados en el daño oxidativo en algunas delas neuropatías degenerativas humanas más frecuentes o más estudiadas, y serevisarán de manera breve sus modelos experimentales y las alternativas terapéu-ticas emergentes que se están probando a nivel experimental y cuya finalidad esla de reducir los efectos nocivos de las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno.Existen diversas razones por las cuales el sistema nervioso central es particular-mente vulnerable a las acciones tóxicas de estas especies. Las tres más importantesse describen a continuación:

1. La primera causa se relaciona con su alto contenido de lípidos, el sustratomás común para la oxidación a través de la acción de las especies reactivasde oxígeno y nitrógeno. La alta proporción de lípidos en el cerebro, en com-paración con otros órganos, es una cuestión que no sólo obedece a la pecu-liar citoarquitectura que este órgano presenta (mayor superficie membranalen células más largas que contienen proyecciones neuríticas), sino tambiéna las extensas coberturas lipídicas de las fibras neuronales. Por esta razón,existen algunas regiones cerebrales particularmente enriquecidas con lípi-


T ejido Ne r vioso

Señales de daño celular y e v entos tóxicos (alte r aciones bioquímicas y moleculares)

F o r mación de especies reacti v as del o xígeno/nitrógeno

Procesos inflamato r ios Estrés o xidati v o/nitrosati v o Acti v ación de f actores de t r ansc r ipción

Degene r ación y m ue r te celular (apoptosis o necrosis)

FFiigguurraa 2244--11.. Procesos tóxicos involucrados en el daño oxidativo al sistema nervioso central.

dos, como el caudado-putamen y el cerebelo. Resulta evidente que órganosenriquecidos con lípidos, como el cerebro y el hígado, sean más vulnerablesa la peroxidación lipídica producida por las especies mencionadas.

2. La segunda causa por la cual el sistema nervioso es más vulnerable a dichasespecies tiene que ver con la alta tasa metabólica del cerebro en compara-ción con otros órganos, dado que el metabolismo aeróbico es la mayor fuen-te de energía para las células nerviosas. Debido a la amplia distribución demitocondrias en el interior de las células neuronales (somas, dendritas,axones y particularmente en terminales sinápticas) necesarias para el meta-bolismo oxidativo y la síntesis de ATP, el riesgo de una pérdida de electro-nes a lo largo de su cadena de transporte es un evento altamente probable,lo que conduce a la formación de O2

• y H2O2. Hoy se sabe que diversos factores exógenos (exposición a radiación, contaminantes, entre otros) yendógenos (déficit energético, alteraciones estructurales y funcionales debiomoléculas, entre otros), predisponen a las células nerviosas a desarro-llar estos escenarios anómalos. Entonces, bajo condiciones fisiológicas nor-males, los sistemas antioxidantes endógenos, ya sean enzimáticos (catalasaSOD, GPx, etc.) o no enzimáticos (GSH, ácido ascórbico, entre otros), sonlos responsables de una adecuada remoción de estas especies; sin embargo,en condiciones fisiopatológicas que conduzcan a bajos niveles de actividado expresión de los sistemas mencionados, cantidades crecientes de estasespecies se tornan nocivas y sirven como sustratos potenciales para la for-mación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno más tóxicas, como •OHy ONOO–.

3. La tercera causa está relacionada con la aparentemente limitada actividadde algunas enzimas antioxidantes (p.ej., la catalasa) en el cerebro, y el sen-tido en el cual actúan algunas de las reacciones que implican la generaciónde especies como el H2O2, que es un subproducto común de la actividad dediferentes enzimas, como la monoaminooxidasa (MAO) y la tirosina hidro-xilasa, así como de procesos de autooxidación de catecolaminas y ascorba-to, procesos que con frecuencia se llevan a cabo en las células del sistemanervioso. Además, la activación de las fosfolipasas que depende de Ca2+, laliberación del ácido araquidónico y la descomposición de xantina por la xan-tina oxidasa, son eventos que conducen a la formación de O2

•. Más aún, laactivación neuronal de la sintasa del óxido nítrico (NOS) dependiente deCa2+/calmodulina conduce a la formación del NO•, y una vez que el NO• yel O2

• se encuentran, reaccionan con alta afinidad y forman la especie alta-mente reactiva ONOO–, conduciendo así a la posterior formación del •OH.Vale la pena destacar que en los tejidos cerebrales post mortem de pacien-tes de algunas neuropatías degenerativas, como la enfermedad de Parkinsony la de Huntington, se han encontrado depósitos incrementados de Fe2+, lo©

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Daño oxidativo y enfermedades neurodegenerativas • 361

que sugiere que éstos, si bien podrían ser el resultado de la liberación delmetal desde las células muertas, también podrían haber favorecido en algúnmomento de la evolución de la neuropatía reacciones tipo Fenton.

En general, el costo es alto para las células del tejido nervioso cuando hay unaformación masiva de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, e incluye la des-composición oxidativa de lípidos, proteínas, ácidos nucleicos y cualquier otra biomolécula disponible. Los mecanismos por los cuales algunas moléculas espe-cíficas son atacadas, así como el papel preciso que juegan diferentes enzimasantioxidantes (formas compartimentalizadas de las proteínas mencionadas)como sistemas de defensa antioxidante en las células, ya se han descrito en loscapítulos previos. Por tanto, en este punto sólo se insistirá en la importancia quetienen tanto el aumento en la formación de especies reactivas de oxígeno y nitró-geno, como la simultánea alteración de los sistemas antioxidantes endógenos parael inicio de procesos de muerte celular, ya sea directa (a través de estrés oxidati-vo y nitrosativo y daño necrótico temprano) o indirectamente (por activación decascadas de eventos de muerte celular a través de factores de transcripción y otrasmoléculas de señalización, conduciendo así a muerte apoptótica). Por ello, estecapítulo se centrará sólo en las evidencias de ocurrencia de estrés oxidativo ynitrosativo en algunas enfermedades neurodegenerativas, y la función que algu-nos agentes antioxidantes representan para su tratamiento.

❚ ENFERMEDAD DE PARKINSON

La enfermedad de Parkinson es la neuropatía motora progresiva más común enlas personas de la tercera edad, y se caracteriza por temblor, rigidez y bradicine-sia. Histológicamente, este trastorno presenta una degeneración selectiva de lasneuronas dopaminérgicas pigmentadas de la sustancia negra (substantia nigrapars compacta) que proyectan sus fibras hacia el caudado-putamen (circuiterianigroestriatal), y que se acompaña de una marcada disminución en los nivelesestriatales de ddooppaammiinnaa, así como de cuerpos de Lewy que pueden describirsecomo una serie de inclusiones intracelulares de la proteína α-sinucleína agregada(cuyo origen quizá obedezca a alteraciones mitocondriales y en la función del sis-tema ubiquitina-proteosoma). Existen diferentes características neuroquímicasde la enfermedad de Parkinson que implican un alto riesgo de ocurrencia deestrés oxidativo y nitrosativo. Entre éstas destaca el aumento en la descomposi-ción de la dopamina producida por la MAO, lo que resulta en una elevada for-mación de H2O2, indicando así que los procesos metabólicos controlados por laMAO constituyen una fuente potencial de especies reactivas de oxígeno y denitrógeno. Además, los cerebros de pacientes con este trastorno muestran niveles


disminuidos de actividad de la GPx y del contenido de GSH en la sustancia ne-gra, así como un aumento en los valores de hidroperóxidos lipídicos y bajas con-centraciones de ácidos grasos poliinsaturados. También se han reportadoalteraciones en la cadena respiratoria mitocondrial a nivel del complejo I, y even-tos excitotóxicos mediados por los receptores para aminoácidos excitadores,estos últimos parecen guardar cierta relación con la degeneración de la vía nigro-estriatal. Sin embargo, a pesar del evidente progreso que la literatura refleja sobrela investigación en la enfermedad de Parkinson, tanto en la caracterización de susprocesos patógenos como en las alternativas terapéuticas en progreso, la compren-sión sobre la naturaleza de esta enfermedad aún es limitada (figura 24-2). En estecontexto, la implementación de modelos experimentales en animales (roedores yprimates no humanos) y preparaciones biológicas que simulen las diferentes al-teraciones de la enfermedad de Parkinson permite a los investigadores hacer inferencias sobre los mecanismos de daño celular y molecular inherentes a estaneuropatía, así como la planeación de estrategias terapéuticas potenciales. Entreestos modelos destacan aquellos transgénicos recién desarrollados y que son pro-ducto de manipulaciones genéticas basadas en alteraciones moleculares, como lasobreexpresión y agregación de α-sinucleína, así como otros modelos farmacoló-gicos. De estos últimos sólo se señalarán los más relevantes.

La ddooppaammiinnaa ha sido propuesta como el modelo clásico de daño oxidativo enla enfermedad de Parkinson debido a que no sólo es el principal neurotransmisorusado por la vía nigroestriatal, sino que además puede actuar como una neuroto-xina endógena cuando es sometida a la autooxidación u oxidación mediante laactividad de la MAO, produciendo así un amplio espectro de eventos de estrésoxidativo y nitrosativo. Por su parte, la conocida toxina 6-hidroxidopamina pro-duce un modelo de la enfermedad de Parkinson cuando se inyecta intracerebral-mente al ser concentrada en las neuronas dopaminérgicas a través de untransportador de alta afinidad para dopamina, reaccionando con oxígeno molecu-lar para producir especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y el consecuenteestrés oxidativo y nitosativo, el cual resulta en el daño selectivo a neuronas dopa-minérgicas. Otro modelo de la enfermedad de Parkinson se produce a través dela metanfetamina, la cual genera eventos excitotóxicos y daño selectivo a las neu-ronas dopaminérgicas nigroestriatales cuando se administra de manera sistémicaa los roedores, disminuyendo las concentraciones de dopamina y la actividad dela tirosina hidroxilasa en procesos mediados por receptores glutamatérgicos tipoN-metil-D-aspartato (NMDA). Sin embargo, el modelo experimental de la enfer-medad de Parkinson más estudiado hasta ahora es el producido por 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), un subproducto de la síntesis de lameperidina que reproduce muchas de las características de la enfermedad tantoen humanos (parkinsonismo) como en animales de experimentación. El MPTPafecta la vía nigroestriatal, donde es convertido en su metabolito tóxico 1-metil-©

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4-fenilpiridinio (MPP+), el cual es capturado activamente por las mitocondrias delas neuronas dopaminérgicas y actúa como inhibidor del complejo I de la cadenarespiratoria, generando así una falla en el metabolismo energético, transporteincompleto de electrones, formación de especies reactivas de oxígeno y de nitró-geno y disminución de dopamina. En dicho modelo, el uso de ratones transgéni-cos que sobreexpresan la SOD dependiente de cobre y cinc (Cu/Zn-SOD) haresultado en una resistencia a la toxicidad del MPTP, mientras que en líneas celu-lares con baja actividad de catalasa hay potenciación del daño por MPP+, fortale-ciendo así las evidencias de estrés oxidativo.

De particular interés son los prometedores efectos neuroprotectores que agen-tes antioxidantes como el selenio (Se) y algunos catalizadores de la descomposi-ción del ONOO– han mostrado recientemente en algunos de estos modelos. Dehecho, son muy diversos los agentes antioxidantes (entre atrapadores de especiesreactivas de oxígeno y de nitrógeno, quelantes de metales y agentes que estimu-lan la actividad de enzimas antioxidantes) y neuroprotectores en general (inhibi-dores de MAO, agentes neurotróficos y fármacos dopaminérgicos) que han sidoprobados en los últimos decenios tanto en los modelos de la enfermedad de Par-kinson como a nivel preclínico y clínico en pacientes con esta enfermedad. Por


EP EA EH ELA

• -amiloide (agregación) • T au (a g regación) • F actores ambientales • T r ansmisión glutamatérgica

• -sinucleina (agregación) • Ciclo noci v o de dopamina • Actividad de M A O alte r ada • F actores ambientales • T r ansmisión glutamatérgica

• Huntingtina (a g regación) • T r ansmisión glutamatérgica

• Actividad o xidati v a basal • Mutaciones en Cu,Zn-SOD • T r ansmisión • glutamatérgica

Neurot o xicidad

Daño o xidati v o

• Daño a neuronas co r ticales e hipocam- pales • Demencia • Pérdida de memo r ia y aprendizaje • T r ansmisión colinérgica

• Daño a neuronas est r iatales y de sustancia ne gr a • Vía ni g ro-est r iatal • T em b lor y r igidez • Enco r v amiento • T r ansmisión dopaminérgica

• Daño a neuronas est r iatales • Demencia • Corea • T r ansmisión GABAérgica

• Daño a neuronas moto r as co r ticales y en médula espinal • P arálisis

FFiigguurraa 2244--22.. Factores causales potenciales en diferentes neuropatías degenerativas y sus conse-cuencias.

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mencionar algunos de los más recientes y prometedores como alternativas tera-péuticas potenciales, destacan la metalotioneína (atrapador de especies reactivasde oxígeno), el componente del té verde polifenol-epigalocatechin-3-galato (unagente antioxidante y antiapoptótico), inhibidores de proteasas dependientes decalcio o calpaínas, melatonina (atrapador de radical •OH), Ginkgo biloba(EGb761), el antitusivo dextrometorfán, inhibidores de la NOS, antagonistas delos canales del calcio, deprenil, tocoferol, etc. Sin embargo, a pesar de que éstos ymuchos otros tratamientos experimentales resultan en efectos neuroprotectoresen los diferentes modelos de la enfermedad de Parkinson, a nivel clínico la mayorparte no produce efecto alguno o evoca respuestas positivas moderadas, revelan-do así las obvias limitaciones de los modelos en relación con la enfermedad idio-pática. En consecuencia, se infiere que el conocimiento sobre los mecanismos deesta neuropatía aún es limitado, y por ello, nuevas herramientas experimentalescomo la genómica, proteómica, imagen cerebral y terapia génica, proveerán lasbases para mejorar las perspectivas sobre tratamientos para la enfermedad de Par-kinson en un futuro cercano.

❚ ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

Típicamente reconocida como una neuropatía demencial, el conocimiento sobrelos mecanismos que conducen a las manifestaciones clínicas de esta enfermedades aún limitado. En la actualidad, la enfermedad de Alzheimer se conoce como laalteración neurodegenerativa relacionada con la edad más común en los huma-nos, y se caracteriza por disminución progresiva de la capacidad cognitiva y pér-dida de la memoria, cursando con frecuencia con otros síntomas psicológicos yconductuales. Aunque fundamentalmente esporádica, cerca de 10% de los casosde dicho trastorno presentan un patrón de herencia autosómico dominante, yentre los blancos comunes de estas mutaciones se incluyen la proteína precurso-ra del péptido amiloide (PPA) y uno de los dos genes conocidos para la preseni-lina (PS1, PS2).A nivel molecular y celular, la causa primaria del trastorno pareceestar relacionada con una acumulación aberrante del péptido β-amiloide (Abeta),producto de la ruptura de PPA. Se asume que Abeta es responsable de las altera-ciones en la homeostasia del Ca2+ intracelular, así como de eventos excitotóxicosy oxidativos que resultan en la muerte celular necrótica y apoptótica. Otro fac-tor involucrado en esta neuropatía corresponde a la agregación de la fosfoproteí-na Tau, la cual es acompañada de alteraciones estructurales del citoesqueleto enlas células neuronales, aunque aún no se sabe con certeza cuál es la relación entrelos patrones de agregación de Abeta y Tau. Las características bioquímicas de laenfermedad de Alzheimer incluyen anormalidades en las transmisiones colinér-gica, glutamatérgica, adrenérgica, serotonérgica y dopaminérgica, así como la ac-


tivación de vías inflamatorias, oxidativas y hormonales. La disminución de lasactividades enzimáticas de la SOD y GPx y bajos niveles cerebrales de GSHacompañan al daño peroxidativo cortical e hipocampal en esta enfermedad. Losmarcadores típicos de esta enfermedad en cerebros post mortem son la forma-ción de placas neuríticas y marañas neurofibrilares, particularmente en las áreascortical e hipocampal. De hecho, dado que la alteración de la vía colinérgica es lacaracterística neuroquímica más relevante en este trastorno, diversos fármacosque afectan la actividad de la colinesterasa (inhibidores de la colinesterasa comodonepezil, galantamina y rivastigmina), y que en consecuencia incrementan labiodisponibilidad de la acetil colina en el cerebro, fueron el tratamiento de elec-ción para esta enfermedad. Sin embargo, en vista de que estos fármacos sólo ofre-cían una eficacia moderada para atenuar sus síntomas, han surgido un númeroconsiderable de estrategias no colinérgicas sobre la base de evidencias experimen-tales, demostrando los diversos factores involucrados en los procesos patogénicosde la enfermedad de Alzheimer. Entre estas estrategias destaca el uso del antago-nista de receptores para NMDA, la memantina, de los antioxidantes Ginkgo bilobay tocoferol, el agente antiinflamatorio no esteroideo indometacina, y estrógenosconjugados. Por desgracia, muchos de ellos no constituyen aún posibilidades tera-péuticas viables, y en algunos casos su administración resulta en hallazgos contra-dictorios, lo que enfatiza la necesidad de una exploración continua de otrasalternativas todavía a un nivel experimental. Más aún, dado que este trastornotambién es reconocido como una neuropatía que por lo general implica la forma-ción de especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno, y el consecuente estrés oxi-dativo y nitrosativo, muchas de estas nuevas estrategias se enfocan en el uso deagentes antioxidantes de fuentes diversas, como la vitamina C, ubiquinona, ácidolipóico, β-caroteno, melatonina y agentes sintéticos. Al respecto, otros productosnaturales como los flavonoides, representan terapias antioxidantes prometedorascontra desórdenes demenciales y que están bajo investigación continua.

El establecimiento de modelos animales o preparaciones biológicas que repro-duzcan las alteraciones observadas en la enfermedad de Alzheimer, constituyeuna herramienta de gran utilidad para caracterizar los mecanismos nocivos invo-lucrados en esta patología y probar alternativas experimentales para su trata-miento. Sin embargo, dada su complicada naturaleza mecanística, la enfermedades difícil de modelar. Algunas aproximaciones de modelos incluyen paradigmastóxicos tan diversos como la exposición a aluminio, fármacos que afectan la trans-misión colinérgica, excitotoxinas que lesionan las vías colinérgicas corticales ehipocampales, y la agregación de la proteína Tau para formar complejos con fila-mentos helicoidales apareados (PHF-Tau), entre otros. En términos de manipu-laciones genéticas, algunos modelos incluyen mutaciones en los genes depresenilina (PS), Abeta, y animales transgénicos derivados de la manipulación delmetabolismo de la PPA, como ratones que portan transgenes para la PPA huma-


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na con o sin mutaciones para la PS, o el modelo inverso producido por ratonesknockout para PPA, del cual sus neuronas en cultivo han demostrado ser resisten-tes a la toxicidad de Abeta y a daño oxidativo. Cabe destacar que otro modelo, elque emplea al péptido Abeta en roedores y en preparaciones biológicas, presen-ta la obvia ventaja de trabajar con una de las moléculas endógenas directamenteimplicadas en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. El papel de Abetaen el daño oxidativo y la neurotoxicidad en la enfermedad ha sido ampliamentedescrito. Abeta es el resultado del procesamiento proteolítico de la PPA por β- yγ-secretasas, y mientras que la PPA de longitud completa parece jugar un papelfisiológico en el transporte axonal, sus fragmentos conocidos como Abeta 1-40 yAbeta 1-42/43 parecen ser responsable de eventos tóxicos en el cerebro. Sinembargo, ha surgido una interesante hipótesis que sugiere que Abeta, por logeneral presente en el líquido cefalorraquídeo y plasma de individuos sanos a lo largo de toda su vida, puede estar mediando un mecanismo homeostático quereduce la transmisión excitatoria en respuesta a la actividad neuronal basal, y que una falla en dicho proceso regulador provocaría una acumulación excesiva delpéptido y su consecuente agregación, que a su vez resultaría en la serie de even-tos patológicos observados en la enfermedad de Alzheimer. Resultados de estudiosin vitro e in vivo con Abeta han demostrado que el fragmento 25 a 35 de Abetaes el responsable de la neurotoxicidad, daño oxidativo, alteración en las funcionesmitocondrial y de la citocromo c oxidasa, así como cambios en la señalizacióncelular mediada por calcio a través de mecanismos que involucran la activación dereceptores para NMDA y la NOS. Además, se sabe que ratones transgénicos que sobreexpresan la SOD 1 (Cu/ZnSOD) son resistentes a las acciones tóxicasde Abeta a través del bloqueo de vías apoptóticas.

Con base en estas observaciones, se han probado diferentes tratamientos con-tra la toxicidad de Abeta, e incluso a nivel clínico en la enfermedad de Alzhei-mer, algunos de éstos agentes son antioxidantes. Aquí se describirán de manerabreve algunos de los más recientes y prometedores para la investigación de estaneuropatía:

La memantina, un antagonista de los receptores para NMDA atenúa notable-mente los síntomas de la enfermedad de Alzheimer y reduce las alteracionesexcitotóxicas y oxidativas a nivel experimental. El factor de crecimiento transfor-mante β-1 y el 17-β-estradiol reducen el daño oxidativo y favorecen la actividadde la ATPasa, así como el transporte de glutamato y glucosa afectados por elAbeta. El uso de 2-desoxiglucosa, los estrógenos y los factores neurotróficosdiversos, ha resultado en la prevención de daño oxidativo de Abeta. El riesgo deestrés oxidativo y nitrosativo producido por Abeta se demostró a través de la for-mación de NO• y la disminución de viabilidad celular en cultivos primarios decélulas corticales, en los cuales los inhibidores de la NOS tipo II L-NIL y 1 400W,


el atrapador de NO• carboxi-PTIO y el antioxidante Troxol, disminuyeron la via-bilidad celular inducida por Abeta y peroxinitrito. La L-acetil-carnitina, un pre-cursor mitocondrial de la acetil-CoA y preservador de ATP, ha demostradoprevenir la disminución de ATP y atenuar el daño oxidativo producido porAbeta, demostrando así que la toxicidad del péptido involucra un metabolismoenergético alterado, como el que se observa en la enfermedad de Alzheimer.Otros antioxidantes cuyos efectos primarios se dan a través de la inactivación delas especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, y que han funcionado en la experi-mentación contra Abeta (y algunos de ellos parcialmente a nivel clínico) son lamelatonina, que mejora las funciones cognitivas y las actividades de enzimasantioxidantes; los flavonoides del extracto de Ginkgo biloba EGb761 y polifeno-les del vino rojo (fracción flavonoide CP 205), y el compuesto organosulfuradoderivado del extracto madurado del ajo S-alilcisteína (SAC), que posee propie-dades antioxidantes y neurotróficas y atenúa el déficit de aprendizaje inducidopor el péptido. En conjunto, éstas y otras evidencias enfatizan el papel del estrésoxidativo y nitrosativo como una parte integral y causal del patrón de daño evo-cado por el Abeta en la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, a pesar de estosprometedores hallazgos, el conocimiento en este punto sobre las alternativasterapéuticas para la enfermedad aún es limitado, y por ello, las investigaciones eneste campo continuarán en los siguientes años.

❚ ENFERMEDAD DE HUNTINGTON

La enfermedad de Huntington es una neuropatía degenerativa asociada con dege-neración selectiva de las neuronas espinosas estriatales en los ganglios basales, yestá caracterizada por disartria (alteración de las articulaciones), demencia y mo-vimientos coreiformes involuntarios (tipo danza). Es una enfermedad autosómicadominante, y el gen responsable se ha localizado en el brazo corto del cromoso-ma 4, el cual contiene repeticiones expandidas del trinucleótido CAG. En lapatogénesis de la enfermedad se han implicado tanto un papel activo de la formaaberrante (mutante) de la proteína huntingtina, como eventos excitotóxicos queimplican la muerte neuronal por sobreactivación de receptores tipo NMDA. Loscambios neuroquímicos en el caudado-putamen de cerebros post mortem depacientes con este trastorno incluyen la disminución de GABA, de la glutamatodescarboxilasa (GAD), sustancia P, encefalina, acetilcolina y colina acetiltransfe-rasa, así como un aumento en las concentraciones de somatostatina, neuropéptidoY, neurotensina y serotonina, al tiempo que los niveles de dopamina permanecensin cambio. Histológicamente, la enfermedad de Huntington se caracteriza porserias alteraciones en neuronas que contienen GABA, NADPH-diaforasa, parva-albúmina y acetil colinesterasa, con marcada reducción en células inmunorreac-


tivas a encefalina y sustancia P. Como en esta enfermedad se afecta la transmi-sión inhibitoria por la pérdida de neuronas GABAérgicas, ésta se conoce comouna enfermedad típicamente excitatoria en ausencia de su componente inhibito-rio regulador. La enfermedad comienza sus manifestaciones en la edad mediaadulta del individuo (35 a 40 años), y su progreso es de casi 15 a 20 años, inha-bilitando al paciente gradualmente hasta que los cuadros de disfagia (incapacidadpara deglutir alimentos) son tan severos que la mayoría de los pacientes muerepor inanición. En la enfermedad de Huntington, el componente oxidativo essevero, aunque no se ha estudiado de manera tan profunda como otras neuropa-tías degenerativas. Hasta ahora se sabe que el estrés oxidativo y nitrosativo estáinvolucrado en la degeneración neuronal, dado que diferentes sistemas antioxi-dantes endógenos se ven afectados desde etapas tempranas de la enfermedad.Entre ellos destacan la disminución en los niveles cerebrales de GSH y el marcadodéficit energético celular a través de la alteración de los complejos mitocondria-les I y II, lo cual sugiere la formación de especies reactivas de oxígeno y de nitró-geno con resultados devastadores para las neuronas, aunque aún no se sabe concerteza cuál es la relación entre estos eventos de daño oxidativo y la selectividaden la muerte neuronal selectiva. Recientemente, dos evidencias han servido parainvolucrar más activamente al estrés oxidativo y nitrosativo en la enfermedad deHuntington: la acumulación del pigmento fluorescente de la peroxidación, lipo-fucsina, y del ácido láctico en cerebros de pacientes vivos con esta enfermedad.

Para el manejo y tratamiento de este trastorno se ha probado la administraciónde agonistas GABAérgicos, agonistas y antagonistas colinérgicos, agentes relacio-nados con la transmisión dopaminérgica y otros fármacos de acción central, y auncuando hasta el momento no hay un tratamiento efectivo para la enfermedad, dife-rentes modelos experimentales que reproducen las características neuroquímicas ehistopatológicas de la enfermedad de Huntington están bajo investigación, yofrecen valiosas aportaciones para el desarrollo de nuevos tratamientos farmaco-lógicos y moleculares. Entre los modelos farmacológicos de la enfermedad pre-dominan los producidos por la infusión intraestriatal a roedores y primates nohumanos de diversos análogos de glutamato, como el ácido kaínico (AK), ácidoiboténico (AI) y ácido quinolínico (AQ). Otro modelo es producido por la infu-sión intraestriatal o sistémica de una potente toxina mitocondrial, el ácido 3-nitropropiónico (3-NP). Aunque tanto el AK como el AI producen lesiones deneuronas estriatales y reducción en la actividad de la GAD y la colina acetiltrans-ferasa en modelos animales, estas toxinas no reproducen fielmente algunas otrascaracterísticas histológicas y neuroquímicas de la enfermedad de Huntington. Enel caso del 3-NP, esta neurotoxina produce atrofia estriatal y reproduce aspectoshistológicos y neuroquímicos de la enfermedad, con la ventaja sobre las otrastoxinas de que puede ser administrada sistémica o tópicamente debido a su capa-cidad para atravesar la barrera hematoencefálica; sin embargo, en contraste con el©

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AQ, el 3-NP no es una toxina endógena, y está lejos de generar el modelo de laenfermedad de Huntington más apegado a la neuropatía humana, como lo haceel AQ. Una ventaja adicional del AQ, además de su naturaleza endógena comoun metabolito derivado del triptófano es su implicación directa como factor cau-sal potencial de la enfermedad, dado que recientemente se ha demostrado quesus niveles corticales y estriatales, así como los de su precursor inmediato, la hi-droxikinurenina, se encuentran aumentados de manera significativa en los cere-bros de pacientes con la enfermedad en etapas tempranas.

Otra línea de investigación que ha surgido sobre la enfermedad de Hunting-ton a nivel experimental se basa en las alteraciones moleculares que conducen ala repetición múltiple de trinucleótidos de CAG en dicho trastorno, lo que hapermitido la generación de modelos transgénicos en levaduras, Drosophila, y par-ticularmente en ratones. En estos últimos, las líneas R6/0, R6/1, R6/2 y R6/5difieren entre ellas en el número de repeticiones de CAG que contienen. A pesardel hecho evidente de que estos modelos transgénicos constituyen herramientasprometedoras para el estudio de las alteraciones en la enfermedad de Hunting-ton, la información sobre sus características neuroquímicas, conductuales e histo-lógicas es aún limitada y se encuentra en continuo progreso. Mientras tanto, eluso de neurotoxinas aún representa la herramienta más útil para modelar estaenfermedad.

A continuación se describirán algunas de las estrategias antioxidantes másempleadas en el modelo farmacológico más cercano a la enfermedad de Hunting-ton, el producido por AQ. El AQ es un ácido dicarboxílico y metabolito endóge-no del triptófano que se forma en la vía de la kinurenina. Actúa como agonistaglutamatérgico sobre receptores para NMDA, y es una excitotoxina conocida queproduce daño oxidativo en el sistema nervioso. Su naturaleza endógena lo harelacionado con diversas enfermedades neurológicas de tipo inflamatorio e infec-cioso. El AQ sobreestimula receptores para NMDA y aumenta la permeabilidada Ca2+, disminuye la formación de ATP y produce estrés oxidativo y nitrosativoy muerte celular. La selectividad en su patrón neurotóxico evoca las alteracionesde la enfermedad de Huntington en roedores y primates. La capacidad del AQ demodificar los perfiles de algunos antioxidantes endógenos en el cerebro, como elcontenido de GSH y la actividad de la Cu/Zn-SOD, así como su capacidad degenerar radicales •OH durante sus etapas tempranas de toxicidad, han demostra-do su carácter prooxidante. Se sabe que el AQ forma complejos tipo hierro (II)-AQ responsables de aumentar la formación del •OH a través de la reacción deFenton y producir así daño oxidativo al DNA y peroxidación lipídica. Además, sesabe que ratones transgénicos con baja expresión de Cu/Zn-SOD resultan mássensibles a las acciones tóxicas del AQ, mientras que los animales que sobreex-presan la Cu/Zn-SOD son más resistentes. Más aún, la participación activa delONOO– en la toxicidad del AQ se ha investigado recientemente y permite


postular al estrés oxidativo como parte integral del patrón neurotóxico de estamolécula.

Mientras que diversos agentes que actúan como antagonistas de receptorespara NMDA han resultado en neuroprotección en éste y otros modelos farmacoló-gicos de la enfermedad de Huntington, una de las tendencias actuales más sólidasen investigación radica en el uso de antioxidantes dado el carácter inocuo de algu-nos de ellos, en comparación con los mencionados antagonistas. Entre los primerosdestacan el MK-801, ácido fosfonovalérico y ácido kinurénico (el antagonista dereceptores tipo NMDA endógeno derivado de la misma vía de síntesis). Otrosagentes no antioxidantes, como el factor de crecimiento neuronal y el factor decrecimiento fibroblástico, han generado importantes respuestas de protección yregeneración. Entre los agentes antioxidantes con mejores resultados en la expe-rimentación tanto in vitro como in vivo destacan atrapadores de especies reacti-vas de oxígeno e inductores de actividad enzimática antioxidante, como lamelatonina, deprenil, N-acetil-cisteína, α-fenil-t-butil nitrona, poliaminas comola espermina y la espermidina, vesículas de ascorbil palmitato (aspasomas), que-lantes de hierro como la desferrioxamina, glutatión reducido, selenio y seleno-compuestos como el ebselen que estimulan la actividad de la GPx, atrapadoressintéticos de radicales, como el OPC-14117, que reducen la señalización proa-poptótica mediada por el factor nuclear kappa B (NFκB), el derivado del ajo SACque estimula la actividad de la Cu/Zn-SOD, y recientemente, inhibidores de laNOS como la L-NAME y la L-NARG, así como metabolizadores de ONOO–

como los porfirinatos de hierro Fe(TPFPP) y Fe(TPPS). Aunque todos estos agen-tes reducen el daño neurotóxico generado por el AQ y otras toxinas a muy distintos niveles celulares, y disminuyen así el estrés oxidativo y nitrosativo aso-ciado al daño excitotóxico en modelos experimentales de la enfermedad de Hun-tington, es necesario mencionar que no todos los fármacos antioxidantesrevierten las alteraciones de estas toxinas, por lo que su uso clínico está sujeto alos resultados de futuras investigaciones y a un adecuado diseño farmacológico.

❚ ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA

La esclerosis lateral amiotrófica es una enfermedad que inicia en la edad adultamedia, y se caracteriza por una degeneración selectiva y progresiva de las neu-ronas motoras inferiores de la médula espinal y de las neuronas motoras supe-riores en la corteza cerebral. La enfermedad afecta casi a 0.05 a 0.1% de lapoblación mundial, e invariablemente conduce a la muerte debido a las múltiplescomplicaciones de la parálisis. Se sabe que el metabolismo de los aminoácidosexcitadores está alterado en los pacientes con esclerosis lateral amiotrófica, dadoque las concentraciones de glutamato, aspartato y N-acetilaspartil glutamato©

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están elevadas en el líquido cefalorraquídeo y disminuidas en la médula espinaly la corteza motora, y estos cambios han sido interpretados como alteracionesen el transporte de glutamato y su consecuente disponibilidad para eventosexcitotóxicos tempranos de la enfermedad, lo que produciría eventos neurode-generativos asociados a daño oxidativo a través de sobreactivación de receptoresAMPA-kainato. Esta hipótesis se apoya en evidencias experimentales como elhecho de que vesículas sinápticas aisladas de médula espinal y corteza motorapost mortem de pacientes que padecieron esclerosis lateral amiotrófica mues-tran alteraciones en los mecanismos de recaptura para el glutamato. Además, sehan identificado al menos 11 mutaciones en el gen que codifica para la Cu/Zn-SOD en familias que han padecido la forma autosómica dominante de la enfer-medad. Tanto la forma esporádica de la esclerosis lateral amiotrófica como laforma dominante presentan síntomas clínicos y neuropatología similares, aun-que esta última constituye sólo 10 % de los casos totales del trastorno. Las muta-ciones en la esclerosis lateral amiotrófica dominante afectan regiones críticas dela estructura terciaria de la Cu/Zn-SOD, lo que redunda en una disminución enla actividad de la enzima en estos pacientes, aunque esto no necesariamenteocurre en los pacientes con el trastorno de tipo esporádico o en la forma here-ditaria no dominante. Lo que sí ocurre en la esclerosis lateral amiotrófica espo-rádica es un elevado nivel de oxidación de las proteínas, sugiriendo eventos deestrés oxidativo y nitrosativo, sean éstos dependientes o independientes de lafunción de la Cu/Zn-SOD. Con base en estas observaciones, se ha propuestoque un aumento en la actividad oxidativa en estos pacientes podría estar invo-lucrado en una hipersensibilización de motoneuronas a una transmisión gluta-matérgica basal, o incluso moderadamente aumentada, a través de receptoresAMPA-kainato.

La generación de modelos experimentales para la esclerosis lateral amiotrófi-ca presenta ciertas dificultades debido a la complejidad de la enfermedad.Dichos modelos comprenderían de manera general los animales portadores delas alteraciones genéticas para la Cu/Zn-SOD y animales knockout para laCu/Zn-SOD. A nivel farmacológico destacan los estudios con agentes que inhi-ben el transporte de glutamato, y en consecuencia, producen degeneración demotoneuronas que se previene por antagonistas de receptores para AMPA-kai-nato, o bien aquellos estudios con la toxina de Lathyrus sativus y que es respon-sable de latirismo, la β-N-oxalilamino-L-alanina. De manera similar, laβ-N-metilamino-L-alanina, una toxina que incluso se ha implicado en el com-plejo esclerosis lateral amiotrófica-enfermedad de Parkinson-demencia, causadegeneración selectiva de neuronas motoras superiores e inferiores a nivel expe-rimental, y sus efectos también resultan sensibles a la acción de antagonistaspara receptores a AMPA-kainato.

La terapéutica para la esclerosis lateral amiotrófica aún es muy limitada, y


constituye un campo fértil de investigación para el uso de agentes antioxidantesinocuos dada la naturaleza prooxidante de sus eventos patógenos.

❚ EXPERIMENTOS REALIZADOS EN EL LABORATORIO DEL AUTOR

El autor, junto con su grupo de investigación, ha desarrollado modelos de enfer-medades neurodegenerativas y daño neuronal excitotóxico en animales de labo-ratorio. Destacan los modelos experimentales de la enfermedad de Huntingtony de déficit energético evocados por la inyección sistémica y/o tópica de neuro-toxinas que estimulan de manera directa o indirecta a los receptores para los ami-noácidos excitadores a través de fármacos que inhiben a dichos receptores oagentes antioxidantes. Asimismo, se ha estudiado de manera sistemática la rela-ción de los eventos neurodegenerativos con la formación temprana de especiesreactivas de oxígeno y nitrógeno, y las posibles alternativas terapéuticas que segeneran a nivel experimental para el tratamiento de eventos degenerativos en elcerebro de humanos.

❚ CONCLUSIONES

Diversos factores confluyen en la generación de los eventos tóxicos que culmi-nan en la manifestación de las alteraciones propias de las diversas neuropatíasdegenerativas. El estrés oxidativo y nitrosativo parece ser, a la luz de las eviden-cias actuales, un factor determinante en estos procesos. Sin embargo, hasta hoy,contando con todo el conocimiento generado por la comunidad científica, no sepuede definir con certeza si la formación de especies reactivas de oxígeno y nitró-geno en los cerebros de los pacientes con estas enfermedades constituye un fac-tor causal o es sólo una consecuencia de otros eventos previos tendientes a laalteración de la homeostasia celular. Por ello, la atención de diversos grupos deinvestigación en el futuro deberá centrarse en el esclarecimiento de esta cuestiónpara la mejor comprensión de la naturaleza patógena de estas enfermedades y suconsecuente canalización terapéutica.

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Ma. Concepción Gutiérrez RuízVerónica Souza ArroyoBlanca Farfán Labonne

❚ INTRODUCCIÓN

El daño hepático, tanto a nivel agudo como crónico, es una patología común anivel mundial, caracterizada en su evolución crónica por un proceso progresivodesde esteatosis a carcinoma hepatocelular, pasando por hepatitis crónica, fibro-sis y cirrosis. La principal etiología es el abuso del alcohol, la infección viral, prin-cipalmente por el virus de la hepatitis B y C, así como enfermedades metabólicascomo la enfermedad de Wilson y la hemocromatosis. Otros factores pueden estarsimultáneamente presentes, como son la sobrecarga de hierro, la infección pormás de un virus, la alteración del metabolismo de carbohidratos y lípidos, entreotros, los cuales pueden exacerbar la enfermedad hepática. Es notorio que, inde-pendiente del agente etiológico, en todos los tipos de daño hepático existe evi-dencia contundente de un incremento de radicales libres y/o una disminuciónsignificativa de las defensas antioxidantes. Así, las especies reactivas de oxígeno(ERO) y nitrógeno (ERN) juegan un papel crucial en la inducción y progresiónde la enfermedad hepática.

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❚ GENERALIDADES SOBRE EL HÍGADO Y LA FIBROSIS HEPÁTICA

El hígado es el mayor órgano del cuerpo y es esencial para mantener la homeos-tasia del organismo. Elimina o neutraliza las sustancias tóxicas, produce agentesinmunitarios para controlar las infecciones y elimina gérmenes y bacterias de lasangre. Produce las proteínas que regulan la coagulación de la sangre y la bilispara ayudar a absorber las grasas y las vitaminas liposolubles, entre otras muchasfunciones.

El parénquima del hígado normal está organizado como un epitelio modelo,con un componente epitelial que son los hheeppaattoocciittooss, una capa endotelial sinu-soidal que se distingue por sus fenestraciones y poros, macrófagos residentes queson las ccéélluullaass ddee KKuuppffffeerr y pericitos hepáticos específicos, conocidos como ccéélluu--llaass eesstteellaarreess hheeppááttiiccaass. El ssiinnuussooiiddee es la unidad microvascular hepática, con unespacio subendotelial denominado espacio de Disse, que separa a los hepatocitosdel endotelio sinusoidal. Este espacio contiene una matriz esencial parecida a lade la membrana basal para el mantenimiento de la función diferenciada de todaslas células residentes hepáticas y para asegurar el intercambio metabólico óptimoentre el torrente sanguíneo y los hepatocitos (figura 25-1). Los sinusoides hepáti-cos, originados de las estructuras vasculares (ramas de la vena porta y de la arteriahepática) están incluidos en espacios porta. Los espacios porta son estructurasclaves en la arquitectura del hígado e incluyen también conductos biliares, con-ductos linfáticos y células estromales (miofibroblastos portales y fibroblastos).

A medida que se produce la fibrosis en el hígado, se producen cambios tantocuantitativos como cualitativos en la composición de la mmaattrriizz eexxttrraacceelluullaarr. Elcontenido total de los componentes tipo colágena y no colagénicas se incremen-


CK

H

CEH

CE

Lumen vascular

Lumen vascular

FFiigguurraa 2255--11.. Morfología del sinusoide hepático: H, hepatocito; CK, células de Kupffer; CEH, célu-las estelares; CE, células endoteliales.

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Daño oxidativo y enfermedades hepáticas • 379

ta de tres a cinco veces, acompañado por un cambio en el tipo de la matriz extra-celular en el espacio subendotelial. La matriz de baja densidad tipo membranabasal cambia a una matriz de tipo intersticial con fibras de colágena. Estos cam-bios en los componentes de la matriz, además de las implicaciones físicas y mecá-nicas, contribuyen a la formación de un nuevo microambiente bioquímico.

La fuente celular de los componentes de tejido conectivo en el hígado fibróti-co es en la actualidad todavía controversial. De entre los diferentes componentesinvolucrados en la producción de la matriz extracelular, las células estelares hanrecibido mucha atención, principalmente por la facilidad de aislamiento y suposibilidad de estudiarlas in vitro. Gracias a estudios realizados en estas célulasse conoce una gran parte de los mecanismos que incrementan las proteínas de lamatriz extracelular.

Las células estelares se activan ante la agresión, cambian fenotípicamente y sevuelven un tipo celular productor de matriz extracelular. Otros tipos celularesinvolucrados también en la producción de proteínas de matriz extracelular sonlos fibroblastos y los miofibroblastos de los tractos portales, las células de múscu-lo liso localizadas en los vasos y los miofibroblastos localizados alrededor de lavena centriolobular. En la actualidad, se están realizando grandes esfuerzos paratratar de identificar y caracterizar la participación de todos estos tipos celularesen el proceso fibrogénico.

❚ ENFERMEDAD HEPÁTICA ALCOHÓLICA

A la fecha, se han realizado múltiples estudios sobre el mecanismo por el cual eletanol produce daño hepático. Se ha considerado que el etanol ejerce una toxici-dad directa en el hígado, órgano principal donde se lleva a cabo el 95% de sumetabolismo, asociado con cambios en el estado redox y con el estrés oxidativo.Los cambios en el estado redox están mediados por la alcohol deshidrogenasa(ADH), mientras que el estrés oxidativo es generado principalmente por la acti-vidad del sistema oxidativo microsomal del etanol (MEOS) y su enzima citocro-mo P450 2E1 (CYP2E1), la cual produce radicales libres. La oxidación del etanolpor medio del patrón de la ADH produce acetaldehído, el cual es convertido enacetato. Ambas reacciones producen nicotinamida adenín dinucleótido en suforma reducida (NADH). El exceso de NADH produce algunos desórdenesmetabólicos, incluyendo la inhibición del ciclo de Krebs y de la oxidación de losácidos grasos. A finales del decenio de 1980-89, se estableció que la enzima claveen el MEOS era el CYP2E1, ya que en las biopsias hepáticas de alcohólicos cró-nicos se encontraba un incremento de 10 veces el contenido de esta enzima, porlo cual se consideró que este sistema enzimático inducible, jugaba un papelimportante en la ingesta crónica de etanol y en la tolerancia metabólica que se

desarrolla en los alcohólicos. Se ha considerado que el daño temprano como es laesteatosis alcohólica y la esteatohepatitis alcohólica son consecuencia de lainducción del CYP2E1. El CYP2E1 se encuentra inducido en ratas obesas, ya queesta isoforma del citocromo también cataliza la hidroxilación de los famosos áci-dos grasos omega 1 y 2 (ω1 y 2). La ingesta de etanol también incrementa la acti-vidad del CYP4A1, el cual cataliza la hidroxilación ω en la terminal carbonilo delos ácidos grasos. Una posterior oxidación de los hidroxiácidos ω y ω1 por el eta-nol y la ADH resulta en la producción de ácidos dicarboxílicos y oxocarboxílicos.Los ácidos dicarboxílicos juegan un papel regulador en el depósito hepático delos ácidos grasos no esterificados, mediante la activación del receptor α por losproliferadores de peroxisomas, el cual incrementa la transcripción de patrones dedisposición de los ácidos grasos como el CYP4A1, la acil coenzima A oxidasaperoxisomal y la proteína unidora de ácidos grasos hepática citosólica (L-FABPc).El resultado es un incremento microsomal de la ω-oxidación, peroxisomal de laβ-oxidación y de la síntesis de acilglicerol.

Se conoce que hay diferencias en las anormalidades de lípidos inducidas por laingesta de alcohol y en la vulnerabilidad de la enfermedad hepática alcohólica,dependiendo del género. Se ha reportado que diferencias en la distribución deletanol, la biodisponibilidad, el metabolismo hepático, que lleva a un incrementodel acetaldehído y desarreglo en el metabolismo de lípidos, podrían contribuir ala vulnerabilidad de la mujer al daño por la ingesta de etanol.

La inducción del CYP2E1 juega un papel importante en la patogénesis deldaño hepático alcohólico, incluyendo la esteatohepatitis alcohólica, debido alestrés oxidativo que genera. Más aún, el CYP2E1 está incrementado en pacien-tes con esteatohepatitis no-alcohólica. Esto se debe a que los ácidos grasos, pre-sentes en cantidades superiores en obesos, lo mismo que las cetonas en losdiabéticos, son también sustratos del CYP2E1 y éstos a su vez provocan unasobrerregulación del citocromo.

El daño causado por el estrés oxidativo en la esteatohepatitis alcohólica inclu-ye daño mitocondrial, lo cual a su vez exacerba el estrés oxidativo, por lo que seconsidera que el daño mitocondrial es un componente importante en la enferme-dad hepática alcohólica.

Progresión del hígado graso a inflamación y fibrosis

El estrés oxidativo causado por la inducción del CYP2E1 y el daño mitocondrialda como resultado la peroxidación de lípidos y la alteración membranal. Además,el acetaldehído producido por la oxidación del etanol tiene efectos tóxicos, inhi-biendo la reparación de las nucleoproteínas, disminuyendo la actividad de enzimasy reduciendo la capacidad mitocondrial para reducir el oxígeno durante la respi-


ración. La oxidación desacoplada de la mitocondria puede interferir con la oxi-dación del acetaldehído, y esto lleva a un círculo vicioso por la acumulación pro-gresiva del acetaldehído y el aumento del daño mitocondrial. El acetaldehídopromueve la muerte celular depletando (abatiendo) la concentración de gluta-tión reducido(GSH), induciendo lipoperoxidación, e incrementando los efectostóxicos de los radicales libres. Al unirse a la tubulina de los microtúbulos, el ace-taldehído bloquea la secreción de proteínas. El incremento en las proteínas, loslípidos, el agua y los electrólitos, causa que los hepatocitos se agranden, unacaracterística en la enfermedad hepática alcohólica. Los aductos proteína-acetal-dehído promueven la producción de la colágena, y pueden actuar como neoantí-genos, lo cual estimula la respuesta inmunitaria.

Los productos de la lipoperoxidación, como el 4-hidroxinonenal (4HNE) y elmalondialdehído (MDA), estimulan la fibrosis, la cual aumenta en la medida enque disminuye la inhibición por retroalimentación de la síntesis de colágena,debido a que el acetaldehído forma aductos con la terminal carboxilo del pro-péptido de procolágena. El estrés oxidativo promueve la inflamación, la cual seincrementa por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), que es una citocinaproinflamatoria secretada por las células de Kupffer. Tanto durante el daño agudocomo durante el crónico, las células de Kupffer se activan para producir citocinasy ERO. El etanol induce también la secreción del factor de crecimiento transfor-mador beta (TGF-β) por los hepatocitos, lo cual provoca la estimulación de lasíntesis de colágena en las células estelares (figura 25-2).

La producción de citocinas proinflamatorias promueve la expresión de la en-zima óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS). Al producirse óxico nítrico(NO•), éste reduce o incrementa la toxicidad del etanol interfiriendo con algu-nas de las enzimas encargadas de su metabolismo. El efecto tóxico de NO• depen-de de las ERO producidas, así como de la cantidad de antioxidantes celularespresentes, principalmente GSH. Cuando hay bajas concentraciones de ERO yalto contenido de GSH, se promueven los efectos protectores del NO•; mientrasque condiciones opuestas, producen un incremento en la lipoperoxidación y enla apoptosis. Los hepatocitos contienen aproximadamente el 10% del total delGSH del organismo. Una homeostasia normal de este tripéptido es necesaria parala actividad del CYP450 y de la mitocondria. El GSH también afecta la transcrip-ción de las citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias, así como la regene-ración hepática mediada por la inducción del factor nuclear kappa B (NF-κB), labiodisponibilidad del NO• y la energía metabólica. Al producirse una disminu-ción del GSH debido a la ingesta de etanol, las ERO inducen estrés oxidativo yreducen también la capacidad de otros antioxidantes. De igual forma, y comoconsecuencia del daño hepático, puede producirse una reducción de GSH. Unhecho bien documentado es la disminución del GSH en el hígado y a nivel cir-culatorio, tanto en pacientes con cirrosis alcohólica como de otras etiologías.©

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Otros sistemas antioxidantes también están involucrados en la inducción y pro-gresión del daño hepático crónico. El etanol altera significativamente el sistemade glutatión peroxidasa (GPx), contribuyendo a la disfunción mitocondrial. Lasuperóxido dismutasa (SOD), particularmente en presencia de vitamina E, es elmecanismo de defensa primaria contra las ERO, pero en animales modelo se haprobado la presencia de un sistema insensible SOD-catalasa a radicales libres quefacilita el daño hepático. El selenio también es un agente protector contra la lipo-peroxidación y el daño hepático, sin embargo su contenido en plasma está dismi-nuido en pacientes cirróticos, en los cuales también hay una disminución deretinol sérico (vitamina A), esto se asocia a riesgo de hepatocarcinoma.

Recientemente se ha sugerido que la determinación de los niveles plasmáticosde GSH, vitamina A, β-carotenos, SOD, GPx, catalasa y marcadores de lipopero-xidación, pueden representar marcadores útiles para ir evaluando la progresióndel daño hepático y la respuesta al tratamiento en pacientes con enfermedadalcohólica y viral hepática.

La familia de la enzima glutatión-S-α-transferasa (GST) representa uno de losprincipales sistemas antioxidantes en los hepatocitos, debido a que este tipo deenzimas unen GSH a gran cantidad de hidroperóxidos y sustancias tóxicas. LaGST también regula la apoptosis dependiendo del patrón de lipoperoxidación.Se sabe que el etanol causa la inducción hepática de la GST.

Para contrarrestar el estrés oxidativo, el organismo posee diferentes mecanis-mos de defensa, denominados colectivamente como antioxidantes. Algunos deellos son sintetizados dentro del cuerpo y otros son obtenidos a partir de la dieta.Hay evidencias contundentes que señalan que la ingesta de etanol altera los sis-temas enzimáticos antioxidantes, así como el contenido de algunos antioxidantesque provienen de la dieta como son la vitamina E y C. Reportes recientes seña-lan que en pacientes con enfermedad hepática alcohólica se incrementa la lipo-peroxidación a nivel sérico, determinada como los niveles de MDA, así como elcontenido de 4HNE. El incremento de ambos es proporcional al grado de dañodel paciente. Asimismo las concentraciones de vitaminas E y C a nivel séricoestán disminuidas. Por ello, algunos investigadores consideran que la alteración en


Metabolismo del etanol CYP2E1


Acetaldehído Inhibe repa r ación de n ucleoproteínas Dismi n u y e actividad de enzimas Dismi n u y e ni v eles GSH Daño mitocond r ial

Lipoper o xidación F o r mación de neoantígenos Promoción de fibrosis

Promoción de Inflamación Acti v ación de NF B Secreción de citocinas : TNF Alte r ación sistema anti o xidante

Inducción de iNOS Producción de E R O

Apoptosis Necrosis Inflamación Respuesta in m unitaria Fibrosis

FFiigguurraa 2255--22.. Fisiopatología del daño hepático inducido por etanol.

los sistemas enzimáticos puede deberse a factores etiológicos importantes en laenfermedad hepática alcohólica.

Las ERO, en particular el anión superóxido, reaccionan rápidamente con elNO• para formar peroxinitrito (ONOO•). Éste puede actuar como una molécu-la dañina, ya que al reaccionar con los grupos tioles (–SH) de las enzimas, alterasu actividad. Además puede contribuir a la inducción de la lipoperoxidación. Laformación del ONOO• puede considerarse como un mecanismo protector debi-do a que el NO• actúa como un atrapador de ERO.

El estrés oxidativo y nitrosativo inicia y regula la transcripción y activación deuna gran cantidad de mediadores en todas las células hepáticas, lo cual culminaen un mecanismo común de daño: inflamación, respuesta inmunitaria, fibrosis,isquemia, expresión génica alterada, apoptosis y necrosis. La persistencia o pre-valencia de uno o más de estos aspectos puede influenciar la ocurrencia de dife-rentes tipos de daño hepático. La producción incrementada de ERO y laalteración de la poza de GSH contribuye a programas de muerte por activaciónde factores de transcripción como el NF-κB, llevando a la sobrerregulación decitocinas pro-inflamatorias, quimiocinas, moléculas de adhesión, ligando Fas, ge-nes de sobrevida, entre otros, los cuales activan la cascada de caspasas (apopto-sis) o inducen la liberación de citocromo c y la depleción de ATP a nivelmitocondrial (necrosis) (figura 25-3). El mecanismo dependiente de GSH tam-bién es requerido para la expresión de proteínas de señalización protectoras y defactores transcripcionales como los de la familia de Bcl-2.

La relación entre el estrés oxidativo y la apoptosis está bien documentada, porsu efecto en la inducción del sistema CYP450, la síntesis de citocinas por las célu-las de Kupffer y la infiltración de los neutrófilos, que incrementan la producciónde ERO y depletan a los hepatocitos de sus reservas de ATP. De hecho, las EROgeneradas por los neutrófilos dañan a los hepatocitos favoreciendo la muerte pornecrosis en lugar de por apoptosis. Otra contribución a la muerte celular derivade la adhesión de linfocitos citotóxicos, ya que al liberar proteasas, tipo granzi-mas, y perforina de los gránulos citotóxicos, particularmente en presencia deERO, median la interacción linfocitos-Fas/Fas ligando.

En diferentes condiciones clínicas, como la diabetes, la obesidad, la exposicióna agentes tóxicos, fármacos, etanol e infección por el virus de la hepatitis C(VHC), el hígado graso representa el primer paso en el daño hepático crónico. Lainducción del CYP2E1 y otras formas de CYP incrementan la producción deERO, el daño membranal lipoperoxidativo y la depleción de ATP, lo que promue-ve a la progresión de hígado graso a esteatohepatitis, fibrosis y cirrosis. Se conoce,desde hace varios años, que el daño oxidativo es un sustrato de la fibrogénesis. Lafibrosis, durante muchos años definida como una enfermedad “pasiva” e irrever-sible, es en la actualidad considerada como un proceso dinámico y reversible.

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❚ ESTEATOHEPATITIS NO ALCOHÓLICA

El término esteatohepatitis no alcohólica fue acuñado en 1980, para describir unnuevo síndrome presente en pacientes generalmente obesos, a menudo diabéti-cos, principalmente de género femenino, en la quinta o sexta década de la vida,con una biopsia hepática con datos de hepatitis alcohólica, pero que no ingeríanetanol. La causa de este síndrome era desconocida y no había tratamiento defini-do. Después de más de dos décadas, este síndrome es poco más entendido, peroaún en la actualidad no hay un tratamiento apropiado. Los pacientes con estea-tohepatitis no alcohólica primaria, típicamente tienen resistencia a la insulina,caracterizada por la obesidad, la hiperlipidemia, la hipertensión y en algunoscasos anormalidades como síndrome de ovarios poliquísticos. La esteatohepatitisno alcohólica secundaria puede ser causada por fármacos como el tamoxifen,algunos productos petroquímicos y la amiodarona; por una derivación yeyunoi-leal, así como una pérdida rápida de peso.

La causa primaria de la esteatohepatitis no alcohólica es motivo de controversia,pero hay evidencias de que el estrés oxidativo juega un papel inicial, el cual esseguido por un segundo evento capaz de inducir inflamación, fibrosis o necrosis.


Inicio del daño hepático Sistema P R OS Aductos aldehídicos CYP2E1 Lipoper o xidación Alte r aciones memb r anales R OS Mitocond r ia Dismi n ución de GSH Dismi n ución de A TP

P e r meabilidad memb r anal

Citosol R OS GSH SOD iNOS GST vit C Catalasa GSH

Respuesta in m unitaria

Acu m ulación de lípidos

Esti m ulación fibrosis

Apoptosis/necrosis

Hepatocito

Pro g resión del daño hepático

Acti v ación de K upf f er R OS NF κ B IL 10 iNOS

iNOS TNF-α

IL 1, IL 6, IL 8

IFN-γ

APOP T OSIS/NEC R OSIS

Reclutamiento

Neutrófilos Acti v ación de células estelares Expresión de genes de mat r iz extracelular R OS

FIB R OSIS

Inflamación

CIR R OSIS

por endot o xinas

450

FFiigguurraa 2255--33.. Procesos involucrados en la progresión del daño hepático.

La presencia de estrés oxidativo está bien documentada en la esteatohepatitisno alcohólica, ya que se ha reportado la presencia de 3 nitrotirosina, un marca-dor para estrés oxidativo, en biopsias de pacientes, así como un incremento de losniveles séricos de tiorredoxina. Las fuentes potenciales para las ERO son múlti-ples, siendo el CYP2E1 y la mitocondria las causas más estudiadas en esta pato-logía. Al principio de este capítulo se menciona que la obesidad puede inducir alCYP2E1, el cual puede disminuir su actividad con una derivación gástrica y unadisminución del peso. Asimismo, se ha registrado una disminución en el contenidode GSH y un incremento de aproximadamente 16 veces del daño lipoperoxida-tivo en animales de experimentación. Se considera que los marcadores de dañooxidativo preceden a la expresión de genes pro-fibróticos y la fibrosis. Los hepa-tocitos son la fuente de los radicales que llevan a la lipoperoxidación, así comouna fuente importante de TGF-β.

Puesto que la mitocondria es también una fuente potencial importante de laformación de ERO, se considera que la desregulación del metabolismo de las gra-sas está asociada a la disfunción mitocondrial, principalmente en tres puntos:

a) El metabolismo de los ácidos grasos, principalmente durante la β-oxi-dación.

b) El incremento de la síntesis de ácidos grasos libres en el hígado, aunado ala toma de ellos de la sangre.

c) El aumento en la velocidad de esterificación de los ácidos grasos libres en elhepatocito, al tiempo de un incremento en la entrada de triglicéridos al hígado.

Con respecto al metabolismo de ácidos grasos a nivel de mitocondrial, los estu-dios se han enfocado a posibles defectos en la β-oxidación. La acumulación degrasa hepática se ha relacionado en parte con la inhibición en la oxidación de estos ácidos grasos. Reportes clínicos indican una actividad respiratoria disminui-da, asociada con un incremento de acil carnitina, (la forma en la cual los ácidosgrasos de cadena larga son transportados a la matriz mitocondrial) y concen-traciones disminuidas de carnitina libre. Una menor actividad respiratoria mi-tocondrial puede promover una disminución de la oxidación de ácidos grasos. Enpacientes con esteatohepatitis no alcohólica, se reporta una disminución de lasintetasa de ácidos grasos de cadena larga ácido-CoA, así como una restituciónmás lenta de la poza de ATP.

Un incremento en la síntesis de ácidos grasos, principalmente a partir de la glu-cosa, se ha demostrado en los ratones ob/ob (ratones con una mutación que loshace ser obesos). El incremento en el TNF-α puede ser importante en el aumen-to de la síntesis de ácidos grasos en el hepatocito a través de la activación de ace-til-CoA carboxilasa, la cual está involucrada en el paso limitante de la síntesis denovo de ácidos grasos.©

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En lo relativo al incremento en la síntesis y depósito de los triglicéridos hepá-ticos, se sabe que un incremento en la disponibilidad de los ácidos grasos libres,principalmente por una disminución en la β-oxidación y un incremento en latoma de ellos, provoca un aumento en la síntesis de triglicéridos.

Una consideración importante en la esteatohepatitis es el metabolismo altera-do de las citocinas, principalmente del TNF-α, y esta alteración es muy semejan-te a la que se presenta en la enfermedad hepática alcohólica.

❚ HEPATITIS VIRAL

De los tres tipos predominantes de hepatitis viral (A, B y C), la B y la C hanincrementado su prevalencia en la población humana. La hepatitis aguda A esdebida a la infección por el virus de la hepatitis A humana (VHA) transmitidopor vía enteral (contaminación fecal del agua para beber o de la comida). En lainfección temprana, el virus se encuentra en la sangre y en las heces. La enferme-dad es autolimitante con un periodo de incubación de 15 a 50 días. En los infantes,el 80% de los casos son asintomáticos y anictéricos (sin amarillez en la piel). Ensujetos con más edad, la ictericia es mayor y los valores de las enzimas hepáticasestán más incrementados. La hepatitis fulminante, aunque es poco frecuente,generalmente está sobrepuesta con infección por el VHB (virus de la hepatitis Bhumana) o VHC (virus de la hepatitis C humana). El VHA no produce daño cró-nico ni carcinoma.

El HBV es un DNA tipo hepadnavirus con un periodo de incubación de 25 a180 días. La infección generalmente es asintomática con excepción de los droga-dictos y su transmisión es generalmente parenteral por el contacto íntimo detodos los fluidos corporales. De 5 a 20% de los infectados por el VHB puede lle-gar en la enfermedad crónica a desarrollar cirrosis y hepatocarcinoma.

El VHC es un virus de RNA, con un periodo de incubación de 11 a 150 días,se transmite casi siempre por sangre infectada. La fase aguda es generalmenteasintomática y del 85 a 90% de los sujetos puede llegar a tener una viremia cró-nica. La lenta progresión del daño provoca que la cirrosis o el hepatocarcinomase presente alrededor de 30 años después de la infección por el virus.

En las hepatitis virales, el daño celular es determinado predominantementepor la respuesta inmunitaria y aunque la patofisiología es muy compleja, hay ungran número de reportes que demuestran que la persistencia de la infección, laprogresión del daño hepático y la carcinogénesis son todos pasos en los cualesestán involucrados procesos oxidativos.

Los análisis inmunohistoquímicos de las biopsias de los pacientes con hepati-tis aguda demuestran aumento en la expresión de las moléculas de adhesión celu-lar vascular como ICAM-1, ELAM-1 y VCAM-1 y el receptor para células T en


el sinusoide y áreas de necrosis en el parénquima. Este hallazgo apoya la idea deque las citocinas inducen la sobrerregulación de las moléculas de adhesión y elreclutamiento de los linfocitos CD8+ con la subsecuente muerte celular media-da por las células T y la liberación de sustancias tóxicas como perforina y pro-teasas, o la inducción de las apoptosis mediada por FAS/Apo-1/CD95 y ladisfunción mitocondrial.

La infección viral promueve la apoptosis. De esta forma el virus puede redu-cir la respuesta inmunitaria del huésped y así permitir la replicación viral y supropagación. La proteína X del virus VHB y la cubierta del VHC regulan laapoptosis a través del TNF-α, TGF-β, IFN-γ e IL-2; estas citocinas también afec-tan la progresión del daño hepático hacia la cronicidad. Por el contrario, la res-puesta inmunitaria mediada por citocinas Th0/Th1, como son las interleucinasIL-4 y la IL-10, protegen de la persistencia del virus y de la aparición de la fibro-sis. In vitro, el antígeno VHB de adhesión depende del estrés oxidativo; los patro-nes intracelulares que inhiben la expresión y replicación del gen del VHB estánmediados por el interferón gamma (IFN-γ) y el TNF-α, los cuales activan ladegradación post-transcripcional del RNA viral en el núcleo. Tanto el VHC comoel VHB son capaces de influir vía el IFN-γ a la iNOS, la cual media el daño celu-lar a través de la producción de TNF-α e IL-1β.

La interacción entre los virus y el etanol afecta significativamente la replica-ción viral e induce la aparición y progresión del daño hepático vía estrés oxidati-vo y nitrosativo.

Durante la hepatitis C aguda y crónica activa, hay un incremento en la gene-ración de radicales libres y en el daño lipoperoxidativo, tanto a nivel hepáticocomo en células mononucleares periféricas. Se ha asociado también al daño hepá-tico la disminución de GSH, el incremento de la actividad de la caspasas, el incre-mento de los niveles séricos de MDA y de 4HNE y la reducción de los niveles decinc en hígado y plasma. La patogénesis y la fibrosis hepática progresan a dife-rentes velocidades. Las deficiencias en niveles de cinc y de selenio incrementanla propensión hacia la cronicidad y la malignidad debido a que se presentan inter-ferencias en la reparación del DNA y en la inmunidad.

En los niños con VHB o VHC crónicos, se han reportado valores disminuidosen la actividad de la catalasa y de la SOD, así como evidencias de un incremen-to en la lipoperoxidación, lo cual indica una defensa antioxidante inadecuada.Algunos pacientes con VHC presentan valores muy altos de ferritina y de hierrohepático, ya que el hierro cataliza la generación de ERO, se produce un estrés oxi-dativo severo que explica en ocasiones la resistencia de los enfermos al tratamien-to con IFN-γ. Asimismo, se han reportado variaciones en los niveles de GSH yGPx en VHC y se ha encontrado una relación de estos niveles con la actividadde la hepatitis: durante los periodos en que se exacerba la infección, prácticamen-te no se encuentran estas enzimas. Se sabe que aunque el estrés oxidativo favo-©

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rece la replicación viral, ésta se puede inhibir por antioxidantes. El balance redoxfluctuante refleja el estado nutricional, enfermedades concurrentes, xenobióticosy medicamentos. La terapia inmunosupresiva y los esteroides favorecen la repli-cación viral, reducen el cinc y reactivan los virus latentes. Algunos autores repor-tan reactivación de la infección del VHB en pacientes inmunodeprimidos que seinfectaron con el virus de la inmunodeficiencia.

Las hepatitis virales y tóxicas son similares histológicamente y el daño hepáticoes debido al estrés oxidativo, generación de radicales libres y lipoperoxidación,por lo que el manejo de la hepatitis viral, así como el manejo de la hepatitis toxi-ca requiere de la restauración temprana de las concentraciones óptimas de losantioxidantes esenciales en el hígado y en el plasma. El objetivo es limitar el daño,erradicar, restringir o dilatar la replicación viral y maximizar la respuesta inmu-nológica y reparativa. Debido a que el GSH, el ubiquitol, el cinc, el selenio, laGPx, la catalasa, la SOD, y las vitaminas A, C, E, pueden estar seriamente dismi-nuidas, durante el establecimiento de la hepatitis, sus pozas requieren con urgen-cia ser repuestas. Así, grandes dosis de antioxidantes primarios deben de ser eltratameinto inicial para restaurar y posteriormente mantener las concentracionesséricas y hepáticas a concentraciones normales. El tratamiento antioxidantepuede incluir a las vitaminas A, C, y E combinadas.

❚ DAÑO HEPÁTICO INDUCIDO POR METALES: ENFERMEDAD DE WILSON Y HEMOCROMATOSIS

El cobre y el hierro son micronutrientes esenciales para el humano. La capacidadde intercambiar electrones en condiciones aeróbicas hace de ellos bio-catalizado-res ideales para las reacciones de oxidación y reducción fundamentales para lavida. El hierro está involucrado en la síntesis del DNA y en el transporte de oxí-geno, mientras que el cobre, en las defensas antioxidantes, la formación de cate-colaminas y la maduración de la hormona peptídico hipofisaria. Ambos metalesson esenciales para las enzimas de la cadena transportadora de electrones y de lafosforilación oxidativa en la mitocondria, así como para el metabolismo de co-lágena. Paradójicamente, su propia química es la base de su toxicidad. Su versa-tilidad para catalizar reacciones químicas lleva a una producción descontroladade radicales libres, responsables del estrés oxidativo. El hígado, órgano central enel metabolismo de ambos metales, es también el principal blanco de su toxicidad.

La enfermedad de Wilson es un desorden del metabolismo del cobre debido ala disminución de la excreción de este metal por el conducto biliar. A pesar deque el organismo trata de compensar el incremento en la concentración delmetal, incrementando la cantidad de cobre excretado por la orina, sigue habien-do un balance positivo del mismo que hace que se deposite cobre en el hígado,


cerebro y otros tejidos. La enfermedad de Wilson es heredada de forma autosó-mica recesiva, con una frecuencia estimada entre 1 a 90 y 1 en 400 y la preva-lencia de 1 en 30 000. Los estudios moleculares han localizado al gen de laenfermedad de Wilson en el cromosoma 13. A la fecha, se han reportado variasalteraciones en el gen, haciendo difícil el diagnóstico molecular. La gran cantidadde mutaciones explica, en parte, la diversidad de las presentaciones clínicas de laenfermedad.

Durante la niñez, el cobre se acumula en el hígado asintomáticamente, demanera principal dentro del citosol de los hepatocitos. Con el tiempo, se empie-za a acumular en los lisosomas. En este punto el cobre es liberado al torrente san-guíneo. Si la liberación es gradual, el paciente pasa varios años sin síntomas, sinembargo, puede presentar crisis hemolíticas. De manera similar en el hígado, si laredistribución celular del citosol a los lisosomas ocurre rápidamente, entonces pue-de haber una necrosis de los hepatocitos y/o una hepatitis crónica activa se puededesarrollar. A medida que más cobre se deposita y se redistribuye, la fibrosishepática progresa a cirrosis y puede empezar el daño en otros órganos. General-mente, cuando el paciente presenta síntomas neurológicos, a menudo ya haydaño hepático permanente.

En 1889, se reconoció por primera vez a la hemocromatosis hereditaria comola sobrecarga de hierro en el hígado. En 1976, se reportó que el gen de la hemo-cromatosis estaba asociado a la región HLA del brazo corto del cromosoma 6 yen 1996, el gen fue finalmente identificado y se le denominó HFE. La hemocro-matosis secundaria debida a mutaciones en el gen HFE es sólo una de las causasde la acumulación de hierro en el hígado. Sin embargo, la hemocromatosis es eldesorden genético más comúnmente identificado en caucásicos, con una prevalen-cia de 1 en 200. Otras variantes de hemocromatosis genética, que no involucranal gen HFE han sido identificadas, por ejemplo como enfermedad autosómicadominante en las Islas Salomón. La hemocromatosis neonatal parece ser una con-dición autosómica recesiva, sin embargo hay evidencias que señalan que éstaseguiría una herencia mitocondrial. Existe otra forma de hemocromatosis gené-tica denominada hemocromatosis juvenil, la cual se presenta en pacientes entrelos 20 y 30 años, y se debe a lesiones en el cromosoma 1.

En la hemocromatosis, el hierro se acumula en el hígado y en otros tejidosdebido al incremento en la absorción de este metal a nivel del intestino delgado.El mecanismo exacto por el que el gen HFE contribuye a la sobreabsorción delmetal no es conocido. El resultado de dicha absorción es el depósito de hierro enel hígado, el páncreas, el corazón y otros tejidos endócrinos. La patología de lahemocromatosis en el hígado, aunque característica, no es específica. El hierro seacumula en los hepatocitos y puede estar también en células reticuloendotelia-les, en los macrófagos y en las células epiteliales del conducto biliar. La sobrecar-ga de hierro secundaria es común en muchas patologías hepáticas. La cirrosis y el©

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carcinoma hepatocelular son las complicaciones hepáticas que se presentan porla sobrecarga del metal.

El mecanismo por el cual el cobre y el hierro producen hepatotoxicidad essemejante, ambos son metales de transición, los cuales tienen electrones desapa-reados, son excelentes catalizadores y juegan un papel decisivo en la generaciónde especies muy reactivas a partir de especies menos reactivas, por ejemplo cata-lizando la formación de radicales hidroxilo (•OH) a partir de formas reducidasde O2. Para evitar el estrés oxidativo y el daño celular, las células han desarrolla-do sistemas para mantener la concentración de metales adecuada con base en susnecesidades metabólicas. De hecho, el secuestro de los metales por la ferritina ola metalotioneina permite tener las concentraciones fisiológicas de hierro y cobrey así evitar que se lleve a cabo la reacción de Fenton.

La mitocondria es el blanco del daño hepático inducido por cobre y hierro. Lamitocondria ocupa una posición única dentro de la célula en la producción deenergía mediante la fosforilación oxidativa. En este contexto, también represen-ta el principal sitio de generación de ERO por medio de la cadena respiratoria aun nivel dependiente del estado metabólico. Se asume que la desestabilización deuno o más componentes de la cadena transportadora de electrones incrementa elpotencial de autooxidación e incrementa la producción de iones superóxido yotras ERO. Hay reportes que muestran que la acumulación crónica de cobre y hierro provoca in vivo lipoperoxidación de la membrana mitocondrial. Esteproceso puede verse modificado por el estado de fluidez de la membrana mito-condrial con alteración en el transporte de solutos y de iones. Los productoshidroperóxidos pueden abrir el canal de Ca+2 o incrementar los productos queactúan como ionóforos específicos de Ca+2. La perturbación del transporte deCa+2 mitocondrial resulta en una pérdida de energía y lleva a un daño mitocon-drial serio. En adición a esto, los productos aldehídicos de lipoperoxidaciónpodrían formar aductos con proteínas, inactivándolas. Todos estos eventos tóxi-cos llevan al desacoplamiento de la función mitocondrial en los hígados de lasratas que tienen una sobrecarga de cobre y hierro, con una disminución del co-ciente respiratorio. La fosforilación oxidativa mitocondrial es la responsable del95% del total del ATP requerido por las células eucarióticas, y una consecuenciade la sobrecarga de cobre y hierro es la reducción del contenido de ATP. Al pare-cer, los cambios en la función mitocondrial podrían contribuir a la disfunciónhepática reduciendo la carga energética celular, incrementando la salida de calcioal citosol, o exponiendo a la célula a concentraciones incrementadas de superó-xido generadas por la disrupción del flujo de electrones normal.

Finalmente, en la toxicología tanto del cobre como del hierro se considera quedañan al DNA y hay genotoxicidad. Mientras que los radicales libre de vidamedia corta son incapaces de llegar al núcleo, los productos aldehídicos finales dela lipoperoxidación y los aductos de las proteínas sí lo alcanzan. Es posible que


los complejos de metales asociados al DNA puedan disparar directamente en elsitio la producción de radicales de oxígeno tóxicos durante la sobrecarga de cobrey hierro. En la figura 25-4 se muestra una representación esquemática del meca-nismo de toxicidad del cobre y el hierro en los hepatocitos.

En humanos con sobrecarga de cobre y hierro, debido a causas genéticas oadquiridas, la fibrosis y la cirrosis son hallazgos comunes. Los patrones molecula-res, las células y los principales actores involucrados en la fibrogénesis son comu-nes con los diferentes agentes etiológicos y han sido descritos en otro de lospuntos de este capítulo.

Los xenobióticos, las hepatotoxinas y los mecanismos de defensa del huéspedpueden modificar la compartamentalización y la especiación de los iones metáli-cos dentro de la célula e incrementar la fracción activa catalítica potencialmentetóxica. Los pasos críticos en las cascadas de señalización son sensibles a oxidan-tes y antioxidantes, y muchos eventos básicos en la regulación celular como sonla fosforilación de proteínas, y la unión de factores de transcripción a señales con-senso en el DNA están manejados por la homeostasia fisiológica de oxidantes-

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• Lipoper o xidación de memb r anas

• Dismi n ución en el contenido y actividad de citocromos

• Lipoper o xidación de memb r anas

• Inhibición de la cadena de t r anspo r te de electrones e incremento de las E R O

• Disminución en el contenido de A TP

• Alte r aciones en la homeostasia del Ca

• Dismi n ución de la fluidez memb r anal • Incremento de la f r agilidad • La acu m ulación de Cu en la en f e r medad

de Wilson induce necrosis

• Ruptu r a de las cadenas de DNA y o xidación de las bases

• Apoptosis y f r agmentación del DNA • Mutagenicidad

Hepatocito

F e*/Cu*/LPx

Núcleo

F e*/Cu*/LPx

Mitocond r ia Microsoma

F e*/Cu*/LPx

Lisosoma F e*/Cu*

++

FFiigguurraa 2255--44.. Mecanismo de toxicidad del cobre y el hierro en los hepatocitos.

antioxidantes, especialmente por el balance de grupos tioles. Cuando metalesactivos catalíticamente se incrementan en la célula, como por ejemplo en las deKupffer, las cuales juegan un papel central en los patrones inflamatorios, inmu-nológicos y fibrogénicos pueden producir una aceleración y progresión de laenfermedad hepática. Una expansión de la poza de hierro secundaria, además deincrementar ligeramente el contenido hepático del metal, puede estar acompa-ñado de enfermedades hepáticas crónicas como la hepatitis viral, la enfermedadhepática alcohólica o la esteatohepatitis. Así, el hierro puede llegar a ser unapotente hepatotoxina y factor profibrogénico que puede actuar como un segun-do golpe en el órgano predañado o actuar en forma concomitante con otras hepa-totoxinas.

❚ CONCLUSIONES

El estrés oxidativo no es una enfermedad específica, pero es un estado patógenono específico donde hay un desbalance redox causado por las ERO secundariasal metabolismo de los hepatocitos infectados por virus y xenobióticos (indivi-dualmente o al unísono), que ocasionan lesiones isquémicas, traumáticas e infla-matorias. El reto en la investigación futura está en desarrollar herramientasterapeúticas capaces de bloquear las alteraciones en el estado redox celular en elinicio de la agresión celular, para evitar la progresión del daño.

❚ REFERENCIAS

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YY NNIITTRROOSSAATTIIVVOO EENN LLAA

IINNSSUUFFIICCIIEENNCCIIAA RREENNAALL AAGGUUDDAA

José Pedraza ChaverríOmar N. Medina-Campos

❚ INTRODUCCIÓN

Se han acumulado evidencias que sustentan la participación fundamental de losmetabolitos de oxígeno, parcialmente reducidos o especies reactivas de oxígeno(ERO), en el daño isquémico, tóxico y mediado inmunológicamente de los teji-dos. Además, en los últimos años, ha surgido una nueva clase de oxidantes queinfluyen en este daño: las especies reactivas de nitrógeno (ERN) derivadas delóxido nítrico (NO•). En este capítulo, se presenta un resumen de las evidenciasque involucran a las ERO y ERN en el daño oxidativo y nitrosativo y en la dis-función renal en diversas formas de insuficiencia renal aguda (IRA).

❚ ERO, ERN Y DAÑO RENAL

La sospecha de que los metabolitos reactivos de oxígeno podrían ser importan-tes en el proceso de inflamación se originó con una publicación, en 1969, en lacual McCord y Fridovich describieron a la superóxido dismutasa (SOD), que eli-mina al radical superóxido (O2

•). McCord supuso que, como los neutrófilos fago-

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citarios, las células efectoras de la respuesta inflamatoria aguda liberan al espacioextracelular grandes cantidades de O2

• y que, como la SOD, una enzima que dis-muta al O2

•, posee actividad inflamatoria, entonces el O2• y otros metabolitos del

oxígeno podrían ser importantes mediadores químicos del proceso inflamatorio.Esta hipótesis ha recibido apoyo considerable de un gran número de estudios endonde se ha examinado en diversos sistemas biológicos.

Por otro lado, el NO• regula el tono vascular y el transporte de iones en elriñón. Cuando las células están expuestas a un ambiente prooxidante, la forma-ción de NO• puede conducir a la generación de ERN. El NO• y el O2

• reaccio-nan muy rápidamente entre sí, para generar el anión peroxinitrito (ONOO–)(capítulo 2).

La generación de NO• es fundamental para la fisiología normal del riñón. Sinembargo, la excesiva producción de NO• puede trastornar el balance hemodiná-mico dentro del riñón y afectar a los procesos de filtración, reabsorción y excre-ción. La expresión de NOS tipo II, la isoforma inducible (iNOS), resulta en laelevada producción de NO•. Normalmente, el riñón es capaz de compensar cam-bios hemodinámicos moderados.

A continuación se describirán algunos modelos de IRA.

❚ LESIÓN POR ISQUEMIA Y REPERFUSIÓN (IR)

La isquemia y reperfusión ocurre cuando se interrumpe la oxigenación de lostejidos (isquemia) y se reestablece después de un periodo (reperfusión). Este pro-ceso conduce a daño celular que se ha involucrado con la formación de ERO.

Fuentes de las ERO en IR del riñón

Xantina oxidasa (XO)

Se ha observado que la actividad de la enzima XO (véase en el capítulo 6 la gene-ración de ERO por la XO), como productora de radicales libres, aumenta duran-te la reperfusión en riñones isquémicos, durante la hipoxia-reoxigenación en riñónperfundido aislado y en otros órganos isquémicos. Durante la isquemia, tambiénhay un rompimiento masivo de la reserva de nucleótidos de adenosina a inosina y después a hipoxantina. Así, después de un periodo de isquemia, hay una acumulación de xantina oxidasa (la preexistente y la recientemente conver-tida) y de su sustrato, la purina hipoxantina. Después de la reperfusión, el oxí-geno molecular reingresa a los tejidos y se produce un estallido en la producciónde O2

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Daño oxidativo y nitrosativo en la insuficiencia renal aguda • 397

Mitocondrias

Estos organelos son una de las principales fuentes de ERO en varios órganos bajocondiciones fisiológicas normales y patológicas (véase capítulo Cadena respirato-ria). Durante la reperfusión, y como consecuencia de la inhibición de la transferen-cia de electrones, ocurre un incremento repentino en la producción de O2

• porel aumento en la autooxidación de las fuentes principales de O2

• de la mitocon-dria: ubisemiquinona y la flavina semiquinona NADH-deshidrogenasa.

Membranas nucleares y microsomales

Las membranas nucleares y microsomales también contienen los sistemas detransporte de electrones citocromo P450 y citocromo b5 que generan ERO (capí-tulo 4).Aunque existe poca información acerca del papel de los suborganelos comofuente de ERO en el riñón, se ha demostrado que los microsomas renales tienen elpotencial de generar O2

• durante la IR. Se ha demostrado que el metabolismo del ácido araquidónico, vía la prostaglandina H sintasa y la lipoxigenasa, produceO2

• en presencia de NADH y NADPH. La autooxidación de catecolaminas ohemoproteínas como la mioglobina también genera O2

• y H2O2.

Leucocitos

Otra fuente importante de ERO son los leucocitos. En efecto, se ha demostradoque los neutrófilos juegan un papel esencial en la lesión por IR de varios órganoscomo corazón, intestino, hígado y riñón. Sin embargo, la contribución de los neu-trófilos a la IRA isquémica es controversial. Por un lado, empleando antisueroantineutrófilos, se ha demostrado que la neutropenia no protege a las ratas de lalesión renal por IR. Por el contrario, en otros estudios se ha demostrado que la in-fusión de neutrófilos en riñones isquémicos aislados y perfundidos empeora lalesión renal y que la fuga transtubular inducida por la isquemia se reduce en rato-nes neutropénicos comparados con los controles no neutropénicos. Por ello, se hapropuesto al estrés oxidativo como uno de los mecanismos de daño celular en lalesión por IR en cerebro, corazón, pulmón, intestino y riñón. En el cuadro 26-1se presenta un resumen de algunas evidencias que apoyan el papel de las ERO enla patogénesis de la lesión por IR.

La demostración de que la administración de SOD protege casi por completocontra la lesión inducida por isquemia en el intestino, condujo a la hipótesis de quelas ERO juegan un papel importante en la progresión del daño inducido por IR.

En contraparte, la lesión por IR afecta el sistema enzimático antioxidante dedefensa, dando como resultado la disminución significativa de los niveles tantode SOD, como de catalasa y glutatión peroxidasa (GPx,) en los riñones. Las pro-piedades de las enzimas antioxidantes en las células tubulares del riñón posible-mente constituyan un importante factor de susceptibilidad a la lesión. Porejemplo, se ha demostrado que la lesión por IR ocasiona daño en los túbulos pro-ximales, pero no en los túbulos distales, y que la expresión del gen de la SODaumenta en las células tubulares distales, mientras que disminuye en las célulastubulares proximales. Esta diferencia en la distribución y regulación de las enzi-mas antioxidantes posiblemente contribuye a la susceptibilidad de los túbulosproximales a la lesión por IR. Otros datos que realzan la relación entre el siste-ma antioxidante enzimático y el daño por IR son las observaciones de que losratones transgénicos que sobreexpresan la SOD son menos susceptibles a lalesión por IR mientras que la inhibición de la catalasa exacerba la lesión por IR.


CCuuaaddrroo 2266--11.. EEvviiddeenncciiaass qquuee ssuuggiieerreenn llaa ppaarrttiicciippaacciióónn ddee llaass EERROO yy ddee llaass EERRNN eenn llaa iinnssuuffiicciieenncciiaa rreennaall aagguuddaa rreennaall iinndduucciiddaa

ppoorr iissqquueemmiiaa yy rreeppeerrffuussiióónn

• En modelos in vivo e in vitro se observa un aumento en la generación de ERO, aumen-to en la actividad de xantina oxidasa y aumento en la conversión de xantina deshidro-genasa a xantina oxidasa

• La administración de atrapadores del espín como α-fenil tert-butil nitrona, disminu-ye el daño renal

• El cociente GSSG/(GSH+GSSG) aumenta después de la IR La peroxidación de lípi-dos que se observa in vivo e in vitro puede ser prevenida por atrapadores de ERO,inhibidores de xantina oxidasa, o quelantes de hierro

• Los atrapadores de ERO, antioxidantes, inhibidores de xantina oxidasa y quelantes dehierro protegen contra el daño

• Una dieta deficiente en selenio y vitamina E exacerba el daño• La inhibición de la catalasa exacerba el daño y los ratones transgénicos con aumento

en la actividad de SOD son menos susceptibles al daño• La actividad en riñón de las enzimas antioxidantes SOD, GPx y catalasa disminuye• La inhibición específica de la actividad de iNOS con L-iminoetil-lisina (L-NIL) o la

inhibición de la expresión de iNOS en el riñón con oligonucleótidos antisentido dis-minuye significativamente el daño

• El ebselen, un atrapador de ONOO–, previene el daño renal y la nitración de tirosina• La administración de BH4 previene la disfunción endotelial en el daño por IR

Aunque existe conflicto en los resultados obtenidos por algunos investigado-res, se ha encontrado que varios antioxidantes como SOD, dimetiltiourea, cata-lasa, GSH y atrapadores de electrones como N-acetilcisteína y vitamina E,funcionan como protectores contra la lesión por IR. Además se ha demostradoque una dieta deficiente en vitamina E y selenio exacerba la lesión por IR. Ladeficiencia de selenio produce una reducción en la actividad de GPx.

Papel del hierro

Se ha demostrado que el hierro es importante en algunos modelos de lesión tisu-lar, debido su participación en la generación de ERO. En la lesión por IR no hayun cambio significativo en el hierro no hémico o en la ferritina en el riñón, perohay un incremento notable y específico del hierro detectable con bleomicina(capaz de catalizar la producción de radicales) después de la reperfusión, pero nodurante el período isquémico. La ferritina es una proteína que constituye unmedio seguro de almacenar hierro intracelular en una forma inerte. A pesar deque una dieta deficiente en hierro provoca una reducción drástica en el conteni-do de hierro en el riñón, no previene el notable incremento en el hierro catalíti-co y tampoco protege contra la lesión por IR. Se ha informado un incrementosimilar en el hierro que se puede quelar con deferoxamina (hierro férrico) enriñones de conejos expuestos a isquemia. Se ha demostrado que los quelantes dehierro, como deferoxamina, protegen al corazón, intestino, riñón y pulmón de lalesión por IR, y contra la lesión inmunitaria y tóxica.

Peroxidación de lípidos

Se ha demostrado que la peroxidación de los lípidos, detectada como malondial-dehído (MDA) y etano, ocurre durante la reoxigenación o reperfusión en unagran variedad de tejidos isquémicos como corazón, hígado, intestino, pulmón,cerebro y riñón. La peroxidación de los lípidos es un mecanismo autocatalíticoque conlleva a la oxidación destructiva de las membranas celulares. A consecuen-cia de este proceso se pueden liberar metabolitos de aldehídos tóxicos y reacti-vos entre los que se incluyen al MDA y al 4-hidroxinonenal (4-HNE). Losaductos de MDA y 4-HNE con proteínas pueden ser detectados en el riñón des-pués de sólo 30 minutos de isquemia. Se ha demostrado que inhibidores de laperoxidación de lípidos, tales como lazaroides (21-aminosteroide) y bioflavonoi-des, reducen la formación de radicales libres, la peroxidación lipídica y la disfun-ción renal en la lesión por IR.

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Papel del glutatión

El cociente GSSG/(GSH+GSSG) se ha considerado como un parámetro para laevaluación del estrés oxidativo debido a que el GSH es oxidado a GSSG duran-te la reducción del H2O2 y de los hidroperóxidos lipídicos por la GPx; la gluta-tión reductasa reduce nuevamente el GSSG a GSH. Se ha informado que dichocociente disminuye durante la isquemia y aumenta durante la reperfusión.

Especies reactivas de nitrógeno

El estrés oxidativo hace evidente el potencial tóxico del NO• en el riñón y tam-bién puede ser aumentado por medio de la generación de NO• y ERN. Las célu-las epiteliales y endoteliales del riñón no son las únicas fuentes de NO• y ERO.Las células inflamatorias infiltrantes movilizadas al sitio de la lesión también soncapaces de generar estas especies y pueden prolongar la exposición del riñón aestos oxidantes. Como se discutió anteriormente, existe mucha especulaciónsobre la fuente de O2

• en el riñón. Se debe destacar que la NOS del túbulo pro-ximal por sí misma es capaz de generar O2

• así como NO•. El cociente de gene-ración de O2

• a NO• cambia en favor del O2• cuando la concentración de

L-arginina disminuye. Es razonable especular que bajo condiciones de flujo san-guíneo reducido (isquemia o choque) la concentración de L-arginina en el riñónposiblemente decaiga lo suficientemente como para favorecer la generación deO2

• así como de NO•, y de este modo también se generaría ONOO–. También seha demostrado que la deficiencia u oxidación de tetrahidrobiopterina (BH4)(figura 26-1), un cofactor de la NOS, también conduce a que esta enzima gene-re O2

•. Cuando la NOS genera O2•, por deficiencia de BH4 o de L-arginina, se

dice que esta enzima está “desacoplada”. En estudios recientes se ha demostradoque en los glomérulos de ratas diabéticas la NOS es una fuente principal de O2

•

como consecuencia de la deficiencia de BH4. El ONOO– es capaz de oxidar a laBH4 y así de “desacoplar” a la NOS.

Se han utilizado inhibidores selectivos de la actividad y de la expresión deiNOS para investigar los papeles del NO• y del ONOO– en diferentes modelosde IRA. El modelo que se ha investigado más ampliamente es el de IR renal. Lanaturaleza de los mediadores de la lesión por IR renal continúa en controversia,pero al parecer las ERN juegan un papel importante (cuadro 26-1). Como se describió previamente, el tratamiento con atrapadores de ERO y antioxidantes,como por ejemplo SOD, dimetiltiourea, alopurinol (un inhibidor de la xantinaoxidasa) y deferoxamina, protegen en algunos pero no en todos los modelos delesión por IR. Los inhibidores mencionados anteriormente tienen otra propiedaden común, todos ellos atrapan o inhiben directamente la formación de ONOO–.


Cuando Noiri y colaboradores bloquearon la expresión de iNOS en el riñón uti-lizando oligonucleótidos antisentido, se redujeron significativamente los marca-dores funcionales y morfológicos de la IRA provocada por IR. Lo mismo sucedecuando se realiza la inhibición selectiva de la actividad de iNOS. Se ha obtenidoevidencia de la generación de ONOO– por medio de la inmunodetección de pro-teínas nitradas en riñón de ratas sometidas a IR. La aparición de proteínas nitra-das indica no solamente la cogeneración de O2

• y NO• sino también que losmecanismos antioxidantes de defensa no fueron capaces de suprimir totalmentelas acciones del ONOO–. En estudios adicionales se ha encontrado que el ebse-len (figura 26-1), un compuesto de bajo peso molecular que reproduce los efec-tos de GPx y que es un catalizador de la descomposición de ONOO–, previno eldaño estructural y funcional renal así como la nitración de proteínas y la oxida-ción de lípidos y de DNA en ratas sometidas a IR.

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FFiigguurraa 2266--11.. Estructura de diversos compuestos mencionados en el texto.

❚ LESIÓN RENAL INDUCIDA POR LIPOPOLISACÁRIDO

El lipopolisacárido (LPS), un componente de la pared celular de las bacteriasgram negativas, es la causa principal del choque séptico. El LPS desencadena la sín-tesis y la liberación de citocinas y de NO•. La estimulación de la expresión de iNOScausada por LPS contribuye de manera importante al incremento en la produc-ción de NO•. Esto ocurre en la vasculatura y la mayoría de los órganos, incluyen-do el riñón.

Además de aumentar la síntesis de NO•, el LPS también provoca la síntesis deERO tales como el O2

• en pulmón, hígado y riñón. Dosis altas de LPS (8 a 10mg/kg) producen IRA en la rata que no es afectada por el tratamiento con SOD,catalasa, dimetiltiourea o deferoxamina. Sin embargo, dosis bajas (5 mg/kg) pro-vocan disminución en la función renal, que puede ser retardada con la adminis-tración de SOD o dimetiltiourea. Estos estudios sugieren que el estrés oxidativojuega un papel en el desarrollo temprano de la lesión renal (cuadro 26-2), perono es la única causa por la cual la lesión conduce a IRA.

Se ha examinado in vitro el potencial que tiene la toxicidad directa del LPS enlas células renales. El componente biológico activo del LPS, el lípido A, es tóxicopara el epitelio tubular de los cultivos celulares (células LLC-PK1), así como paralos túbulos proximales aislados de rata. El lípido A causa un incremento rápidoen la concentración de calcio intracelular en el túbulo proximal. Esta respuestaes mediada, al menos en parte, por la liberación de las reservas de calcio intrace-lular. Este evento inicial conduce a estrés oxidativo, a peroxidación lipídica y even-tualmente a la muerte celular. La toxicidad es prevenida por la inhibición de la


CCuuaaddrroo 2266--22.. EEvviiddeenncciiaass qquuee ssuuggiieerreenn eell ppaappeell ddee llaass EERROO yy EERRNN eenn eell ddaaññoo rreennaall iinndduucciiddoo ppoorr lliippooppoolliissaaccáárriiddoo ((LLPPSS))

• Los antioxidantes como SOD y dimetiltiourea protegen contra el daño por LPS• Los niveles renales de GSH disminuyen en ratas tratadas con LPS• La liperoperoxidación renal aumenta en ratas tratadas con LPS• La administración de dimetiltiourea y de SOD previene parcialmente el daño renal

inducido por LPS• La toxicidad del lípido A en las células LLC-PK1 es prevenido por antioxidantes• El LPS induce la iNOS en el riñón• El LPS es directamente citotóxico en túbulos proximales aislados por medio de una

vía de señalización disparada por un aumento en la concentración intracelular de cal-cio. La citotoxicidad es mediada por oxidantes derivados de NOS

• La inhibición farmacológica de iNOS reduce el estrés oxidativo y el daño renal• La aparición de aductos 3-nitrotirosina-proteína refleja la producción de ERN

liberación de calcio, por los antioxidantes hidroxitolueno butilado y N,N´-difenil-1-fenilenediamina, SOD, deferoxamina, ácido dietilentriaminopentaacético y porel incremento de los niveles intracelulares de GSH. Por lo anterior, es claro que elestrés oxidativo juega un papel en este modelo in vitro. El estrés oxidativo tambiénocurre in vivo. Los niveles renales de GSH disminuyen y hay evidencia de peroxi-dación lipídica después de 6 horas del tratamiento de ratas con LPS (3 mg/kg).

Se ha estudiado el papel de las ERN derivadas de la iNOS en las ratas usandoL-NIL, un inhibidor selectivo de iNOS. La inyección de LPS induce el aumentoen la expresión de iNOS y un aumento de 100 veces en la concentración de losnitratos y nitritos (productos del metabolismo de NO• e indicadores de la pro-ducción de NO•). También se observa estrés oxidativo y aumento en la nitraciónde tirosina, sugiriendo la excesiva producción de ERN. El tratamiento con L-NILpreviene el estrés oxidativo y atenúa el aumento en la concentración de nitratosy nitritos en plasma. El L-NIL también disminuye la formación de aductos de 4-HNE-proteína y 3-nitrotirosina-proteína (figura 26-1). La disminución de losaductos 3-nitrotirosina-proteína no es total, lo que sugiere que otras isoformas deNOS participan en la generación de ERN. Los datos anteriores, en su conjunto,sugieren que el NO• y las ERN participan en el daño oxidativo renal inducidopor LPS.

❚ NEFROTOXICIDAD POR GENTAMICINA

Una de las principales complicaciones del uso de los antibióticos aminoglicósi-dos, incluyendo a la gentamicina, que son ampliamente usados en el tratamientode las infecciones gram negativas, es la nefrotoxicidad, la cual constituye del 10al 15% de todos los casos de IRA. Aunque el mecanismo o los mecanismos exac-tos responsables de la nefrotoxicidad por gentamicina (figura 26-1) aún no estánclaros, en el cuadro 26-3 se presenta un resumen de algunas de estas evidencias.

Se ha documentado la capacidad de la gentamicina para alterar la respiraciónmitocondrial in vivo e in vitro. Esto conduce a que la gentamicina estimule lageneración de ERO en mitocondrias de corteza renal.

También se ha demostrado que la gentamicina estimula la producción in vivode H2O2. Los estudios realizados por diversos grupos de investigadores han esta-blecido que la catalasa pura es inactivada por aminotriazol solamente en presen-cia de H2O2, debido a que el aminotriazol reacciona con un intermediario decatalasa, formando un complejo covalente con la proteína. La inhibición de la ca-talasa en el tejido por aminotriazol ha sido utilizada como un parámetro cualitativo de la producción de H2O2. Con el uso de este método, la inyecciónde aminotriazol produce una inhibición de la actividad de catalasa muchomayor en las ratas tratadas con gentamicina, lo que es una evidencia de la ge-©

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neración neta de H2O2 en la corteza renal en la nefrotoxicidad inducida por gentamicina.

Por otro lado, diversos estudios in vivo e in vitro han demostrado que la gen-tamicina aumenta la generación de H2O2 y la liberación de hierro, posiblementede la ferritina, lo cual contribuye a la generación de más ERO. Asímismo, los atra-padores de •OH y los quelantes de hierro protegen la función renal en la IRAinducida por gentamicina en la rata, mientras que la administración de SOD odimetiltiourea protege contra la disfunción renal, la peroxidación de lípidos y eldaño tubular en este modelo experimental. También se ha demostrado que lacoadministración de diferentes antioxidantes como vitamina E, selenio, melato-nina, N-acetilcisteína, etc., protege contra la nefrotoxicidad inducida por genta-micina y previenen la disminución de las enzimas antioxidantes.

El papel que las ERN puedan jugar en la nefrotoxicidad por gentamicina noestá completamente claro. Los glomérulos aislados de ratas tratadas con gentami-

404 Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas (Capítulo 26)

CCuuaaddrroo 2266--33.. EEvviiddeenncciiaass qquuee ssuuggiieerreenn llaa ppaarrttiicciippaacciióónn ddee EERROO eenn llaa IIRRAA iinndduucciiddaa ppoorr ggeennttaammiicciinnaa

• La gentamicina aumenta la generación de O2•, H2O2, y •OH en mitocondrias de cor-

teza renal• Hay un aumento en la generación in vivo de H2O2 en la corteza renal de las ratas tra-

tadas con gentamicina• La gentamicina aumenta la liberación de hierro de las mitocondrias de corteza renal• El complejo gentamicina-hierro induce lipoperoxidación in vitro y es un potente cata-

lizador de la formación de radicales libres• Los atrapadores de •OH protegen del daño• Los quelantes de hierro protegen de la formación de •OH inducida por gentamicina

en mitocondrias de corteza renal así como del daño inducido in vivo• La suplementación de hierro aumenta el daño• La actividad de las enzimas antioxidantes catalasa, GPx y SOD disminuyen en corte-

za renal• La administración de SOD protege significativamente• El pretratamiento con cinc previene el daño al inducir la metalotioneína la cual puede

atrapar ERO• La administración de diferentes antioxidantes como vitamina E, vitamina C, selenio,

polvo de ajo, extracto de ajo envejecido, S-alilcisteína, S-alilmercaptocisteína, dialil-sulfuro y dialildisulfuro previenen el daño

• La detección in vivo de aductos 3-nitrotirosina-proteína sugiere la producción deERN. El efecto protector de antioxidantes como extracto de ajo envejecido S-alilcis-teína, S-alilmercaptocisteína y dialildisulfuro está asociado a la prevención de la for-mación de estos aductos y de la disminución de las enzimas antioxidantes

cina tienen niveles elevados de GMPc, sugiriendo un aumento en la producciónde NO•. La inhibición no selectiva de NOS con NG-nitro-L-arginina-metil ester(L-NAME) empeora la nefrotoxicidad inducida por gentamicina. Sin embargo nose pueden sacar conclusiones de que la producción de NO• protege en estemodelo debido a que el L-NAME aumenta la presión sanguínea y puede alterarla filtración glomerular. Se requieren estudios con inhibidores selectivos de iNOSen este modelo. En algunos estudios, se ha encontrado que aumenta la nitraciónde tirosina y que este incremento es prevenido por diversos antioxidantes, lo quesugiere que la producción de ERN está elevada y puede estar involucrado en eldaño renal, en la nefrotoxicidad por gentamicina. Se requieren estudios con atra-padores de ONOO–, como el ebselen (figura 26-1), o con metaloporfirinas quedescomponen específicamente al ONOO– para precisar la participación delONOO–, en este modelo experimental.

❚ INSUFICIENCIA RENAL AGUDA MIOGLOBINÚRICA

Durante la segunda guerra mundial se describió la primera asociación causalentre la IRA y el daño a músculo esquelético, con la consecuente liberación de lamioglobina al plasma (rabdomiolisis). Se estima que alrededor de un tercio de lospacientes con rabdomiolisis desarrollan IRA y que la rabdomiolisis puede consti-tuir cerca del 10% de todos los casos de IRA. El modelo más ampliamente usadode IRA mioglobinúrica es producido por la inyección subcutánea o intramuscu-lar de glicerol.

El papel de las ERO en la IRA inducida por daño al músculo se ha estudiadoen el modelo de glicerol (cuadro 26-4). Se ha demostrado el aumento en la gene-ración de H2O2, lo cual motivó el estudio del efecto del piruvato, un alfa cetoá-cido, en este modelo debido a que una característica de una gran variedad de alfacetoácidos es su capacidad para descomponer H2O2 por medio de una reacciónde descarboxilación oxidativa no enzimática. La administración de piruvato pre-viene la disfunción renal y el daño estructural inducidos por la inyección intra-muscular de glicerol. También se ha demostrado que la mitocondria es un sitiocrítico de la formación de ERO inducida por el grupo hemo.

Los quelantes de hierro y los atrapadores de •OH también tienen un efectoprotector. Se ha demostrado que el 21-aminoesteroide previene la peroxidaciónde lípidos y la citotoxicidad inducida por proteínas hemo en células tubulares invitro y en los riñones in vivo en el modelo de IRA inducida por glicerol.

Aunque se ha postulado que la mioglobina del músculo es una fuente impor-tante de hierro en la IRA inducida por glicerol, ya que la mioglobina liberada delmúsculo es rica en hierro hémico, también existen evidencias de que el citocro-mo P450 es una fuente significativa de hierro en este modelo experimental.©

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Así mismo, se ha demostrado que, en este modelo disminuyen los niveles rena-les de GSH. La disminución de GSH, inducida por la administración de butioni-na sulfoximina, exacerba el daño funcional renal, comparado con ratas inyectadascon glicerol. Por el contrario, la administración de GSH a ratas inyectadas con gli-cerol protege claramente del daño renal funcional y estructural en este modeloexperimental. Los datos anteriores en su conjunto sugieren el papel del GSH enla IRA inducida por glicerol.

Por otro lado, la mioglobina y la hemoglobina son potentes atrapadores deNO•. Por lo tanto, el aporte de estas proteínas al riñón puede anular la actividadvasodilatadora del NO• en la vasculatura renal, lo cual puede ser parte del meca-nismo de vasoconstricción renal asociada con esta enfermedad. De hecho se haencontrado que en la IRA inducida por glicerol el sustrato para la síntesis deNO•, L-arginina, protege y que la administración de melatonina disminuye losniveles de NO• y empeora el daño y que la administración de L-NAME, un inhi-bidor no específico de la NOS, también empeora el daño renal en estos anima-les. Además, se ha encontrado que la molsidomina, un donador de NO•, tiene unefecto protector en las alteraciones funcionales y estructurales así como en la dis-


CCuuaaddrroo 2266--44.. EEvviiddeenncciiaass qquuee ssuuggiieerreenn llaa ppaarrttiicciippaacciióónn ddee EERROO yy ddeell NNOO·· eenn llaa IIRRAA iinndduucciiddaa ppoorr mmiioogglloobbiinnaa

• Se presenta un aumento en la generación in vivo de H2O2 en la corteza renal en ratascon IRA inducida por glicerol

• El piruvato, un atrapador de H2O2, protege de la IRA inducida por glicerol• Los atrapadores de •OH protegen de la IRA inducida por glicerol en la rata• La deferoxamina, un quelante de hierro, protege del daño renal en la IRA inducida

por inyección intramuscular de glicerol o por inyección intravenosa de hemoglobina• La administración conjunta de deferoxamina y de manitol (un atrapador de •OH)

previene el daño renal y del estrés oxidativo inducido en la IRA miohemoglobinúri-ca (inducida por inyección intramuscular de glicerol)

• La administración de GSH mejora y la inhibición de su síntesis con butionina sulfo-ximina empeora la IRA mioglobinúrica (inducida por inyección intramuscular de gli-cerol)

• La expresión de hemo-oxigenasa-1 aumenta en la IRA inducida por glicerol. La inhi-bición de esta enzima empeora el daño y la inducción previa de la misma protege deldaño en este modelo experimental

• Un inhibidor de la peroxidación de lípidos, el 21-aminoesteroide, previene la peroxi-dación de lípidos inducida por el grupo hemoproteínas in vivo e in vitro

• La molsidomina, un donador de NO•, tiene un efecto protector en ratas tratadas conglicerol

minución de las enzimas antioxidantes y en el aumento de la peroxidación delípidos inducidos por glicerol. Los datos anteriores sugieren que la deficiencia de NO• está asociada e involucrada en la IRA mioglobinúrica. No hay eviden-cias de estrés nitrosativo o de daño por ERN en este modelo experimental.

❚ NEFROTOXICIDAD POR CICLOSPORINA

La ciclosporina A (figura 26-2) es un polipéptido inmunosupresor ampliamenteusado en el trasplante de riñón, hígado, corazón y páncreas. El uso de este agen-te inmunosupresor ha representado uno de los más grandes avances en los pasa-dos 25 años, al reducir el rechazo agudo y aumentar la sobrevida del injerto alargo plazo. La nefrotoxicidad y la hipertensión son los principales efectos secun-darios del tratamiento con ciclosporina A, la cual produce contracción glomeru-lar que conduce a una reducción significativa en la filtración glomerular.

Diferentes estudios experimentales apoyan el papel de las ERO en la patogé-nesis de la nefrotoxicidad por ciclosporina A, en modelos in vitro e in vivo. Por

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FFiigguurraa 2266--22.. Estructura de la ciclosporina.

ejemplo, varios estudios han demostrado la generación de H2O2 por la ciclospo-rina A en las células mesangiales y aumento en la generación de O2

• y de H2O2

en glomérulos. También se ha demostrado que el aumento en la generación deERO por la ciclosporina A en el riñón puede ser bloqueado por antioxidantes.

Hay evidencias que sugieren que el citocromo P450 juega un papel en la gene-ración de oxidantes al funcionar como un donador de hierro, lo cual conduce ala generación de ERO. La ciclosporina A también afecta el sistema antioxidanteen el riñón; se ha demostrado que disminuye los niveles de GSH y de vitamina E.

Los efectos benéficos de los atrapadores de ERO y de los antioxidantes son evi-dencias adicionales que apoyan el papel de las ERO en la nefrotoxicidad porciclosporina A. La administración de SOD o de catalasa previene la disminuciónde la función renal inducida por ciclosporina A. La administración de vitamina Eo lazaroides atenúan la vasoconstricción microvascular renal y la hiperperfusióninducida por ciclosporina, lo que preserva la filtración glomerular. De igualmanera, el oxopurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa, atenúa las alteracionesestructurales en la mitocondria y la citotoxicidad en las células tubulares renales.

La administración de antioxidantes como el GSH y la vitamina E también atenúa la peroxidación de lípidos y la toxicidad renal inducida por ciclosporinaA. Además la administración de ciclosporina A a animales deficientes en antioxi-dantes y la depleción de GSH conducen a un mayor daño renal y peroxidaciónde lípidos. En el cuadro 26-5 se presentan algunas evidencias del papel de lasERO en la nefrotoxicidad por ciclosporina.

Se conoce poco sobre el papel del NO• y de las ERN en el desarrollo de lanefrotoxicidad por ciclosporina A. En algunos estudios se ha sugerido que el NO•

puede ser benéfico. La nefrotoxicidad por ciclosporina A se caracteriza por vaso-constricción renal e hipertensión, que puede progresar a daño estructural irrever-sible. La acción vasodilatadora del NO• puede atenuar el efecto de sustanciasvasoconstrictoras como endotelina, angiotensina II y tromboxano, de hecho, se hademostrado que la ciclosporina A induce la NOS endotelial en el riñón y en célu-las endoteliales de aorta de bovino. El tratamiento con ciclosporina A no inducecambios en el mRNA de iNOS en corteza renal. De acuerdo con la informaciónanterior, un donador de NO•, la molsidomina, tiene un efecto benéfico en estetipo de nefrotoxicidad.

❚ NEFROTOXICIDAD POR CISPLATINO

El cisplatino (figura 26-1) es un agente quimioterapeútico que es usado en el tra-tamiento de una gran variedad de tumores sólidos como el de cabeza, cuello, tes-tículo y ovario. Desafortunadamente, además de causar supresión de médula óseay ototoxicidad, un 28 a 36% de los pacientes que reciben una dosis inicial de cis-


platino desarrollan IRA debido a su acumulación dentro de los túbulos proxima-les en la médula externa del riñón. Los eventos celulares en la nefrotoxicidadinducida por cisplatino incluyen disminución en la síntesis de proteínas, peroxi-dación de las membranas, disfunción mitocondrial y daño al DNA como conse-cuencia de la generación de radicales libres y la incapacidad para neutralizardichas moléculas.

Aunque el mecanismo fundamental de la nefrotoxicidad por cisplatino no estácompletamente establecido, hay evidencias del papel de las ERO (cuadro 26-6).En varios estudios in vitro se ha demostrado que el cisplatino aumenta la gene-ración del H2O2 en las células del túbulo proximal de ratón, así como de otrasERO a través de la inhibición del complejo I de la cadena respiratoria mitocon-drial en células del túbulo proximal porcino.

El papel de las ERO en la patogénesis de la nefrotoxicidad por cisplatino hasido apoyado por el efecto benéfico de los atrapadores de estos metabolitos eneste modelo de daño renal. Los estudios in vitro han demostrado que la catalasa,un atrapador de H2O2, protege contra la muerte celular inducida por cisplatinoy en estudios in vivo se ha demostrado el efecto benéfico de SOD y de dimetil-tiourea en la nefrotoxicidad por cisplatino.©

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• La ciclosporina A aumenta la generación de H2O2 in vivo e in vitro• La peroxidación de lípidos aumenta y disminuye la NADPH citocromo P450 en micro-

somas renales, y en el cociente GSH/GSSG en corteza renal, microsomas, o mitocon-dria in vitro e in vivo

• La SOD o la catalasa pueden prevenir la disminución de la función renal inducida porciclosporina

• El oxipurinol, un inhibidor de la xantina oxidasa, atenúa la citotoxicidad inducida porciclosporina in vitro

• La ciclosporina reduce los niveles de GSH y de antioxidantes y la administración deantioxidantes como GSH o vitamina E produce una marcada atenuación de los efec-tos tóxicos inducidos por ciclosporina A

• La deficiencia de antioxidantes exacerba el daño renal y el estrés oxidativo inducidospor ciclosporina

• La peroxidación de lípidos inducida por ciclosporina es bloqueada por un inhibidorde citocromo P450

• El NO• derivado de eNOS puede ser benéfico en la preservación del flujo sanguíneorenal. La ciclosporina no aumenta la expresión de iNOS en corteza renal

• La molsidomina, un donador de NO•, tiene un efecto protector en ratas tratadas conciclosporina

También se ha examinado el contenido de hierro catalítico y el efecto de losquelantes de hierro en un modelo in vitro en células LLC-PK1 y en un modeloin vivo en rata, la exposición de las células LLC-PK1 al cisplatino produce unaumento significativo en el hierro capaz de catalizar la producción de radicaleslibres (hierro medible con bleomicina) liberado al medio, la incubación simultá-nea de las células LLC-PK1 con quelantes de hierro atenúa significativamente lacitotoxicidad inducida por cisplatino. El contenido de hierro detectable con bleo-micina también aumenta en las ratas tratadas con cisplatino y la administraciónde deferoxamina previene el daño renal funcional y estructural inducido con cis-platino. También se ha demostrado en las células LLC-PK1 que la incubación concisplatino induce un aumento de •OH. De acuerdo con este dato los atrapadoresde •OH reducen significativamente la citotoxicidad inducida por cisplatino yprotegen contra la IRA inducida por este agente. Los datos anteriores en su con-junto apoyan un papel fundamental del hierro en el daño a tejido por •OH eneste modelo de IRA.

Se ha estudiado el papel del citocromo P450 como una fuente de hierro catalí-tico en la nefrotoxicidad inducida por cisplatino in vivo e in vitro. En el riñón de


CCuuaaddrroo 2266--66.. EEvviiddeenncciiaass qquuee ssuuggiieerreenn llaa ppaarrttiicciippaacciióónn ddee EERROO yy ddee EERRNN eenn llaa IIRRAA iinndduucciiddaa ppoorr cciissppllaattiinnoo

• El cisplatino aumenta la generación in vitro de H2O2 en las células de túbulo proximal• El cisplatino in vivo aumenta el hierro catalítico en las células LLC-PK1 y los quelan-

tes de hierro protegen in vivo e in vitro• Los atrapadores de ERO, incluyendo la catalasa, y los atrapadores de •OH protegen

tanto in vivo como in vitro• El cisplatino aumenta el contenido de citocromo P450 y del hierro que se mide con

bleomicina. Los inhibidores de citocromo P450 previenen el aumento en el hierro quese mide con bleomicina y son protectores in vivo e in vitro

• El cisplatino induce la peroxidación de lípidos in vivo e in vitro• El cisplatino disminuye los niveles de GSH y de grupos tiol in vitro e in vivo. El GSH

protege y la inhibición de la síntesis de GSH y la deficiencia de selenio aumenta lanefrotoxicidad in vivo

• Diversos antioxidantes protegen de la nefrotoxicidad inducida por cisplatino• El cisplatino induce a la hemooxigenasa-1. La inhibición de esta enzima exacerba y la

sobreinducción disminuye el daño• La administración de FeTPPS, el cual metaboliza la descomposición de ONOO–, pre-

viene parcialemnte el daño renal inducido por cisplatino, sugiriendo que el ONOO–

participa en el daño renal

ratas tratadas con cisplatino disminuye el contenido de citocromo P450 y aumen-ta significativamente el hierro catalítico. La coadministración de un inhibidor decitocromo P450 previene la pérdida de citocromo P450, el aumento en el hierrocatalítico en el riñón y las alteraciones estructurales y funcionales inducidas porcisplatino. También se ha demostrado in vitro que los inhibidores del citocromoP450 previenen el aumento de hierro catalítico en las células LLC-PK1 expuestasa cisplatino. Estos datos en su conjunto sugieren que el citocromo P450 puede seruna fuente significativa de hierro catalítico en la nefrotoxicidad inducida por cis-platino.

La enzima hemo oxigenasa-1 es inducida por oxidantes y se ha demostradoque dicha inducción tiene una respuesta protectora en el daño renal. El cisplati-no induce el mRNA y la cantidad de proteína de hemo oxigenasa-1 y la inhibi-ción de esta enzima aumenta la disfunción renal en la nefrotoxicidad porcisplatino. En experimentos realizados en ratones knockout para hemo oxigena-sa-1 (-/-) se ha observado que la administración de cisplatino agrava la nefrotoxi-cidad, comparada con ratones silvestres para hemooxigenasa-1 (+/+). Resultadossimilares se han obtenido en estudios in vitro en células de túbulo proximal de ori-gen humano o porcino, en donde también se ha demostrado que la sobreexpre-sión de la hemooxigenasa-1 previene la citotoxicidad y el aumento en EROinducidas por cisplatino.

El cisplatino produce una reducción del sistema antioxidante que metabolizalas ERO. El cisplatino reduce los niveles de las vitaminas antioxidantes C y E enpacientes con cáncer y la administración de α-tocoferol protege contra la nefro-toxicidad inducida por cisplatino. En un estudio in vitro se ha demostrado que elcisplatino reduce los niveles mitocondriales de GSH al inhibir a la glutatiónreductasa en células incubadas con cisplatino. El papel del GSH, como parte delsistema antioxidante de defensa en este modelo de daño renal, es apoyado tam-bién por las siguientes observaciones: a) la administración de GSH tiene un efec-to protector, b) la inhibición de GSH por butionina sulfoximina y la deficienciade selenio aumentan la magnitud de la nefrotoxicidad y c) la administración deselenio previene la nefrotoxicidad por cisplatino.

La administración de cisplatino induce la expresión de iNOS en el riñón mien-tras que la inhibición de la actividad de NOS reduce la peroxidación de lípidosy el daño renal. También se ha observado que las ERN potencian la citotoxicidadpor cisplatino en fibroblastos en cultivo y que la administración de FeTPPS, unametaloporfirina sintética que descompone al ONOO– (figura 26-3), reduce sustan-cialmente el daño estructural y funcional inducido por cisplatino. Estos datos, ensu conjunto, apuntan a que el NO• y las ERN son mediadores de la nefrotoxici-dad inducida por cisplatino (cuadro 26-6).

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❚ ESTUDIOS REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

Se han realizado estudios en diversos modelos de insuficiencia renal aguda comolos inducidos por IR, gentamicina y cisplatino. Algunas de las contribuciones rea-lizadas en dichos modelos han sido las siguientes: a) en el modelo de insuficien-cia renal aguda por IR demostramos que la administración de un atrapador deradicales libres, α-fenil-tert-butil-nitrona, previene el daño renal, b) en el modelode nefrotoxicidad por gentamicina demostramos que la administración de diver-sos compuestos organosulfurados derivados del ajo protegen del daño renal fun-cional y estructural así como del estrés oxidativo y nitrosativo y c) en el modelo


FeTPPS

NN

N N

SO3

H

SO3

H

SO3

H

HO3

S Fe Cl

FFiigguurraa 2266--33.. Estructura de 10,15,20-tetrakis-(4-sulfonatofenil)-porfirinato de hierro (III)(FeTPPS), una metaloporfirina sintética que cataliza la descomposición de ONOO–.

de nefrotoxicidad por cisplatino se demostró que la administración de una meta-loporfirina, que descompone ONOO–, FeTPPS, previno el daño estructural yfuncional así como la nitración de tirosina en riñón. En este trabajo se demostró,por primera vez, que el ONOO– es un mediador del daño renal inducido por cis-platino.

❚ AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue posible gracias a los donativos del Consejo Nacional de Cienciay Tecnología (CONACYT, 40009-M) y de la Dirección General de Asuntos delPersonal Académico (DGAPA, PAPIIT IN227103) de la Universidad NacionalAutónoma de México (UNAM).

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EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASS

DDEE OOXXÍÍGGEENNOO YY DDIISSFFUUNNCCIIÓÓNN

EENNDDOOTTEELLIIAALL

José Carlos García PiñeiroNáyade Pereira Roche

Anaida Osoria Pérez

❚ INTRODUCCIÓN

Al saberse, accidentalmente, que cumple diversas y trascendentes funciones; elendotelio fue redescubierto como un órgano “nuevo”, a finales del milenio pasa-do. Entre los descubrimientos más relevantes se encuentran los de Robert Furch-gott que, en 1980, reportó que el endotelio controla el tono del músculo lisovascular, mediante la liberación de un factor relajador derivado del endotelio(EDRF); posteriormente, en 1987, Salvador Moncada descubrió que el EDRF erael óxido nítrico (NO•).

La comprensión de las funciones de este “nuevo” y ubicuo órgano ha permiti-do desentrañar diversos conocimientos en la biología celular y en la fisiopatolo-gía de enfermedades de gran importancia médico-social.

❚ CARACTERÍSTICAS DEL ENDOTELIO VASCULAR

El endotelio vascular es la primera capa celular de los vasos sanguíneos, está encontacto directo con la sangre y el oxígeno, se orienta en el sentido del flujo san-

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guíneo a lo largo de todo el lecho vascular, desde el corazón hasta los más peque-ños capilares. Las células endoteliales poseen alta capacidad proliferativa, seadaptan en número y disposición según los requerimientos locales y pueden for-mar nuevos capilares de ser necesario. Las células endoteliales sintetizan y libe-ran sustancias de acción autocrina y paracrina necesarias para la regulación deltono vascular, entre de las que destacan la prostaciclina (PGI2), el óxido nítrico(NO•) y la endotelina-1 (ET-1) (cuadro 27-1). Además, la célula endotelial libe-ra factores de crecimiento bajo circunstancias de daños como el factor de creci-miento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas(PDGF) y el factor de crecimiento semejante a la insulina.

❚ FUNCIONES DEL ENDOTELIO VASCULAR

Actúa como barrera macromolecular

Las células endoteliales, íntimamente conectadas entre sí, constituyen una barre-ra que posee permeabilidad selectiva, con doble transporte activo, lo que permi-


CCuuaaddrroo 2277--11.. PPrriinncciippaalleess ssuussttaanncciiaass pprroodduucciiddaass ppoorr eell eennddootteelliioo vvaassccuullaarr yy ssuuss ffuunncciioonneess

MMeeddiiaaddoorr FFuunncciióónn eenn eell eennddootteelliiooPPrroossttaacciicclliinnaa ((PPGGII22)) • VasodilatadorConstituye la sustancia • Regulador de la adhesión y agregación plaquetariamás importante derivada • Inhibidor de la movilización de sitios de fibrinó-del ácido araquidónico geno en las plaquetas humanas, in vivoen el tejido vascular • Aumenta la actividad fibrinolíticaOOxxiiddoo NNííttrriiccoo ((NNOO••)) • Disminuye el tono vascularSu presencia en la célula • Potente vasodilatadorendotelial se identificó en • Inhibidor de la adhesión y la agregación pla-la segunda mitad del quetariadecenio 1980-89 • Inhibidor de la migración y adhesión de mono-Anteriormente era citos y leucocitosconocido como factor • Disminuye la permeabilidad endotelialrelajante derivado del • Regula el flujo de lipoproteínas al interior de la endotelio pared vascular

• Inhibe la proliferación y migración de las células musculares lisas vasculares

EEnnddootteelliinnaa • La sustancia vasoconstrictora más potente que(ET-1), péptido de 21 existeaminoácidos que no se • Induce la proliferación del músculo liso vascular expresa constitutivamente en la subíntima

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Especies reactivas de oxígeno y disfunción endotelial • 417

te el paso de nutrientes de la luz del capilar hacia el subendotelio y metabolitosen dirección contraria.

Proporciona una superficie tromborresistente

El endotelio regula la adhesión y agregación plaquetaria con la participación dela prostaciclina y el NO•. Estimula, además, el sistema anticoagulante y modulael sistema fibrinolítico a través de la síntesis y liberación de proteínas fibrinolíti-cas, dentro de las que destacan la urocinasa, el activador tisular del plasminóge-no, los inhibidores del activador del plasminógeno tipos 1 y 2, y el receptor de laurocinasa.

Regula la función del músculo liso vascular

La función del músculo liso vascular se regula a través de la síntesis y liberaciónde sustancias vasoactivas constrictoras, como las endotelinas y la renina-angioten-sina, y dilatadoras como el NO•, la prostaciclina, el factor hiperpolarizante deri-vado del endotelio y la bradicinina.

❚ EL ENDOTELIO EN EL PROCESO INFLAMATORIO

El endotelio juega un papel importante en los procesos inflamatorios. En estascondiciones, aumenta la producción de NO• y prostanoides vasodilatadores, porla inducción de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la cicloxigenasa 2(COX-2), en respuesta a la acción de las citocinas proinflamatorias. El factor de ne-crosis tumoral α (TNF-α) y la interleucina 1 (IL-1) son, in vivo, mediadores dela inflamación sistémica y de la respuesta inmunitaria, por lo que actúan sobre elendotelio vascular donde potencian la expresión de moléculas de adhesión y decitocinas. El TNF-α se une a su receptor, TNFR1, activando una cascada de seña-les mediada por proteínas cinasas, que culmina con la translocación del factor detranscripción nuclear NF-κB del citoplasma al núcleo. De esta forma se estimulala transcripción de las moléculas de adhesión selectina-E, ICAM-1, VCAM-1 ylas citocinas IL-6 e IL-8. La selectina-E media la interacción inicial de leucocitoscon el endotelio, la IL-8 activa la adhesión de los leucocitos cuya unión se pro-duce a ICAM-1 y otros ligandos en la superficie del endotelio. La expresión coor-dinada de estas moléculas produce una fuerte adhesión leucocitaria seguida demigración de estas células hacia los espacios tisulares. Los leucocitos y las célulasendoteliales activados liberan gran cantidad de especies reactivas de oxígeno

(ERO), mediadores del daño celular. El NO• producido en grandes cantidadesinhibe la respiración mitocondrial y daña al DNA, mediante la formación delperoxinitrito (ONOO–). En el endotelio, las ERO producen activación de la p38,la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) con la posterior fosforilaciónde la proteína de estrés térmico 27 (HSP27), moduladora de la respuesta intra-celular del citoesqueleto al estrés oxidativo.

❚ DISFUNCIÓN ENDOTELIAL

La generación de radicales libres del oxígeno, así como la activación de vías transcrip-cionales sensibles a oxidantes se ha propuesto como el mecanismo fisiopatológicocomún en el desarrollo de numerosas e importantes enfermedades vasculares.

Se considera que existe disfunción endotelial, cuando se producen trastornosen las funciones constitutivas del endotelio vascular. El funcionamiento de lacélula endotelial determina el control adecuado del tono vascular y del flujo san-guíneo local y sistémico. Por lo que la disfunción del endotelio vascular partici-pa, de manera importante, en la génesis y desarrollo de las condiciones anormalesen el funcionamiento del sistema cardiovascular (cuadro 27-2).

El daño oxidativo constituye un factor de importancia en la fisiopatología dela aterosclerosis y contribuye al proceso del envejecimiento. En situaciones de estrés oxidativo aumentado (hipercolesterolemia, tabaquismo, infección einflamación agudas o crónicas, entre otras) se activan genes que responden a con-diciones oxidativas y se sintetizan factores de crecimiento, citocinas y moléculasde adhesión que aumentan la interacción entre las células endoteliales y los leu-cocitos, estimulan el crecimiento de las células musculares lisas vasculares y par-ticipan en procesos de inflamación vascular y su remodelamiento.

La cantidad de ERO aumenta significativamente en el proceso de isquemia/reperfusión, proceso en el que participa activamente la enzima xantina oxidasacon la generación del radical superóxido (O2

•). Otro evento de importancia en lareperfusión es el influjo de neutrófilos, que son secuestrados rápidamente en lospequeños vasos del órgano pos-isquémico, mediante la expresión de moléculas deadhesión en la célula endotelial y los leucocitos. Estos últimos también contribu-yen al daño mediante la liberación de oxidantes, proteasas y elastasa, por la acti-vación de fosfolipasas y la liberación del factor activador de plaquetas (PAF) y delos leucotrienos. Una fuente importante de oxidantes es la reacción de Fentoncon la participación del hierro liberado debido a la lisis de los eritrocitos y de lascélulas parenquimatosas necróticas.

La localización del endotelio, en contacto directo con el flujo sanguíneo, haceque se convierta en blanco potencial de los oxidantes producidos por la propiacélula endotelial y los leucocitos polimorfonucleares, que se acumulan durante el


proceso inflamatorio. Aún en condiciones basales la célula endotelial produce ylibera cantidades significativas de peróxido de hidrógeno (H2O2). Durante situa-ciones anormales niveles los de esta ERO aumentan y contribuyen al daño de lacélula por su acción, per se, sobre estructuras celulares y por la generación delradical hidroxilo (•OH), después de su transformación en presencia de metalesde transición, el cual puede dañar directamente las proteínas, al DNA y los lípi-dos de la membrana, lo cual conduce a la muerte celular.

❚ LAS ERO Y LA MUERTE CELULAR POR APOPTOSIS EN EL ENDOTELIO

Después del proceso infeccioso-inflamatorio se produce una disfunción endote-lial transitoria con desbalance en la producción de sustancias vasopresoras/vaso-dilatadoras que puede ocasionar vasoespasmo y trombosis. Puesto que el estrésoxidativo ocasiona la pérdida de la capacidad de síntesis de la prostaciclina, quees una sustancia vasodilatadora, inhibidora de la agregación y adherencia plaque-tarias, así como un agente citoprotector regulador de la actividad de la ésteres decolesterol hidrolasa e inhibidor de la proliferación de la célula muscular lisa.

Por otro lado, el efecto citotóxico de las LDL oxidadas (LDLox) sobre las célu-las endoteliales está involucrado en el proceso de aterogénesis. Se reporta quebajas concentraciones de LDLox son potentes inductores de apoptosis en la célulaendotelial. Estos efectos citotóxicos explican, en parte, los cambios morfológicosde las células endoteliales y la pérdida de su alineamiento observada en la super-ficie de las lesiones ateroscleróticas. Estas alteraciones se asocian con un aumentode la adhesión plaquetaria, la deposición de fibrina y la formación de microtrom-bos; así como los trastornos en el tono vascular, procesos que producen alteracio-©

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CCuuaaddrroo 2277--22.. TTrraassttoorrnnooss yy ffaaccttoorreess ddee rriieessggoo rreellaacciioonnaaddooss ccoonn llaa ddiissffuunncciióónn eennddootteelliiaall

• Arterioesclerosis• Hipertensión• Insuficiencia cardiaca• Diabetes• Resistencia a la insulina• Obesidad• Tabaquismo• Deficit de estrogenos• Hiperhomocistinemia• Hipercolesterolemia hereditaria

nes vasculares locales y eventos trombóticos. Durante estos procesos aumentanlos niveles de los productos de la peroxidación lipídica y los isoprostanos.

El poder controlar a los factores que conducen al estrés oxidativo, así como laadministración de agentes protectores del endotelio vascular reducen, el riesgo depadecimiento de enfermedades cardiovasculares. Se considera que las vitaminasE, C y A, y la CoQ10 son antioxidantes y tienen efecto como protectores endote-liales reduciendo la morbilidad y mortalidad por enfermedades coronarias. Losantioxidantes limitan la progresión de las lesiones ateroscleróticas y mejoran laproducción y la acción del NO••. Además, la vitamina E regula la expresión demoléculas de adhesión e inhibe la función plaquetaria.

❚ EXPERIMENTOS REALIZADOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

En el laboratorio de los autores se estudia el efecto del H2O2 sobre las célulasendoteliales de la línea murina H5V. Así mismo se analiza el efecto protector dela proteína α-cristalina en las células endoteliales en contra del estrés oxidativo ydaño al DNA. La α-cristalina es la principal proteína del cristalino en los verte-brados, constituye alrededor de 40 a 50 % de su fracción proteínica soluble. Estácompuesta por 2 subunidades: aA-cristalina y aB-cristalina, con peso molecularde 20 kDa cada una. Estas subunidades forman agregados no covalentes, dinámi-


FFiigguurraa 2277--11.. Modelo de la estructura de la α-cristalina.

cos y heterogéneos, de peso molecular alrededor de 800 κDa (figura 27-1). Actúacomo chaperona frente a proteínas modificadas por el estrés térmico, los agentesquímicos desnaturalizantes, el daño inducido por oxidación o fotoxidación, comosucede en las condiciones de estrés oxidativo o irradiación ultravioleta. En ellente ocular su actividad chaperona es fundamental para mantener la solubilidady estabilidad de las otras cristalinas, lo que contribuye al mantenimiento de sutransparencia.

Asimismo, las proteínas de choque térmico son inducidas bajo situaciones deestrés y protegen a las estructuras celulares de cambios irreversibles, que afectansu funcionamiento. Se ha observado que el aumento de la expresión de las pro-teínas HSP27 y α-cristalina está relacionado con la protección de la célula, anteagentes inductores de la apoptosis.

❚ CONCLUSIONES

Ahora se sabe que las ERO juegan un papel importante en la regulación, así comoen el malfuncionamiento de las células endoteliales. Por lo que la búsqueda denuevos agentes protectores del endotelio vascular, así como el uso de antioxidan-tes no convencionales, abre un importante campo para la terapéutica de las enfer-medades cardiovasculares que constituyen en numerosos países, la primera causade incapacidad y muerte.

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EELL ÓÓXXIIDDOO NNÍÍTTRRIICCOO YY SSUU PPAAPPEELL

EENN EELL DDAAÑÑOO EENN EELL OOÍÍDDOO

Beatriz Aguilar MaldonadoGraciela Meza

❚ INTRODUCCIÓN

El óxido nítrico (NO•) es un mediador biológico con una gran variedad de fun-ciones en el organismo, tales como, la relajación muscular, la vasodilatación, laneurotransmisión y la defensa en contra de bacterias y de hongos. El NO• es sin-tetizado por una familia de enzimas llamadas NO-sintasas (NOS), que catalizanla oxidación del aminoácido L-arginina dando como producto el óxido nítrico y la L-citrulina, con la formación del intermediario N-hidroxil-L-arginina.

A la fecha, se han identificado tres isoformas de la NOS, las cuales difierentanto en su ubicación como en su regulación y en su función fisiológica: la iso-forma neuronal (nNOS o NOS-1) que se expresa constitutivamente en las neu-ronas del cerebro y en el sistema nervioso entérico; la isoforma endotelial (eNOSo NOS-3), la cual también es constitutiva y está confinada a las células endote-liales y plaquetas; por último, la isoforma inducible (iNOS o NOS-2), que seexpresa en respuesta a algunos estímulos inflamatorios como productos bacteria-nos (endotoxinas), citocinas y mediadores lipídicos y no depende de un incre-mento en la concentración de calcio. Una vez activada, la iNOS puede producir

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grandes cantidades de NO• por periodos prolongados; este incremento sostenidoen los niveles de NO• funciona como un mecanismo de defensa del organismo;sin embargo, en ciertas situaciones puede tornarse peligroso y causar daño enalgunos tejidos.

El óxido nítrico parece tener un papel paradójico en el organismo ya que suincremento o disminución puede conducir a un efecto fisiológico normal o pato-lógico, dependiendo de la ubicación y la enzima involucrada en su producción.Se ha sugerido que el NO• generado por la eNOS tiene un papel protector mien-tras que el inducido por la activación de la iNOS tiene un papel tóxico.

Uno de los órganos en los que el óxido nítrico tiene un efecto importante esel oído, a continuación se hará referencia, brevemente, en primer lugar a la ana-tomía y después al papel del óxido nítrico en la fisiología del oído.

❚ EL OIDO

El oído es el órgano responsable de la audición y del equilibrio. Está compuestopor mecanorreceptores que captan las vibraciones y las transforman en impulsosnerviosos que irán hasta el cerebro, donde los estímulos serán interpretados. Eloído se divide en tres zonas: externa, media e interna (figura 28-1).

El oído externo

Es la parte del aparato auditivo que se encuentra en posición lateral al tímpanoo membrana timpánica. Comprende la oreja o pabellón auricular (lóbulo exter-no del oído) y el conducto auditivo externo.

El oído medio

Se encuentra situado en la cavidad, cuya cara externa está formada por la mem-brana timpánica, o tímpano, que lo separa del oído externo. Incluye el mecanis-mo responsable de la conducción de las ondas sonoras hacia el oído interno. Eloído medio está en comunicación directa con la nariz y la garganta a través de latrompa de Eustaquio, que permite la entrada y la salida de aire del oído mediopara equilibrar las diferencias de presión entre éste y el exterior. Hay una cadenaformada por tres huesos pequeños y móviles (huesecillos) que atraviesa el oídomedio. Estos tres huesos reciben los nombres de martillo, yunque y estribo. Lostres conectan acústicamente el tímpano con el oído interno.


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El óxido nítrico y su papel en el daño en el oído • 425

El oído interno

También llamado laberinto, se encuentra en el interior del hueso temporal y con-tiene los órganos auditivos y del equilibrio, que están inervados por las fibras delnervio auditivo. Se compone de cinco órganos vestibulares: tres canales semicir-culares, un utrículo y un sáculo, los cuales son sensibles a aceleraciones angulares,lineales y de la gravedad y un solo órgano relacionado con la audición, el órganode Corti. La parte sensitiva de los canales se encuentra en las crestas vestibulares,porción más elevada de un estroma de tejido conectivo que forma un ensancha-miento o ampolla en la parte basal de aquéllos; la de los órganos otolíticos(utrículo y sáculo) en manchas o máculas ubicadas en la pared de éstos. La por-ción sensitiva de la cóclea la constituye el órgano de Corti, llamado también“órgano espiral” que se encuentra adosado a la membrana basilar, a todo lo largode la cóclea o caracol, en ella se distinguen una parte basal, otra media y la quese encuentra más elevada o apical (figura 28-2).

Martillo EstriboYunque

Meato externo

Oído medio

Tímpano

Ducto coclear

Trompa de

Eustaquio

Perilinfa

Cóclea

Sáculo

Utrículo

Nervio coclear

Meato interno

Ampolla

Conductos

semicirculares

Nervio vestibular

FFiigguurraa 2288--11.. El oído. Esquema que muestra los principales componentes del oído externo, medio e interno.


Perilinfa

Endolinfa

CálizBotonaferente

Terminal eferenteIII

Endolinfa

Membranatectoria

Célulapilosainterna

Túnel de Corti

Célulasen pilar

Perilinfa

Membrana basilar

Células de Deiters

12 3

Células pilosas externas

Limboespiral

Fibrasnerviosas

B

A

FFiigguurraa 2288--22.. AA)) Esquema del epitelio sensitivo vestibular, se muestran las células pilosas tipo I y II.BB)) Esquema del epitelio sensitivo coclear, se muestran las células pilosas externas e internas.

En el epitelio sensitivo de las crestas y en las máculas se encuentran las célu-las sensitivas pilosas vestibulares que, por su forma, han sido clasificadas en tipoI y II, la primera con forma de botella y la segunda alargada y cilíndrica (figura28-2). Las células pilosas del órgano de Corti son de dos tipos, las internas y lasexternas, llamadas así por su localización con respecto al modiolo.

La célula pilosa es el receptor sensorial común de los órganos vestibulares y losde la audición. Los estímulos son detectados por estructuras accesorias dentro decada tipo de órgano, lo que resulta en deflexiones de los haces de pelos sensoriosde las células pilosas. Estos pelos sensorios tienen un arreglo anatómico compli-cado e idóneo para la realización de sus funciones. Una deflexión de ellos cam-bia las propiedades mecánicas de elementos elásticos que los componen y que seencuentran en el ápice, lo que resulta en un aumento en la probabilidad de aper-tura de los canales iónicos, llamados canales de transducción. La corriente iónicaresultante altera el potencial de membrana de la célula pilosa, lo que a su vezopera canales iónicos sensibles a calcio y a voltaje transformándolo en potencialde receptor. Este último conduce a una comunicación química de naturalezaexcitadora con la neurona aferente primaria.

❚ LOCALIZACIÓN DE LAS SINTASAS DE ÓXIDO NÍTRICO EN EL OÍDO

Utilizando técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas, se ha demostrado lapresencia de las isoformas nNOS (NOS-1) y la eNOS (NOS-3), tanto en la có-clea como en el órgano de Corti de algunos mamíferos. La isoforma eNOS se en-cuentra ampliamente distribuida en todas las estructuras de la cóclea, mientrasque en el órgano de Corti se encontró principalmente la isoforma nNOS. Tantoen el epitelio del vestíbulo como en la mácula del utrículo y del sáculo se hanlocalizado las isoformas nNOS y la eNOS. En el oído interno en condiciones nor-males no se ha encontrado la presencia de la isoforma iNOS (NOS-2), únicamen-te bajo condiciones patológicas tales como la inoculación de polisacáridos, degentamicina o cisplatino, en el envejecimiento o después de una reacción infla-matoria, ha sido posible detectar la expresión de esta isoforma de la NOS, lo quesugiere que juega un papel importante en el daño del oído interno.

La detección directa del óxido nítrico en el oído ha coincidido con la localiza-ción de la isoforma de la NOS.

❚ IMPORTANCIA FUNCIONAL DEL ÓXIDO NÍTRICO EN EL OÍDO

Aunque el óxido nítrico es un radical libre, no es tóxico para las células en con-centraciones fisiológicas debido a que su modo de acción es relativamente lento©

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y puede ser eficientemente inactivado. Sin embargo, su sobreproducción puedellevar a la muerte celular. A nivel del oído, el óxido nítrico tiene un papel muyimportante tanto en la regulación de las reacciones fisiológicas como en algunaspatologías. A continuación se revisará la información inherente a cada una de laspartes del oído.

Oído medio

En la otitis media se ha demostrado la presencia de metabolitos del NO• en lassecreciones del oído medio, observadas en este tipo de enfermedad. Además,tanto en experimentos in vitro como in vivo se ha encontrado que la producciónde mucina se incrementa con la presencia de un donador de NO• (dinitrato deisosorbida, ISDN) y que dicho incremento es bloqueado por la adición de inhi-bidores de las NOSs como la NG-monometil-L-arginina (L-NMMA) y el N-nitro-L-arginin-metil-éster (L-NAME). Se ha sugerido entonces que, el NO•

modifica la permeabilidad de los vasos sanguíneos, la transudación de suero en lamucosa y el movimiento del fluido extracelular a través del epitelio del oídomedio. Aunque la evidencia indica que el NO• actúa como un mediador en lainflamación al incrementar la permeabilidad vascular en el oído medio y la secre-ción de mucina en la otitis media, el papel exacto del NO• en la patogénesis dela inflamación del oído medio y el daño coclear todavía no ha sido determinado.Sin embargo, la modulación de las vías involucradas en la estimulación de la pro-ducción de mucina inducida por el NO• podría ofrecer posibilidades terapéuti-cas en este desorden.

Oído interno

Existe suficiente evidencia de la participación de la vía NO•/cGMP en la regula-ción del flujo sanguíneo de la cóclea. Para ello se han aplicado directamente enla membrana redonda sustancias donadoras de NO•, como la espermina-óxidonítrico (SPNO) y la S-nitroso-N-acetil-penicilamina (SNAP), observándose unincremento en el flujo sanguíneo coclear. Por otro lado, cuando se aplicó el L-NAME, un inhibidor de las NOS, se vio una disminución del flujo sanguíneo enla cóclea. Estos datos sugieren que la producción de óxido nítrico en la vascula-tura de la cóclea tiene gran importancia en la regulación del flujo sanguíneo eneste sitio. En condiciones fisiológicas, la producción de NO• puede darse tambiénpor la estimulación hormonal. En el órgano de Corti, la sobreestimulación de losreceptores para glutamato, así como también la isquemia, degeneran las conexio-nes aferentes a las células pilosas internas resultando en una elevación del umbral


del potencial de acción del nervio auditivo. Estas alteraciones se han adjudicadoal incremento en los niveles de NO•, debido a que cuando se aplicó tópicamen-te un donador de NO• como el nitroprusiato de sodio, se encontraron daños mor-fológicos en las células pilosas internas y externas de la cóclea. El posiblemecanismo por el cual el NO• media la excitotoxicidad en la cóclea se muestraen la figura 28-3. El glutamato es liberado después de una estimulación acústica delas células pilosas internas y activa a los receptores para glutamato presentes en lasdendritas aferentes. Luego, hay una entrada de calcio a través de canales de cal-cio acoplados a receptores para NMDA y activa a la NOS. Una sobreestimula-ción acústica conduce a una sobreproducción de NO•, la cual puede reaccionarcomo un radical tóxico en el sitio de su producción y en un momento dado, cau-sar daño celular.

Se ha sugerido también que la alteración en el flujo sanguíneo coclear causa-da por el cambio en los niveles de NO•, contribuye a ciertas formas de pérdida©

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GLUR

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G G

G

G G G G G

NO

Sobreesti m ulación acústica

Sobreproducción de óxido nít r ico

D A

CPI

D A

CPI

FFiigguurraa 2288--33.. Mecanismo propuesto para la excitotoxicidad coclear. El óxido nítrico (NO•) puedemediar la excitotoxicidad causada por el glutamato liberado de las células pilosas internas (CPI).En esta hipótesis, el glutamato (G), liberado después de la estimulación acústica, activa a sus recep-tores (GLUR) presentes en las dendritas aferentes (DA). El calcio entra a las células y activa a laóxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) para producir NO•. La sobreestimulación acústica induceuna sobreproducción de NO• causando la degeneración de las dendritas aferentes y con ello la exci-totoxicidad.

auditiva súbita, así como también a otros desórdenes auditivos como el tinnitusy la enfermedad de Ménière.

Vestíbulo

A nivel vestibular, se ha sugerido que el NO• tiene un papel importante en elmantenimiento de la endolinfa y la homeostasia iónica. Se han encontrado lasisoformas eNOS y nNOS tanto en las células sensitivas como en las células gan-glionares y en las células epiteliales. La isoforma inducible de la NOS no ha sidodetectada en condiciones fisiológicas, únicamente cuando por ejemplo, se inocu-lan polisacáridos bacteriales en el órgano vestibular o por aplicación de amino-glucósidos como la gentamicina o también en daño coclear inducido por anoxialocal. La iNOS, una vez activada, puede producir grandes cantidades de NO• portiempos prolongados, lo cual conduciría a daño en el oído interno. Si la activaciónde mecanismos dependientes de NO• es bloqueada por inhibidores apropiados opor secuestradores de radicales libres, entonces el oído podría ser protegido dealgunos procesos degenerativos.

❚ DAÑO EN EL OÍDO CAUSADO POR AMINOGLUCÓSIDOS

Los aminoglucósidos son antibióticos que fueron desarrollados en el decenio de1940-49, para tratar infecciones causadas por bacterias Gramnegativas que norespondían a los antibióticos convencionales, como la penicilina. En este grupo seencuentran incluidos la estreptomicina, la kanamicina, la tobramicina, la neomi-cina, la gentamicina y la amikacina entre otros. Todos ellos muestran cierto gradode ototoxicidad aunque varían en el daño que producen a nivel de la cóclea o elvestíbulo.

Se ha postulado que el paso inicial para la ototoxicidad de los aminoglucósi-dos es la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) que, como puntofinal, lleva a la muerte celular. En este proceso, se ha observado que los amino-glucósidos forman un complejo con el hierro, el cual reacciona entonces con algu-nos ácidos grasos insaturados para formar radicales superóxido (O2

•), y peróxidosde lípidos. Normalmente, el O2

• es convertido a peróxido de hidrógeno (H2O2)por la superóxido dismutasa (SOD) y detoxificado en agua y oxígeno mediantela catalasa. Sin embargo, cuando existen grandes condiciones oxidativas, las víasantioxidantes endógenas se sobrepasan y entonces los radicales libres pueden lle-gar a ser abundantes (figura 28-4). Los aminoglucósidos como la gentamicina,pueden activar a la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en el tejido del oídointerno, causando un incremento en los niveles de NO•. Bajo estas condiciones el


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P er o xidación

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Radical Carbono

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Mue r te Celular

Mue r te Celular

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O 2

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FFiigguurraa 2288--44.. Mecanismo propuesto para la muerte celular en la cóclea inducida por los aminoglu-cósidos. Los aminoglucósidos (AG) forman complejos ternarios con el hierro (Fe2+) y con los lípi-dos de la membrana celular, incluyendo al fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) y al ácidoaraquidónico (AA). El complejo AG-PIP2-Fe2+ puede ser oxidado por el oxígeno molecular paraproducir el anion superóxido (O2

•). Este último puede reaccionar con otros componentes celula-res o formar peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual al reaccionar con el complejo de Fe2+ puedeproducir radicales hidroxilo (•OH). Los radicales •OH pueden reaccionar con el AA en el comple-jo AG-Fe2+ para producir radicales de carbono que pueden directamente iniciar la peroxidación, ocombinarse con el O2 para formar radicales peroxilo con el AA.

O2• puede reaccionar con el NO• presente para formar el peligroso radical pero-

xinitrito (ONOO–) o puede directamente iniciar la muerte celular. Además,recientemente se ha encontrado evidencia que sugiere que los genes para laexpresión de algunas enzimas antioxidantes podrían ser regulados negativamen-te por los aminoglucósidos; por ejemplo, en cultivos del órgano de Corti expues-tos a la gentamicina se observó una reducción de 2 veces en la transcripción delgen de la catalasa.

Los aminoglucósidos causan daño preferencialmente en las células pilosasexternas del órgano de Corti y en las células pilosas vestibulares tipo I (figura 28-2).De manera interesante, las células de soporte y las pilosas internas del órgano deCorti no resultan frecuentemente afectadas. Esto podría deberse a diferencias enla activación y translocación del factor nuclear NFkB, el cual se ha visto implicadoen la señalización celular inducida por la activación de las ERO. La administraciónsistémica de kanamicina en ratas, mostró un incremento de la peroxidación de lípi-dos en todos los tipos celulares del órgano de Corti; además, esto fue acompañadopor un incremento en los niveles del NFkB en el núcleo de las células pilosas inter-nas y en las células de soporte del órgano de Corti. Sin embargo, el NFkB estuvoausente en el núcleo de las células pilosas externas, indicando que este factor nucle-ar es translocado al núcleo de las células resistentes a la kanamicina, pero no en lascélulas sensibles a este antibiótico.Además, la coadministración de salicilatos o 2,3-dihidroxibenzoato, facilitó la translocación del NFkB al núcleo de las células pilo-sas externas y las protegió del daño celular inducido por la kanamicina.

Por otro lado, las células pilosas externas tienen una menor capacidad antioxi-dante comparada con la de otros tipos celulares del órgano de Corti. El nivel deglutatión (GSH) en las células pilosas externas es menor que el observado enotras células del órgano de Corti y además en ellas existe un gradiente del nivelde GSH desde la base al extremo apical de la cóclea. En la porción apical de lascélulas pilosas externas existen niveles mucho más altos de GSH que en la porciónbasal. Los aminoglucósidos originan daño en estas células en la región basal de lacóclea y puede ser un daño progresivo hacia la porción media o apical de ésta.

Se ha postulado que un exceso de ERO puede ocasionar muerte celular porapoptosis, y los aminoglucósidos han sido relacionados de manera directa coneste evento.

❚ ESTUDIOS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES Y CONCLUSIONES

La estreptomicina (STP) es el antibiótico aminoglucósido antibacteriano másefectivo, pero sus efectos ototóxicos a largo plazo son devastadores. En el labora-torio de los autores, recientemente, se descubrió la presencia de un derivadometabólico de la STP, la estreptidina (STD) (figura 28-5) la cual se produce por


hidrólisis de la primera, quedando libre para actuar en el torrente sanguíneo depacientes tratados con la STP.

Debido a que la STD posee 2 grupos guanidino, se ha sugerido que la STDpodría ingresar a las células del oído a través de un acarreador de arginina. Demanera interesante, se ha observado que el tratamiento con la STP causa acumu-lación de STD en las células del oído. Por otro lado, también se ha encontradoque la actividad de la NOS inducible se encuentra incrementada con la adminis-tración de aminoglucósidos.

Lo anterior puede sugerir que el daño en el oído inducido por este tipo de anti-bióticos, podría deberse a la formación de NO• derivado de los grupos guanidinode la STD y que dicha reacción podría ser catalizada por la isoforma induci-ble de la NOS.

❚ AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Dra. Yolanda Saldaña Balmori la información proporcionadaacerca del metabolismo del óxico nítrico.©

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Hidrolisis

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Estreptomicina

Estreptidina

FFiigguurraa 2288--55.. La estreptomicina produce estreptidina por hidrólisis en el suero de pacientes trata-dos con el antibiótico, mediante un mecanismo no conocido todavía. A su vez la estreptidina puedeactuar como donador de NO•.

❚ REFERENCIAS

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EESSTTRRÉÉSS OOXXIIDDAATTIIVVOOYY RREETTIINNOOPPAATTÍÍAASS

Rocío Salceda Sacanelles

❚ INTRODUCCIÓN

La visión es uno de los procesos sensoriales de mayor relevancia en los organis-mos en general, y en el hombre, en particular. Por medio de la visión conocemosel mundo que nos rodea y podemos responder a una variedad de condiciones, porlo que alteraciones en el sistema visual causan incapacidad y pérdida de la pro-ductividad. De particular relevancia son las alteraciones que se presentan en laretina, ya que este órgano localizado en el fondo del ojo, recibe la luz y la con-vierte en señales eléctricas que son procesadas y enviadas al cerebro, en el que seanalizan y se construye el mundo visual.

El daño iniciado por los radicales libres se ha implicado en la etiología de ungran número de enfermedades inflamatorias y degenerativas, incluyendo las reti-nopatías. La descripción de la generación de radicales libres y las reacciones queprevienen o disminuyen su toxicidad se revisó en los capítulos anteriores, por loque en se tratará únicamente del daño que ocurre en la retina como resultado delestrés oxidativo.

29

❚ ASPECTOS GENERALES DE LA VISIÓN

La retina

La luz entra al ojo a través de la pupila y es enfocada por el cristalino en la reti-na (figura 29-1). Este órgano es la capa más interna del ojo, se localiza entre losvasos de la coroides y el humor vítreo. La retina está formada por varias capas decélulas nerviosas comunicadas en circuitos y una monocapa de células epiteliales(epitelio pigmentario de la retina, EPR). Este epitelio recubre el fondo del ojo ymantiene la composición iónica del fluido que rodea a los fotorreceptores, reci-cla la vitamina A, selecciona y transporta nutrientes de los vasos de la coroides,los cuales yacen inmediatamente atrás del epitelio. El EPR, como su nombre loindica, contiene gránulos de melanina que absorben el exceso de luz que llega ala retina, favoreciendo la calidad de la imagen en la misma.

Los cuerpos o somas de las neuronas forman la capa nuclear externa (célulasfotorreceptoras), la capa nuclear interna (células bipolares, horizontales, amacrinase interplexiformes ) y la capa de células ganglionares. Estas neuronas se comunicanentre sí en dos capas sinápticas, externa e interna. Los axones de las células gan-glionares forman el nervio óptico que se dirige al cerebro (figura 29-2).


Nervioóptico

Pupila

Iris

Córnea

Cristalino

Retina

Coroides

FFiigguurraa 2299--11.. Esquema general del ojo de los vertebrados.

La luz que llega a la retina es capturada por los fotorreceptores, ccoonnooss y bbaass--ttoonneess, llamados también células visuales. Los bastones son responsables de lavisión en condiciones de luz tenue y los conos en condiciones de luz brillante yla visión de color.

Fotorreceptores

Cada fotorreceptor tiene un apéndice llamado segmento externo, el cual contie-ne proteínas especializadas que absorben la luz y amplifican la señal. El segmen-to externo de los fotorreceptores está formado por cientos de sacos membranososaplanados, acomodados uno sobre otro y denominados ddiissccooss (figura 29-3), loscuales tienen una alta concentración de la proteína rrooddooppssiinnaa (pigmento visual).

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Estrés oxidativo y retinopatías • 437

Sinápticaexterna

Nervioóptico

Sinápticainterna

Luz

RR R

R RR

R RR

H

BBBB

BB

A

G G G G

A

FFiigguurraa 2299--22.. Estructura de la retina. IIzzqquuiieerrddaa,, esquema que muestra la estructura y células de laretina. DDeerreecchhaa,, corte histológico de la retina humana en la que se observa su estructura estratifi-cada. A, células amacrinas; B, células bipolares; G, células ganglionares; H, células horizontales; R,células fotorreceptoras.

La ffoottoottrraannssdduucccciióónn es el proceso por el que la energía luminosa se convierteen un estímulo nervioso. En la oscuridad, la membrana del fotorreceptor se man-tiene despolarizada debido a que en su segmento externo existe una corrientecatiónica, denominada corriente oscura. Los iones fluyen a lo largo de la célula yson expulsados de la célula en el segmento interno. La luz absorbida por larodopsina isomeriza a su cromóforo de la forma 11-cis retinal a la todo-trans reti-nal, lo cual inicia una cascada de señalización que culmina con la disminución dela concentración del monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) el cual moduladirectamente la corriente oscura. La disminución en la concentración de cGMPcierra los canales catiónicos del segmento externo del fotorreceptor y en conse-


Epiteliopigmentario

Discos

Segmento interno

Terminal sináptica

Segmento externo

FFiigguurraa 2299--33.. Esquema que muestra la estructura de las células fotorreceptoras y su relación con elepitelio pigmentario de la retina.

cuencia la membrana de la célula se hiperpolariza; esta señal pasa a las siguien-tes neuronas de la retina.

Las membranas de los fotorreceptores están enriquecidas en fosfolípidos com-puestos de ácidos grasos poliinsaturados, en especial una alta proporción de ácidodocosahexaenoico (22:6, n-3) el cual contiene 22 carbonos y seis dobles ligadu-ras, n-3 indica la posición del primera doble ligadura a partir del grupo metilo ter-minal. Este ácido graso es el producto final de una serie de elongaciones ydesaturaciones del ácido linolénico(18:2, n-3). Otro ácido graso abundante en losfosfolípidos de los fotorreceptores es el ácido araquidónico (20:4, n-6), éste deri-va de otro ácido graso esencial, el linoléico (18:2, n-6) y es precursor de prosta-glandinas y leucotrienos.

Los segmentos externos de los fotorreceptores son continuamente renovadoscon nuevos discos membranosos que se adicionan en la base del segmento externoy los extremos distales son fagocitados por el EPR. Los fotorreceptores sintetizancerca del 10% de su segmento externo cada día. Experimentos de autorradiogra-fía demostraron que amino ácidos radiactivos recién incorporados a la rodopsina,forman una banda discreta en la base del segmento externo y con el tiempo labanda migra hacia la región distal. En contraste a la proteína, los lípidos son reno-vados por reemplazamiento molecular; el glicerol y los ácidos grasos radiactivosmostraron un marcaje difuso a lo largo de los segmentos externos, resultados queindican que el recambio de lípidos es más rápido que el de las proteínas. Sinembargo, el recambio del ácido docosahexaenoico parece ser muy lento, ya quepara disminuir sus niveles en la retina se requiere de una deficiencia prolongadaen la dieta.

El recambio continuo que ocurre en las membranas de los fotorreceptoresincrementa la relevancia de estos lípidos como precursores de la biogénesis de lasmembranas, ya que sus precursores son secuestrados de la circulación sanguínea ylos cambios en esta acumulación pueden contribuir a la degeneración de las célu-las visuales. La retención de estos ácidos grasos depende también de la proteccióndel tejido contra la peroxidación. Los ácidos grasos poli insaturados son muy sus-ceptibles a destrucción por conversión a peróxidos. La retina tiene varios meca-nismos que protegen contra el daño oxidativo de los componentes lipídicos de lamembrana. Se han demostrado niveles elevados de antioxidantes, como la vita-mina E y las enzimas glutatión peroxidasa (GPx), superóxido dismutasa (SOD)y catalasa (CAT), en la retina de varias especies.

Las dobles ligaduras del ácido docosahexaenoico se han asociado a la elevadafluidez de la membrana de los discos de los fotorreceptores. Debido a que enestas células existen otros ácidos grasos con menor número de dobles ligaduras,los cuales aumentan eficientemente la fluidez de la membrana, se considera queel ácido decosahexaenoico puede tener otras funciones adicionales, por ejemplocomo precursor de otras moléculas o segundos mensajeros. De hecho se demos-©

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tró que en la retina, el ácido decosahexaenoico es substrato de una lipo oxigena-sa que produce compuestos hidroxilados llamados docosanoides, que actúancomo señales intracelulares de manera semejante a como lo hacen los eicosanoi-des, formados por lipo oxigenasas que actúan sobre el ácido araquidónico. El te-jido retiniano responde a estímulos fisiológicos y patofisiológicos por la activaciónde fosfolipasas y consecuente liberación de segundos mensajeros. Así, por la acti-vación de la fosfolipasa A2 se forman eicosanoides y un factor activador de pla-quetas (PAF) los cuales se acumulan en la retina en respuesta a daño. Loseicosanoides, en particular los prostanoides, el tromboxanoA2 (TXA2) y el PAFse generan abundantemente después del estrés oxidativo y contribuyen al dañoneovascular. Éstos inducen directamente la muerte de las células endoteliales ypotencialmente pueden contribuir a la patogénesis de retinopatías isquémicas.

❚ ÓXIDO NÍTRICO

El óxido nítrico (NO•) es un radical libre presente en diversos tejidos, incluyendola retina, el cual puede combinarse con el anión-radical superóxido (O2

•) forman-do al peroxinitrito (ONOO–). Adicional a la producción de especies reactivas deoxígeno (ERO), se demostró que el NO• juega un papel importante en la reti-na. La administración intraperitoneal de L-NAME (N-nitro-L-arginina metilester), un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS), protegió a las células foto-rreceptoras del daño causado por la luz.

Asimismo, se demostró con estudios inmunohistoquímicos que el NO• aumentaen la retina durante la diabetes. La muerte de los fotorreceptores puede atribuirseo exacerbarse por el efecto de radicales de NO• y/o también por su efecto estimu-lador de la actividad de la guanilato ciclasa en los fotorreceptores, modificando lasconcentraciones de cGMP y como consecuencia el proceso de fototransducción.

❚ PATOLOGÍAS

Los altos requerimentos de oxígeno y constante exposición a la luz, hacen de laretina y particularmente a los fotorreceptores, blancos vulnerables del estrés oxi-dativo. El estrés oxidativo se ha relacionado con varias alteraciones retinianas talescomo el incremento en la permeabilidad vascular, disminución en el flujo sanguí-neo y el engrosamiento de las membranas basales. El incremento en la producciónde ERO está combinado con una perturbación de las defensas antioxidantes. Efec-tivamente, la administración de antioxidantes a animales de diversos modelosexperimentales, inhibe el desarrollo de las lesiones características de la retinopa-tía. El radical O2

• es de particular interés porque puede reaccionar con el NO•


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produciendo ONOO–, el cual produce citotoxicidad debido a la peroxidación delípidos, inactivación de enzimas por la oxidación de los grupos sulfhídrilos, nitra-ción de tirosinas y daño del DNA mitocondrial. En las degeneraciones retinianas,particularmente las hereditarias, ocurre una destrucción de las membranas de losfotorreceptores, que lleva a la alteración de la función de las células visuales y posi-blemente a la ceguera. La muerte apoptótica en las células de la retina es un eventocomún en complicaciones oculares que incluyen retinopatía diabética, glaucoma,degeneración macular y daño isquémico. Asimismo, en los años recientes se haexplicado la cataratogénesis como resultado de un daño oxidativo. La catarata sedefine como la opacidad del cristalino, el cual es un órgano complejo, avascular,transparente que tiene como función enfocar las imágenes en la retina.

Daño causado por la luz

Se conoce ampliamente que la exposición prolongada a la luz o las altas intensi-dades luminosas produce muerte de las células visuales. La luz y el oxígeno sonesenciales para la visión, pero son también elementos que favorecen la formaciónde ERO que llevan al daño fotoquímico. Mientras que los mecanismos de foto-transducción se han determinado detalladamente, poco se conoce sobre losmecanismos a través de los cuales la luz produce daño. Sin embargo, el daño esmenor cuando se administran antioxidantes naturales o sintéticos, por lo que sesugiere que la exposición a la luz genera reacciones oxidativas. Existen estudiosque indican que la luz causa daño oxidativo en el DNA, porque los niveles de 8-hidroxi desoxi-guanosina (8-oxodGuo o 8-OHdG) se elevaron y el tratamientocon el antioxidante dimetil tiourea, redujo la ruptura del DNA. Los efectos queproduce la luz brillante están asociados a un incremento en la peroxidación delípidos, los cuales causan la apoptosis de los fotorreceptores de la retina del ratón,a través de regular el mRNA y la proteína del factor nuclear kappa β (NF-kβ), asícomo la vía de la caspasa 1. Una mayor susceptibilidad al daño causado por la luzse observó en una cepa de rata con una mutación autosómica que la hace deficien-te en la síntesis del colesterol. Asimismo, una mayor susceptibilidad se ha obser-vado como resultado de mutaciones específicas en el gen de la rodopsina, sinembargo la relación entre la rodopsina y la peroxidación de lípidos no se conoce.

La retinopatía diabética

La hiperglucemia se conoce como la principal causa del desarrollo de la retino-patía diabética. Aunque el mecanismo exacto se desconoce, la hiperglucemiapuede llevar a complicaciones vasculares que incluyen la fragilidad capilar, resul-


tando en microangiopatías. Ésta es una de las consecuencias más serias de la dia-betes, su gravedad radica en que las modificaciones producidas en la funciónvisual son irreversibles. Varios estudios han reportado un claro incremento en laconcentración de ERO en la retina de los animales diabéticos, aumento que se hacorrelacionado con una elevación en la peroxidación de lípidos de la membrana.Si bien la retinopatía diabética se caracteriza por un engrosamiento de la membra-na basal de los capilares y un aumento de la permeabilidad de los mismos, estudiosposteriores han demostrado modificaciones en el registro electrorretinográfico,indicando que las células fotorreceptoras e interneuronas se alteran. Aunque lapatogénesis de esta enfermedad aún no se conoce, está relacionada con la forma-ción de radicales libres de oxígeno, los cuales reaccionan preferentemente conlípidos insaturados llevando a la formación de radicales lipoperoxido, induciendoun proceso oxidativo que lleva a la lisis de las membranas, que a su vez lleva a ladesorganización de los discos de los fotorreceptores y el daño o muerte de éstos.Para demostrar la participación del estrés oxidativo se han llevado a cabo experi-mentos en distintos modelos animales de diabetes tipo 1 y 2, caracterizados porla disminución o ausencia de insulina y por resistencia a la misma, respecti-vamente. Estos estudios han revelado que existen varias fuentes potenciales deradicales libres que pueden ejercer diferentes grados de estrés oxidativo. La glu-cosilación de proteínas por la vía de Amadori parece incrementar su susceptibi-lidad al ataque de radicales hidroxilo (•OH). Por una serie de reacciones dereacomodo, los productos de Amadori pueden formar una familia de productosfinales de glucosilación avanzada, los que se piensa pueden formarse en proteí-nas, ácidos nucleicos, membranas y dañar el tejido por entrecruzamiento proteina-proteina, tal es el caso de la opacidad del cristalino.

La retinopatía del prematuro

La retinopatía del prematuro es un desorden de la maduración vascular manifes-tado por una proliferación anormal de los vasos en la retina inmadura de uninfante prematuro. La proliferación de nuevos vasos en el vítreo puede llevar a latracción circunferencial y desprendimiento irreversible de la retina. El dañopuede incrementarse por la administración terapéutica de oxígeno en exceso, sinembargo el monitoreo continuo de oxígeno presenta poco beneficio. De manerasemejante, la exposición a altas concentraciones de oxígeno resulta en una pro-nunciada degeneración de las células visuales y la pérdida del electrorretinogra-ma. La vulnerabilidad de los fotorreceptores al oxígeno se estudió en ratasexpuestas a diferentes concentraciones de oxígeno (hipoxia, normoxia) y diferen-tes grados de hiperoxia. Tanto la hipoxia como la hiperoxia causaron muerte delas células fotorreceptoras.


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La degeneración macular

La degeneración macular se caracteriza por la pérdida gradual de la visión cen-tral de la retina (fóvea o mácula). Aunque la apariencia de la retina varía, en lamayoría de los casos se acumulan partículas que impiden la visión; en otros casos,nuevos vasos de la coroides penetran al EPR y proliferan o sangran debajo de lafóvea, lo que resulta en una rápida pérdida de la visión. Frecuentemente se aso-cia a la pérdida de las células del epitelio pigmentario. En la mácula existen pig-mentos derivados de los carotenos y las xantofilas, cuya actividad antioxidante esespecialmente efectiva a presiones bajas de oxígeno, como es el caso de las neu-ronas de la retina. Los principales pigmentos son la zeaxantina y luteína, éstos seencuentran concentrados en las fibras nerviosas y la disminución en su concen-tración se correlaciona con el riesgo de que ocurra la degeneración macular. Estu-dios recientes demostraron que la luteína ejerce un efecto anti inflamatorio através de inhibir las señales dependientes de NF-kβ.

❚ ANTIOXIDANTES Y RETINOPATÍAS

Ascorbato

El ascorbato es un antioxidante natural presente en los tejidos y el plasma, esen-cial en la eliminación de los radiaclaes libres, además de ser un cofactor en elmetabolismo de las catecolaminas, en la síntesis de neuropéptidos y de la coláge-na (véanse los capítulos: Potencial antioxidante del ácido ascórbico y Aspectosnutriológicos de la vitamina C).

En la retina, la ausencia de ascorbato o cambios en el estado redox del ascorba-to en estadios tempranos de la diabetes son consistentes con modificaciones en losniveles de glutatión (GSH) y la relación GSSG/GSH. Tomando en consideraciónla capacidad del ascorbato para proteger al α-tocoferol en contra de la oxida-ción producida por los radicales libres, resulta interesante que en la retina las con-centraciones de ascorbato son diez veces mayores que los de la vitamina E,aunque éste parece ser insuficiente para prevenir el aumento en la peroxidaciónde lípidos. Sin embargo, la incidencia de retinopatía diabética se correlaciona direc-tamente con bajos niveles de ascorbato en el suero. Cierta protección contra el dañocausado por iluminación se consigue con suplementación de ascorbato en la dieta.

Vitamina E

El papel del α-tocoferol en el metabolismo del oxígeno y su función en las mem-branas como un protector de la oxidación por radicales libres se ha documenta-


do ampliamente (véanse los capítulos, Potencial antioxidante del α-tocoferol yAspectos nutrológicos de la vitamina E). En la retina existen altas concentracio-nes de vitamina E. Se tiene evidencia que dietas carentes de esta vitamina pro-ducen cataratas y muerte de las células visuales y del EPR. Asimismo laadministración diaria de esta vitamina causa estabilización de las membranas liso-somales del EPR en ratas RCS, un modelo animal de distrofia retiniana heredita-ria, en la que se presenta un defecto en las membranas lisosomales que lleva a laliberación extracelular de enzimas líticas como la catepsina y fosfatasa ácida querompen las membranas de los fotorreceptores.

Cinc

Se considera que el estrés oxidativo juega un papel importante en la patogénesisde la degeneración macular. En estudios clínicos se observó que la administraciónoral de cinc sólo o suplementado con antioxidantes reduce significativamente elriesgo de la progresión de la degeneración macular. Más aún, es un mejor protec-tor que el β-caroteno y las vitaminas C y E. Estos estudios sugieren una funciónadicional a la de defensa antioxidante. Se ha propuesto que el cinc ejerce efectosdirectos e indirectos en la función de los antioxidantes. El cinc puede estabilizarlos grupos sulfhídrico de las proteínas por unirse directamente a estos grupos oen sitios adyacentes actuando sobre estos grupos o en otros sitios causando cam-bios conformacionales que secuestren los grupos sulfhídrico; puede tambiénantagonizar la catálisis de metales de transición como el cobre y el hierro en lavía de las reacciones de Fenton, inhibiendo así la producción de especies reactivasde oxígeno. Asimismo puede inducir enzimas que actúan como antioxidantestales como la catalasa y las metalotioneinas.

❚ CONCLUSIONES

El hecho de que la retina tenga altos requerimientos de oxígeno y sea sumamen-te sensible a la falta de éste, la hace particularmente vulnerable al estrés oxidati-vo y al daño por ERO. Aún y cuando no se conoce con exactitud la etilogía de lasretinopatías, existen muchos estudios que apoyan la participación de las ERO, sinembargo, todavía deben realizarse más experimentos para esclarecer este tipo defenómenos.

La autora agradece el apoyo de CONACYT, proyecto 45840.


❚ REFERENCIAS

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EELL EESSTTRRÉÉSS OOXXIIDDAATTIIVVOOEENN EELL EENNVVEEJJEECCIIMMIIEENNTTOO

Norma Edith López Diazguerrero

❚ INTRODUCCIÓN

Una cuestión que siempre ha intrigado a los seres humanos es el hecho de quecada especie tenga un tiempo máximo de vida. Por ejemplo, lo máximo que haalcanzado a vivir un humano hasta ahora se ha estimado en 121 años. El tiempode vida de las tortugas es aproximadamente de 150 años, la de un perro domés-tico es de 20 años y la de la mosca de la fruta es de 3 meses. De manera naturaly previa a la muerte de casi todas las especies animales, se ha visto un proceso dedeterioro general, paulatino e irreversible, que comienza después de la madurezreproductiva. A este periodo se le conoce como envejecimiento. Así mismo, se haobservado que no existen patrones de envejecimiento idénticos entre dos indi-viduos de una misma especie. Lo que ha llevado a suponer la existencia de ge-rontogenes y/o genes de longevidad, que junto con factores ambientales ymetabólicos, tanto endógenos y exógenos, influyen sobre el envejecimiento y lalongevidad. Entre estos factores se encuentra de manera importante el estrés oxi-dativo.

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❚ ENVEJECIMIENTO

El envejecimiento se puede definir como un fenómeno biológico complejo e ine-vitable que se relaciona con el decaimiento o la pérdida de las capacidades fisio-lógicas, bioquímicas y estructurales de un organismo. El deterioro progresivo y lareducida capacidad para responder a los estímulos ambientales en el envejeci-miento conducen a la morbilidad y finalmente a la muerte.

En los últimos años se ha incrementado la expectativa de vida en la poblaciónhumana, lo que ha traído consigo un aumento relativo en la incidencia de enfer-medades asociadas al envejecimiento, como los desórdenes neurodegenerativos, lasneoplasias y las enfermedades autoinmunitarias como la artritis reumatoide,entre otras.

El estudio del envejecimiento es multidisciplinario y diverso. Actualmente seutilizan modelos de organismos eucariotas, como las levaduras, las nemátodos, lasmoscas y los ratones, para tratar de elucidar el o los mecanismos participantes eneste proceso. Sin embargo, a pesar del avance en las investigaciones en este tema,aún no se conocen las causas primarias.

Para tratar de esclarecer a diferentes niveles los mecanismos que pudieran con-ducir al envejecimiento, se han propuesto varias teorías que no son exclusivasentre ellas. Desde una perspectiva evolutiva, el envejecimiento puede verse comoun fenómeno en cual la selección natural de ciertos genes puede afectar la longevidad de una especie. Se han propuesto dos formas en las que actúa la se-lección natural:

a) SSeelleecccciióónn ppaassiivvaa.. Llamada así puesto que en este caso se acumulan mutacio-nes que no son elegidas o “escapan” a la selección natural. Ello debido a quelos efectos de dichos genes ocurren después de la etapa de reproducción.

b) SSeelleecccciióónn aaccttiivvaa.. También conocida como antagonismo pleiotrópico. Se re-fiere a la selección de un gen que provee un beneficio a corto plazo pero unperjuicio a largo plazo. En los animales de vida silvestre este detrimento difí-cilmente llegará a manifestarse pues la mayoría de los organismos silvestresno logran sobrevivir para llegar a edades avanzadas por causa de la depreda-ción, la desnutrición, las enfermedades, entre otras.

Cuando se habla de genes asociados al envejecimiento existe una discusiónsobre la función y la denominación de estos genes. Se ha sugerido que deberíanllamarse ggeerroonnttooggeenneess en el caso de que retrasaran o aceleraran el envejecimien-to o genes de lloonnggeevviiddaadd si es que su función fuera la de alargar la vida. Sinembargo, esto es aún una cuestión pendiente.

Por otro lado, las teorías sistémicas adscriben el envejecimiento de todo elorganismo a un decremento de la función de un sistema clave, como el sistema


nervioso, endocrino o inmunitario. Las teorías celulares relacionan los cambiosque se producen en los elementos estructurales y funcionales de las células, comolos lisosomas y las mitocondrias, con el paso del tiempo; todo ello bajo la influen-cia de factores ambientales.

Dentro de las teorías moleculares se encuentra una que cuenta con gran evi-dencia experimental, y es la teoría propuesta por Denham Harman en 1956. Lateoría propone que el envejecimiento es el resultado de la acumulación de dañooxidativo en las biomoléculas, principalmente al DNA, a lo largo de la vida de unorganismo y sus orígenes se explican a continuación.

❚ TEORÍA DEL ENVEJECIMIENTO POR RADICALES LIBRES

A mediados del siglo pasado, Harman descubrió la generación de radicales hidroxi-lo (•OH) en la reacción de la radiólisis del agua; este hecho, junto con el conoci-miento previo de la presencia endógena del mismo radical en la materia viva, hizoque el investigador sugiriera que las especies reactivas de oxígeno (ERO) se pro-ducían de manera endógena como subproductos de la química enzimática redox.Así mismo, se empezó a conocer que las enzimas que participaban en este tipo dereacciones eran aquéllas involucradas en la utilización directa del oxígeno molecu-lar, particularmente las que contenían hierro. Al comparar los efectos producidospor la radiación ionizante con el fenotipo que se manifiesta durante el envejeci-miento, observó patrones similares como la presencia de mutagénesis, cáncer ydaño celular en general. Poco después, tras el descubrimiento in vivo del aniónsuperóxido (O2

•), se encontró que la mitocondria era la principal fuente endóge-na de oxidantes. Harman sugirió que estos organelos eran participantes activos enel proceso del envejecimiento, y que los radicales libres producidos durante larespiración aeróbica en los organismos eran los que causaban la acumulación deldaño oxidativo que contribuía al envejecimiento y a la muerte.

Resulta paradójico que la generación intracelular de oxidantes pueda limitar lavida, ya a que desde el punto de vista energético, la utilización del oxígeno mo-lecular como aceptor de electrones en la cadena respiratoria hace posible la sín-tesis de ATP y por tanto la vida.

Aunque no se puede afirmar que el estrés oxidativo sea el único factor quedetermine la longevidad de un organismo, no hay duda de que está asociado a lapatofisiología del envejecimiento.

La teoría del envejecimiento por daño oxidativo de Harman comenzó a atraer laatención desde el decenio de 1980-89, y desde entonces cuenta con una gran can-tidad evidencia experimental que la sustenta, como son las mediciones fenome-nológicas del estrés oxidativo asociado con el envejecimiento, las comparacionesentre especies, la restricción calórica, la manipulación de la tensión de oxigeno en©

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El estrés oxidativo en el envejecimiento • 449

la actividad metabólica, los tratamientos con antioxidantes alimenticios y farma-cológicos, entre otros.

❚ ESTRÉS OXIDATIVO EN EL ENVEJECIMIENTO

Como se ha mencionado a lo largo de este libro, en condiciones metabólicas nor-males, debe existir un balance entre los eventos oxidantes en donde hay produc-ción de ERO y los sistemas de defensa antioxidante y de reparación del dañooxidativo. Lo anterior, mantiene la homeostasia celular y la regulación del estadoredox intracelular, mediante retroalimentaciones positivas y negativas. El equili-brio redox permite un control versátil en la expresión génica y de transducciónde señales de las vías relacionadas al crecimiento, la proliferación, la diferencia-ción y la muerte, entre otras actividades celulares. Pero cuando no se mantieneun balance entre ellos, ya sea por la pérdida y/o la disminución del sistema protec-tor, por un aumento en la producción de las ERO o por ambos eventos simultá-neamente, se dice que existe un estado de eessttrrééss ooxxiiddaattiivvoo,, dando como resultadoseveras disfunciones metabólicas. Durante el envejecimiento se ha visto que sealtera este balance, llevando a las células de organismos viejos a un estrés oxida-tivo y por consecuencia un mayor daño celular.

Daño oxidativo

De acuerdo con la hipótesis de Harman, las células que provienen de animalesviejos deben haber acumulado mayor daño oxidativo en el DNA, en comparacióncon las células provenientes de animales jóvenes. Las principales biomoléculas,blanco de las ERO, son los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos, lesionan-do así la función y la estructura celular. Existen varias manifestaciones indirectas dedaño oxidativo en las células. Tales mediciones incluyen lipoperoxidación, oxida-ción del DNA con formación de aductos como el 8-oxo-2´-desoxiguanosina (8-oxodG), oxidación de las proteínas, y cambio en el estado redox de la parejatiol/disulfuro, entre otras.

Se ha demostrado de manera muy importante, que la acumulación del daño alDNA se asocia con el proceso de envejecimiento. Este daño es trascendente, puesaltera la regulación de las funciones celulares. Por ejemplo, se ha encontrado unmayor daño en el DNA nuclear en células de animales viejos que de jóvenes, con-virtiéndose, de nuevo, un blanco más vulnerable al ataque de las ERO. A pesar deque existen algunos mecanismos de reparación del DNA nuclear y reparación delDNA mitocondrial (mDNA), los radicales libres causan daños estructuralescomo mutaciones de pares de bases, rearreglos, deleciones, inserciones y amplifi-


caciones de secuencia; así como rompimientos de DNA, daño a genes supresoresde tumores, como p53, y amplificación de la expresión de protooncogenes.

Por ejemplo, en la enfermedad neurodegenerativa de Parkinson hay una alte-ración de la función mitocondrial y deficiencia de la actividad del complejo I, loque conlleva a una gran producción de ERO. Así también, en la enfermedad deAlzheimer, el estrés oxidativo es un evento temprano que favorece el depósito de hierro en las placas seniles.

Sistemas protectores contra las ERO

La amenaza continua del daño que causan los radicales libres en la célula, en lostejidos y, en general, en los organismos pluricelulares es contrarrestada por la exis-tencia de sistemas de defensa celular. De hecho, la teoría del envejecimiento porradicales libres ganó credibilidad en 1969, con la identificación de la enzima super-óxido dismutasa (SOD). Con tal descubrimiento se obtuvo la primera evidencia de la generación in vivo del anión O2

• y las defensas antioxidantes celulares, de lasque ya se ha hablado en capítulos anteriores. Sin embargo, a pesar de la eficienciade los sistemas de defensa antioxidantes, Lu et al. (1999) han sugerido que, duran-te el proceso del envejecimiento, existe una disminución en las actividades enzimá-ticas de protección contra las ERO. Por ejemplo, diversos autores han demostradoque las concentraciones de glutatión reducido (GSH) disminuyen con la edad envarios tejidos de origen murino y en algunos insectos. La actividad y la expresiónde la glutatión peroxidasa (GPx) y la glutatión-S-transferasa (GST) decaen duran-te el envejecimiento en todos los tejidos estudiados. La catalasa (CAT) tiene uncomportamiento diferente según el tejido del que se trate, sin embargo, existe engeneral una marcada disminución de esta enzima en las últimas etapas de la vida.

Mediante manipulaciones genéticas se creó un transgénico de la mosca de lafruta Drosophila melanogaster que sobreexpresaba a la SOD1 y CAT, y se obser-vó una sobrevida del 34% comparado con los controles. En otro modelo, losmutantes age1 del nematodo C. elegans presentaron un aumento en los nivelesde los antioxidantes endógenos SOD y CAT, lo que les permitió vivir dos vecesmás que los controles. Sin embargo, al someter a ambos modelos a un estrés oxi-dativo exógeno, se encontró una protección de manera general, contra el daño,pero no se logró retrasar el proceso de envejecimiento. De manera contraria, aleliminar la producción de GPx, no se observó un fenotipo de envejecimientoprematuro, pero si la presencia de algunas patologías asociadas al envejecimien-to. En el caso de los ratones carentes de SOD2 se observó muerte neonatal.

Lo anterior demuestra que el balance entre los oxidantes y los antioxidantes esimportante para el funcionamiento del organismo y un desequilibrio entre ellosse refleja en la patofisiología del envejecimiento y la longevidad.©

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❚ LA TEORÍA DEL ENVEJECIMIENTO POR DAÑOEN EL DNA MITOCONDRIAL

A la mitocondria se le considera la central energética de las células. Es en esteorganelo en donde se lleva a cabo el metabolismo oxidativo de los eucariotas, yaque en la mitocondria se realiza el ciclo del ácido cítrico, la oxidación de los áci-dos grasos y están presentes las enzimas y proteínas redox que llevan a cabo eltransporte de electrones y la fosforilación oxidativa.

Se ha estimado que los radicales libres generados en la mitocondria puedenproducir daño a la membrana interna del organelo, a los componentes de la cade-na de transporte de electrones y al DNA mitocondrial. De esta manera, al dañar-se la mitocondria, no sólo produce menos ATP, sino que también incrementa la producción de ERO que consecuentemente produce más daño oxidativo a lamitocondria, creando así un ciclo vicioso (figura 30-1). De modo que se ha pro-puesto que la mitocondria tiene una participación esencial en diversas patologías,así como en el proceso del envejecimiento, y se ha asociado la duración de la vidade un organismo con el grado de daño oxidativo que presenta este organelo. Mi-quel et al. (1980) mostraron los primeros apoyos experimentales a la teoría delenvejecimiento por daño oxidativo en el DNA mitocondrial (mDNA), en dondese encontró que los niveles de daño oxidativo al mDNA son al menos 10 vecesmás elevados que los que se encontraban en el DNA nuclear y que las lesionesoxidativas en el mDNA se acumulaban en función de la edad en el cerebro, en elhígado de rata y en la piel humana. Se ha pensado que la causa de la elevada tasa


Muerte celularApoptosiso necrosis

Estrés oxidativo

Antioxidantes

Generación de oxidantes

mutagénicos

Daño al DNA nuclear y mitocondrial

Células con producción de energía deficiente

envejecimiento

FFiigguurraa 3300--11.. Círculo vicioso del daño por ERO y el envejecimiento.

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de mutaciones en el mDNA se debe a sus limitados mecanismos de reparación ya la ausencia de histonas que lo protejan.

La relación entre los niveles de mutaciones somáticas en el mDNA de mamí-feros, la disfunción de la cadena respiratoria y los fenotipos expresados en elenvejecimiento se demostraron al utilizar un ratón que expresaba deficientemen-te la subunidad catalítica de la polimerasa del mDNA.

En 1989, Linnane formuló la teoría del envejecimiento por mutaciones en elmDNA inducidas por ERO, se trata de un refinamiento de la teoría de Harman.

Linnane menciona que la acumulación de mutaciones en el mDNA, generadaspor las ERO sobre las células somáticas a lo largo de la vida, son el principal con-tribuyente del envejecimiento humano y las enfermedades degenerativas asocia-das. Los sustentos sobre los cuales se basa esta hipótesis son:

a) La existencia de numerosas deleciones en el mDNA de los tejidos envejeci-dos, que además son potencialmente patogénicas.

b) Las alteraciones funcionales en el mDNA dependientes de la edad.c) La disminución en la actividad de algunas enzimas importantes de la mito-

condria en el músculo humano de edad avanzada.Además, se ha demostrado que la acumulación de mutaciones en el mDNA

ocurre en humanos entre los 70 y 100 años de edad, a partir de los 50 años enlos chimpancés y entre los 2 y 3 años en el ratón.

Daño en el mDNA, envejecimiento y longevidad

Al parecer, el daño oxidativo en el mDNA hace la diferencia entre el envejecimien-to y la longevidad de las especies. Tanto las aves, como los grandes mamíferos, tie-nen baja producción mitocondrial de ERO, a pesar de que la tasa metabólica enlos primeros es alta y baja en los segundos. Sin embargo, ambos organismos pre-sentan un envejecimiento lento.

Este fenómeno se ha usado para explicar porqué en algunos casos los antioxidan-tes endógenos se correlacionan negativamente con el tiempo máximo de vida de lasespecies, en particular en donde los animales de larga vida tienen bajos niveles deantioxidantes asociados a bajos niveles de ERO y, al parecer, una mayor longevidad.

Un estado que presenta un comportamiento similar a lo que ocurre en estetipo de especies de larga vida, está dada por una manipulación experimental quedisminuye la tasa de envejecimiento en mamíferos. Este estado se conoce comorestricción calórica (RC) y consiste en el consumo de una dieta nutriológicamen-te balanceada, pero reducida en aporte calórico. La RC disminuye la generaciónde ERO en la mitocondria, principalmente los que provienen del complejo I. Elmecanismo que permite la disminución de ERO, al parecer no se debe a la dis-


minución en el consumo de oxígeno, sino a que hay disminución en el flujo deelectrones dirigidos hacia la formación de ERO. En este estado, aparentemente,no hay modificación en la expresión o actividad de las enzimas antioxidantesSOD, CAT, GPx. Experimentos con ratas, a las que se les redujo en un 50% suaporte calórico, vivieron el doble y retrasaron la aparición de tumores y enferme-dades crónicas como en sucede en el envejecimiento. Sin embargo, fueron menosfértiles y 30% más pequeñas que las ratas alimentadas ad libitum.

Otro ejemplo del papel del daño al DNA mitocondrial fue aportado por estu-dios realizados por Tanaka (1998), que revelaron que cerca de las 2/3 partes delos centenarios japoneses presentaban una variante de un gen mitocondrial cono-cida como Mt5178A que codifica para una subunidad de la NADH deshidroge-nasa del complejo I de la cadena respiratoria. Dado que el complejo I es laprincipal fuente de ERO, puede ser que la variante esté asociada con una dismi-nución en la fuga de radicales libres y por tanto una menor incidencia de muta-ciones en el mDNA. Muchas de las personas con esta variante mostraron sólo lamitad de la incidencia de enfermedades relacionadas con el envejecimiento.

Lo anterior sugiere que los cambios en el estado redox en las células parecenregular algunas vías intracelulares críticas de manera específica en cada especie,y se puede pensar que es un parámetro que controla el envejecimiento. Esto hasido apoyado por estudios con vertebrados, hongos y células en cultivo.

❚ EL DAÑO OXIDATIVO INDUCE SENESCENCIA CELULAR

Como se ha mencionado, el estrés oxidativo parece tener una participación im-portante en el daño celular. En células de mamíferos se ha observado que depen-diendo de la concentración de los oxidantes, del tipo celular y el estado del ciclocelular en que se encuentra la célula, se pueden desencadenar diferentes respues-tas como necrosis, apoptosis, cáncer o senescencia celular. Cómo y porqué lascélulas entran en dichos estados, no está claro, pero se piensa que esas vías po-drían compartir algunas moléculas reguladoras.

Uno de estos fenómenos, que llama la atención en el envejecimiento, es la se-nescencia celular. Chen et al. (1995), supusieron que la acumulación del dañooxidativo contribuye a este estado, tanto in vivo como in vitro. Estos investiga-dores demostraron que las células senescentes contenían 30 % más de 8-oxodGen el DNA que las células no senescentes. Así mismo, un estudio de Allen et al.(1999), confirmó que las células senescentes producían niveles elevados de radi-cales oxidantes y de H2O2 (figura 30-2).

Cabe aclarar que la senescencia sólo se observa en organismos pluricelulares yen células que tienen potencial para el recambio celular. En la senescencia, lascélulas se encuentran deterioradas en general, pero están metabólicamente acti-


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vas. Su ciclo celular permanece detenido irreversiblemente en la fase G1 aun ycuando existan estímulos mitogénicos en el medio. Dependiendo del tipo celulardel que procedan, las células senescentes muestran cambios selectivos en laexpresión génica que les da un fenotipo alterado.

Se sabe que diferentes tipos de señales intrínsecas y extrínsecas de estrés oxi-dativo, pueden activar genes supresores de tumores como p53, Rb, o ambos, loscuales se han considerado como los principales activadores de la senescencia. Laproteína p53 puede ser activada por las vías de señalización de daño al DNA,mediante las proteínas ATM y ATR, o por la proteína p14ARF. Cuando hay unestado de estrés oxidativo, las proteínas p21 y p16 pueden inhibir a las CDK(cinasas dependientes de ciclinas) e impedir la fosforilación de pRb deteniendola progresión del ciclo celular. De esta manera, las dos proteínas supresoras detumores pueden actuar como integradoras de señales de estrés y su nivel combi-nado de activación podría determinar la senescencia como respuesta.

Se ha encontrado en estudios in vitro e in vivo que durante el estrés oxidativoque induce senescencia como sucede en el envejecimiento, se encuentra sobreex-presada la proteína Bcl-2. Recientemente se ha descubierto que esta proteínatiene un papel modulador de las ERO para la protección celular, a pesar de que


Inter r upción

Irr e v ersi b le

del ciclo celular

Daño al DNA


Senescencia celular

E R O

30% más de 8- o xodG

Alte r ación del ciclo celular en células v ecinas preneoplásicas

Cáncer

Acu m ulación de células senescentes

Dete r ioro asociado al e n v ejecimiento

FFiigguurraa 3300--22.. Participación del estrés oxidativo en la inducción de la senescencia prematura (SIPS).

se ha visto que su sobreexpresión también induce la formación de ERO, posible-mente para activar los sistemas antioxidantes como el glutatión intracelular, entreotros. Esta proteína es un elemento importante en el proceso de la senescenciacelular, pues se ha observado que su sobreexpresión puede detener el ciclo celu-lar con incremento de los niveles de p27 como de p130.

La senescencia celular contribuye al envejecimiento

En 1995, se tuvo la primera evidencia directa de la existencia de células senes-centes in vivo en dermis de humano, utilizando un ensayo histoquímico para elmarcador de senescencia: la presencia de la enzima β-galactosidasa en altas con-centraciones. La acumulación paulatina de las células senescentes en los organis-mos a lo largo de la vida se ha confirmado en otras especies y en otros tejidos. Seha propuesto que la senescencia es un mecanismo supresor de tumores en la vidatemprana de un individuo. Sin embargo, si existe una acumulación de célulassenescentes, se altera el microambiente celular lesionando la función e integridaddel tejido en el que se encuentran, además de fomentar la desregulación metabó-lica de las células vecinas incrementando las posibilidades de iniciar enfermeda-des o patologías comunes en la vejez como el cáncer.

Lo anterior, conlleva directamente a relacionar el deterioro producido por laacumulación de las células senescentes en un tejido con el fenómeno del enveje-cimiento de los organismos. La evidencia que se tiene para sustentar esta hipóte-sis está basada en una gran cantidad de correlaciones experimentales. Unaprimera línea de evidencia se basa en que los cultivos primarios, derivados dedonadores de edad avanzada, tienden a senescer antes que los cultivos de dona-dores jóvenes. La siguiente línea de evidencia deriva de algunas comparacionesentre especies. En general, las células derivadas de especies de vida corta iniciansu etapa de senescencia de manera temprana en comparación que las especiesmás longevas. En tercer lugar, se encuentran los estudios realizados en tejidoshumanos derivados de personas con síndromes de envejecimiento prematurohereditario, en especial con donadores con síndrome de Werner. En estos casos,se observa que las células de los pacientes senescen de manera prematura con res-pecto a los controles.

Existen otros mecanismos mediante los cuales las células puedan sobrevivir alestrés oxidativo asociado al envejecimiento. Como por ejemplo, la expresiónendógena de la proteína antiapoptótica Bcl-2 se ha visto aumentada en organis-mos viejos y en células senescentes. Lo interesante de esta proteína es que secomporta como una molécula prooxidante, induciendo la generación de EROque permite encender los mecanismos antioxidantes de la célula, además dedetener el ciclo celular para que la célula pueda repararse.


❚ CONCLUSIONES

El envejecimiento es un fenómeno natural que constituye uno de los mayoresretos para la investigación biológica actual. El estrés oxidativo tiene un papel fun-damental en el proceso del envejecimiento y las enfermedades asociadas a él y,junto con otros componentes intrínsecos y extrínsecos, determinan la longevidadde los organismos. La mitocondria es la principal fuente y a su vez blanco de lasERO, y el aumento de estos radicales en el estrés oxidativo, aunado con una dis-minución en las defensas antioxidantes y de reparación, provocan un daño a lasbiomoléculas y el deterioro celular asociado al envejecimiento. Recientemente sehan encontrado otros sistemas de protección celular, como el que confiere la pro-teína Bcl-2 que actúa en la protección contra el estrés y el daño oxidativo, per-mitiendo la sobrevivencia celular. Dependiendo de las concentraciones deoxidantes presentes y el estado del ciclo celular, la célula puede transformarse ensenescente, que es un estado alterado, con detención del ciclo celular, pero meta-bólicamente activa. Se ha observado un aumento de células senescentes por dañooxidativo en organismos viejos, lo que hace suponer que la senescencia contribu-ye al envejecimiento.

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DDAAÑÑOO OOXXIIDDAATTIIVVOOYY EENNFFEERRMMEEDDAADDEESS CCRRÓÓNNIICCOO--DDEEGGEENNEERRAATTIIVVAASS AASSOOCCIIAADDAASS

AA LLAA CCOONNTTAAMMIINNAACCIIÓÓNN AAMMBBIIEENNTTAALL

Andrea M.G. De Vizcaya RuizLuz M. Del Razo

❚ INTRODUCCIÓN

La contaminación ambiental se define como cualquier sustancia química, ele-mento físico u organismo patógeno, presente en el medio ambiente que interfie-re de manera adversa con los recursos naturales o la salud humana, animal o delos ecosistemas. Tal escenario plantea una relación estrecha y directa entre lamagnitud de la exposición a los contaminantes y el riesgo a las enfermedades.

Se ha reconocido que un alto porcentaje de las padecimientos a nivel mundialpodría atribuirse a factores ambientales asociados a la degradación de los ecosis-temas, como son la exposición a los productos químicos y accidentes tecnológicos.Si actualizamos el concepto de ambiente para incluir a la dieta, así como a los factores de comportamiento social y cultural, entonces el porcentaje de padecimien-tos atribuibles a los cambios o modificaciones ambientales se eleva considerable-mente. Cuando las poblaciones se exponen crónicamente a los contaminantesambientales, con frecuencia se observa un aumento en la prevalencia de las enfer-medades crónico-degenerativas. Estos efectos adversos dañan la salud, disminu-yen la calidad y la esperanza de vida, y afectan a la economía de la sociedad, yaque decae su productividad y aumentan significativamente los gastos destinadosal tratamiento de las enfermedades.

31

Para entender esta relación, actualmente se realizan estudios que analizan des-de la liberación del contaminante al medio ambiente, hasta el desarrollo de lasenfermedades en la población. La naturaleza de estos efectos adversos puede serdiversa y afectar a los organismos a distintos niveles, tanto bioquímicos, comocelulares y hasta los mecanismos de acción moleculares. Entre estos efectos des-tacan los procesos de estrés originados por un desbalance entre eventos prooxi-dativos (incremento de radicales libres, especies reactivas de oxígeno, ERO, y denitrógeno, ERN) y antioxidantes (enzimáticos y no enzimáticos).

Los radicales libres, así como las ERO y ERN, se forman constantemente en elorganismo a partir de fuentes endógenas y exógenas. Las fuentes endógenasincluyen a los subproductos de las reacciones metabólicas esenciales, como lageneración de energía por la mitocondria o del metabolismo de compuestos tóxi-cos a través del sistema enzimático del citocromo P450. Las fuentes exógenas quegeneran radicales libres y ERO son el humo del cigarro, los contaminantes am-bientales como las emisiones de los automóviles e industrias, el asbesto y la expo-sición a radiaciones iónicas, entre otras.

Entre los contaminantes ambientales que han sido asociados con enfermeda-des crónico-degenerativas por estrés oxidativo, están algunos metaloides y metales,los plaguicidas organofosforados y organoclorados, las dioxinas e incluyen diversoscontaminantes atmosféricos.

En condiciones normales, las defensas antioxidantes protegen a las células encontra del exceso de los radicales libres y las ERO; pero si estas defensas no funcio-nan adecuadamente se puede provocar daño celular a distintos niveles, como en lamolécula del DNA, provocando una oxidación de ácidos nucleicos; también enlípidos membranales, causando una pérdida estructural de la membrana celular uoxidando a las proteínas.

El daño oxidativo a nivel celular conlleva disfunciones metabólicas y sistémicasque preceden distintos tipos de padecimientos o efectos adversos a la salud. Los sis-temas más afectados por los agentes químicos o contaminantes ambientales inclu-yen los sistemas inmunitario, neurológico y endócrino. Cuando esta condiciónpersiste durante periodos prolongados, se favorece el desarrollo de las enfermedadescrónico-degenerativas como las que se mencionan a lo largo de este capítulo.

Es importante considerar que los blancos celulares y moleculares de los distin-tos compuestos químicos no serán iguales en todos los casos, a pesar de que todosse lleven a cabo a través de procesos de estrés y daño oxidativo, por lo que los efec-tos adversos a la salud y, en consecuencia, la manifestación de enfermedades cró-nico-degenerativas dependerá del tipo de compuesto químico de que se trate, asícomo de la duración de la exposición al mismo. En este capítulo, se describiránlos principales compuestos químicos medioambientales, que se han relacionadocon la manifestación de enfermedades crónico-degenerativas a causa de procesosde estrés oxidativo.


❚ CONTAMINANTES AMBIENTALES

Metales

Los metales son sustancias naturales que se han formado por meteorización deminerales y son emitidos al ambiente durante la actividad volcánica. Algunosmetales son esenciales para la salud humana y a menudo son componentesimportantes de varias enzimas con funciones fisiológicas. Los metales se puedenencontrar en aguas superficiales en sus formas iónicas estables o bien reaccionarcon otros iones, para formar compuestos que en ocasiones pueden ser tóxicos.Algunos metales están implicados en las reacciones de transferencia electrónicaen las que el oxígeno está presente, lo que favorece la formación de oxiradicalestóxicos. Desde el punto de vista toxicológico, los metales o metaloides más im-portantes que participan en este tipo de reacciones son el plomo (Pb), el mercu-rio (Hg), el cromo (Cr), el cadmio (Cd) y el arsénico (As).

La mitocondria es uno de los principales blancos celulares de los efectos oxi-dantes de los metales. Se ha propuesto que algunas especies oxidantes de losmetales como As3+, Cr6+, Hg2+, perturben la integridad estructural de la membra-na interna mitocondrial, lo cual produce un aumento en la permeabilidad. Estoaltera el potencial de membrana y se traduce en el desacoplamiento de la fosfo-rilación oxidativa, favoreciendo la producción de ERO como el superóxido (O2

•)y el peróxido de hidrógeno (H2O2) por la cadena transportadora de electrones,así como de especies reactivas intermediarias, producto de su biotransformación.Tal es el caso del metabolismo intracelular del Cr6+, que produce especies intermedias de Cr4+ y Cr5+, capaces de dañar directamente a las macromoléculasbiológicas; o del As3+ que, al oxidarse a As5+, genera H2O2 espontáneamente ydurante su biotransformación produce radicales de As, como el peroxil dimetila-do de As. Todos estos eventos se traducen en un estrés oxidativo mitocondrial ycelular. Otro mecanismo de acción consiste en la inhibición de algunas de lasenzimas involucradas en la protección celular contra el estrés oxidativo.

Plaguicidas

Se denomina plaguicida a cualquier agente químico, físico o biológico utilizadopara eliminar a los organismos animales o vegetales no deseados. Este tipo deagente ha sido ampliamente utilizado durante los últimos 50 años en la agricul-tura, por lo que actualmente se ha convertido en un contaminante ambiental degran relevancia. En general, los plaguicidas se agrupan en insecticidas organoclo-rados y organofosforados, en herbicidas, fungicidas, fumigantes y rodenticidas. Seha propuesto al estrés oxidativo como uno de los mecanismos plausibles de toxi-©

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Daño oxidativo y enfermedades crónico-degenerativas... • 461

cidad por la exposición a plaguicidas. Los efectos biológicos causados por los pla-guicidas se inician a través de la interacción fisiológica directa entre el agente ylas macromoléculas, como son las enzimas, las membranas, las inmunoglobulinas,los ácidos nucleicos, las citocinas, las proteínas y otras estructuras celulares. Asi-mismo, los sistemas enzimáticos pueden convertir a los plaguicidas en interme-diarios altamente reactivos, metabolitos o productos secundarios, como ERO(O2

•, H2O2, •OH) y otros radicales libres, como en el caso del herbicida paraquat(PQ) y el diquat (DQ).

La toxicidad del PQ y los biperidilos se debe a que son compuestos capaces deiniciar un proceso cíclico de óxido-reducción, a través de la reducción de un elec-trón por el nicotinamida adenín dinucleótido fosfato reducido (NADPH; fuentemás importante de equivalentes para la reducción intracelular del PQ). De estamanera, se forman radicales libres que donan un electrón a una molécula de O2,produciendo así un O2

•. Una vez agotado el NADPH, el O2• reacciona consigo

mismo, produciendo al radical hidroxilo (•OH), que es tan dañino que puede lle-var a la muerte celular (figura 31-1). La exposición del tejido pulmonar in vivoa PQ y DQ, en un microambiente con altas concentraciones de O2, favorece lageneración de las ERO, lo que puede provocar una destrucción masiva del tejidoepitelial, el cual es reemplazado por tejido fibroso, causando fibrosis pulmonar,hipoxia y muerte.

La lipoperoxidación (LPx) puede ser iniciada por radicales reactivos orgánicos,metabolitos de plaguicidas o bien por la interferencia con mecanismos de defen-sa, que controlan las reacciones de peroxidación. Las interacciones de las EROcon los constituyentes celulares también generan radicales libres secundarios yterciarios derivados de lípidos, aminoácidos y ácidos nucleicos. La figura 31-2muestra un esquema del metabolismo de plaguicidas y efectos acumulativos dereactividad.

Los insecticidas organoclorados, como el DTT y sus metabolitos p’p-DTT, p’p-DDE y p’p-DDD, son capaces de generar ERO y causar muerte celular por apop-tosis in vitro en células periféricas mononucleares humanas. Asimismo, unestudio comparativo donde se evaluó la toxicidad del lindano, el DTT, el clorda-no y el endrin, sobre el daño en el hígado de ratas expuestas a estos agentes, mos-tró un aumento en la inducción de la LPx de las membranas mitocondriales ymicrosomales, y el rompimiento de las cadenas simples del DNA. Los insectici-das organofosforados como el etil-clorpirifos, pueden causar LPx y alteración deenzimas antioxidantes (SOD, CAT, GPx) en eritrocitos de humanos expuestos yde ratas. El hexaclorobenceno es un fungicida estable capaz de inducir al sistemaenzimático de los citocromos P450 y a otras enzimas de conjugación, que provocadaño hepático, interfiere con la biosíntesis de los grupos hemo, causando porfiriacutánea tardía, síndrome de daño hepático y fotosensibilidad. Se ha reportadoque el daño hepático causado por la exposición a hexaclorobenceno está relacio-


nado con mecanismos de estrés oxidativo, a través de su capacidad de movilizaral Fe endógeno y por ser metabolizado por los citocromos P450. Asimismo, pro-voca la inducción de la hemooxigenasa (HO-1) en hígado de ratas, una proteínaantioxidante que se induce únicamente en condiciones de estrés oxidativo (véasela sección V, Antioxidantes).

Dioxinas y solventes (CCl4)

Los hidrocarburos policlorados, como las dioxinas (2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxina, TCDD) son compuestos que se caracterizan por la presencia de átomosde cloro, que sustituyen a los átomos de carbono en los anillos aromáticos y otrasestructuras, y son considerados como altamente tóxicos. La estabilidad química yfísica de los compuestos altamente clorados, así como su lipofilicidad (capacidadde disolverse en lípidos), contribuye a la persistencia y bioacumulación en elmedio ambiente. A pesar de que las dioxinas no tienen ningún uso comercial oindustrial, se encuentran presentes en el medio ambiente, debido a que son unproducto inadvertido de la síntesis de plaguicidas clorofenólicos, blanqueadoresclorados y otros procesos industriales (ej. metalúrgica, incineración).

El TCDD es un compuesto altamente carcinogénico, cuyo mecanismo de acción involucra la interacción con la proteína receptora intracelular arilo-hidro-carbono para TCDD (Ah TCDD-receptora), que subsecuentemente afecta latranscripción génica, incluyendo genes que codifican para varios de los citocro-mos P450. Se ha observado que la exposición de animales de laboratorio a concen-©

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PQ ++ PQ PQ ++

+ O 2 • Cit c reductasa

[pa r aquat] [ r adical del pa r aquat] [radical anión superóxido]

O 2 + O 2 H 2 O 2 + O 2 OH + OH - + O 2 SOD (+e) C A T (-e)

[Radical hidr o xilo]

[Anión hidr o xilo]

PQ + H 2 O 2 OH + OH + PQ ++ +

[ P a r aquat]

+

FFiigguurraa 3311--11.. La interacción fisiológica de los plaguicidas con macromoléculas favorece la genera-ción de intermediarios reactivos, metabolitos y radicales libres de los plaguicidas.

traciones altas de TCDD causa LPx, como consecuencia del daño oxidativo celu-lar, mientras que la exposición crónica genera la presencia de aductos de DNAcomo la 8-hidroxideoxiguanosina (8-OHdG), en hígados de ratas. El TCDD invitro e in vivo en roedores, es capaz de generar daño genotóxico en células hepá-ticas y macrófagos, LPx, aumento en la excreción urinaria de malondialdehído,incremento en la producción de O2

• por macrófagos peritoneales y una disminu-ción del contenido de GSH y NADPH en el hígado. El mecanismo plausible cau-sal de estos eventos, así como el potencial carcinogénico del TCDD, es el estrésoxidativo, con una importante participación del Fe como catalizador de ERO y


LÍPIDOS P R O TEÍNAS

PL A GUICI D AS Metabolitos no tóxicos Eliminación

Sistema acti v ador del metabolismo celular

Metabolismo reacti v os/inte r media r ios

Gene r ación de r adicales libre s , E R O y ERN

Enzimas Anti o xidantes

Anti o xidantes sacrificables

Alte r aciones y/o químicos en la dieta

Unión a macromoléculas celulares (enzima s ,

memb r ana, receptore s , DNA)

T o xicidad (daño tisula r , cáncer,

cambios fisiológicos)

Repa r ación celular (repa r ación DNA,

síntesis de proteínas)

Metabolismo celular alte r ado / daño en organelos

Daño celular

Mani f estaciones de daño por radicales libres

Daño oxidativo

Lipoper o xidación

Daño membranal

Oxidación de tioles,f o r mación de carbonilos

Depleción de GSH

P er o xidación/ acti v ación/ desacti v ación

Productos esta b les de la oxidación proteínica

Excreción

Daño al DNA

Alte r ación en la expresión genética

DNA

FFiigguurraa 3311--22.. Representación esquemática del daño tisular inducido por radicales libres de pla-guicidas.

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daño al DNA. Por lo anterior, se propone la evaluación de este tipo de daño enpoblaciones expuestas y así ser considerado como un marcador de riesgo.

El tetracloruro de carbono (CCl4) es un líquido incoloro, no hidrosoluble, utili-zado en la industria como un disolvente orgánico, para eliminar residuos aceitososo durante los procesos de lavado de textiles en seco (tintorerías). Permanece ubi-cuo en el medio ambiente, debido a su alta estabilidad química en la atmósfera(30 a 100 años). El CCl4 fue el primer compuesto para el cual se describió quesu toxicidad es mediada por mecanismos que involucran la participación de radi-cales libres. Estudios realizados en animales de experimentación indican que elprimer paso en el metabolismo del CCl4 involucra la formación del radical triclo-rometil (•CCl3), a través de la vía del citocromo P450 (figura 31-3). El •CCl3 seune directamente a lípidos microsomales y a otras macromoléculas celulares,contribuyendo al rompimiento de la estructura membranal por LPx, a la inacti-vación de varias enzimas e interrumpiendo los procesos energéticos de la célulay la síntesis de proteínas. El •CCl3 puede también experimentar reacciones anae-róbicas (sin presencia de oxígeno), resultando en la formación de otros compues-tos tóxicos como el cloroformo (CHCl3), el hexachloroetano (Cl3CCCl3) y elmonóxido de carbono (CO). Durante el metabolismo aeróbico (en presencia deoxígeno), el radical •CCl3 puede producir triclorometanol (Cl3COH), un precur-sor del fosgeno (COCl2), que es hidrolizado para formar CO2. La alta liposolu-bilidad del CCl4 le permite atravesar las membranas, lo que favorece que una vezingerido pueda ser distribuido a todos los órganos, aunque sus efectos tóxicos semanifiestan principalmente en el hígado.


CHCl 3

CCl 4 CCl 3 Cl3CCCl3

CO + HCOO -

P450 Anaeróbico

Aeróbico

Interacción con macromoleculas celulares

Dañocelular

Cl 3COH COCl 2 CO2

FFiigguurraa 3311--33.. Productos del metabolismo del CCl4.

Contaminantes atmosféricos: dióxidos de nitrógeno, ozono, dióxidos de azufre y partículas atmosféricas

El ozono (O3), los dióxidos de nitrógeno (NO2) y de azufre (SO2) y las partícu-las atmosféricas son contaminantes conocidos por inducir daño oxidativo.

Durante la combustión de material orgánico, las emisiones vehiculares, lasemisiones de plantas de energía y los procesos de combustión, los átomos denitrógeno presentes reaccionan con el O2 generando dos radicales: el óxido nítri-co (NO•) y el dióxido de nitrógeno (NO2

•). Los individuos sanos son capaces detolerar una exposición corta de hasta 4 ppm de NO2

•, sin embargo las personassusceptibles, como los asmáticos, son seriamente afectados desde concentracionesde < 0.3 ppm. El NO2

• se disuelve en el agua y forma ácido nítrico (HNO3), quepuede irritar el tracto respiratorio, y también ácido nitroso (HNO2), que puedecausar mutaciones en el DNA. El NO2

• puede iniciar procesos de LPx, al sustraerhidrógenos de ácidos grasos no saturados. Se ha observado un incremento en lasconcentraciones de etano y dienos exhalados en los pulmones de animales ex-puestos y en los fluidos corporales de humanos. La ausencia de elementos antio-xidantes como la vitamina E, el ascorbato, el ácido úrico y los tioles, como elGSH, agudizan el daño pulmonar por la exposición a NO2

•.El O3 es un gas altamente irritante, incoloro y que tiene un olor característico

y, a pesar de no ser un radical libre, es altamente oxidante. Se forma a partir dereacciones fotoquímicas (presencia de rayos UV) entre óxidos de nitrógeno e hi-drocarburos, que pueden provenir de las emisiones vehiculares. Aun las concen-traciones bajas (0.5 ppm) pueden provocar daño pulmonar en unas pocas horas,induciendo inflamación, activación de macrófagos alveolares y reclutamiento deneutrófilos. El O3 es capaz de oxidar a las proteínas mediante el ataque de losgrupos sulfidrilo (-SH), así como a los residuos aminoacídicos de tirosina, triptó-fano, histidina y metionina entre otros. Tanto los lípidos, como las proteínas, pue-den ser blancos directos del ataque del O3. Debido a que los fluidos nasales delos humanos son particularmente ricos en uratos, reaccionan rápidamente con elO3 y el NO2

•, favoreciendo la irritación nasal.Otro contaminante atmosférico relevante es el SO2, un gas sofocante e incolo-

ro formado por la quema de combustibles que contienen azufre, éste es un agentereductor más que oxidante. Debido a que no tiene electrones despareados, no esun radical libre per se, sin embargo, reacciona con moléculas de H2O, formandosulfito y bisulfito, iones que pueden ser oxidados y generar tanto ERO, como radi-cales sulfito, sulfato y peroxisulfato, los cuales pueden favorecer el daño pulmo-nar y la broncoconstricción.

Existe una relación entre la contaminación del aire, en especial por la exposi-ción a partículas suspendidas en el aire (PM; por sus siglas en inglés ParticulateMatter), y la morbilidad y mortalidad por enfermedades cardiorrespiratorias. Las


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PM son mezclas complejas de compuestos orgánicos e inorgánicos que varían entamaño, origen y composición. Se han sugerido varios mecanismos de daño, queincluyen desde la capacidad que tienen las PM de causar daño directo a las fuen-tes intracelulares generadoras de ERO, hasta efectos indirectos debidos a la libe-ración de mediadores intracelulares. Así como la estimulación de los macrófagospor la deposición de las PM en pulmones (figura 31-4).

El componente metálico de las PM es un importante generador de ERO, a tra-vés de la reacción de Fenton, contribuyendo así a la generación de estrés oxida-tivo y daño celular. Se ha reportado una relación entre la citotoxicidad, laformación de malondialdehído (producto de la LPx) y la muerte celular porapoptosis con la expresión de enzimas antioxidantes como catalasa y metalotio-neína y el factor de transcripción Nrf-2, que ha sido relacionado con el elemen-to de respuesta antioxidante en epitelio pulmonar de rata expuesto a PM. Otrosestudios en ratas han demostrado que la exposición a 5 horas de PM concentra-


Célula epitelial

E R O

Macró f ago

P a r ticulas atmosfé r icas Señalización Citot o xicidad

Apoptosis Necrosis

MnSOD Citocinas

E R O

Citoesqueleto

TNF

Mitocond Mitocond r r ia ia Mitocond r ia

FFiigguurraa 3311--44.. Esquema de los posibles mecanismos de daño activados por la exposición a PM en epi-telio pulmonar.

das genera estrés oxidativo en el pulmón y el corazón, asociado al contenido demetales (Fe, Mn, Cu, Zn), así como un incremento en la actividad de la SOD yla catalasa. La exposición a cenizas, partículas de emisiones de diesel, PM y par-tículas de cuarzo generan ERO, mediante procesos que involucran la respiraciónmitocondrial y la activación de enzimas de NAD(P)H, así como el estallido res-piratorio y la actividad de las óxido nítrico sintasas (iNOS) en macrófagos y fago-citos. Estos procesos tienen como consecuencia citotoxicidad e inflamación, dañoal DNA y estimulación de la proliferación celular.

Radiación

La radiación iónica es un evento en el que la energía de un fotón excede la ener-gía necesaria para remover un electrón de una molécula, provocando una coali-ción molecular que genera la formación de iones. La luz visible y la UV no tienenla energía suficiente para ionizar a la mayoría de las biomoléculas, mientras quelos rayos-γ, los rayos X, los electrones de alta energía (partículas β), los neutro-nes de alta energía o los fragmentos de fisión nuclear y las partículas α (ionesHe2+) pueden producir radiación ionizante. Cuando la radiación ionizante atra-viesa un sistema biológico, la energía no es depositada uniformemente sino enpaquetes, los cuales varían en tamaño y pueden contener una o varias moléculasexcitadas, iones y electrones, y así favorecer la formación de radicales libres, sien-do el más abundante el •OH, que es capaz de interactuar con la mayoría de loscomponentes celulares, produciendo radicales orgánicos. El DNA es un blancoaltamente susceptible de este proceso, se generan rompimientos de cadenas sim-ples y dobles, daño de deoxiribosas y modificaciones de bases. En personasexpuestas a radiación, como en el caso de la radioterapia, hay un aumento en laconcentración 8-OHdG en el DNA de sus linfocitos y en su orina.

❚ ENFERMEDADES CRÓNICO DEGENERATIVAS Y CONTAMINACIÓN

Las ERO, las ERN y los radicales libres han sido reportados como participantes ocausales de múltiples enfermedades como el cáncer, la diabetes, las afeccionescardiovasculares y respiratorias, la disfunción de la respuesta inmunitaria, la dis-rupción endócrina, neurológica y del metabolismo. Un exceso en la liberación deiones de metales de transición y proteínas hemo, así como el daño mitocondrial,son algunos de los causales del daño oxidativo y tisular, que promueven el desa-rrollo de enfermedades.


Cáncer

Es bien sabido que la sobreproducción de ERO y ERN, por un periodo prolon-gado de tiempo, está relacionada con la carcinogénesis. Esto, vinculado a lasmutaciones y la modificación en la expresión génica. El daño a bases del DNAque no es reparado puede resultar en una mutación. Esto, sobretodo si se lleva acabo la replicación celular previa al proceso de reparación de las bases modifica-das. Las ERO pueden dañar directamente al DNA produciendo rompimientos decadena simples o dobles, modificaciones en purinas, pirimidinas o a la desoxiri-bosa, y entrecruzamientos (véase el capítulo Daño al DNA).

La asociación de la exposición a los compuestos inductores de ERO y dañooxidativo sobre las bases del DNA cobra mayor relevancia en situaciones dondela población está expuesta a contaminantes ambientales como son las partículasatmosféricas ultrafinas (> 0.1 µm). Otro evento importante, que se ha estableci-do como una de las posibles participantes de la carcinogénesis relacionada con laoxidación de DNA nuclear, es el daño al DNA mitocondrial, mutaciones y alte-raciones de la función genómica mitocondrial.

Por otro lado, las ERO y el estado redox celular, que puede verse afectado poruna baja de los elementos los antioxidantes como GSH, TRx, oxidación deNADPH, modulan las vías de señalización transduccionales relacionadas con laregulación del crecimiento celular, proceso complejo que depende del tipo ce-lular y de la forma del oxidante, así como de la concentración de las ERO. Lamodificación de la expresión génica por las ERO tiene efectos directos en la proliferación celular y en la muerte por apoptosis, a través de la activación de fac-tores de transcripción. Por ejemplo, se han reportado modificaciones en la expre-sión de algunos reguladores transcripcionales como c-jun y c-fos, inducida pordiversos compuestos promotores de tumores contenidos en los plaguicidas,el CCl4, el pentobarbital, el TCDD, el cadmio, o bien las radiaciones ionizante y elasbesto, a través de la generación de ERO, como se describió anteriormente en estecapítulo. Otro evento relacionado con la carcinogénesis y el estrés oxidativo es la disminución de las uniones intercelulares por ERO, como el H2O2, en ocasionesa partir de compuestos como el éster de forbol (PMA) y el promotor tumoral 12-o-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), PQ, DTT y CCl4.

Diabetes Mellitus

El término diabetes mellitus (DM) describe diferentes trastornos metabólicosque resultan de alteraciones en la secreción de insulina, en la respuesta periféricaa la misma o en ambas; lo que conduce a un síndrome caracterizado por hiperglu-cemia crónica (aumento de azúcar en la sangre) y alteraciones del metabolismo©

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de los carbohidratos, las proteínas y los lípidos. La gran mayoría de los casos deDM corresponde a las de tipo 1 y a las de tipo 2. En la DM tipo 1, la caracterís-tica más relevante es la destrucción de las células β pancreáticas, causando la dis-minución de la secreción de la insulina; mientras que en la DM tipo 2 se presentala resistencia de los tejidos periféricos a la acción de la insulina. En personas dia-béticas, el exceso de ERO generado puede conducir a un estrés oxidativo y a unadisminución en la capacidad antioxidante. Las ERO son generadas como conse-cuencia de la reacción de las proteínas glicosiladas no enzimáticamente con eloxígeno o por la enolización de la glucosa catalizada por metales de transición,con la subsecuente reducción del oxígeno molecular que da lugar a los cetoalde-hídos e intermediarios oxidantes. Además de la glicosilación no enzimática de lasproteínas, los factores como la autooxidación de la glucosa, los cambios en elmetabolismo energético y en la concentración de mediadores de la inflamación ydel estado de las defensas antioxidantes también pueden contribuir a la apariciónde estrés oxidativo en la DM.

Algunos contaminantes orgánicos como los policlorobifenilos (PCB), el TCDD,los compuestos nitrados como los nitratos, los nitritos, y los compuestos N-nitro-sos, así como algunos metaloides del tipo del arsénico, han sido consideradoscomo diabetogénicos, ya que su exposición puede causar efectos sobre la secre-ción de insulina, el metabolismo de la glucosa, la resistencia a la insulina, el dañopancreático u otros posibles signos de DM (figura 31-5).


Daño del transp. de glucosa

Resistencia a la insulina

Hígado

Gra

sa

Páncreas

Mús

culo

Contaminantes

ambientales

Inferencia con metabolismo

de glucosa

Daño a células ßeta, por

exceso de ERO

Daño del transp. de glucosa Resistencia a la insulina

FFiigguurraa 3311--55.. Esquema de la influencia de contaminantes ambientales en el desarrollo de DM.

Las ERO son una liga entre la hiperglucemia y los signos fisicopatológicos típi-cos observados en la DM. La generación de ERO puede inactivar las vías de seña-lización entre el receptor de insulina y el sistema transportador de glucosa (figura31-6).

Afecciones cardiovasculares y respiratorias

Se ha reportado que las ERO y las ERN juegan un papel importante en el desa-rrollo y el establecimiento de la hipertensión y la ateroesclerosis. El aumento enla presión vascular, llamado hhiippeerrtteennssiióónn, es un factor de riesgo para las enferme-dades cardiovasculares, de modo que el incremento en la generación del radicalO2

• que inactiva al NO•, favoreciendo la formación de ONOO• en las paredes de

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P

P P

P

IRS P

PI -3K

GLUT4

G L U T 4

G L U T 4

G L U T 4

Insulina Glucosa

Metabolismo de carbohidratos

Receptor Insulina

PDK

PIP 3

PIP 2

+

AsIII

AsIII

PKC ,

PKB/Akt P

P

ERO ERO

FFiigguurraa 3311--66.. Adipocitos expuestos a arsenicales trivalentes formados durante el metabolismo de As,son capaces de inhibir la entrada de glucosa estimulada por insulina debido a la disminución de lafosforilación de PKB/Akt y/o por la interferencia con la translocación de los transportadores GLUT4 hacia la membrana plasmática.

los vasos sanguíneos, contribuyendo a la hipertensión. La susceptibilidad a estepadecimiento puede ser debida tanto a factores genéticos, como a la exposicióna compuestos tóxicos como el humo del cigarro y partículas suspendidas en elaire, entre otros.

Se conoce como ateroesclerosis al engrosamiento del endotelio vascular debi-do a la acumulación de colesterol, minerales, sangre y células musculares; estaacumulación puede convertirse en placas fibrosas que pueden calcificarse o esti-mular la muerte celular por necrosis. Dicha acumulación hace que la arteria seamás rígida de lo normal y produce un bloqueo parcial o total de la circulación desangre. Al igual que en la hipertensión, un aumento en la generación de O2

• favo-rece la formación de ONOO–, el aumento mismo de la generación de ERO y ERN por los macrófagos o los monocitos degenerando el endotelio vascular yfavoreciendo la acumulación de lipoproteínas de baja densidad (precursoras de laformación de colesterol) que a su vez son susceptibles de ser oxidadas.

La implicación del exceso de O2 se vuelve particularmente importante cuandose trata de las vías respiratorias, esto debido a que los pulmones son órganos queestán expuestos a una mayor tensión de O2 y a su gran área de superficie, lo que los hace susceptibles a contaminantes en el aire, particularmente aquelloscapaces de generar ERO/ERN. La exposición de los pulmones a elevadas concen-traciones de O2 y de contaminantes, favorece la generación intracelular de O2

• yH2O2. Otra fuente de ERO en los pulmones es la activación de los fagocitos, tantomacrófagos residentes pulmonares como monocitos y neutrófilos reclutados. Lapresencia de estas células en los pulmones causa daño al tejido pulmonar y favore-ce que se presente la condición del síndrome de distrés respiratorio del adulto(SDRA). Por otro lado, una activación prolongada de células inmunitarias como sonlos eosinófilos, también generan un aumento en los niveles de H2O2 y NO•, ya quese ha reportado un aumento en estas ERO/ERN en el aliento de niños asmáticos.

❚ CONCLUSIÓN

Mientras que en el caso de algunos compuestos químicos (el CCl4 o la radiación)la generación de ERO y ERN es el mecanismo directo de daño tisular, en otros ca-sos (los plaguicidas o los contaminantes atmosféricos), los compuestos químicosjuegan un papel precursor de estas especies. Algunos compuestos químicos comolos metales contribuyen a la depleción de elementos de la defensa antioxidantecomo el glutatión, predisponiendo así al daño oxidativo celular. Existe evidenciade que este daño contribuye de manera parcial o total al desarrollo de enferme-dades crónico-degenerativas.


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SSEECCCCIIÓÓNN VVIIIIII..AASSPPEECCTTOOSS FFIISSIIOOLLÓÓGGIICCOOSS RREELLAACCIIOONNAADDOOSS

AA LLAASS EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASS

32. Estrés oxidativo y apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477

33. ERO y señalización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 487

34. Especies reactivas de oxígeno en las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501

35. Vida animal en ambientes extremos, papel de los radicales libres y los antioxidantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 525

36. Estrategias para determinar la relevancia fisiológica de las especies reactivas de oxígeno en animales completos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 543

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❚ 477 ❚

EESSTTRRÉÉSS OOXXIIDDAATTIIVVOOYY AAPPOOPPTTOOSSIISS

Erika Olivia Gómez GonzálezJosé Luis Ventura Gallegos

Rebeca López MarureMaría de Jesús Ibarra Sánchez

Alejandro Zentella Dehesa

❚ INTRODUCCIÓN

La muerte celular y el estrés oxidativo han estado relacionados desde el momen-to en que fue posible evaluar la presencia de metabolitos oxidados. Sin embargo,a pesar de que existen múltiples estudios, ha resultado difícil definir el papel quejuega el estrés oxidativo en el proceso de muerte y así poder distinguir cuándo escausa y cuándo consecuencia de la muerte celular. El estrés oxidativo ahora sereconoce como disparador de la muerte celular, en particular la muerte por apo-tosis. En algunos casos incluso, ha mostrado ser un elemento indispensable duran-te la fase de activación del programa de muerte. En especial, los sistemas quegeneran óxido nítrico (NO•) y las NADPH oxidasa que generan superóxido(O2

•) y peróxido de hidrógeno (H2O2), forman parte del repertorio de señalesresponsables de iniciar y/o modular positivamente la activación de diversos pro-cesos de muerte celular fisiológica y de la apoptosis. Sin embargo, aún se desco-noce mucho sobre las reacciones específicas de oxidación implicadas y sobre los sustratos oxidados que participan en las vías de señalización que activan laapoptosis.

32

❚ ESTRÉS OXIDATIVO Y MUERTE CELULAR

La muerte de células, tejidos y órganos en sitios y momentos específicos a lo largode la ontogenia de los vertebrados ha sido documentada cuidadosamente porestudios embriológicos desde hace más de 150 años. En muchos de estos casos seha reconocido una estrecha relación entre la muerte celular y la aparición de evi-dencias bioquímicas de estrés oxidativo, que van desde la presencia de especiesque reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARs) hasta la detección de aduc-tos oxidados de DNA como la 8-hidroxi-2, desoxi-guanina (8-OHdG). Pero larelación entre el estrés oxidativo y la muerte celular por apoptosis tardó en esta-blecerse, en parte porque la apoptosis apenas cobró vida durante el último cuar-to del siglo XX y además porque el gran desarrollo de la bioenergética durante lasegunda mitad del siglo XX ha permitido explicar al estrés oxidativo como unaconsecuencia de la muerte celular.

Nuestro conocimiento de la bioenergética reconoce que una célula sana man-tiene ambientes oxidantes y reductores separados dentro de la célula. Por unlado, la célula realiza múltiples reacciones de oxidación de sustratos asociadas al ciclo de Krebs, al del glioxalato o la oxidación de xenobióticos por citocromosP450, mismas que se realizan dentro de compartimentos subcelulares como lamatriz mitocondrial, la matriz del peroxisomal o dentro de la luz del retícu-lo endoplasmático. Por el otro lado, la célula mantiene un ambiente reductor delcitoplasma, gracias a la actividad de la vía de las pentosas. Bajo esta perspecti-va, el estrés oxidativo es un resultado natural que se presenta en la interfase de estos dos compartimentos, por ejemplo cuando la ubiquinona, en lugar deceder sus electrones a los componentes de la cadena respiratoria, los cede al oxí-geno en forma prematura generando superóxido (véase el capítulo Cadena respiratoria).

Si la célula pierde el control sobre esta compartamentalización o no producesuficiente poder reductor, los procesos oxidativos se salen de regulación generandoestrés oxidativo, que de no ser neutralizado, conduce a un incremento de especiesreactivas de oxígeno (ERO), metabolitos y moléculas oxidadas e inevitablemen-te la célula muere por necrosis. Siguiendo este razonamiento, se dio por un hechoque el estrés oxidativo asociado a la muerte es una consecuencia inevitable y tar-día de la muerte celular que resulta de la perdida de control de procesos oxidan-tes como las cadenas de transporte de electrones. Esta visión se fortaleció con unagran variedad de estudios in vivo e in vitro que analizaron la relación entre estrésoxidativo y muerte celular por necrosis.


❚ NECROSIS VERSUS APOPTOSIS

El primer proceso de muerte celular descrito tanto a nivel histológico como bio-químico, fue la nneeccrroossiiss. La necrosis suele presentarse como consecuencia deeventos accidentales o patológicos como traumatismos, intoxicación o isquemia,entre otros; y se caracteriza por la pérdida de la organización del citoesqueleto, deltráfico vesicular y de los procesos biosintéticos y de generación de energía. Todoesto resulta en la pérdida de la organización subcelular, hinchamiento y eventualruptura de la membrana, con el consecuente vaciamiento del contenido intrace-lular al medio intersticial. El hecho de que el contenido celular esté fuera de lacélula induce la activación de una respuesta inflamatoria como un efecto secun-dario a la exposición de antígenos intracelulares, lo cual suele producir un mayorgrado de destrucción tisular.

En contraste con la necrosis, durante la muerte celular por apoptosis la célulaparticipa activamente encendiendo una cascada secuencial de endopeptidasas(enzimas que degradan las proteínas celulares) de la familia de ccaassppaassaass (cisteinaspartic acid endopeptidases). Son muchas las diferencias histológicas y bioquími-cas que se dan entre necrosis y apoptosis, en el cuadro 32-1 se listan algunas de lasdiferencias más sobresalientes, incluyendo su relación con el estrés oxidativo.

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Estrés oxidativo y apoptosis • 479

CCuuaaddrroo 3322--11.. CCoommppaarraacciióónn eennttrree aappooppttoossiiss yy nneeccrroossiiss

AAppooppttoossiiss NNeeccrroossiissDNA Fragmentación inter- Degradación inespecífica,

nucleosomal, patrón apariencia de “barrido”de escalera

Núcleo Marginación de la cromatina PinosisIntegridad de la Se preserva Se pierdemembranaInflamación asociada No hay Asociada con frecuenciaCambios de volumen Se reduce, “encogimiento” Aumento, “hinchamiento”celular u “oncosis”Fragmentación celular Presente con la formación No. Hay lisis celular

de “cuerpos apoptóticos”Activación de cas- Sí NopasasFosfatidil serina en Sí Nola membrana celular externaEstrés oxidativo Como elemento causal: Como consecuencia de la asociado NO•, O2

•, H2O2 muerte: peróxidos

La perspectiva catastrofista del proceso de muerte celular cambió en el dece-nio de 1970-79 con el trabajo de Kerr, Wyllie y Curri que postularon la existen-cia de un proceso fisiológico de muerte celular bien organizado, al que dieron elnombre de apoptosis (del griego: marchitar de una flor) mismo que quedó defini-do con base en sus características histológicas que lo distinguen de la necrosis.

Las evidencias de un control genético de la apoptosis fueron aportadas por losestudios realizados por Horowitz, Yuan y Hengartner durante el decenio de 1980-89 con el nematodo Caenorhabditis elegans, donde demostraron de maneraincontrovertible que la apotosis es un proceso de muerte controlado activamen-te por la célula y que resulta de la expresión de genes proapotóticos como ced-3(miembro de la familia de las caspasas) y antiapoptóticos como ced-9 (miembrode la familia de Bcl-2). La primera correlación entre el estrés oxidativo y la apop-tosis se evidenció por una variedad de estudios de expresión de los miembros deesta familia de Bcl-2 iniciados por Korsmeyer en el decenio de 1990-91. Estosestudios mostraron que Bcl-2, y otros miembros de la familia como Bcl-XL, nosólo interfieren con la apoptosis, sino que además inducen mecanismos celularesque neutralizan el daño oxidativo, sugiriendo la existencia de una relación entreestrés oxidativo y apoptosis. No obstante, esta visión ha cambiado al reconocerque la apoptosis de algunas neuronas, en particular la que es inducida por el fac-tor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), requiere de la producción de estrés oxida-tivo durante etapas tempranas de su activación. En la producción de este tipo deestrés oxidativo, las NADPH oxidasas parecen jugar un papel central.

Estudios posteriores han corroborado que la muerte por apoptosis es un pro-ceso con un alto grado de organización y control metabólico, que permite expli-car fenómenos como la reabsorción, la involución o la regresión de órganos ytejidos, como la que ocurre con los conductos Müllerianos en los machos duran-te la organogénesis de los órganos reproductores en los vertebrados.

A la luz de toda esta información, es necesario reconsiderar la relación entre el estrés oxidativo y la muerte celular por apoptosis, y reconocer que si bien elestrés oxidativo con mucha frecuencia es una consecuencia de la muerte, tam-bién puede fungir como una causa actuando como una señal intra o extracelularcelular temprana que activa el proceso de la muerte celular por apoptosis.

❚ LA APOPTOSIS COMO UN MECANISMODE SELECCIÓN NEGATIVA DE CÉLULAS

La selección negativa de células se presenta en etapas posteriores al desarrollo, ydepende de la activación de un programa de muerte que hasta este momento seencontraba apagado. Durante dicho mecanismo, en vez de factores tróficos, loque hay son factores proapoptóticos como el TNF-α, el ligando de FAS o CD95,


puesto que lo que se trata es inducir la apoptosis en las células que por algúnmotivo fisiológico deben desaparecer.

La figura 32-1 presenta en forma esquemática el progreso de la apoptosis quese inicia con la activación de receptores, como el del factor de necrosis tumoral(TNF-α) o el CD95/FAS. El proceso comienza con la formación de complejosmultiproteínicos como el denominado DISC (Death Inducing Signaling Com-plex) para el caso del receptor de TNF. Estos complejos se caracterizan por elreclutamiento de proteínas acopladoras que presentan dominios de interacciónproteínica denominados dominios de muerte, por haber sido identificados enesta vía. Estas proteínas incluyen dos isoformas de la proteína con dominios demuerte asociada al receptor de TNF (TRADD 1 y 2) o la proteína con dominiosde muerte asociada a FAS (FADD). A este grupo se suman otras proteínas comola cinasa RIP y el zimógeno de la caspasa 8 denominado originalmente FLICE.Mientras que a partir de RIP se desencadenan vías de transducción que llevan ala activación del sistema NF-kB, la activación del zimógeno (proteína no madu-ra) de la caspasa 8 activa propiamente al proceso de muerte celular por apopto-sis. La forma activa de la caspasa 8 procesa a más zimógenos de la misma caspasa

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DISC

Receptor

de TNF

TNF

Inhibidor del

receptor de TNF

TRADD

F ADD

Zim Casp8

Casp8

Bid

inacti v o

Bid

acti v o

Mitocond r ia

Citocromo c = APAF 2A P AF 1

A P AF 2

Zim

Casp 9 V ía i

n t r

í n s

e c a

Apoptosoma

Casp9

Casp3 Zim

Casp 3

Vía extrínseca

E R O

E R O

E R O

F r agmentación de DNA

Exposición de f os f atidilse r ina

Procesamiento proteínico

IAPS

Bcl-2

Esfingomielinasa

Esfingomielina

Ce r amida

FFiigguurraa 3322--11.. Esquema que muestra el progreso de la apoptosis.

promoviendo su maduración y amplificando la señal. El sustrato proteínico de lacaspasa 8 mejor estudiado es la proteína Bid, que al ser escindida genera un pép-tido que se une a la membrana externa de la mitocondria. La unión de Bid areceptores específicos sobre la membrana mitocondrial provoca importantescambios en la estructura de la membrana interna y de sus crestas. El cambio másrelevante inducido por Bid es la activación del poro de transición de la permea-bilidad de la membrana mitocondrial, que además de inducir una despolarizacióntransitoria de la membrana interna, permite la salida de citocromo c del espaciointermembranal. El citocromo c liberado, actúa con el factor activador de laapoptosis tipo 2 (APAF2) que unido a APAF1 y al zimógeno de la caspasa 9 pro-cesan y activan a la misma caspasa 9. Ésta a su vez activa al zimógeno de las cas-pasa 3 activando así al último eslabón en la cascada de endopeptidasas. A partirde esta actividad se inician los cambios en la fisiología celular característicos dela apoptosis descritos en el cuadro 32-1.

TNF, ceramida y estrés oxidativo

Como se ha mencionado, existen evidencias de que el estrés oxidativo es un ele-mento en la señalización temprana de la apoptosis. Durante la inducción de laapoptosis en respuesta al TNF se ha encontrado la presencia de especies molecu-lares con electrones desapareados que indican un incremento de la tención oxi-dativa; mientras que la presencia de agentes antioxidantes, agentes reductores oatrapadores de electrones confiere una protección limitada en contra de la muertecelular inducida por el TNF. Sin embargo, lo más importante es que la presencia deestos compuestos retrasa el avance del la apoptosis, siempre y cuando estos com-puestos estén presentes antes o al mismo tiempo de añadir el TNF. La adición deestos compuestos 60 minutos después de activar al receptor de TNF, carece de unefecto protector y la apoptosis procede con la misma velocidad a la que avanzaen células control que no fueron tratadas con estos compuestos. La existencia deun proceso de estrés oxidativo durante las etapas tempranas de la apoptosis indu-cida por el TNF ha sido reforzada por el efecto protector enzimas antioxidantespresentes en el medio de cultivo como la catalasa, la superóxido dismutasa o unacombinación de ambas. Cabe resaltar que en todos estos casos la presencia deagentes reductores, atrapadores de electrones y enzimas detoxificantes de H2O2y de O2

• sólo retrasa la apoptosis sugiriendo que el estrés oxidativo es un com-ponente temprano, pero, que no es el único y que su anulación no es suficientepara interferir con la apoptosis inducida por el TNF. En este fenómeno, tambiénse activa una esfingomielinasa ácida del retículo endoplasmático, responsable deliberar ceramida al citoplasma y contribuir a la apoptosis. De hecho, la mera adi-ción de ceramida a las células sensibles al TNF, no sólo induce la muerte celular


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sino que también induce estrés oxidativo. Tanto compuestos antioxidantes, comoreductores o atrapadores de electrones retrasan la muerte inducida por la cera-mida, en forma semejante a lo que ocurre con el TNF. A pesar de toda esta evi-dencia indirecta, aún no ha sido posible determinar el origen del estrés oxidativoinducido por el TNF o por la ceramida.

Bcl-2, apoptosis y estrés oxidativo

Desde la caracterización inicial de los genes que controlan la apoptosis en elnematodo Caenorhabditis elegans por el grupo de Horowitz, además de los genesinductores de apoptosis como ced3, también se identificaron genes como ced9cuya actividad interfiere con este tipo de muerte. El primer gen de mamíferosidentificado como ortólogo de ced-9 fue encontrado en un modelo de desarrollode leucemias de células B (B-cell leucemia gene 2: Bcl-2). Mientras que en elnematodo existe un solo gen con actividad antiapoptótica, en mamíferos se iden-tificaron dos familias representadas por Bcl-2 y por Bax, que tienen efectos anta-gónicos. Por un lado, Bcl-2 previene el desarrollo de la apoptosis, mientras queBax la induce. Pero el efecto protector de Bcl-2 va más allá de interferir con lamuerte por apoptosis ya que además se asocia a una mayor resistencia a la muer-te inducida por una variedad de agentes que inducen estrés oxidativo como elparaquat, el H2O2 o el O2

• entre otros. Estos efectos de Bcl-2 fortalecen la ideade que el estrés oxidativo es un componente importante durante la fase de acti-vación de la apoptosis.

Bcl-2 es una proteína pequeña con capacidad de formar homo y heterodíme-ros tanto con otros miembros de la familia de Bcl-2 como con miembros de la fa-milia antagónica Bax. El efecto protector o inductor de apoptosis depende de la titulación entre miembros de ambas familias, así, por ejemplo, un exceso de pro-teínas Bcl-2 sobre Bax resulta en un incremento del número de homodímerosBcl-2/Bcl-2 y tiene un efecto antiapoptótico. Cuando el número de monómerosde Bax se incrementa, se forman heterodímeros Bcl-2/Bax y se induce un efectoproapoptótico. A pesar de múltiples estudios, no se ha podido demostrar que eneste equilibrio entre homo y heterodímeros participe alguna reacción de oxido-rreducción que permitiera explicar el efecto protector contra el estrés oxidativoque confiere la sobreexpresión de Bcl-2 y otros miembros de esta familia comoBcl-X largo (Bcl-XL).

Hasta ahora se han propuesto tres teorías para explicar la protección inducidapor Bcl-2:

1. La sobre expresión de Bcl-2 podría inducir la expresión de mecanismosantioxidantes.


2. La sobre expresión de Bcl-2 podría inducir un estado prooxidante en lacélulas, sirviendo así como una vacuna que prepara a las células para con-tender mejor con un estrés oxidativo más intenso.

3. La sobre expresión de Bcl-2 podría inducir la expresión de enzimas quereparan el daño oxidativo.

Cualquiera que sea el mecanismo, está claro que Bcl-2 neutraliza el daño gene-rado por el estrés oxidativo y que su efecto protector de muerte se extiende másallá de la apoptosis.

❚ LA APOPTOSIS COMO UN MECANISMODE SELECCIÓN POSITIVA DE CÉLULAS

Este fenómeno corresponde a la muerte celular por apoptosis que se presentadurante el desarrollo, donde el programa de muerte y la cascada de caspasas seencuentran constitutivamente activa. En este caso, la presencia de factores desupervivencia o factores tróficos interfieren con la ejecución del programa y portanto se interrumpe la cascada de activación de caspasas. Tal es el caso de lasinaptogénesis, donde los factores tróficos como el NGF (factor de crecimientoneuronal) secretado por la neuronas blanco, guían a las dendritas que debenestablecer una sinápsis funcional. Toda neurona que se aleje del área de influen-cia del factor trófico generado por la neurona blanco muere, mientras que aqué-llas que se le acercan sobreviven. Una vez establecida la sinapsis, el programa de muerte se desactiva y por ende desaparece el mecanismo que induce la muerte.

Apoptosis neuronal y estrés oxidativo

En nemátodos el programa de muerte por apoptosis parece estar encendido enforma constitutiva en aquellas células programadas para morir. La muerte deneuronas durante la sinaptogénesis se encuentra en una situación similar, ya queen este caso es la presencia de supervivencia, también denominados factores tró-ficos, la que interrumpe el progreso del programa de muerte.

Una sobre estimulación neuronal también puede evocar la muerte por apop-tosis, a este fenómeno se le conoce como excitotoxicidad. Un caso particular demuerte neuronal por excitotoxicidad se presenta in vitro al despolarizar a lasneuronas granulares del cerebelo con un pulso de potasio (K+). Este estímuloactiva un proceso apoptótico en el que participa una cascada de caspasas y portanto puede detenerse por medio de inhibidores de caspasas. Sin embrago, duran-


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te las etapas tempranas de este proceso de apoptosis se ha podido documentar unincremento transitorio de estrés oxidativo asociado al O2

• y no a la producciónde H2O2. Aún es controversial la fuente de este estrés oxidativo, pero es claro quejuega un papel activador de la muerte por apoptosis, ya que al interferir con elestrés oxidativo en etapas tempranas, la activación posterior de caspasas no sepresenta. Estas observaciones apoyan la idea de que el estrés oxidativo generadoen respuesta a la despolarización es un paso indispensable en la activación delproceso apoptótico.

❚ CONCLUSIONES

Como hemos visto el estudio de la relación entre el estrés oxidativo y la apopto-sis ha evolucionado. En un inicio se tenía una visión catastrofista en la que elestrés oxidativo era una consecuencia terminal de la pérdida de control de losprocesos oxidativos en una célula que muere. Hoy en día, ha quedado claro queexisten formas de estrés oxidativo que participan en etapas muy tempranas de laseñalización que conduce a la activación de la apoptosis. Este pequeño cambiode posición, del final al principio del proceso de muerte, marca sólo el principio,ya que aún quedan muchas preguntas por resolver como son:

1. ¿Cuál es la naturaleza bioquímica de las especies reactivas?2. ¿Cuál es la fuente de los electrones?3. ¿Cómo se activan estos procesos oxidantes?4. ¿Cuáles son los blancos sensibles al estrés oxidativo?

En cualquier caso, es claro que el estrés oxidativo forma parte de la secuenciade eventos tempranos de la vía de activación de la apoptosis.


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EERROO YY SSEEÑÑAALLIIZZAACCIIÓÓNN

Luis Enrique Gómez QuirozDeidry Beatriz Cuevas Bahena

❚ INTRODUCCIÓN

La definición de los segundos mensajeros es que se generan en el momento enque se activa un receptor, son de corta vida, y actúan específicamente sobre lasmoléculas efectoras. Para poder clasificar a las especies reactivas de oxígeno(ERO) como segundos mensajeros, habrá que verificar si cumplen con la defini-ción antes expuesta. Las ERO pueden generarse en el momento de la activacióndel receptor y son también de muy corta vida, sin embargo, es aún difícil demos-trar su especificidad. Como se ha venido explicando, el •OH reacciona práctica-mente con cualquier molécula con la que se encuentra, por lo que no se puedehablar sobre especificidad en la reacción de este radical libre, por otro lado, lasmoléculas como el peróxido de hidrógeno (H2O2) o el radical superóxido (O2

•)no son tan reactivas como el •OH, y pueden ser producidas de manera endógenapor la activación de receptores, y controladas enzimáticamente, por lo que cadavez más se les reconoce como segundos mensajeros.

De lo anterior se infiere que las ERO, incluso en situaciones de estrés oxidati-vo, así como las especies reactivas de nitrógeno (ERN), no son del todo negativaspara la célula si su producción es generada bajo condiciones controladas de con-centración y tiempo.

33

❚ LA NADPH OXIDASA Y LA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES

En los últimos años se ha reunido evidencia de que varios factores de crecimien-to y citocinas generan la producción de ERO como intermediarias en la señaliza-ción. El factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento delendotelio vascular (VEGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas(PDGF), el factor de crecimiento neuronal (NGF), el factor transformador decrecimiento beta (TGF-β), entre otros, están relacionados estrechamente con lageneración de ERO para fines de transducción de señales. Se ha sugerido queestos receptores emplean a la enzima NADPH oxidasa (NOX) para la producciónde las ERO. La NOX cataliza la reducción del oxígeno a O2

•, reacción mediadapor el NADPH. La enzima es un complejo multiproteínico que contiene proteí-nas citosólicas como la p67PHOX, la p47PHOX, la p40PHOX y la GTPasa Rac, que setranslocan a la membrana para unirse a la subunidad gp91. La regulación de laactividad de la enzima está estrechamente vinculada a la actividad de Rac, se hareportado que varios factores de crecimiento inducen la expresión de Rac, aun-que también pueden existir una interacción directa entre la oxidasa y los recep-tores a estos factores de crecimiento (véase el capítulo NADPH oxidasa).

Además de jugar un papel central en las células fagocíticas durante el controlde las infecciones microbianas, la NOX no fagocítica tiene cada vez un papel másclaro en la transducción de señales, las cuales son fundamentales en células comolos hepatocitos, los espermatozoides, los fibroblastos, los cardiomiocitos, las célu-las endoteliales, entre otras. Algunos estudios recientes han mostrado que elempleo de inhibidores de la NOX, como el DPI o el AEBSF, bloquean la produc-ción de las ERO y la transducción de señales. El empleo de estos compuestos, porejemplo, anuló completamente la apoptosis inducida por el TGF-β en hepatoci-tos fetales de rata, lo que sugiere que la actividad de la NOX es fundamental enla transducción de la señal.

❚ PROTEÍNAS SENSORAS DE LAS ERO

El conocimiento de que las ERO regulan una gran cantidad de actividades celu-lares no es reciente, sin embargo aún no se conoce completamente como se llevaa cabo el mecanismo de regulación. En los últimos años se ha investigado el papelde los grupos tioles (-SH) de los residuos de cisteína en el control de la señal. Laoxidación de estos grupos reactivos en varias proteínas de las rutas de señaliza-ción ha pasado a ser el foco de atención en este mecanismo. Estos grupos puedenser oxidados fácilmente, lo que hace presumir que los sensores de las ERO de-ben ser proteínas con tioles altamente reactivos. Se han propuesto a varias pro-teínas como sensoras de estrés oxidativo, como son las proteínas cinasas C,


específicamente la isoforma α (PKC-α), que son activadas rápidamente en pre-sencia de H2O2 en un proceso independiente de fosfolípidos, que involucra la fos-forilación de una tirosina en el sitio activo. Algunas otras proteínas que se hansugerido fuertemente como sensores de ERO son, por citar sólo algunas, MEKK1,JNK, Akt, IKK, SAPK, p53, ASK1, entre otras.

De manera general, la activación de las rutas de señalización por las EROrequiere de la activación directa de las proteínas sensoras por los radicales libres.Una vez activadas, ellas son las que transducen la señal a otras proteínas en la cas-cada de señalización o activan directamente a los factores de transcripción queregularán la transcripción de los genes blanco (figura 33-1).

Se han identificado al menos tres mecanismos mediante los cuales los fenóme-nos oxidativos pueden regular la función de una proteína.

El primero de ellos se presenta por medio de la oxidación de una cisteína enel dominio de unión al DNA de un factor de trascripción. Esta modificación en la proteína genera pérdida en la afinidad de unión a su elemento de respuesta,lo que origina una deficiencia en la transcripción de los genes blanco (figura 33-2A).

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ERO y señalización • 489

Receptores de f actores de crecimiento(TG F , TN F ,PDG F , EGF) Mitocond r ia Radiaciones

E R O

Sensores

F actores de t r ansc r ipción


Cinasas

T r ansc r ipción

FFiigguurraa 3333--11.. Cascada de señalización que activa a los factores de transcripción.

Otro mecanismo es mediante la oxidación de cisteínas en el centro catalítico, quederiva en pérdida de la funcionalidad de la proteína. Este es el caso de algunascinasas y fosfatasas, que se explicará en detalle más adelante (figura 33-2B).

Estos mecanismo regulan negativamente la función de las proteínas, pero tam-bién existe un mecanismo de regulación positiva que involucra la oxidación decisteínas y la formación de puentes disulfuro en proteínas inhibidoras asociadasa factores de transcripción o enzimas. Al inactivar a los inhibidores se permite laliberación de la enzima y su activación (figura 33-2C).

❚ FOSFATASAS COMO EJEMPLO DE REGULACIÓN REDOXEN LAS CASCADAS SE SEÑALIZACIÓN

Las reacciones de fosforilación y desfosforilación son, tal vez, el principal meca-nismo de transducción de señales dentro de la célula. La fosforilación de residuosde tirosina en las proteínas se lleva a cabo por las tirosina cinasas, mientras que lareacción inversa (la desfosforilación), la llevan a cabo las tirosina fosfatasas. Elconocimiento de que las fosfatasas son reguladas por reacciones de oxidación vatomando cada vez más relevancia en diversos estudios de señalización celular.


SH S-Ox

SH S-Ox

SH SH S S

Acti v ación

Inacti v ación

Inacti v ación

A

B

C

FFiigguurraa 3333--22.. Mecanismos de regulación dados por los fenómenos oxidativos. AA)) Oxidación de unacisteína en el dominio de unión al DNA de un factor de trascripción. BB)) Oxidación de cisteínas enel centro catalítico del factor de transcripción. CC)) Inactivación de los inhibidores que retienen alfactor de transcripción.

Bajo condiciones fisiológicas, las cisteínas en el centro catalítico de las fosfata-sas tienen un pKa bajo y se encuentran en un estado de anión tiolato (-S-), lo cuallas hace altamente susceptibles de ser oxidadas. La oxidación de estas cisteínasbloquea la actividad de la enzima, lo que origina la pérdida de la capacidad deremover fosfatos, ya que la catálisis está mediada por la transferencia del fosfatodel sustrato a la cisteína catalítica, seguida de una hidrólisis del fosfato.©

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C C = N

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N

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Cis 215

Ser 216

Acido Sul f enico

Sul f enilamida

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N N

N N

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C

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N Cis 215

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X

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C

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N

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O Cis 215

Ser 216 II

H

C

FFiigguurraa 3333--33.. Modificaciones oxidativas de cisteínas en centros catalíticos. AA)) Oxidación del anióntiolato. Ácido sulfénico (-S-OH); ácido sulfínico (-S-O2H) y ácido sulfónico (-S-O3H). BB)) Oxida-ción de la cisteína catalítica de la fosfatasa PTP1B. En su estado de menor oxidación o de ácido sul-fénico, el sulfuro reacciona con un nitrógeno de una serina vecina formando sulfanilamida osulfenamida. CC)) La sulfanilamida se transforma directamente o vía ácido sulfénico a su forma acti-va de anión tiolato.

Experimentalmente se ha observado que las concentraciones fisiológicas deH2O2 pueden generar la oxidación del anión tiolato produciendo un residuo de áci-do sulfénico (-S-OH). Esta modificación puede ser reversible por agentes reduc-tores como el glutatión (GSH) sin embargo, bajo estrés oxidativo, el ácidosulfénico puede ser oxidado aún más para generar los ácidos sulfínico (-S-O2H)y sulfónico (-S-O3H), estas modificaciones son irreversibles, por lo que la enzimaqueda completamente inhibida (figura 33-3A).

Existe otra reacción de oxidación en la cisteína catalítica; se ha observado en lafosfatasa PTP1B, que en su estado de menor oxidación o de ácido sulfénico, el sul-furo reacciona con un nitrógeno de una serina vecina formando una estructuracíclica de 5 miembros conocida como sulfanilamida o sulfenamida (figura 33-2B).La formación de esta especie es muy rápida y se ha observado que en dicho estadoya no puede sufrir más oxidaciones. Lo interesante de este intermediario es que, adiferencia de los ácidos sulfínico y sulfónico, puede ser transformado directa o indi-rectamente, vía ácido sulfénico, a su forma activa anión tiolato (figura 33-3A y 33-3C). Esta reacción se puede llevar a acabo por nucleófilos como el GSH, el cualpuede conjugarse en un intermediario S-glutationilato, el cual puede ser reducidoa tiolato por otros agentes reductores. Este mecanismo puede representar unaforma de estabilización de las fosfatasas ante condiciones de estrés oxidativo.

❚ FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN QUE RESPONDEN A LAS ERO

A mediados del decenio de 1980-89, se observó que el H2O2 promueve rápida-mente la síntesis de aproximadamente 30 proteínas, de las cuales casi la mitad seexpresaban en menos de 10 min. Más tarde se descubrió en bacterias, que la ma-yoría de ellas eran reguladas por una proteína conocida ahora como OxyR, lacual es un factor de transcripción perteneciente a la familia de las LysR. OxyRpuede existir en dos versiones: reducida y oxidada, y es esta última la encargadade activar la transcripción.

En los mamíferos aún no se ha encontrado un homólogo de OxyR, y la iden-tificación de proteínas sensoras ha sido una tarea difícil y controversial. Aunquese sabe con mucha certidumbre que varios factores de transcripción en los mamí-feros responden de manera similar a OxyR, entre los que podemos destacar a losfactores AP1, NF-κB y Nrf2.

AP1

La proteína Activadora 1 (AP1) es un término que se aplica en realidad a todauna familia de factores de transcripción que poseen dominios básicos de cierre de


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leucina (bZIP). La familia se compone principalmente de c-Fos, FosB, Fra1, Fra2,c-Jun, JunB,JunD, entre otras. La AP1 se une a una secuencia consenso o elementode respuesta en el DNA llamada TRE ( Elemento de respuesta al 12-O-tetrade-canoil forbol-13- acetato, TPA). Para tener un factor de transcripción activo serequiere que se dimerisen dos miembros de la familia, pueden exisitir varias com-binaciones entre las proteínas, sin embargo el dímero más común es el formadopor c-Fos y c-Jun.

Tomando como ejemplo al heterodímero Fos/Jun, la activación de AP1 se rea-liza por un proceso dependiente de la fosforilación de la subunidad c-Jun por lacinasa JNK, la cual es activada en citoplasma y translocada al núcleo donde fos-forila a c-Jun, que una vez fosforilado se une a c-Fos y el dímero, a su vez, se unea la secuencia regulatoria de los genes blanco.

La lista de los genes que se encuentran regulados por AP1 es amplia, y destacanlos que codifican para la colágena, la ciclina D, y las citocinas TGFβ, IL-8, TNF-α,entre muchos otros más. Lo que hace que AP1 sea un factor de transcripción desuma importancia para el buen funcionamiento de un organismo, ya que regulabásicamente procesos de proliferación, reparación, fase aguda hepática e in-flamación.

Si bien AP1 puede ser activado por proteínas de la cascada de señalización delas MAPK, de la cual varios de sus miembros se han propuesto como sensores de ERO, existe evidencia de que puede ser activado directamente por modifica-ción en el estado de oxidación de ciertas cisteínas. Por ejemplo, la sustitución dela cisteína 154 en Fos o de la cisteína 272 en Jun por una serina, genera la perdi-da de la regulación redox de AP1 y de su unión al DNA, lo que representa unaregulación negativa de la actividad de AP1 por las ERO dentro del núcleo.

NF-κB

El factor nuclear κB (NF-κB) es por mucho el factor de transcripción reguladopor radicales libres más estudiado. NF-κB fue identificado en 1986 como un fac-tor de transcripción que se une a un elemento de respuesta en el promotor delgen de la cadena ligera de la inmunoglobulina κ de las células B. Originalmentese pensó que era específico de este tipo celular, pero ahora se sabe que está pre-sente en prácticamente todos los tipos celulares y es capaz de regular fenómenostanto proliferativos como de apoptosis.

El NF-κB bajo condiciones basales se encuentra en el citoplasma, formado pordímeros que resultan de la combinación de proteínas de la familia Rel. En losmamíferos se han identificado 5 miembros de esta familia: p65 (o Rel A), c-Rel,RelB, p52 (y su precursor p100), p50 (y su precursor p105). El dominio Rel, co-mún en todos ellos, se compone de tres regiones funcionales: dominio de dime-


rización, dominio de localización nuclear y dominio de unión al DNA; dentro deeste último, y en el caso de p50, se encuentra la cisteína 62 la cual es crítica parala regulación de unión al DNA mediada por ERO. Si bien todos los miembros de la familia Rel pueden formar homodímeros entre sí (excepto RelB), la formamás abundante es el heterodímero p65/p50, el cual se une con mayor afinidad asecuencia general GGGRNNYYCC, donde R es una purina, Y es una pirimidinay N cualquier otro nucleótido. Se sabe, por estudios en animales mutados, que notodos los NF-κB ejercen la misma función, de hecho sólo p65 es esencial para lasobrevivencia.

El factor NF-κB se mantiene en el citoplasma, de manera inactiva, formandoun complejo inhibitorio con la proteína IκB. Las IκB son proteínas ricas en repe-ticiones de ankirina que se unen al dímero del NF-κB y enmascaran su secuenciade localización nuclear. Se han identificado varios miembros de esta familia queincluyen a la IκB-α, -β, -ε, -δ, y Bcl-3. La interacción entre el NF-κB y la proteí-na IκB se rompe cuando se recibe un estímulo que permite la fosforilación delIκB, normalmente esta señal proveniene de la cinasa específica del NF-κB (IKK);la fosforilación del IkB permite su ubiquitinación en residuos de serina y treoni-na y su posterior degradación por el proteosoma 26S. Una vez liberado de IκB, elfactor NF-κB se transloca al núcleo donde se une a su secuencia regulatoria y esti-


p65 p65

p50

P

De gradación

p50

p65 p50

Ikk

p65 p50

Núcleo

E R O

P P

26S κ B

Mitocond r ia

NADPH

o xidasa Receptores

NIK MEKK1

Src

PKC

-UB-UB-UB-UB

-UB-UB-UB-UB

FFiigguurraa 3333--44.. Esquema general de la activación del NF-κB.

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mula la expresión de los genes blanco que dirige, incluyendo la síntesis de IκB-αy β, los cuales ayudan a terminar la respuesta por la formación de un nuevo com-plejo inactivo IκB/NF-κB que lo exporta al citoplasma. Se han identificado unagran cantidad de genes que son regulados por este factor de transcripción, entrelos cuales se encuentran citocinas y factores de crecimiento (IL-2, IL-8, IL-6,IFN-γ, TNF-α), receptores inmunológicos (Fas, MHC clase I ), moléculas deadhesión (E-selectina, I-CAM), óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS), proteí-nas antiapoptóticas (Bcl-xL, Bcl-2, c-IAP, entre otras), entre muchas otras más.

Varios receptores de citocinas y factores de crecimiento inducen la activacióndel NF-κB, no sólo por su ruta canónica mediada por la IKK sino también pormedio de las MAPK cinasas, particularmente por la JNK y p38. JNK activa coor-dinadamente a la IKK e induce la fosforilación de los residuos de serina del IκB-αen respuesta a la estimulación con el TNF-α, MEKK1 activa a la IKK-α y –β den-tro del complejo IKK. NIK también puede activar directamente a la IKK-α. Porotro lado, se ha visto que la JNK interactúa con la subunidad c-Rel e induce laactivación del factor nuclear, sin embargo, no fosforila directamente a las subuni-dades. La figura 33-4 muestra un esquema general de la activación del NF-κB.

La sobre expresión de Rac induce la activación del NF-κB, y el empleo de anti-oxidantes disminuye esta activación, lo que deja claro que la producción de EROpor la NADPH oxidasa impacta directamente en la activación de este factor detranscripción.

Además de la activación del NF-κB por la fosforilación de las serinas 32 y 36del IκB, también puede ser activado por la fosforilación de la tirosina 42. Unaspecto que llama mucho la atención es que el tratamiento con pervanadato, uninhibidor de tirosina fosfatasas, activa al NF-κB sin la degradación proteolítica delIκB. Varios receptores tienen asociadas tirosin-cinasas (PTK) como mediadoresen la transducción de señales, entre ellas se encuentran Lck y Src, las cuales sonactivadas por las ERO, estas PTK activan a su vez al NF-κB por medio de la fos-forilación de la tirosina 42. Se sabe que se requiere de Src para la activación delfactor inducida por la luz ultra violeta o por el TNF-α, también se ha mostradoen estudios con pervanadato o de hipoxia/reoxigenación que la fosforilación dela tirosisna 42 disminuye notablemente en presencia de inhibidores de Src. Masaún, la presencia de anti-oxidantes como catalasa o glutatión peroxidasa (GPx),pero no de las SOD, disminuye notablemente la fosforilación de la tirosina indu-cida por Src, lo que sugiere que es un proceso mediado por H2O2. Como se hamencionado, la fosforilación de la tirosina 42 no conduce a la degradación delIκB, se ha mostrado que la subunidad p85 de la fosfatidil inositol cinasa (PI3K)interactúa con el IκB fosforilado en la tirosina, y que tal vez pudiera ésta facilitarla activación y translocación al núcleo del NF-κB.

Al igual que en el caso de la AP1, la presencia de las ERO en el citoplasmaregula la activación del NF-κB, sin embargo en el núcleo las ERO tiene un efec-


to negativo. Bajo condiciones oxidantes la cisteína 62 de p50 es oxidada lo quehace que disminuya su afinidad por su secuencia en el DNA, el óxido nítrico(NO•) también puede tener este efecto por la nitrosilación de ese mismo resi-duo, de hecho, como se ha mencionado, la activación del NF-κB induce la expre-sión de la iNOS, la cual aumenta notablemente la produccón del NO•, lo quesugiere que el NO· puede jugar el papel de regulador negativo en la activacióndel NF-κB.

Nrf2

El factor 2 relacionado con NF-E2 (Nrf2) es otro de los factores de transcripciónque se activan por ERO que, si bien se descubrió hace tiempo, ha tomado mucharelevancia en los últimos años. La importancia de Nrf2 reside en su capacidadpara controlar la expresión de varias proteínas de defensa anti-oxidante y de des-toxificación. Diversos artículos se han publicado en el sentido de que Nrf2 es unfactor clave en citoprotección en procesos como carcinogénesis, respuesta infla-matoria, neuroprotección, entre otros.

En condiciones normales, Nrf2 se encuentra en citosol unido a Keap1, proteí-na que le impide su translocación al núcleo. Cuando Keap1 es degradada por elproteosoma 26S, Nrf2 se transloca al núcleo donde se une a la proteína Maf, la


Nrf2 K eap1

Nrf2 K eap1

Maf Nrf2 Núcleo

E R O Cinasas

Anti- o xidantes

Proteínas de dest o xificación

DEGRA D A CIÓN

26S

ARE

K eap1

Maf

UB-UB-UB-UB-

FFiigguurraa 3333--55.. Actividad del factor de transcripción Nrf2.

cual es una proteína que también se regula por las ERO, una vez formado eldímero Nrf2/Maf, se une al elemento de respuesta antioxidante (ARE) de losgenes que controla (figura 33-5). Keap1 llama particularmente la atención, yaque es una proteína que contiene 27 residuos de cisteína, y varios de ellos sonaltamente reactivos, lo que la coloca como candidata a proteína sensora de ERO,además que responde rápidamente a los cambios en el estado redox celular.

Nrf2 ha sido implicado en la regulación de la NAD(P) quinona reductasa, engenes que regulan destoxificación de fase 2 como UDP-gluconoril-transferasa,Aflotoxina B1 aldehido reductasa y la epoxido hidrolasa microsomal. Dentro delas enzimas antioxidantes que se encuentran bajo el control de Nrf2 están la cata-lasa, la GPx, la SOD, tiorredoxina, hemooxigenasa 1, ferritina, entre otras (figu-ra 33-6).

Como se ha discutido ya en el capítulo referente al GSH, la enzima γ-gluta-milcisteina sintetasa es la enzima que regula el paso limitante o de control en lasíntesis del tripéptido GSH, esta enzima está también regulada por el Nrf2, loque involucra directamente al factor de transcripción en la regulación y la disponi-bilidad del GSH. De hecho, el factor Nrf2 regula tanto la producción basal, comola inducida, de GSH. En algunos tipos celulares, el intercambio entre cisteína y

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Inductores

Hidroperóxidos

NO

Metales pesados

Quinonas

Di f enoles

Prostaglandinas

Estrés en retículo

Disulfuros

Hemo

Isotiocianatos

Otros

Nrf2

Genes acti v ados

Proteínas anti o xidantes

Enzimas gene r ado r as de GSH

Proteínas chaperonas

Proteínas del proteosoma

Ezimas dest o xificantes de f ase 2


Otros

•

FFiigguurraa 3333--66.. Moléculas inductoras de Nrf2 y enzimas que se encuentran bajo su control trans-cripcional.

glutamato es fundamental para mantener los niveles adecuados de GSH, estetransporte de intercambio es mediado por el sistema Xc

– el cual estÁ formadopor dos proteínas, una de ellas, la xCT está controlada también por el Nrf2.

En general, por tecnología de microarreglos se han identificado alrededor de200 genes que son regulados por el Nrf2, muchos de los cuales, como se ha men-cionado, codifican para proteínas antioxidantes y de citoprotección.

Se ha observado que la eliminación del Nrf2 incrementa la sensibilidad de lasneuronas al estrés oxidativo, reduciendo la expresión basal e inducida de genesde citoprotección. También se observó que los ratones deficientes en este factorpresentaron niveles altos de formación de aductos en el DNA después de laexposición de agentes carcinogénicos, como la aflotoxina B1, materia particuladade diesel, entre otros. Mas aún, se observó que las cualidades quimiopreventivasdel oltipraz y sulfuraphane son abolidas en los ratones deficientes de Nrf2, lo quesugiere que estos fármacos actúan regulando la actividad de Nrf2.

❚ CONCLUSIONES

La visión que se tenía de que las ERO representaban un factor negativo para lacélula ha ido cambiando con el tiempo. La regulación de la expresión génica porradicales libres tiene suma importancia tanto en los procesos fisiológicos, comoen los patológicos para el organismo.

El uso de nuevas tecnologías como el estudio de la expresión de genes pormicroarreglos ha favorecido que el avance en la identificación de genes que seactivan por ERO sea más rápido. Por otro lado, el analisis comparativo de lassecuencias promotoras de genes que responden bajo condiciones similares hanpermitido desenmascarar secuencias regulatorias comunes o que se sobreponena la expresión de genes que responden a ERO.

La regulación de la expresión de genes por las ERO es un tema muy amplio,cada día se descubren nuevas interaciones entre las rutas dirigidas por radicaleslibres, de modo que lo que presento aquí, es sólo una pequeña parte de un vastomundo de la regulación de señales dentro de la célula.

❚ REFERENCIAS

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❚ 501 ❚

EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASSDDEE OOXXÍÍGGEENNOO EENN LLAASS PPLLAANNTTAASS

Fernando Rivera CabreraBeatriz Buentello Volante

Fernando Díaz de León SánchezLaura Josefina Pérez-Flores

❚ INTRODUCCIÓN

A partir de la introducción del oxígeno molecular en nuestra atmósfera por losorganismos fotosintéticos, hace aproximadamente 2.5 billones de años, las espe-cies reactivas de oxígeno (ERO) han sido los compañeros indeseables de la vidaaeróbica.

Los intermediarios reactivos de oxígeno o ERO son formas parcialmente redu-cidas o activadas del oxígeno atmosférico (O2). Generalmente provienen de laexcitación del O2 para formar al oxígeno singulete (1O2) o de la transferencia deuno, dos o tres electrones al O2 para formar, respectivamente, al radical supe-róxido (O2

•), al peróxido de hidrógeno (H2O2) o al radical hidroxilo (•OH)(capítulo 2).

El 1O2 se forma en las plantas principalmente por la fotoexcitación de la cloro-fila, puesto que en este caso, un electrón se eleva a un orbital de energía superior,liberando al oxígeno de su estado de spin restringido y favoreciendo su reaccióncon moléculas orgánicas. Normalmente los carotenoides (agentes fotoprotectores)apagan el estado excitado de la clorofila previniendo así la formación del 1O2. Aligual que en las células de los animales, en las plantas generalmente el O2

• es la

34

primera ERO producida por reducción del oxígeno con un electrón, su vida mediaes inferior a un segundo. Dos moléculas de O2

• dismutan rápidamente generandoH2O2, ya sea por una reacción no enzimática o por una reacción catalizada por laenzima superóxido dismutasa (SOD). Existen diversos tipos de SOD en plantas,localizadas en distintos compartimientos celulares. Como se ha mencionado en loscapítulos anteriores, en presencia de metales de transición como el hierro, el H2O2produce el •OH mediante las reacciones de Haber-Weiss o de Fenton.

En contraste con el O2, que en su estado basal es relativamente poco reactivo,las ERO son altamente reactivas, tóxicas y capaces de oxidar diversas biomo-léculas (lípidos de membranas, proteínas y DNA, véase Sección IV) que alteranel metabolismo y pueden llevar a la destrucción oxidativa de la célula. En conse-cuencia, la evolución de los organismos aerobios ha dependido del desarrollo demecanismos eficientes de remoción de las ERO para minimizar sus efectos cito-tóxicos. Debido a que las plantas generan ERO como parte de su metabolismo ya que estos niveles se incrementan en condiciones de estrés, no es sorprendenteque las plantas también posean mecanismos antioxidantes enzimáticos y no enzi-máticos para prevenir que las ERO alcancen niveles destructivos y mantener elbalance redox celular. Estos mecanismos son muy importantes ya que en la na-turaleza, las plantas están expuestas frecuentemente a distintos tipos de estrésbbiióóttiiccoo (virus, bacterias, nemátodos, hongos e insectos), aabbiióóttiiccoo o ambos (cam-bios climáticos como sequía, frío, intensidad luminosa elevada, entre otros). Se hasugerido que el aumento en la generación de ERO en respuesta a los diferentestipos de estrés, podría ayudar a explicar la tolerancia cruzada en plantas. En latolerancia cruzada, la exposición previa a un estrés moderado aumenta la tole-rancia a un estrés posterior más severo.

❚ LAS ERO COMO MOLÉCULAS DE SEÑALIZACIÓN EN PLANTAS

Además de su papel como subproductos tóxicos del metabolismo aeróbico, recien-temente se ha identificado un nuevo papel para las ERO. En bajas concentraciones,estas moléculas actúan como señales reguladoras de procesos biológicos, como elcrecimiento y el desarrollo, la muerte celular programada, las respuestas a hor-monas y a distintos tipos de estrés bióticos y abióticos. Se han propuesto varioscriterios para demostrar el papel de las ERO como señales endógenas en diversosprocesos fisiológicos o del desarrollo. Entre éstos se encuentran:

a) La inducción o modulación del proceso por la aplicación exógena de las ERO.b) La correlación de la inhibición del proceso con la remoción de las ERO (a

través de la inhibición de su síntesis/o de la estimulación de su metabolis-mo por medios químicos o genéticos).


c) Cambios en el proceso analizado que correlacionen con cambios en la sen-sibilidad a las ERO.

d) La correlación de la síntesis/aumento en la concentración de ERO con elproceso analizado.

El uso de las ERO como moléculas de señalización en las células vegetalessugiere que, durante el curso de la evolución, las plantas adquirieron un altogrado de control sobre la toxicidad de las ERO lo que ha requerido de una granred de genes denominada “red de genes de oxígeno reactivo”, compuesta en Ara-bidopsis por al menos 152 genes.

En contraste con la señalización de Ca2+, que se controla en las plantas predo-

minantemente por su almacenamiento y liberación, la señalización de las ERO secontrola a través de su producción y de su remoción (figura 34-1). Diferentestipos de señales del desarrollo, así como del ambiente, alimentan la red de seña-lización de las ERO y perturban su homeostasis de manera celular o comparti-miento específicas. La alteración en los niveles de las ERO es percibida pordiferentes proteínas, enzimas o receptores, modulando diversas vías metabólicasdel desarrollo y de defensa. Las ERO se generan por distintas enzimas con diver-sas localizaciones celulares y son removidas por enzimas localizadas también en distintos compartimientos celulares (figura 34-1 y cuadro 34-1). La intensidad,duración y localización de las diferentes señales de las ERO están determinadaspor la interrelación entre las vías de producción y de remoción de las ERO, y sulocalización subcelular determina el espectro de respuestas celulares activadas.Además, las vías de remoción de las ERO son también responsables de manteneruna línea basal baja de estado estacionario del estrés oxidativo, sobre la cual pue-den registrarse estas señales.

❚ PRODUCCIÓN DE ERO EN PLANTAS

Como se mencionó antes, existen muchas fuentes potenciales de ERO en lasplantas (figura 34-1). Entre ellas, algunas reacciones involucradas en el metabo-lismo normal, en concordancia con el concepto tradicional de considerar a las EROcomo subproductos indeseables del metabolismo aeróbico. Otras fuentes de ERO corresponden a vías que se incrementan durante distintos tipos de estrés.

Los organelos con una actividad oxidante muy alta o con una velocidad inten-sa de flujo de electrones, como los cloroplastos, las mitocondrias y los microcuer-pos, son fuentes importantes de producción de ERO en las células vegetales. Enlos cloroplastos la reacción de Mehler y los pigmentos antena son las fuentesprincipales de generación de ERO (figura 34-2). Esta generación se incrementa©

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Especies reactivas de oxígeno en las plantas • 503

por condiciones limitantes de fijación de CO2, tales como un estrés de sequía,salino o de temperatura, así como por la combinación de estas condiciones conestrés de alta intensidad luminosa. En las plantas C3, las condiciones de limita-ción de CO2 activan la vía de la fotorrespiración, en la que se genera al H2O2 enlos peroxisomas por la enzima glicolato oxidasa. También puede ocurrir la pro-ducción de H2O2 en los microcuerpos durante el catabolismo de los lípidos comoun subproducto de la oxidación de los ácidos grasos. En las mitocondrias, lasobrerreducción de la cadena de transporte de electrones es la principal fuentede producción de O2

• bajo condiciones de estrés específicas. Recientemente sehan estudiado las UCP (proteínas desacoplantes) que disipan el gradiente de H+.Las UCP son proteínas transportadoras, miembros de la familia de acarreadoresde aniones. Se ha encontrado que estas proteínas provocan un escurrimiento deH+ en la membrana interna mitocondrial que depende de la presencia de O2

•.Estos resultados son consistentes con la idea de que las UCP ayudan a mantenerla velocidad de transporte de electrones reduciendo la desviación de éstos para laformación de ERO. Otras fuentes adicionales de ERO en las plantas incluyen lasreacciones de desintoxicación catalizadas por los citocromos, tanto en el citoplas-ma como en el retículo endoplasmático.

En años recientes se han identificado nuevas fuentes de ERO en las plantasincluyendo a las oxidasas dependientes de NADPH (NOX), a las amino oxida-


P ercepción de E R O

Sensores o blancos

Estrés abiótico Sequía, salino, estrés por frío. Alta intensidad luminosa.

Estrés biótico Ataque por patógenos

Metabolismo aeróbico F otosíntesis respiración, etc

Otros procesos del crecimiento y desarrollo Respuestas a hormonas, gravitropismo, regulación del cierre de estomas

MCP en aleuronade semillas, etc

T r ansducción de estrés

T r ansducción de la señal

Producción de ERO

O 2

• , OH, • H 2 O

2

Cambios en el estado RED O X

F actores de transcripción sensi b les al

estado RED O X

Ca 2+

Calmodulina Cinasas (CDPK)

Acti v ación de

fosfolipasas

Cascada de MAPK

E f ectos directos en proteínas

E f ectos en las células

Regulación de la

expresión génica

Acti v ación de cascadas de señalización

Remoción de ERO

Oxidación de lípidos

FFiigguurraa 3344--11.. Procesos de producción, remoción y señalización de ERO en plantas. El metabolismoaerobio, los estímulos ambientales y el estrés biótico y abiótico pueden estimular la producción deERO y éstas a su vez inducir una gran variedad de efectos en las células.

sas y a las peroxidasas de pared celular. Estas enzimas están fuertemente regula-das y participan en la producción de las ERO durante procesos tales como lamuerte celular programada y la defensa contra los patógenos. Las NOX de la mem-brana plasmática de plantas han sido objeto de intensas investigaciones. Se piensaque las NOX de plantas son de forma similar a las NOX5, reguladas por calcioen mamíferos, y tienen un papel clave en la señalización de las ERO. Las enzimasvegetales contienen flavocitocromos que forman una cadena de transporte deelectrones capaz de reducir el O2 a O2

•. Se ha demostrado que los inhibidores dela NADPH oxidasa de mamíferos bloquean o disminuyen la producción de EROen plantas durante un estrés biótico o abiótico. Más aún, se han identificadogenes homólogos a la subunidad catalítica gp91phox en diferentes genomas vege-©

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CCuuaaddrroo 3344--11 LLooccaalliizzaacciióónn ddee llaass EEnnzziimmaass qquuee ppaarrttiicciippaann eenn llaa pprroodduucccciióónn yy rreemmoocciióónn ddee EERROO eenn ppllaannttaass

MMeeccaanniissmmoo yy EERROO iinnvvoolluuccrraaddaa LLooccaalliizzaacciióónnPPrroodduucccciióónnTE, fotosíntesis y FSI o II (O2

•) CloTE, respiración (O2

•) MitGlicolato oxidasa (H2O2) PerClorofila excitada (1O2) CloNADPH oxidasa (O2

•) MPβ-oxidación de ácidos grasos (H2O2) PerOxalato oxidasa (H2O2) ApoXantina oxidasa (O2

•) PerPeroxidasas (H2O2, O2

•) PCAmino oxidasa (H2O2) Apo

RReemmoocciióónnSuperóxido dismutasa (O2

•) Clo, Cit, Mit, Per, ApoAscorbato peroxidasa (H2O2) Clo, Cit, Mit, Per, ApoCatalasa (H2O2) PerGlutatión peroxidasa (H2O2, ROOH) CitPeroxidasas (H2O2) PC, Cit, Mit, VacTioredoxina peroxidasa (H2O2) Clo, Cit, MitÁcido ascórbico (H2O2, O2

•) Clo, Cit, Mit, Per, ApoGlutatión (H2O2) Clo, Cit, Mit, Per, Apoα-tocoferol (ROOH, 1O2) MembranasCarotenoides (1O2) Clo

Abeviaturas: Apo, apoplasto; Cit, citoplasma; Clo, cloroplasto; ERO, especie reactiva deoxígeno; FS, fotosistema; MP, membrana plásmática; Mit, mitocondria; 1O2, oxígeno sin-gulete; PC, pared celular; Per, peroxisoma; TE, transporte de electrones; Vac, vacuola.

tales. Además de las NADPH oxidasas, se ha propuesto que las peroxidasas depared celular dependientes de pH, las oxalato oxidasas y las amino oxidasas gene-ran ERO en el apoplasto.

En condiciones normales de crecimiento, la producción de ERO en las célulases baja (240 μM seg-1de O2

•, 0.5 μM de H2O2 en cloroplastos), muchos tipos deestrés que rompen la homeostasis celular incrementan su producción (240 a 720μM seg-1 de O2

•, 5 a 15 μM de H2O2 en cloroplastos). Entre estos tipos de estrésse incluyen la sequía y desecación, el estrés salino, el choque térmico, los metalespesados, la radiación ultravioleta, los contaminantes del aire como el ozono y elSO2, el estrés mecánico, la carencia de nutrientes, el ataque de patógenos y el estrés de alta intensidad luminosa. La producción de ERO durante estos tiposde estrés proviene de las NADPH oxidasas y de vías como la fotorrespiración, lafotosíntesis y la respiración.

Aunque el aumento en la producción de ERO puede ser usado por las plantaspara monitorear el estrés intracelular activando respuestas de defensa, los nivelesde ERO deben mantenerse bajo un estricto control, debido a que su sobre acu-mulación puede producir la muerte celular por daño oxidativo (concepto tradi-cional de toxicidad y reactividad de ERO). En forma alternativa, los niveleselevados de ERO pueden activar una vía de muerte celular programada (MCP),como se demostró recientemente en tabaco por la inhibición de genes antiapop-tóticos inducida por estrés oxidativo.

Debido a que las ERO son tóxicas pero también participan en eventos de seña-lización, las células vegetales requieren de al menos dos mecanismos diferentesde remoción de ERO para regular su concentración: uno para propósitos de seña-lización que permita la modulación fina (para niveles bajos de ERO), y otro quepermita la desintoxicación del exceso de ERO, especialmente durante la presen-cia de un estrés. Además es importante, el tipo de ERO producido y el balanceentre sus niveles de estado estacionario.

❚ COMPONENTES ENZIMÁTICOS DE LAS VÍAS DE REMOCIÓNDE ERO EN PLANTAS

Los principales mecanismos de remoción de las ERO en las plantas incluyen a lasenzimas superóxido dismutasa (SOD), ascorbato peroxidasa (APX), catalasa


H 2 O 2O

2 ½ O

2+ + + 2H + 2O

2 •

+ 2H + 2O 2

• • H 2 O

2 O

2 +

FFiigguurraa 3344--22.. Reacción de Mehler.

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(CAT), glutatión peroxidasa (GPx) y peroxiredoxina (PRXR) (cuadro 34-1). Estasenzimas junto con los antioxidantes ácido ascórbico y glutatión (GSH), proveen alas células con una maquinaria altamente eficiente para la desintoxicación de O2

•

y del H2O2. El balance entre las actividades de estas enzimas en las células es crucialpara determinar el nivel de estado estacionario de O2

• y H2O2. Este balance juntocon el secuestro de iones metálicos por la ferritina y otras proteínas que unen meta-les, previenen la formación del •OH, considerado el radical más agresivo.

Las principales vías de remoción de las ERO en plantas se muestran en la figu-ra 34-3 e incluyen a la SOD, presente en casi todos los compartimientos celulares,al ciclo agua-agua en los cloroplastos, al ciclo ascorbato-glutatión en el cloroplasto,el citosol, la mitocondria, el apoplasto y los peroxisomas, a la GPx y a la CAT enlos peroxisomas. La afinidad por el sustrato, la velocidad de la reacción y la concen-tración de las enzimas son parámetros importantes para asignar la función relativade las diferentes enzimas en la desintoxicación de ERO. Las diferentes afinidadespor el H2O2 (rango μM) y de la CAT (rango mM), sugieren que la APX es respon-sable de la modulación fina de ERO para señalización; mientras que la CAT pre-sente en los peroxisomas, participa en la detoxificación de altos niveles de EROdurante el estrés. Además, el estrés oxidativo causa la proliferación de los peroxi-somas lo que aumentaría la eficiencia en el secuestro de ERO, especialmenteH2O2, el cual difunde libremente desde el citosol a los peroxisomas.

El ciclo agua-agua presente en los cloroplastos, toma la energía reductoradirectamente del aparato fotosintético, por lo que parece ser autónomo con res-pecto al aporte de energía. El descubrimiento del ciclo ascorbato-glutatión encasi todas las localizaciones celulares probadas (cloroplastos, mitocondrias, apo-plastos y peroxisomas), así como la elevada afinidad de APX por H2O2, sugiereque este ciclo tiene un papel crucial en el control de los niveles de ERO en estoscompartimientos.

A la fecha, no está enteramente clara la fuente de energía reductora para elsecuestro de ERO por el ciclo de ascorbato-glutatión durante el metabolismonormal y en particular durante el estrés, cuando el aparato fotosintético podríaestar suprimido o dañado. En los animales y las levaduras, la vía de las pentosasfosfato es la fuente principal de NADPH para la remoción de las ERO. Debido aque la CAT no requiere de un aporte de reductores equivalentes para su función,podría ser insensible al estado redox de las células y su función podría no estarafectada durante el estrés a diferencia de los otros mecanismos.

Los antioxidantes tales como el ácido ascórbico y el GSH, que se encuentranen altas concentraciones en los cloroplastos y otros compartimientos celulares (5 a 20 mM de ácido ascórbico y 1 a 5 mM de GSH) son cruciales para la defen-sa de las plantas contra el estrés oxidativo. En consecuencia, tanto las mutantescon niveles suprimidos de ácido ascórbico como las plantas transgénicas con con-tenidos alterados de GSH son hipersensibles a condiciones de estrés. Las pozas


celulares de estos antioxidantes se mantienen en su estado reducido por acciónde las enzimas glutatión reductasa (GR), monodehidroascorbato reductasa(MDAR) y dehidroascorbato reductasa (DHAR) usando al NADPH como poderreductor (figura 34-3). Además, los radicales monodehidroascorbato (MDAS)pueden ser reducidos nuevamente a ácido ascórbico por vía de la ferredoxinausando electrones que se desvían del aparato fotosintético en el ciclo agua-aguaen los cloroplastos (figura 34-3). El H2O2 puede también ser removido por lasperoxidasas vegetales “clásicas” usando diversos reductores. En Arabidopsis estasenzimas están codificadas por una familia de al menos 73 genes y se localizan enel citosol, la vacuola, el apoplasto y la pared celular.

El balance global entre los diferentes antioxidantes tiene que estar estricta-mente controlado. Por ejemplo, un incremento en la biosíntesis de GSH en loscloroplastos puede resultar en el daño oxidativo a las células más que en su pro-tección, posiblemente por la alteración del estado redox global de los cloroplas-tos. También se ha sugerido que la relación de las formas oxidadas/reducidas delos diferentes antioxidantes puede servir como una señal para la regulación de losmecanismos de remoción de ERO.


Memb r ana plasmática

Citosol Citosol

DNA

M D A

M D A

DHA

ASC

ASC

ASC

NADPH

NADPH

NADPH

Cloroplasto Lumen

NADPH

NADPH

NADPH

NADPH

Catalasa

NADP

NADP

NADP Ascorbato

Ascorbato

NADP

M D AR

M D AR

M D A

M D A

M D AR

Estroma

NADP GR

GSSG

GSSG

GSSG

DHAR,GLR

DHAR,GLR

DHA

DHA

P er o xisoma

GR GPX GPx

GPX GPx GR

GSH

GSH

N O X

Mitocond r ia

H 2 O H 2 O

H 2 O

H 2 O H 2 O

H 2 O

H 2 O

H 2 O 2

H 2 O 2

H 2 O 2

H 2 O 2

H 2 O 2 + O 2

H 2 O 2 H 2 O 2

O 2

O 2

O 2

O 2

O 2

O 2

O 2

O 2 O 2

•

SOD

SOD

FSII

FD APX t FNR

FSI

AOX

Complejo ubiquinona

2

2GSH DHAR, GLR

MnSOD •

AOX

Cu/Zn

e –

NADP

PrxR Trx

+

FFiigguurraa 3344--33.. Producción y remoción de ERO en los distintos compartimientos celulares. Las prin-cipales vías de remoción de ERO en plantas incluyen a la SOD, presente en casi todos los compar-timientos celulares, al ciclo agua-agua en los cloroplastos, al ciclo ascorbato-glutatión encloroplasto, citosol, mitocondria, apoplasto y peroxisomas, a la glutatión peroxidasa (GPx) y a laCAT en peroxisomas.

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En las células vegetales, las membranas son muy susceptibles al estrés oxidati-vo, están protegidas por la GPx específica de fosfolípidos y por α-tocoferol (vita-mina E), el cual se mantiene en su estado reducido por el ascorbato reducido.

❚ COORDINACIÓN DE LAS VÍAS DE PRODUCCIÓN Y REMOCIÓNDE ERO EN DISTINTOS COMPARTIMIENTOS CELULARES

En general existen varias enzimas para remover un tipo particular de ERO encada uno de los distintos compartimientos (p. ej., GPx, y APX en el citosol y en elcloroplasto, y APX y CAT en los peroxisomas) (figura 34-3). Cuando se considerala función relativa de cada enzima en los distintos compartimientos celulares, esimportante recordar que algunas ERO, como el H2O2, difunden entre los com-partimientos. Asimismo, se sugiere que los transportadores de los compuestosantioxidantes (ácido ascórbico y GSH), son determinantes en los niveles de estoscompuestos y el potencial redox en los distintos compartimientos celulares. A lafecha se desconoce el potencial de producción y remoción de ERO de la vacuo-la y debido a su gran volumen es posible que tenga un papel esencial en el con-trol de las ERO en plantas. Por otra parte, se ha empezado reconocer la capacidadantioxidante y la función en la señalización de ERO del apoplasto y los peroxi-somas. Diversos reportes sugieren que en las respuestas de defensa de las plantashay un elevado y complejo grado de coordinación entre los distintos comparti-mientos celulares. Por años, se ha considerado a los cloroplastos como la princi-pal fuente de producción de ERO y en consecuencia uno de los blancospotenciales para el daño por ERO durante el estrés. Las mitocondrias son otrositio importante de producción de ERO y también reguladores clave de la muer-te celular programada o apoptosis.

Tanto las mitocondrias como los cloroplastos contienen mecanismos de remo-ción de las ERO. En contraste, se sabe poco acerca de estos mecanismos en elnúcleo, el cual contiene factores de transcripción sensibles al estado redox. Debi-do a que el H2O2 puede difundir a través de las acuaporinas, las ERO producidasen un sitio específico (por ejemplo el cloroplasto durante un estrés abiótico o elapoplasto durante el ataque de patógenos) pueden afectar otros compartimien-tos celulares, superando su capacidad de remoción de ERO y alterando el patrónde expresión génica. En este sentido, se ha observado que los tipos de estrés queincrementan la producción de ERO en el cloroplasto, inducen mecanismos deremoción de ERO en el citosol y la producción de ERO en el apoplasto inducela producción de proteínas de respuesta a patógenos. Debido a que las mitocon-drias y el núcleo vegetal están involucrados en la activación de la apoptosis, losniveles de ERO que alcanzan estos compartimientos durante cualquier tipo deestrés, deben estar estrictamente controlados para prevenir la activación anormal


de dicho fenómeno. El citosol, con su ciclo ascorbato-glutatión, y los peroxiso-mas, con la reacción de la CAT, podrían actuar como zonas amortiguadoras paracontrolar los niveles globales de ERO que alcanzan diferentes compartimientoscelulares durante el estrés y en el metabolismo normal.

La importancia de los peroxisomas en el metabolismo de las ERO ha ganadoreconocimiento. Los peroxisomas no son solamente el sitio de detoxificación delas ERO por la CAT, sino también un sitio de producción de las ERO. Las princi-pales funciones de los peroxisomas en las plantas son la fotosíntesis, la oxidaciónde los ácidos grasos, el ciclo del glioxilato y el metabolismo de los ureidos. Unacaracterística importante de los peroxisomas es su plasticidad metabólica, ya quesu contenido enzimático puede variar dependiendo del organismo, del tipo de teji-do o célula, de la etapa del desarrollo y de las condiciones ambientales. Entre lasprincipales enzimas de los peroxisomas están las del metabolismo de ERO y las debiosíntesis de óxido nítrico (NO•), óxido nítrico sintasa (NOS). El H2O2 se gene-ra en los peroxisomas de la fotorrespiración, de la glicolato oxidasa de la oxidaciónde los ácidos grasos, de las flavina oxidasas y de la dismutación del O2

•. Los pero-xisomas pueden liberar varias moléculas de señalización como el H2O2, el O2

• y elNO•. El O2

• inhibe a la CAT y el NO• inhibe a la CAT y a la APX, las dos princi-pales enzimas que remueven al H2O2 en los peroxisomas vegetales. Además, elaumento en el NO• incrementa la oxidación de ácidos grasos que produce H2O2en las células animales, lo que genera condiciones tóxicas en la célula. Se ha demos-trado que el NO• está involucrado en la muerte celular inducida por ERO en plan-tas y que es un regulador clave de las respuestas a los patógenos, aunque se sabepoco acerca de su participación en las respuestas a distintos tipos de estrés abiótico.

Diversos estudios con mutantes y plantas transgénicas en los que se suprimióla producción de los mecanismos de desintoxicación de ERO, revelaron algunasde las relaciones complejas entre los mecanismos de producción y remoción deERO. Así, en las plantas que no producen APX, se inducen las enzimas SOD,CAT y GR para compensar la pérdida de APX; mientras que en las plantas conproducción suprimida de CAT se inducen las enzimas APX, GPx y la oxidasa alternativa (AOX) mitocondrial. La CAT y la APX no son completamente re-dundantes en su función, ya que una de ellas no compensa la carencia de la otra,como se demuestra por la mayor sensibilidad de las plantas con niveles reducidosde APX o CAT, a distintos tipos de estrés ambiental y al ataque de patógenos. Porotra parte, resulta interesante que las plantas que carecen de APX o CAT, resul-ten menos sensibles al estrés oxidativo que las plantas con niveles reducidos deAPX o CAT bajo un conjunto definido de condiciones ambientales, presentandouna reducción en su actividad fotosintética, un aumento en la producción deAOX en cloroplastos y en la expresión de los genes de la vía de las pentosas fos-fato y de MDAR, posiblemente para evitar la producción de ERO, así como paraincrementar la remoción de H2O2.


Mecanismos para evitar la producción de ERO

Evitar la producción de ERO puede ser tan importante como su remoción. Di-versas condiciones de estrés incrementan la velocidad de producción de ERO, porlo que evitar o aliviar los efectos de los distintos tipos de estrés en el metabolis-mo vegetal, reducirá el riesgo de la producción de ERO. Entre los mecanismospara reducir la producción de ERO durante el estrés se encuentran:

a) Adaptaciones anatómicas (movimiento o enrollamiento foliar, desarrollo deuna epidermis refractante, entre otras).

b) Adaptaciones fisiológicas (metabolismos C4 y CAM).c) Mecanismos moleculares (rearreglo del aparato fotosintético y pigmentos

antena en función de la calidad e intensidad luminosa e incluso la supresiónde la fotosíntesis).

Estos mecanismos regulan la cantidad de energía luminosa absorbida con ladisponibilidad de CO2, evitando la sobre reducción del aparato fotosintético y la transferencia de electrones al O2 en lugar de al CO2.

La producción de ERO disminuye también por la canalización alternativa delos electrones de la cadena de transporte de electrones de los cloroplastos y lasmitocondrias a un grupo de enzimas denominadas oxidasas alternativas (AOX).Las AOX desvían el flujo de electrones de las cadenas de transporte de electro-nes y los usan para reducir el O2 a agua. Las AOX disminuyen así la producciónde ERO por dos mecanismos, por un lado, previenen que los electrones reduzcanel O2 a O2

• y por el otro, reducen los niveles globales de O2 (el sustrato para laproducción de ERO). La disminución de la AOX mitocondrial incrementa la sen-sibilidad de las plantas al estrés oxidativo. Además, la AOX de los cloroplastos esinducida en las plantas transgénicas que carecen de APX y/o de CAT, y en lasplantas normales se induce en respuesta a la alta intensidad luminosa.

Regulación de la expresión génica de la red de ERO en la Arabidopsis

En años recientes se ha utilizado a la planta Arabidopsis thaliana como modelopara analizar la regulación de la expresión de los genes del metabolismo de lasERO en las plantas mutantes y transgénicas con niveles alterados de las enzimasantioxidantes (APX1 y CAT2) sometidas a diferentes tipos de estrés abiótico(sequía, salinidad, frío o alta intensidad luminosa). Los resultados apoyan dosprincipios fundamentales de una red de genes: la redundancia y la flexibilidad. Laredundancia es evidente por la viabilidad de mutantes en las que se encuentra©

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suprimida la producción de una enzima y la flexibilidad por la respuesta especí-fica a cada uno de los diferentes tipos de estrés a partir de la expresión de ungrupo particular de transcritos.

❚ VÍA DE TRANSDUCCIÓN DE LAS SEÑALESDE LAS ERO EN LAS PLANTAS

Se sugiere que las células vegetales perciben a las ERO a través de diferentesmecanismos como son las proteínas receptoras (aún no identificadas), los facto-res de transcripción sensibles al estado redox (NPR1, HSFs, entre otros) y la inhi-bición directa de las fosfatasas por efecto de las ERO.

En estudios recientes se han identificado diversos intermediarios involucradosen la vía de transducción de las ERO, en un evento posterior al de su percepción(figura 34-4). Entre estos intermediarios se han identificado iones Ca2+, proteí-nas que unen Ca2+ como la calmodulina, proteínas G y segundos mensajeroscomo el ácido fosfatídico (PA). Asimismo, se ha identificado una proteína cinasade serina/treonina que al parecer tiene un papel central en la percepción de EROy en la activación por Ca2+ de proteínas cinasas activadas por mitógenos(MAPK). Esta cinasa de serina/treonina se activa por la cinasa dependiente defosfoinosítidos (PDK1) a través de PA. La activación de la vía de MAPK contro-la la activación de diferentes mecanismos de defensa. También se ha reportadoque las ERO incrementan la expresión de diferentes factores de transcripción(miembros de las familias de WRKY, Zat, RAV, GRAS y Myb) los cuales regulanla expresión de diversos genes (figura 34-4).

La existencia de mecanismos de amplificación de la señalización de las EROque involucran a las NADPH oxidasas se apoya en varios estudios genéticos y far-macológicos. Las NADPH oxidasas se activan por niveles bajos de ERO, incre-mentando la producción de las señales de ERO en localizaciones celularesespecíficas. Se considera que la acumulación de las ERO en las células activaríalas vías de remoción de las ERO también en localizaciones celulares específicas.

En años recientes se ha demostrado que las ERO participan en una gran diver-sidad de respuestas de las plantas no solamente a distintos tipos de estrés bióti-cos, abióticos o ambos, sino durante el crecimiento y desarrollo vegetal.

Participación de las ERO en las respuestas de defensa vegetal contra patógenos

A lo largo de su vida, las plantas interaccionan con un gran diversidad de patóge-nos. Ante esta situación, las plantas han desarrollado diversos mecanismos de de-


fensa para evitar su potencial colonización por el patógeno. La primera línea dedefensa la constituyen las barreras físicas y químicas preformadas. También existendiversas respuestas inducibles cuya participación depende del reconocimiento exi-toso del patógeno por la planta. Este evento de reconocimiento está mediado por lainteracción directa o indirecta entre el producto de un gen del patógeno y el corres-pondiente producto del gen de resistencia de la planta (R). Esta interacción generalda por resultado la respuesta hipersensible (RH) que produce un área de muertecelular que rodea al sitio de ingreso del patógeno evitando su propagación. Siguien-do a la RH se encuentra el establecimiento de la inmunidad a infecciones secunda-rias en tejidos sistémicos, a esta respuesta se le denomina resistencia sistémicaadquirida (RSA) que confiere protección contra un amplio espectro de patógenos.

Una de las respuestas celulares de defensa más rápidas después del reconoci-miento del patógeno, es la denominada explosión oxidativa, que produce ERO (O2

•

y H2O2) en el sitio de invasión. Durante esta respuesta, las ERO son producidas por© E

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NADPH

?

Histidinacinasa

NADP

PP PK

H2O2H2O2

H2O2

H2O2

H2O2

O2

O2

MAPKKK

Vacuola

MAPKK

MAPK

Fosforilación

Oxidación

Núcleoexpresióngénica

Actividades celulares

Modificado

TF

TF

TFS-H

TF

S-S

P

Respuesta

Proteínas de unióna calcio (CaM)

?

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

•-

NOX

FFiigguurraa 3344--44.. Vías de señalización de ERO. El peróxido de hidrógeno (H2O2) generado en la célulao que difunde al interior puede oxidar o modular la acción de varias proteínas como fosfatasas (PP),proteína cinasas (PK) como las histidina cinasas de la membrana plasmática y la cascada de las cina-sas dependientes de mitógenos (MAPKKK, MAPKK, MAPK) y factores de trascripción sensibles alestado redox (TF).

las células vegetales vía el aumento en la actividad enzimática de las NADPH oxi-dasas unidas a la membrana plasmática, las peroxidasas unidas a la pared celular ylas amino oxidasas en el apoplasto. La principal enzima responsable de la “explo-sión oxidativa” en diversas plantas es la NADPH oxidasa (NOX también denomi-nadas Rboh) de membrana plasmática, que es homóloga a la NADPH oxidasa oRbo que genera O2

• durante la explosión respiratoria en los fagocitos de los mamí-feros. Se piensa que las ERO producidas durante esta respuesta, difunden dentrode las células y junto con el ácido salicílico (AS) y el NO•, activan muchas de lasdefensas vegetales, incluyendo la apoptosis o MCP (figura 34-5).

Existen evidencias recientes que demuestran la síntesis enzimática de NO• en lasplantas. En dicha síntesis participan las enzimas NOS constitutivas de ArabidopsisAtNOS1 y las enzimas NOS inducibles, aunque también se ha descubierto que lanitrato reductasa y la xantina oxidoreductasa producen NO• en las plantas.

Durante las respuestas de defensa el AS y el NO• inhiben la actividad de laAPX y la CAT. La producción de la APX es suprimida por una regulación pos-transcripcional y la de la CAT es a nivel del mRNA. Así, la planta produce másERO y simultáneamente disminuye su capacidad para remover al H2O2, resul-tando en la sobre acumulación de las ERO y en la activación de la MCP o apop-tosis. En la vía de transducción de la muerte celular inducida por ERO y NO•

durante la RH, participan el GMP cíclico (GMPc), los canales de calcio, las pro-teasas, la modificación postraduccional de las proteínas por nitrosilación y laregulación de la expresión de genes.

El aumento en la producción de las ERO, además de participar en la RH,aumenta también la resistencia a las enfermedades por otros mecanismos, comopor ejemplo a través de efectos tóxicos directos en los patógenos y a través delentrecruzamiento de las proteínas de la pared celular vegetal para hacerla másresistente al ataque de las enzimas del patógeno.


Proteína G

Reconocimiento del patógeno Ca 2+

CDPK PCK

Ca 2+

Calmodulina

NADPH

N O X

NADP

O 2

O 2

H 2 O

2

K +

NADK

•

FFiigguurraa 3344--55.. Modelo de los eventos de señalización de la respuesta a patógenos en plantas. El reco-nocimiento del patógeno induce la entrada de Ca2+ que activa la producción de NADPH por laNAD cinasa, el NADPH es entonces usado por la NOX que genera ERO.

Como se mencionó anteriormente, la RSA requiere de AS y de la proteínaregulatoria positiva NPR1, la cual interacciona con las factores de transcripciónmiembros de la clase TGA, que regulan la expresión de genes RSA entre los quese encuentran los genes relacionados con la patogénesis (RP). Reportes recientesapoyan la participación del estado redox celular en la señalización de la RSA. Loscloroplastos emergen como fuente importante de ERO en esta respuesta, al pare-cer la transferencia del ácido linolénico del cloroplasto al exterior activa a laNADPH oxidasa y regula la producción de las ERO. Los últimos estudiosdemuestran que la actividad de NPR1 y de los factores de transcripción TGA1 yTGA4 se regulan por modificaciones redox de residuos de cisteína inducidas porAS. En ausencia de patógeno o estado no inducido, la proteína NPR1 se encuen-tra formando un oligómero, que se mantiene por puentes disulfuro intermolecu-lares y se localiza en el citosol. La reducción de las cisteínas conservadas de NPR1inducida por AS, lleva a la formación del monómero que se moviliza al núcleo.Para activar la expresión de los genes RP se requiere la localización nuclear deNPR1. A su vez, la reducción de las cisteínas conservadas en TGA1 y TGA4 per-mite su interacción con NPR1, que actúa como un cofactor sensible al estadoredox celular estimulando la unión de TGA al DNA. Aunque se desconoce laidentidad de los mediadores redox que regulan a NPR1 y TGA se ha propuestola participación de tioredoxinas y glutaredoxinas.

Papel dual de las ERO durante el estrés biótico y abiótico en plantas

El papel que tienen las ERO en la MCP en la respuesta a patógenos pareceopuesto al papel que tienen durante el estrés abiótico, durante el cual nivelesbajos de ERO inducen los mecanismos de remoción de las ERO, tales como lasenzimas APX y CAT que disminuyen el nivel de estado estacionario de las EROen las células. Las diferencias en la función de las ERO entre el estrés biótico yabiótico podrían resultar de la interacción del AS y el NO•, en las respuestas dedefensa y del entrecruzamiento entre diferentes vías de señalización o de diferen-cias en los niveles de estado estacionario de las ERO producidas durante los dis-tintos tipos de estrés (figura 34-6). El aparente conflicto en el metabolismo de lasERO en la respuesta a un estrés biótico y uno abiótico lleva a la pregunta ¿cómomanipulan las plantas su velocidad de producción y de remoción de las ERO cuan-do se encuentran frente a un ataque biótico durante un estrés abiótico? En estesentido, se encontró que cuando las plantas de tabaco que fueron sometidas previa-mente a un estrés abiótico y que, en consecuencia, tenían niveles elevados de enzi-mas antioxidantes, mostraron una velocidad reducida de MCP comparadas conplantas testigo no estresadas. Además, las plantas con sobreproducción de la CAT©

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tuvieron una resistencia disminuida a la infección de patógenos.

Participación de las ERO en el cierre de los estomas

La regulación del cierre de los estomas involucra la interacción e integración dediversos controles que ayudan a la planta a adaptarse a los ambientes fluctuan-tes. Las condiciones ambientales desfavorables, como la sequía, la salinidad y lasbajas temperaturas, limitan la productividad. En ausencia de estrés, para que losestomas se abran, las células guarda incorporan iones como K+, Cl–, NO3

–, etc.que en conjunto con otros solutos elevan la turgencia celular y, debido a la dis-posición de las microfibrillas de celulosa de la pared celular, ocasionan la apertu-ra de los estomas. Durante un estrés hídrico se acumula ácido abscísico (ABA),hormona vegetal con diversos papeles en la tolerancia de las plantas a la sequía.La acumulación de ABA en las hojas activa la producción de H2O2 en las célulasguarda a través de dos fuentes, la NADPH oxidasa y los cloroplastos. Al pareceren la formación de las ERO por ABA y por metil-jasmonato interviene la alcali-nización de las células guarda. El H2O2 inactiva los canales de entrada de K+, acti-


Estrés Abiótico Estrés Biótico

Respuesta de de f ensa

Mitocond r ia (O 2 )

Cloroplastos (O 2 )

O 2

Respuesta de

defensa

E R O

AP X Cat

Mitocond r ia (O 2 )

O 2

Cloroplastos (O 2 ) E R O

E R O

A PX Cat NO

O 2

Respuesta a estrés biótico y a biótico

NO AS

E R O

NADPH

NADP

O 2 •

H 2 O 2

RH

SAR

• •

FFiigguurraa 3344--66.. Papel de las ERO durante el estrés biótico y abiótico en plantas. Especies reactivas deoxígeno (ERO), oxidasa dependiente de NADPH (NOX), ascorbato peroxidasa (APX), catalasa(CAT), óxico nítrico (NO•), ácido salicílico (AS), respuesta hipersensible (RH), respuesta sistémi-ca adquirida (RSA).

va los canales de entrada de Ca2+ de la membrana plasmática que contribuyen aincrementar la concentración de Ca2+ en el citosol junto con la liberación de Ca2+

de almacenes intracelulares. El aumento de Ca2+ en el citosol participa tambiénen la regulación de los canales de aniones, dando por resultado una reducción enla turgencia de las células guarda y en consecuencia el cierre de los estomas (figu-ra 34-7). Recientemente se ha encontrado que en el cierre de estomas participael NO• producto de la nitrato reductasa (NR). La actividad de la NR está fuer-

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Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

abi2

abi1

ABA

NADP

NOX

NADPH

Cloroplasto

H2O2H2O2

O2

O2

NO

NOSNR

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FFiigguurraa 3344--77.. Participación de las ERO en el cierre de estomas. Modelo del cierre de estomas indu-cido por el ácido abscísico (ABA). El ABA puede ser percibido por un receptor desconocido o poralgunos componentes de la membrana como la oxidasa dependiente de NADPH (NOX). Las EROproducidas en esta señalización activan los canales de Ca2+, además de inducir la expresión de genescomo ABI1 y ABI2.

temente regulada tanto a nivel transcripcional como postraduccional por diver-sos factores como la luz, la temperatura, la disponibilidad de CO2 y de O2, todosestos factores regulan también el cierre de estomas. Así la NR, al parecer no sóloparticipa como una enzima clave en la coordinación de la asimilación del N y elC, sino que también es fuente de la molécula de señalización NO• en la red detransducción de señales de cierre de estomas inducido por ABA.

Participación de las ERO en la muerte celular programada en la capa de aleurona de semillas

La capa de aleurona se diferencia del endospermo almidonoso de semillas de ce-reales. La capa de aleurona es un tejido diferenciado que no se divide, no posee clo-roplastos funcionales por lo que no realiza la fotosíntesis. Durante la maduraciónde la semilla, las células del endospermo mueren, pero las de la capa de aleuro-na permanecen viables. Durante la imbibición que lleva a la germinación, la capade aleurona sintetiza y secreta a las hidrolasas encargadas de movilizar las reser-vas del endospermo para el establecimiento de la plántula posterior a la germi-nación y previa al establecimiento de la autotrofia. La función de la capa dealeurona está regulada por las hormonas giberelinas (GA) y ABA. Después de lasíntesis y secreción de las hidrolasas ocurre la MCP de la capa de aleurona. LasGA promueven la MCP en las células de la capa de aleurona mientras que elABA la inhibe. Estudios con antioxidantes demuestran que en la MCP de estascélulas participan las ERO. Al parecer la mayor sensibilidad a las ERO de lascapas de aleurona tratadas con GA se debe a la síntesis continua o aumentada delas ERO y a la disminución paralela de las enzimas antioxidantes encargadas de removerlas, esta disminución se refleja en los niveles de mRNA, de proteí-nas y de la actividad de estas enzimas. En las capas de aleurona tratadas con ABAlas mitocondrias utilizan a las AOX para minimizar la producción de las ERO yademás hay una inducción de las enzimas encargadas de remover las ERO.

Participación de las ERO en el envejecimiento de semillas

La capacidad de germinación y el vigor de las semillas se afectan dramáticamen-te por el envejecimiento que ocurre durante el almacenamiento prolongado. Unode los factores más importantes del envejecimiento de las semillas es la acumu-lación de las ERO. Diversos estudios demuestran que, a pesar de la baja hume-dad durante el almacenamiento de las semillas, pueden ocurrir reacciones de autooxidación que llevan a la producción de las ERO y a una perdida de la actividadde las enzimas antioxidantes. El almacenamiento prolongado en baja humedad o


condiciones inadecuadas de conservación, como temperaturas y humedades rela-tivas elevadas, incrementan estos procesos. Las alteraciones causadas por las EROse expresan durante la imbibición de las semillas por lo que se considera a laimbibición como un paso crítico.

Participación de las ERO en el gravitropismo de la raíz inducido por las auxinas

Desde 1926 se descubrió que en la respuesta gravitrópica de la raíz participan lasauxinas. El mecanismo propuesto indica que la estimulación gravitrópica es loque induce el transporte asimétrico de las auxinas, que a su vez provoca la cur-vatura en el crecimiento denominada curvatura gravitrópica. Se ha descubiertoque en esta respuesta participa el mensajero lipídico inositol trifosfato (IP3) queinduce la apertura de los canales de Ca2+ intracelulares aumentando el Ca2+ cito-sólico. En años recientes se demostró la participación de las ERO en la vía deseñalización de la respuesta gravitrópica. La aplicación exógena de las auxinasestimula la generación de las ERO en la región tratada y se sugiere que las EROparticipan en la redistribución de las auxinas por el estímulo gravitatorio. Se hademostrado también que las ERO inducen la cascada de fosforilación de MAPKen la raíz. Aunque a la fecha no se sabe cómo se integran las señales de ERO yCa2+ en la respuesta gravitrópica.

Participación de las ERO en el crecimiento de las células apicales

Las células apicales representan un caso extremo del crecimiento polarizadobasado en el alargamiento exclusivo del ápice. En las plantas hay dos ejemplostípicos de crecimiento de células apicales: los pelos radiculares y el tubo políni-co. Los pelos radiculares deben percibir el ambiente del suelo y crecer para opti-mizar la toma de agua y nutrientes, también para responder a los estímulosbióticos. El tubo polínico debe comunicar sus propiedades (especie e individua-lidad) a las células del estigma.

En los últimos años se ha avanzado en el conocimiento de las vías de señaliza-ción del crecimiento de las células apicales. Se ha reportado la participación delácido γ-amino butírico (GABA), un neurotransmisor en animales, del NO•, deseñales lipídicas como el PA y la fosfolipasa D (PLD), de los iones Ca2+, K+, Cl–y gradientes de pH. Una nueva área de investigación acerca de la participaciónde las ERO en esta vía de señalización surgió con el estudio de las mutantes deArabidopsis rhd2, mutantes defectuosas en el crecimiento de pelos radiculares©

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que se caracterizan por pelos radiculares cortos. La proteína RHD2 mutada es unaNADPH oxidasa que tiene alterada la subunidad catalítica y por lo tanto altera laproducción de las ERO. Se ha encontrado que las ERO se requieren para estimu-lar la entrada de Ca2+ necesaria para el alargamiento celular. Las señales de lasGTPasas ROP, los gradientes iónicos, las señales lipídicas y los nucleótidos cíclicosparticipan en la vía de señalización afectando al citoesqueleto (figura 34-8). Sepiensa que las proteínas que unen actina integran así todo este conjunto de seña-les modificando el citoesqueleto. Al parecer, todas las proteínas que coordinan ladinámica del citoesqueleto de actina deben estar fuertemente reguladas para queel crecimiento polarizado direccional pueda efectuarse. Entre estas proteínas seencuentran el factor de despolimerización de actina (ADF), que se regula por pHy la profilina cuya actividad es dependiente de Ca2+, además el ADF se inhibe através de la fosforilación catalizada por una cinasa dependiente de Ca2+ que unelípidos. En los animales y las levaduras se ha demostrado la función relevante quetienen las proteínas de unión a poli L profilina (PLP) como las WASP, las VADPy la formina en la remodelación del citoesqueleto. En Arabidopsis se ha demos-


ERO

ADF

CDPKs

Efectosinérgico

Ca2+

GTPasaROP

PIP CinasaPIP2

pH

ForminaFamiliaWASP

Proteínas PLP

ComplejoArp 2/3Profilia

Remodelación de la actina del citoesqueleto

Crecimiento polarizado

FFiigguurraa 3344--88.. Participación de las ERO en la remodelación del citoesqueleto durante el crecimien-to de células apicales. Las ERO estimulan la entrada de Ca2+ necesaria para el alargamiento celu-lar. Las GTPasas ROP, los gradientes iónicos, las señales lípidicas y los nucleótidos cíclicos participanen la vía de señalización para la remodelación del citoesqueleto. El factor de despolimerización deactina (ADF) y la profilina son proteínas que coordinan la dinámica del citoesqueleto. En anima-les y levaduras se ha demostrado la participación de proteínas de unión a poli L profilina (PLP)como las WASP y la formina en la remodelación del citoesqueleto.

trado que la sobre expresión de la formina afecta la regulación del crecimientopolarizado del tubo polínico.

Participación de las ERO en las respuestas alelopáticas

Las especies vegetales invasoras alteran la integridad de los sistemas naturalesdesplazando a las comunidades nativas. Un mecanismo propuesto para explicarel éxito de las especies invasoras es la alelopatía que consiste en la liberación defitotoxinas por las plantas. Recientemente se ha reportado que la especie invasi-va Centaura maculosa, que se encuentra entre las más destructivas en Norteamé-rica, desplaza a las especies nativas mediante la exudación por las raíces de lafitotoxina catequina. En las especies sensibles como Arabidopsis, la catequinaprovoca la generación de las ERO en el meristemo de la raíz que dispara una cas-cada de señalización en la que interviene Ca2+ y que modifica la expresión géni-ca y en casos extremos lleva a la muerte del sistema radicular.

❚ ESTUDIOS REALIZADOS EN EL LABORATORIODE LOS AUTORES Y TRATAMIENTOS PROTECTORESCONTRA EL DAÑO POR FRÍO Y ERO EN FRUTOS

La refrigeración es una de las tecnologías más usadas para extender la vida post-cosecha de los productos hortofrutícolas. Sin embargo, los frutos tropicales o subtropicales, como el limón persa (Citrus Latifolia T.) y mexicano (Citrusaurantifolia S.), presentan un desorden fisiológico conocido como daño por frío(DPF) cuando se almacenan por debajo de ciertas temperaturas críticas (10 a12°C). Este desorden es de suma importancia ya que afecta la aceptación delconsumidor, provocando pérdidas comerciales. En cítricos, los síntomas típicos deDPF son: la aparición de manchas en el flavedo (cáscara), el oscurecimiento delalbedo (porción blanca) y en casos extremos la producción de aromas y saboresanormales. Algunos autores han sugerido la participación del estrés oxidativo enel desarrollo del DPF en frutas y hortalizas. En el caso de los cítricos se ha repor-tado que los cultivares tolerantes al DPF poseen un sistema antioxidante más efi-ciente que los cultivares sensibles. Por lo que la capacidad para remover a lasERO podría estar implicada en la tolerancia al DPF.

Durante los últimos años, se ha demostrado la efectividad de algunos trata-mientos de acondicionamiento con calor en la resistencia al DPF en cítricos.Actualmente se piensa que los tratamientos de acondicionamiento con calor ofrío pueden reducir el DPF en diferentes especies, incluyendo a los cítricos. Estefenómeno se conoce como “tolerancia cruzada”, en el que la exposición a un©

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estrés moderado aumenta la tolerancia a un estrés posterior más severo. Diversosreportes sugieren que la “tolerancia cruzada” podría estar relacionada con unincremento en los sistemas antioxidantes, previniendo así la acumulación y eldaño por ERO.

En este sentido, el grupo de trabajo se ha enfocado a investigar las bases bio-químicas y moleculares de la “tolerancia cruzada” al DPF y la relación de estedesorden fisiológico con el estrés oxidativo, teniendo como modelos biológicos allimón persa (Citrus latifolia T.) y limón mexicano (Citrus aurantifolia S.).

En el caso del limón persa se encontró que el acondicionamiento con hidroca-lentamiento (inmersión en agua a 53°C por 3 minutos), previo al almacenamien-to refrigerado de los frutos en temperaturas inductoras de DPF no indujotolerancia a esta fisiopatía. Inmediatamente después de aplicado, el acondiciona-miento produjo un incremento significativo en la actividad de las enzimas antio-xidantes (2.6 veces para PX y 1.7 veces para SOD), aunque esta inducción no sesostuvo durante todo el periodo de almacenamiento.

Por otra parte, en el caso del limón mexicano, se exploró la efectividad de untratamiento de acondicionamiento con frío (13°C por 48 horas), previo al alma-cenamiento de los frutos en refrigeración, en la protección contra el DPF. Elacondicionamiento con frío disminuyó 1.6 veces los síntomas de DPF y produjoun incremento significativo en la actividad de PX (2.2 veces), mientras que laactividad de la SOD se mantuvo durante todo el periodo de almacenamiento.Estos resultados sugieren que la efectividad de los tratamientos de acondiciona-miento en la tolerancia al DPF, depende de la capacidad de estos tratamientos deinducir o mantener los sistemas antioxidantes durante todo el periodo de alma-cenamiento.

❚ CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

Se ha demostrado que las ERO participan activamente en la fisiología de las plan-tas, pero aún quedan muchas interrogantes por responder.

A la fecha no se conoce en detalle la causa de la muerte celular inducida porestrés oxidativo en las plantas, y si es que ésta se debe solamente a la toxicidadde las ERO o a la activación de una vía de MCP por ellas. Por lo que para respon-der estas preguntas se espera que el futuro se realicen estudios en donde se apli-que estrés oxidativo a plantas mutantes deficientes en distintas vías de MCP.

Otras preguntas relacionadas con la señalización y el metabolismo de las EROque permanecen sin respuesta son:

1. ¿Cuáles son los sensores para las ERO en plantas?2. ¿Qué tan tóxicas son las ERO en las células vegetales?


3. ¿Cómo se coordinan las redes de producción y remoción de las ERO en lasplantas?

4. ¿Cómo se regula el metabolismo de las ERO durante una combinación deestrés biótico y abiótico o durante múltiples tipos de estrés abiótico?

5. ¿Cuál es la fuente de energía reductora para la reducción de las ERO duran-te el metabolismo normal y durante el estrés?

6. ¿Cómo afectan la identidad química de una ERO y/o su sitio de produccióna la señalización y respuesta generada?

7. ¿Qué factores afectan la especificidad de las actividades biológicas de las ERO?8. ¿Cuáles son las funciones de la vacuola y el apoplasto en la señalización y

metabolismo de las ERO?9. ¿Cómo se integran las ERO en la red señalización general de la célula?

En la actualidad se encuentran disponibles la mayoría de las tecnologías reque-ridas para responder a muchas de estas preguntas. Se pueden citar como ejem-plo, el análisis de la expresión génica usando microarreglos, acoplado con estudiosde proteómica y metabolómica siguiendo las diferentes enzimas y compuestosantioxidantes en plantas expuestas a un estrés biótico o abiótico o combinacio-nes de distintos tipo de estrés, completado con el estudio de mutantes con capa-cidades alteradas de producción o remoción de las ERO. Además, el desarrollo demarcadores celulares que permitan la cuantificación no destructiva de las dife-rentes ERO en los distintos compartimientos celulares, profundizará nuestracomprensión del metabolismo y transducción de señales de ERO.

Los autores agradecen el financiamiento otorgado por la UAM, CONACyT,SIMORELOS No. 19990301016, CONACYT No. SEP-2003-CO2-45162 yPROMEP CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE PLANTAS, RED DE CUERPOSACADÉMICOS (UAM-I, UNACH, UC Davis, EUA).

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Alexis F. Welker Gabriella R. Ramos-Vasconcelos

Eva PhilippMarcelo Hermes-Lima

❚ INTRODUCCIÓN

Algunas especies de animales viven en situaciones que serían sumamente extre-mas para el ser humano, logran sobrevivir a periodos de baja o nula oferta de oxí-geno, con temperaturas extremadamente bajas (incluyendo situaciones en las quese da congelamiento de los líquidos corporales), de ausencia de alimentos e inclu-so de agua. Estas condiciones alteran el metabolismo entero y provocan picos deproducción de especies reactivas de oxígeno (ERO) que, tal como fue abordadoen capítulos anteriores de este libro, pueden causar daños oxidativos. A pesar detodo, existen decenas de especies de animales que resisten a esa exposición aumen-tada las ERO, que ocurre en condiciones naturales y fisiológicas, a través de uneficaz sistema antioxidante.

Esa capacidad extraordinaria es lograda a través de mecanismos bioquímicos yfisiológicos adquiridos a lo largo del proceso evolutivo. Conocer dichos mecanis-mos ayuda al hombre a entenderse mejor a sí mismo, a sus procesos patológicosy a proponer tratamientos para algunas enfermedades.

Los animales oxidan nutrientes constantemente, produciendo coenzimas y co-factores enzimáticos mitocondriales ricos en electrones. En la cadena respirato-

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ria, el oxígeno recibe los electrones y es convertido en agua; sin embargo unapequeña porción del oxígeno (de 0.1 a 0.5%) no se convierte en agua, sino quees transformado en ERO. Como fue explicado en el capítulo Hipoxia/reperfusión,cuando el tejido de un mamífero común es mantenido en bajas concentraciones deoxígeno se da una acumulación de electrones en la cadena respiratoria, y cuando el oxígeno vuelve a estar disponible ocurre una superproducción de ERO. En lascélulas de los animales expuestos a este fenómeno, pueden ocurrir graves daños oxi-dativos por la incapacidad del sistema antioxidante de funcionar adecuadamente.

❚ VIVIENDO SIN OXÍGENO

El incremento de la producción de ERO también se encuentra en animales some-tidos a hhiippooxxiiaa (concentraciones de oxígeno disminuidas) o aannooxxiiaa (0% de oxí-geno), y posteriormente reoxigenados. Este es el caso de algunas ranas y tortugasde América del Norte que hibernan bajo del agua durante meses. Con el conge-lamiento de la superficie de los ríos y lagos, el ambiente acuático se vuelve hipó-xico e incluso anóxico. En el caso de la Rana pipiens, fue demostrado que esteanimal puede vivir varios días en anoxia. Por otro lado, en ciertas tortugas, fueobservada una sobrevivencia de hasta 3 meses en anoxia. Uno de los secretos resi-de en la capacidad de cambiar el metabolismo de oxidativo a fermentativo duran-te la anoxia, así como reducir la tasa metabólica.

Existen otros ejemplos de animales que necesitan vivir en anoxia: peces de ríosy lagos del Hemisferio Norte que se congelan en la superficie. Un ejemplo clási-co es el pez Carassius auratus, de origen asiático, conocido popularmente en Brasil como goldfish o pez dorado; peces de lagos amazónicos que pueden per-manecer en anoxia durante la noche (causado por el consumo nocturno de oxí-geno por la flora y fauna); peces de ríos que pueden quedar periódicamente enhipoxia; invertebrados de respiración branquial de regiones de intermarea yestuarios (incluyendo poliquetos, gastrópodos y crustáceos) que son sujetos a labaja de la marea y a la exposición al aire. Cuando los animales salen de esas con-diciones, ocurre una abrupta reoxigenación, que puede resultar en una elevadaproducción de ERO. Así, en un intento de comprender cómo se defienden esosanimales del estrés oxidativo, diversos trabajos han investigado los animales tole-rantes a la anoxia e hipoxia.

Preparación para el estrés oxidativo

El primer estudio donde se investigó el sistema antioxidante específicamente enrespuesta a la anoxia fue realizado a principios de los años 90 por Marcelo Her-


mes-Lima y Kenneth Storey, en la Carleton University, en Ottawa, con la serpien-te Thamnophis sirtalis parietalis, encontrada en América del Norte y que resiste48 horas sin oxígeno. Esta adaptación a la anoxia ha sido asociada, en términosecológicos, a la inundación de los invernaderos hacia el final del invierno. Lainducción de anoxia en laboratorio por 10 h (a 5ºC) provocó un incremento dealgunos parámetros antioxidantes, tales como la actividad de la enzima antioxi-dante superóxido dismutasa (SOD) en el músculo esquelético y en el hígado, yde la concentración del antioxidante no enzimático glutatión (GSH) en el múscu-lo esquelético (figura 35-1). Este primer resultado fue sorprendente, tomando encuenta que en ausencia de oxígeno no se esperaría un incremento en las defensasantioxidantes justamente porque no se podrían formar ERO en esas condiciones.

En ese trabajo, publicado en 1993, se propuso que existiría una preparaciónpara el estrés oxidativo en estos animales. Esta hipótesis fue, en años subsiguien-tes, confirmada también en otros animales que pasan por la situación de anoxiay reoxigenación. Así, el incremento en la producción de antioxidantes endógenosen anoxia sería una defensa anticipada a una superproducción de ERO durantela reoxigenación. Los mecanismos moleculares que regulan los preparativos parael estrés oxidativo siguen siendo un misterio al día de hoy.

En un segundo estudio, publicado en 1996, se mostró la respuesta antioxidan-te del anfibio anuro Rana pipiens, luego de 30 horas en anoxia (a 5ºC). Se encon-tró un incremento en la actividad de la catalasa (CAT) en el músculo esqueléticoy en el corazón; así como de la enzima glutatión peroxidasa dependiente de sele-

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FFiigguurraa 3355--11.. Efecto de la anoxia en la actividad enzimática de superóxido dismutasa (SOD) expre-sada en unidades por miligramo de proteína AA)) y concentración de glutatión reducido (GSH)nmol/g de peso húmedo en serpiente Thamnophis sirtalis parietalis BB)). Los valores se muestrancomo media ± error padrón de la media (SEM). *: significativamente diferente al control respectivo.

nio (GPx) en el cerebro y el corazón, y también de la glutatión-S-transferasa(GST) en el cerebro. El único antioxidante que mostró una disminución fue laconcentración de glutatión total (GSH) en el cerebro. En estos anfibios fue veri-ficado que, luego de 40 horas de recuperación aeróbica, la mayor parte de lasalteraciones en las defensas antioxidantes volvía a la normalidad.

Los trabajos antes discutidos confirman la hipótesis sugerida, en 1986, por elinvestigador Evaldo Reischl, acerca de que los vertebrados pulmonados submari-nos tolerantes a la hipoxia (y con bajas concentraciones musculares de mioglobi-na), tenían algún tipo de sistema antioxidante que los protegía de las EROformadas durante la reperfusión de la sangre oxigenada, al final de una inmersiónprolongada. Él observó en la tortuga Phrynops hilarii, que permanece sumergidadurante períodos muy largos, una alta concentración de grupos sulfhidrilo pre-sentes las hemoglobina de muchas de esas especies y postuló, en esa época, unafunción antioxidante para esos sulfhidrilos, capacidad confirmada actualmente.

En invertebrados que viven periodos sin oxígeno, también fue demostrado unincremento en el sistema de defensa antioxidante durante la anoxia. El cangrejoChasmagnathus granulata mantenido por 8 horas en anoxia (a 25ºC) presentó unincremento de actividad de las enzimas catalasa y GST de las branquias posterio-res. Por otro lado, se dio una reducción de la actividad de SOD en anoxia. En elcaso del poliqueto Heteromastus filiformis, tanto la hipoxia como la anoxia in-crementaron la actividad de catalasa, sin cambios en la actividad de la SOD. Enel gastrópodo Biomphalaria tenagophila (un cangrejo de agua dulce), también seencontró que después de 24 horas de anoxia, hubo un aumento en la actividadde la enzima GPx dependiente de selenio (GPx-Se) en su glándula digestiva.

Otras adaptaciones antioxidantes

Las tortugas Trachemys scripta elegans, que logran permanecer entre 2 a 3 mesessin respirar, presentaron en varios tejidos una reducción de la actividad de algu-nas enzimas antioxidantes (SOD, GST y gammaglutamil transpeptidasa (γ-GT)en el hígado; la CAT, el GSH y el GST en el corazón; la CAT, GPX y γ-GT en elriñón; CAT y SOD en cerebro) y de la concentración de GSH total (hígado, cora-zón y riñones) luego de 20 horas de estar sumergidas en agua desoxigenada (laCAT hepática no se vio alterada en este estudio) (a 5ºC). Sin embargo, los inves-tigadores descubrieron simultáneamente que la actividad antioxidante de estosanimales es mayor que la de otros animales ectodérmicos. Esta especie presentóuna reducción en los indicadores de estrés oxidativo durante la anoxia (peroxi-dación lipídica). Otros trabajos mostraron que el cerebro de esas tortugas poseeuna mayor concentración de ácido ascórbico que otros reptiles o anfibios intole-rantes a la anoxia.


Se encontraron respuestas distintas en el gastrópodo marino Littorina littorea,que en general presentó una reducción de la actividad de enzimas antioxidantesen la glándula digestiva y en el músculo del pie luego de 6 días de exposición ala anoxia. En compensación, hubo un incremento en los niveles de GSH total.Recientemente, ese mismo animal fue investigado y la anoxia provocó un incre-mento en la expresión de la metalotioneína, que tiene propiedades antioxidantes. Esafamilia de proteínas se liga a metales, algunos de los cuales (como los iones hie-rro y cobre) son cofactores para la producción de radicales libres. Un incremen-to semejante fue encontrado en la síntesis de ferritina, una proteína que se liga aiones hierro, importante en algunas reacciones formadoras de radicales hidroxilo,como la reacción de Fenton.

Daños oxidativos en la reoxigenación

La producción de ERO resulta en daños a varias moléculas cuando el sistemaantioxidante no es lo suficientemente eficaz. Varios trabajos reportaron algunosindicadores de este estrés oxidativo en animales sometidos a anoxia y/o hipoxiay luego reoxigenados.

En el goldfish, luego de una hora de reoxigenación, hubo un incremento de114% en los niveles de dienos conjugados (un producto de la peroxidación lipí-dica) en el hígado, y luego de 14 horas, hubo un incremento de 75% en el cere-bro. En cangrejos Chasmagnathus granulata mantenidos 8 horas en anoxia, lareoxigenación por 40 minutos elevó los niveles de peroxidación lipídica (medidoen forma de TBARS), a pesar de la relativamente alta actividad de algunas enzi-mas antioxidantes. Un incremento en los niveles de proteínas carboniladas (indi-cadores de daños oxidativos en proteínas) fue observado también en el hígado detilapias (Oreochromis niloticus) en reoxigenación, luego de 3 horas bajo hipoxia;en este caso no se observaron alteraciones en los niveles de TBARS.

En la Rana pipiens no se observó un incremento en los niveles hepáticos ymusculares de peroxidación lipídica (TBARS) luego de la reoxigenación, lo quepuede ser explicado por un eficiente sistema antioxidante. En el caso de la tortu-ga Trachemys scripta elegans, se encontró una disminución de los niveles dehidroperóxidos lipídicos en riñones y de TBARS en músculo esquelético luego de 24 horas de reoxigenación. En el gastrópodo marino Littorina littorea, lue-go de una recuperación de 12 a 24 horas por una exposición prolongada de ano-xia (6 días), hubo una disminución de los niveles de hidroperóxidos lipídicos.

Como se puede apreciar, no existe un patrón en los distintos trabajos realizados,lo que puede ser explicado por el hecho de que algunos exponen a los animales asituaciones ante las cuales no se ven expuestos en la naturaleza, al menos nocomúnmente. Además, es posible que realmente se presente estrés oxidativo fisio-©

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lógico, y que las defensas antioxidantes tan sólo minimicen el daño oxidativo. Lomás importante es que en todos los casos se presenta la sobrevivencia del animal.

❚ INMERSIÓN E HIPOXIA

Varios vertebrados con respiración pulmonar viven gran parte del tiempo sumer-gidos en el agua marina y/o dulce, como las tortugas, los cocodrilos, las focas, lasballenas y los delfines, presentando algunas adaptaciones fisiológicas. La apneacausada por la inmersión ocasiona una disminución en la concentración sanguí-nea de O2 y un incremento del CO2, relacionados con cambios fisiológicos comola vasoconstricción periférica y la disminución de la frecuencia cardiaca. Comoconsecuencia, se presenta hipoxia en los tejidos de los animales que se sumergen(excepto cerebro y arterias coronarias), e incluso anoxia, dependiendo del tiem-po de inmersión. El regreso luego de una inmersión prolongada causa una abruptareperfusión de oxígeno a los tejidos, lo que, como fuera propuesto por R. Elsneret al., en 1998, podría aumentar la generación de ERO y la oxidación de compo-nentes celulares. Semejante estrés oxidativo fisiológico de la inmersión podría serminimizado con un sistema antioxidante eficazmente evolucionado para ello.

En trabajos recientes se compararon los sistemas antioxidantes en la sangre demamíferos que se sumergen constantemente contra los de mamíferos terrestres.Los animales estudiados que se sumergen fueron: foca Mirounga leonina, mana-tí del Caribe Trichechus manatus manatus, ballena Balaenoptera acutorostrata ydelfines Stenella clymene y Pontoporia blainvillei. Los mamíferos terrestres fue-ron: mono Cebus apella, hurón Grison vittatus, mapache cangrejero Procyoncancrivorus, oso hormiguero Tamandua tetradáctila y ciervo Ozotocerus bezoar-ticus. Los autores encontraron una mayor actividad de las enzimas antioxidantesen los animales que se sumergen, como SOD, GSH reductasa (GR) y GPx, asícomo de GSH. Y confirmando esto, los mamífero acuáticos presentaron menoresniveles de TBARS en plasma.

Al investigar a la foca Phoca hispida (encontrada en las frías aguas del ártico),el grupo de Tania Zenteno-Savin en La Paz BCS, México, descubrió que la pro-teína llamada factor inducido por hipoxia-1 alfa (HIF-1α) presenta sólo pequeñasdiferencias estructurales respecto de la proteína hallada en ratones. Esta proteínase encuentra presente en altas concentraciones en los tejidos de focas, y pareceser la responsable de inducir los cambios (activación de la transcripción demRNA y expresión de proteínas) que ayudan a proteger el proceso de isque-mia/reperfusión asociado a la inmersión. La misma foca, al ser comparada concerdos (Sus scrofa), presentó una mayor tasa de producción de superóxido (cora-zón, músculo e hígado) en condiciones de normoxia. Pero esta diferencia noresulta en un incremento proporcional de daños oxidativos (a pesar de los incre-


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mentados niveles de peroxidación lipídica) en tejidos. La inesperada producciónmayor de radicales libres y de TBARS en comparación con los cerdos aún se estáinvestigando. Resultados más recientes mostraron que esa foca (Phoca híspida)tiene una actividad relativamente más alta (respecto de los cerdos) de las enzi-mas SOD, GPx y GST en corazón, catalasa en hígado, GPx en músculos y SODy GPx en pulmones. La GST hepática de las focas, responsable por la remociónde productos de la peroxidación lipídica, presentó menor actividad que en loscerdos. Esto podría estar siendo compensado por la alta tasa de CAT en el híga-do, minimizando la formación de esos productos.

❚ SISTEMAS ANTIOXIDANTES Y DESHIDRATACIÓN SEVERA

La mayor parte de los animales no tolera grandes variaciones en el volumen deagua corporal o en su osmolaridad. Tal es el caso de los seres humanos, que correnun gran riesgo de muerte al perder un 10% de su peso total. No obstante, muchosanfibios sobreviven a pérdidas de 25 a 60% de su agua corporal, sin verse perju-dicados luego de la rehidratación. Los anuros del desierto pasan la mayor partedel año estivando en agujeros, y pueden perder más de la mitad de su agua. Enel caso de los anuros de regiones templadas, la deshidratación del animal es pro-vocada por vientos fríos y secos.

La deshidratación incrementa la viscosidad de la sangre, lo que reduce la ofer-ta de oxígeno a los tejidos, ocasionándoles hipoxia. Durante la rehidratación, seobserva un rápido incremento del flujo sanguíneo que, como en el proceso deisquemia/reperfusión, genera un incremento en la producción de ERO. Así, losanfibios que viven en ambientes extremadamente secos (desiertos) también sir-ven como modelo de investigación.

Para relacionar al sistema antioxidante con la deshidratación, se investigó alanuro Rana pipiens, sometiéndolo a 92 horas de severa deshidratación (pérdidade 50% del contenido de agua, a 5ºC). Se halló un incremento de la actividad delas enzimas GPx hepática (74%) y CAT muscular (52%), pero también unareducción de la actividad de SOD y GR musculares (34 a 35%). Esa modulación delsistema antioxidante parece ser eficaz, dado que no fueron encontrados cambios enlos niveles de peroxidación lipídica (cuantificado en forma de TBARS), tanto en el músculo como en hígado durante la deshidratación y la rehidratación.

Sistemas antioxidantes y congelamiento

Muchos animales (incluyendo insectos, moluscos, anfibios y reptiles) que vivenen regiones de clima frío del Hemisferio Norte son tolerantes al congelamien-


to en invierno, sobreviviendo por semanas, incluso con la mayor parte de su aguacorporal congelada y con bloqueo total de los latidos cardíacos y flujo sanguíneo.Esto se logra a través de varias adaptaciones fisiológicas y bioquímicas, como:

a) La presencia de compuestos que impiden la formación de cristales nocivosde hielo (proteínas resistentes y altas concentraciones de glucosa o trealosa).

b) La utilización del metabolismo fermentativo en el estado congelado (ya queno hay disponibilidad de oxígeno).

c) La depresión metabólica, que favorece una gran economía energética duran-te el congelamiento.

En los animales que sobreviven a ese estrés, nunca ocurre congelamiento en elinterior de las células a lo largo de los días o semanas que pueden vivir en estacondición de animación suspendida e isquemia total de los órganos.

El calentamiento del cuerpo de un animal congelado hace que el flujo sanguíneovuelva a ser normal (reperfusión), llevando oxígeno a los tejidos. ¿Sería esperableentonces, de un modo similar al proceso de isquemia/reperfusión en mamíferos,una elevada producción de ERO y estrés oxidativo en el descongelamiento? ¿Cuá-les serían las adaptaciones del metabolismo de radicales libres de estos animales?

Estas preguntas se contestan con la idea antes planteada sobre la preparaciónpara el estrés oxidativo postulada, primeramente por Hermes-Lima y Storey en1993, con los estudios sobre serpientes.

Otros estudios que confirman esta hipótesis se realizaron con la rana Rana syl-vatica, que resiste durante días temperaturas por debajo de los – 6ºC. Cuando seexpuso – 2.5ºC por 24 se encontró un incremento de la actividad de la GPx envarios tejidos distintos. Esta actividad volvió a la normalidad 24 horas después deldescongelamiento. A pesar de haber sido observada una reducción de la actividadde SOD en algunos tejidos, no se verificó un incremento en los indicadores deestrés oxidativo (peroxidación lipídica) durante el congelamiento y descongela-miento. Lo que sugiere que el anfibio también utiliza los anticongelantes endó-genos como defensa contra las ERO. Así mismo se han encontrado resultadossimilares en invertebrados: gastrópodos e insectos.

❚ HIBERNACIÓN EN MAMÍFEROS Y ESTRÉS OXIDATIVO

Varias especies de mamíferos pequeños hibernan para sobrevivir cuando las tem-peraturas ambientales son muy bajas y las fuentes de alimentos son escasas oausentes. La hibernación es un proceso estacional, caracterizado por largos pe-ríodos de entumecimiento, en los que hay una reducción de la tasa metabólica dehasta un 5% de lo que habría en un animal activo. Lo cual se refleja como una


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caída de la temperatura corporal a valores cercanos a los 0ºC, una reducción de loslatidos cardiacos, así como de la respiración y de la perfusión sanguínea, y alteracio-nes fisiológicas que ocasionan isquemia severa en los órganos. De esta manera, losanimales hibernantes logran economizar su energía para mantenerse vivos.

Sin embargo, estos períodos de entumecimiento son interrumpidos periódica-mente por el regreso del animal al estado eutérmico (36 a 37ºC). Este regresoocurre durante pocas horas, pero durante dicho período se da un incremento enel consumo de oxígeno de 100 a 300 veces, lo que consecuentemente sirve comoun ccoommbbuussttiibbllee para la termogénesis, promoviendo el recalentamiento del ani-mal. Considerando que la producción de ERO es directamente proporcional alincremento de la presión parcial de oxígeno (pO2) y a la concentración de mito-condrias funcionales presentes en el tejido, se asume que el potencial para la pro-ducción de daños oxidativos durante la hibernación es una consecuencia de laformación periódica de ERO durante los ciclos de hibernación y recalentamien-to. Así, la relación entre hibernación y estrés oxidativo es principalmente unaconsecuencia de las alteraciones fisiológicas que ocurren en la hibernación. Por loque se cree que los animales que hibernan tienen un buen sistema de defensaantioxidante para reducir la acumulación de productos de daños oxidativos a lolargo de varias semanas de entumecimiento.

Aunque es más o menos un consenso en la literatura que los animales seencuentran en hipoxia durante la hibernación por causa de una reducción en elritmo cardiaco, estudios de la Dra. Drew mostraron que las ardillas del árticoSpermophilus parryii (adaptadas a pasar por variaciones de temperatura corpo-ral, entre 4 a 37ºC durante la hibernación) se encuentran, de hecho, a pO2 altadurante la hibernación. Esto podría explicarse por la baja utilización del oxígenopor los tejidos en depresión metabólica. Así mismo, se encontró un incrementode 3 a 5 veces en las concentraciones plasmáticas del antioxidante ascorbato enel período de hibernación de estas ardillas, mientras que durante el recalenta-miento la concentración de ascorbato se reduce rápidamente, al tiempo que elconsumo de O2 aumenta. El pico de consumo de O2 también coincide con unpequeño incremento de la concentración de ácido úrico en plasma. El ácido úricoes un producto del metabolismo de las purinas, cuya formación es catalizada porla enzima xantina oxidasa, la que también produce el radical superóxido. Por lotanto, el incremento del ácido úrico en plasma (al despertar de la hibernación) esconsistente con la producción de ERO vía xantina oxidasa.

Este mismo patrón de incremento en la concentración de ascorbato plasmáti-co durante la hibernación se ve en ardillas de 13-líneas (Spermophilus tridecem-lineatus). El ascorbato también aumenta su concentración durante la hibernaciónde la ardilla Citellus citellus, así como la actividad de las enzimas SOD y GPx,particularmente en el tejido adiposo marrón, donde la termogénesis es importan-te durante este periodo.


En otro trabajo, Hannah Carey, de la Universidad de Winsconsin, examinó a lolargo del año el equilibrio redox de GSH en la mucosa intestinal de ardillas de13-líneas. Durante la hibernación, hay una reducción del 50% en la actividad de la enzima GR. La cantidad de GSH total fue menor en ardillas durante el des-pertar, y más alta en los animales durante el “recalentamiento”. La razón entreGSH y GSSG, cuyos valores bajos indican estrés oxidativo, fue 5 veces menor enanimales que hibernan comparados con animales activos en el verano, un efectoprobablemente causado por el incremento de la concentración de GSSG en lahibernación. La expresión de HSP70 en la mucosa intestinal fue mayor en ardi-llas al inicio del entumecimiento y durante el recalentamiento, reflejando lainducción de la respuesta al estrés. Los resultados sugieren que la hibernación en estas ardillas está asociada a un cambio en el equilibrio redox del estado de la GSH.

En murciélagos Myotis lucifugus, se observó recientemente que hay un incre-mento de una proteína de la familia de la tioredoxina peroxidasa en el corazónde animales en hibernación cuando se los compara con animales eutérmicos.Algunos marcadores de estrés oxidativo, también aumentan en el corazón y en elmúsculo esquelético durante la hibernación, como la HSP 27 (incremento de 4.4veces), aunque se dé una inhibición general de la traducción, como consecuenciade la depresión metabólica.

Existen pocos trabajos en los cuales se ha determinado la relación entre lahibernación y los indicadores de daño oxidativo a proteínas y lípidos. Los únicosestudios en este sentido fueron realizados por Kelly Drew, en colaboración deMarcelo Hermes-Lima y estudiantes de Alaska. En ellos se observó un aumentode proteínas oxidadas y TBARS en el tejido adiposo café de las ardillas S. parryiidurante el despertar de la hibernación.

❚ ESTIVACIÓN, ANTIOXIDANTES Y ESTRÉS OXIDATIVO

La estivación es un estado de entumecimiento que se da en los peces pulmona-dos, algunos gasterópodos y anuros, principalmente en respuesta a la baja dispo-nibilidad de agua en el ambiente. La tasa metabólica puede caer a niveles de un30% o menos del metabolismo normal. En embriones del camarón Artemia, lastasas metabólicas en determinados períodos son cercanas a cero.

La estivación puede ser interrumpida cuando se da un incremento de la hume-dad en el ambiente, probando que los mecanismos de regulación metabólica quecontrolan la depresión del metabolismo son rápidamente reversibles. En general,el retorno incluye un rápido incremento de la tasa de ventilación y consumo deoxígeno, momento en que se da la reoxigenación y posiblemente el estrés oxida-tivo. Corroborando esta propuesta, se puede observar que en el proceso de tran-


sición entre estivación y despertar de los caracoles terrestres Helix aspersa yOtala lactea se da un incremento en la peroxidación lipídica (determinada porTBRS) de glándula digestiva. En O. lactea sometidas a estivación por 30 días seda un incremento de la actividad de las enzimas antioxidantes SOD (64%), CAT(62%) y GST (94%) en el músculo del pie, y de SOD y GPx en la glándula diges-tiva, en relación con aquellos activos por 24 horas.

De modo similar, el caracol H. aspersa sometido a 20 días de estivación, pre-senta un incremento de la actividad de GPx y de niveles GSH total en la glándu-la digestiva, y de la actividad de GPx en el músculo del pie (comparado conanimales despiertos 24 horas antes). Luego de 15 minutos del despertar, se da unincremento transitorio en la razón GSSG/GSH total, indicando un estrés oxida-tivo de naturaleza fisiológica. El cangrejo acuático Biomphalaria tenagophila, enestivación por 15 días promueve un pequeño (pero significativo) aumento en laactividad de la Se-GPx y una reducción de la SOD en la glándula digestiva. Losincrementos en la actividad de antioxidantes endógenos en los caracoles B. tena-gophila, H. aspersa y O. lactea en estivación fueron considerados una prepara-ción para el estrés oxidativo que parece darse en el despertar de la estivación.

La modulación de la capacidad antioxidante durante la estivación también fueobservada en el sapo de espuela Scaphiopus couchii, animal característico de laregión sudoeste de EUA. Estos sapos estivan durante 9 a 10 meses al año, redu-ciendo su tasa metabólica a un 20 a 30% de la del animal activo, y con una pér-dida de aproximadamente un 60% del agua del cuerpo luego de seis meses enestivación. Durante el despertar de la estivación, el sapo tiene un incrementotransitorio del consumo de O2. Así, es probable que una gran cantidad de EROsea producida en ese momento. Luego de 10 días de la salida de estivación enestos sapos (comparados con animales en estivación por 2 meses a 21ºC), seobserva una mayor actividad de varias enzimas antioxidantes (p. ej.: GPx, GR,GST y CAT en hígado). O sea, los sapos en estivación, al revés de lo verificadoen caracoles, presentaron una disminución de los niveles de enzimas antioxidan-tes en varios tejidos.

Los autores observaron asimismo que la peroxidación lipídica se incrementóentre un 27 y un 168% en casi todos los tejidos de los sapos en estivación, lo quepuede ser explicado por la reducida capacidad antioxidante bajo esas condicio-nes. Tal vez esta menor capacidad antioxidante (en la estivación) ocurra comorespuesta a la reducción de la tasa metabólica, y el S. Couchii adopta como estra-tegia adaptativa una tolerancia a los productos de peroxidación. Tal estrategiapodría ser como punto central el ahorro energético, al no realizar la detoxifica-ción de productos aldehídicos (de la peroxidación lipídica) y no sintetizando odegradando nuevas proteínas de función antioxidante.

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❚ ESTACIONALIDAD DEL SISTEMA DE DEFENSA ANTIOXIDANTE

Los procesos de hibernación y estivación se encuentran asociados a las variablesestacionales, como, por ejemplo, cambios en la insolación y en la temperatura. Ydado que se propone que la modulación del sistema de defensa antioxidante esimportante para la supervivencia de estos animales en ambientes extremos,es importante analizar como influye la estacionalidad.

Las alteraciones estacionales en el sistema de defensa antioxidante ya han sidodescritas en la literatura. Las ardillas Citellus citellus, durante el invierno (épocaen la cual hibernan) poseen menor actividad de las enzimas antioxidantes que lasencontradas en el verano (época de mayor actividad en estos animales). Delmismo modo, el ácido ascórbico y el α-tocoferol son encontrados en menor con-centración durante el periodo de invierno que durante el verano.

Alteraciones estacionales fueron observadas también en el mejillón Pernaperna, conocido como mejillón azul. Un estudio del Brasil mostró que la mayoractividad de las enzimas antioxidantes se encuentra en el verano. Un estudioirlandés mostró en el mejillón azul, durante el invierno, una caída de los nivelesde defensa antioxidante en la glándula digestiva y en las branquias.

En otro estudio con el molusco Mytilus edulis, en Italia, se demostró la dismi-nución de los niveles/actividades de las defensas antioxidantes en la glánduladigestiva durante el invierno (en comparación con las otras estaciones), acompa-ñado por un incremento de TBARS.

El caracol terrestre Helix aspersa, una especie originaria de la región del medi-terráneo capaz de estivar e hibernar, también presenta un comportamiento esta-cional del sistema de defensa antioxidante. En un estudio desarrollado en Brasil, enel período de julio a agosto (invierno) se dio un incremento en la actividad de laGPx en la glándula digestiva y en el músculo del pie durante la estivación.

Pero durante el periodo de enero a marzo, la estivación provocó una caída enla actividad de las enzimas catalasa y SOD (y un incremento de GPx) en la glán-dula digestiva de H. aspersa, sin embargo, comparativamente con las actividadesde julio a agosto, todas las enzimas antioxidantes tuvieron una actividad basalmás elevada en enero a marzo.Así, durante este período, que corresponde al vera-no en Brasil, estos caracoles presentan un potencial antioxidante mayor. En losmeses de julio a agosto, hubo un incremento transitorio en la concentración deTBARS y GSSG durante el despertar (indicando un estrés oxidativo). Este incre-mento no fue observado cuando los animales despertaban de la estivación en losmeses de enero a marzo.

Hasta las ratas presentan una variación en su sistema de defensa antioxidante.Un estudio reciente analizó enzimas antioxidantes y daños oxidativos a lípidos engrupos de ratones de distintas épocas del año. Los investigadores observaron quedurante el verano, las actividades de la GPx y CAT son mayores en corazón


e hígado que en el resto del año. Los daños oxidativos a lípidos del corazón fue-ron mayores durante la primavera que en otras épocas del año.

De modo general, la modulación del sistema de defensa antioxidante está rela-cionada con variaciones de las condiciones ambientales, tales como temperatura,humedad, presión atmosférica, mayor disponibilidad de alimentos, períodoreproductivo e incluso ciclos circadianos.

❚ INVERTEBRADOS MARINOS QUE VIVEN EN EL FRÍO: RADICALES LIBRES Y ENVEJECIMIENTO

El proceso de envejecimiento se define como el deterioro progresivo de las célu-las, tejidos y órganos, asociado con una disminución en la función fisiológica a lolargo del tiempo. El alto potencial de las ERO para ocasionar daño oxidativo llevóa Denham Harman, en 1956, a sospechar que las ERO estaban involucrados enel proceso de envejecimiento (véase capítulo ERO, envejecimiento y senescenciacelular). Puesto que gran parte de las ERO son producidos por las mitocondrias,de allí que se crea que estos organelos juegan un rol protagónico en el envejeci-miento. En ectotermos marinos, se ha encontrado un aumento en el periodo devida máxima esperada (MLSP, por sus siglas en inglés) en organismos que vivenpermanentemente en ambientes fríos, en comparación con especies similares deaguas más cálidas. Esto lleva a la pregunta de ¿Cómo la temperatura ambientalinfluye en el proceso de envejecimiento en los ectotermos marinos? La tempera-tura tiene un impacto en las tasas metabólicas y en la intensidad de formación deERO en especies ectotérmicas. Una menor tasa metabólica estándar (SMR, porsus siglas en inglés) y una menor tasa de generación de ERO podrían, por tanto,ser un factor primordial responsable de un MLSP más largo.

Comparando dos especies de almejas de ecotipos similares del Mar del Nortey la Antártida, E. Philipp y colaboradores encontraron SMR aún más bajos, unamenor producción mitocondrial de ERO, una mayor capacidad antioxidante(niveles de GSH y actividad de CAT) y una mejor conservación de la funciónmitocondrial al pasar los años en una especie polar longeva (Laternula elliptica,MLSP de 36 años) comparada con una especie de clima templado más efímera(Mya arenaria, MLSP 13 años). Sin embargo, la temperatura parecería ser sólouno de los factores relacionado con la configuración del MLSP de la poblaciónde una especie. La almeja de Islandia Arctica islandica llega a tener períodos devida de varias décadas (el registro más longevo es la casi increíble edad de 374años), mientras que la Mya arenaria del Mar del Norte no alcanza nunca a pasarlos 20 años; sin embargo, la temperatura media del hábitat de ambas especiesdifiere tan sólo en 5 a 10ºC. Actualmente se está investigado cómo la forma devida específica de las especies y las características ambientales del habitat de las©

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poblaciones (por ejemplo, alimentación, predadores) contribuyen a la modula-ción de la fisiología animal en relación con la temperatura, incluyendo la for-mación celular de ERO y capacidad antioxidante, influyendo así en el MLSP dela población de una especie.

❚ INVESTIGACIONES REALIZADAS EN EL LABORATORIO DE LOS AUTORES

Como se ha descrito a lo largo de este capítulo, los autores son pioneros en estecampo de estudio. Además de lo antes mencionado, los autores son de los pocosinvestigadores que han determinado la relación entre depresión metabólica eindicadores de daños oxidativos a proteínas o lípidos. Los experimentos se reali-zan con diversas especies que viven en condiciones extremas. La adaptación delmetabolismo de radicales libres se investiga también en invertebrados marinos deregiones antárticas y templadas.

❚ CONCLUSIONES Y CONSIDERACIONES FINALES

Los animales que vivencian cambios constantes y abruptos en la oferta de oxíge-no (y/o de la temperatura) presentan respuestas adaptativas (o de preparación) ensus sistemas antioxidantes. Tales respuestas fueron descritas a lo largo del capítu-lo, y corroboran la hipótesis de la “preparación para el estrés oxidativo”, en la cualexiste un incremento de la capacidad antioxidante de los tejidos antes de que hayauna elevada producción de radicales libres (seguido de daños oxidativos), tal comose da en la reoxigenación, luego de un periodo de anoxia o hipoxia, bajo deshidra-


CCuuaaddrroo 3355--11.. EEjjeemmppllooss ddee ccaammbbiiooss eenn llooss ppaarráámmeettrrooss aannttiiooxxiiddaanntteess aassoocciiaaddooss aa llaa vviiddaa aanniimmaall eenn ssiittuuaacciioonneess aammbbiieennttaalleess eexxttrreemmaass

AAnniimmaall EEssttrrééss ffiissiioollóóggiiccoo EEjjeemmppllooss ddee aalltteerraacciióónn

Serpiente Thamnophis sirtalis Anoxia por 10 h (5ºC) ↑ SOD e GPx (*)parietalis

Anfibio anuro Rana pipiens Anoxia por 30 h (5ºC) ↑ catalasa, Se-GPx e GST (*)

Tortugas Emydoidea blandingii, Anoxia por 16 días (4ºC) ↑ catalasa hepática (*)Chrysemys picta, Malaclemys terrapin, Chelydra serpentina yTrachemys scripta

Pez Carassius auratus Anoxia por 8 h ↑ catalasa, G6PDH y Se-GPx (*)

Continúa...

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Cangrejo Chasmagnathus Anoxia por 8 h ↑ catalasa y GST y ↓granulata SOD (*)

Gastrópodo Biomphalaria tenagophila (un caracol de agua dulce) Anoxia por 24 h ↑ Se-GPx y ↓ catalasa

(26 a 27ºC) (*)Tortugas Trachemys scripta Anoxia por 20 h (5ºC) ↓↑ algunas enzimas

elegans antioxidantesAlta actividad de enzimas y [GSH-eq]

Gastrópodo marino Littorina Anoxia ↓ algunas enzimaslittorea antioxidantes

↑[GSH] en hepato-páncreas y músculo del pie

↑ expresión de meta-lotioneína y ferritina (*)

Tortuga Trachemys scripta Resistente a la Anoxia Alta [ascorbato] consti-tutiva en cerebro

Pez carpa Cyprinus carpio Hipoxia por 5 h ↑ catalasa y GPx (*)↓ protección antioxi-

dante en varios tejidosPez Leiostomus xanthurus Hipoxia por 12 h ↑ actividad de SOD (*)Pez tilapia Oreochromis niloticus Hipoxia ↑ [Hsp70] en sangre,

cerebro y músculo↑ Se-GPx hepática (3 h

de hipoxia) (*)Poliqueto Heteromastus filiformis Hipoxia ↑ catalasa (*)Focas Phoca hispida, Mirounga Mamíferos que se Alta [GSH] o [GSH-

leonina, baleia Balaenoptera sumergen eq] constitutiva enacutorostrata, golfinhos Stenella hemáceasclymene, Pontoporia blainvillei Alta actividad de diver-y manatí Trichechus manatus sas enzimas antioxi-manatus dantes en hemáceas

Tortuga Phrynops Hilarii Hipoxia/sumersión Muchos agrupamientos sulfhidrilo en hemo-globina

...continuación

Continúa...




Anuro Rana pipiens Deshidratación severa ↑ Se-GPx y catalasa y ↓por 4 días SOD y GR (*)

Anuro Rana sylvatica Congelamiento (24 h) ↑ GPx total y ↓ SOD (*)

Serpiente Thamnophis sirtalis Congelamiento (5 h) ↑ catalasa y Se-GPx (*)parietalis

Gastrópode marinho Littorina Congelamiento ↑ expressión de metalo-littorea tioneína (*)

Larva de insecto Eurosta solidaginis Congelamiento (24 h) ↑ catalasa (no descongelamento)

Ardillas Spermophilus parryii Hibernación ↑ [ascorbato] en plasma y fluido cerebroespi-nal (*)

Ardilla Citellus citellus Hibernación ↑ algunas enzimas antioxidantes (*)

Ardilla Spermophilus Hibernación ↑ HSP70 ↓ [GSH-eq] ytridecemlineatus ↓GR expresión de

SOD, GST y Se-GPx(*)↑ [ascorbato] en plasma

y fluido cerebroespinalMurciélago Myotis lucifugus Hibernación ↑ expresión de tiorredo-

xina peroxidasa,Se-HPx, GST yperoxirredoxina (*)

Caracol terrestre Otala lactea Estivación (30 días) ↑ catalasa, Se-GPX,SOD y GST (*)

Caracol terrestre Helix aspersa Estivación (20 días) ↑ Se-GPx y ↑[ GSH-eq] y ↓ SOD (*)

Caracol acuático Biomphalaria Estivación (15 días) ↑ Se-GPx y ↓ SOD (*)tenagophila

Sapo Scaphiopus couchii Estivación ↑↓ enzimas en varios tejidos y ↓ [GSH]

G6PDH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; GPX, glutatión peroxidasa; GPX total, GPX depen-diente + independiente de selenio; GR, glutatión reductasa; GSH, glutatión reducida; GSH-eq, glu-tatión (GSH + GSSG); GST, glutatión-S-transferasa; Hsp70, proteína de choque térmico; Se-GPx,glutation peroxidasa dependiente de selenio; SOD, superóxido dismutasa; (*), preparación para elestrés oxidativo.

...continuación

tación severa, congelamiento, en hibernación y estivación . El cuadro 35-1 es unresumen de las observaciones experimentales que sustentan esta hipótesis.

La mejor adaptación antioxidante y menor producción de ERO en animalespolares se correlacionó con la vida más larga de los mismos. En este sentido, surgela pregunta ¿Los animales tolerantes a la anoxia e hipoxia también controlan laproducción de ERO en la fase de reoxigenación? Resultados recientes, obtenidoscon mitocondrias aisladas de goldfish, apuntan hacia esta posibilidad.

Los mecanismos moleculares que regulan las respuestas antioxidantes de dis-tintos animales en variadas condiciones extremas aún no se conocen. Por lo quese vuelve importante, entonces, revelar los mecanismos de regulación del sistemaantioxidante, lo que permitirá entender mejor el proceso adaptativo de animalesque viven en extremos ambientales y, seguramente, ayudará a la comprensión ytratamiento de enfermedades isquémicas que afectan al hombre.

❚ AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Evaldo Reischl (profesor jubilado de la UFRGS, Brasil) por la revisión departe de este capítulo, al Programa de Pos-Graduación en Fisiología (USP, Brasil),a la Dra. Mina Konigsberg Fainstein (UAM) por la invitación a participar en estelibro, y al CNPq (Brasil) e Instituto do Milênio-CNPq (Redoxoma) y IFS (Sue-cia) por el apoyo financiero.

❚ REFERENCIAS

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EESSTTRRAATTEEGGIIAASS PPAARRAA DDEETTEERRMMIINNAARRLLAA RREELLEEVVAANNCCIIAA FFIISSIIOOLLÓÓGGIICCAA

DDEE LLAASS EESSPPEECCIIEESS RREEAACCTTIIVVAASSDDEE OOXXÍÍGGEENNOO EENN AANNIIMMAALLEESS CCOOMMPPLLEETTOOSS

Luis F. Covarrubias Robles

❚ INTRODUCCIÓN

Es de esperarse que ocurran cambios en la producción de especies reactivas deoxígeno (ERO) asociados a las modificaciones en el metabolismo que acompa-ñan a los diversos procesos del desarrollo embrionario, así como a las funcionesespecíficas de los tejidos y órganos. Por otro lado, se sabe que en respuesta a cier-tas señales extracelulares se pueden producir ERO, y que éstas son necesariaspara transducir señales que generen respuestas celulares específicas.

Los niveles de las ERO no son determinados únicamente por cuánto se produ-ce de cada una de ellas, sino también por qué tanto (y cuáles) son degradadas oinactivadas por los sistema antioxidantes de la célula. Entre los antioxidantes noenzimáticos más utilizados por las células de mamíferos están el glutatión (GSH)y la tiorredoxina (Trx), los que deben ser ayudados por otros compuestos comoalgunas vitaminas. Los sistemas antioxidantes enzimáticos son también muydiversos y están constituidos por enzimas como la superóxido dismutasa (SOD),la catalasa (CAT) y una variedad de peróxidasas, que fueron descritas amplia-mente en los capítulos precedentes.

Desde el punto de vista de las posibles consecuencias dañinas que resultan dela reacción de las ERO con distintos componentes celulares, pudiera pensarse que

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el organismo debe estar luchando siempre por mantener sus niveles bajos; sinembargo, actualmente se conoce que la elevación de las ERO a ciertos umbralescausa efectos celulares que pueden ser esenciales para el desarrollo embrionarioo las funciones de tejidos y órganos. Entre estas respuestas está incrementar o dis-minuir la proliferación celular, inducir la diferenciación, o causar la muerte celu-lar. ¿Cómo determinar si estas respuestas celulares a las ERO son efectivamenteesenciales para el organismo en su conjunto, y qué consecuencias pueden resul-tar si éstas no se llevan a cabo? Los estudios con células en cultivo sólo permiteninferir posibles funciones, pero respuestas que definan la relevancia real de lasERO no puede derivar de este sistema experimental, por lo que es necesario hacerestudios en el organismo completo. Puesto que es de particular interés contestar aestas preguntas en el contexto de los seres humanos, donde es imposible diseñarexperimentos controlados, los científicos han acudido a los organismos modelo.Entre estos el ratón representa el modelo de elección para estudiar procesos rele-vantes para los mamíferos en general, y para el humano en particular.

❚ DETECCIÓN DE ERO IN VIVO

Una primera evidencia que puede indicar una función potencial de las ERO es lacorrelación entre un proceso biológico y un cambio en los niveles de ERO. Exis-ten muchos datos a este respecto en células en cultivo, pero muy pocos se hanobtenido en organismos completos, particularmente durante el desarrollo. Loanterior se debe esencialmente a la dificultad para realizar estas mediciones demanera confiable.

Directa

Para determinar las ERO se pueden utilizar métodos directos basados esencial-mente en el uso de colorantes o fluoróforos, donde la aparición de un color ofluorescencia resulta de la oxidación de estos compuestos. Una de las desventa-jas de estos métodos es que tienen que aplicarse sobre muestras frescas, lo cualse dificulta cuando se trata de tejidos embrionarios o adultos, pues la manipula-ción (p. ej., disección) puede causar alteraciones en el patrón de las ERO. Unaalternativa que reduce significativamente este problema cuando se trata de teji-dos complejos, es la detección en la pieza completa fresca; aunque el ensayo enestas condiciones aún permite hacer análisis cuantitativos, éste es más bien cua-litativo. De esta forma es posible detectar tejidos específicos o capas celularesque están bajo estrés oxidativo con poca manipulación de la muestra que se estáestudiando.


Uno de los pocos colorantes que permite hacer un análisis sobre el tejido fija-do es el dihidroetidio. Este compuesto tiene la propiedad de ser permeable a lascélulas en su forma reducida, pero una vez adentro en caso de haber estrés oxí-dativo, éste se oxida, se convierte en etidio y se transloca al núcleo donde se unefuertemente al DNA resistiendo el proceso de fijación.

Indirecta

El estrés oxidativo al que han estado sometidos los tejidos, se puede detectar demanera indirecta determinando el daño (oxidación) de diversas macromoléculascomo los lípidos (lípidos peroxidados), las proteínas (p. ej., carbonilos) y el DNA(8-hidroxi-desoxiguanina). Puesto que, en general, para estos ensayos se requierehacer extractos de los tejidos, no es posible hacer determinaciones detalladas detejidos complejos.

Un cambio en la concentración de las ERO también puede inferirse por cambiosen la expresión o actividad de las enzimas antioxidantes. En respuesta a condicio-nes de estrés oxídativo, varias enzimas responden incrementando su expresión yactividad.

❚ ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE GENESQUE REGULAN EL ESTADO REDOX

Si bien las correlaciones son indicios de una posible función para las ERO, la de-mostración requiere la posibilidad de valorar las consecuencias funcionales cuan-do las ERO se incrementan en sitios o en momentos donde naturalmente susniveles son bajos, y cuando los niveles de las ERO se reducen o se eliminan enmomentos y sitios donde en condiciones normales las ERO están elevadas. Lograrestas condiciones in vivo es complicado pues la variedad de ERO es diversa y lafunción de cada especie puede ser específica. Además, los mecanismos que con-tienden con las ERO son diversos y frecuentemente redundantes. La aplicaciónde antioxidantes comunes es una vía para reducir las ERO, aunque no siemprelleva a resultados concluyentes, ya sea por su inespecificidad o por los desbalan-ces metabóicos que puede causar. Cabe mencionar el desarrollo de nuevos antio-xidantes llamados mimetics que imitan la actividad de la SOD y/o CAT, loscuales son poco tóxicos y muy permeables a las membranas celulares, por tanto,permiten hacer estudios in vivo.

Otra manera de lograr estas alteraciones de manera más controlada y dirigida esmediante manipulaciones genéticas de las enzimas involucradas en la producciónde las ERO y de las enzimas antioxidantes. Un modelo animal donde esto puede©

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Estrategias para determinar la relevancia fisiológica... • 545

lograrse es el ratón, donde en los últimos 25 años se han desarrollado una seriede tecnologías que permiten modificar la expresión génica de manera precisa ycontrolada. A continuación se hace una breve descripción de estas técnicas.

Ratones transgénicos

Para lograr una ganancia de cierta función, comúnmente se utiliza la tecnologíade producción de ratones transgénicos. Desde el punto de vista genético, la ggaa--nnaanncciiaa ddee ffuunncciióónn significa la activación de un gen de forma eeccttóóppiiccaa (en lugaresdistintos a los normales) y/o acrónica (en tiempos distintos a los normales). Paraesto inicialmente se genera una construcción con el gen de interés (ttrraannssggéénn), lacual está constituida por un promotor específico que controla el momento y elsitio donde se expresa el transgén, y las señales necesarias para el procesamientoy traducción de un RNA mensajero maduro (p. ej., sitios de empalme, sitios depoliadenilación). Una vez contando con esta construcción, ésta se inyecta a unode los pronúcleos del huevo fertilizado. En estas condiciones, frecuentemente elDNA inyectado se integra al genoma antes o poco después de la primera divi-sión, de tal forma que la mayor parte de las células del organismo resultante lle-varán el transgén; cuando el DNA se incorpora a la línea germinal (el linaje queda lugar a los gametos), se dice que se cuenta con una llíínneeaa ttrraannssggéénniiccaa puestoque el transgén se podrá heredar a su progenie indefinidamente.

Mediante esta tecnología también se puede lograr pérdida de función usandoformas dominantes negativas (formas del mismo gen que inactivan al gen endó-geno) del gen particular.

Mutaciones sitio específicas (gene targeting)

La manera más común de lograr la pérdida de función de un gen es mediante lageneración de deleciones por recombinación homóloga, estrategia comúnmentedenominada como knock out. En este caso, la construcción debe incluir regionesde homología con el locus que se pretende modificar, y debe carecer de la regiónque se pretende deletar. Esta construcción debe contar además con elementos quepermitan seleccionar las células en las cuales ocurrió el evento de homología.Comúnmente se incluye, a cambio de la región que se pretende deletar, el gen deresistencia a neomicina o algún otro antibiótico (diseño de rreeeemmppllaazzoo). Por otrolado, se incluye un gen de selección negativa que se ubica fuera de las regionesde homología. El gen más frecuentemente utilizado para este propósito es lattiimmiiddiinnoo cciinnaassaa (TK) del virus de herpes. Esta enzima, en presencia de sustratoscomo el aciclovir, genera productos tóxicos que matan a la célula. Así entonces,


en condiciones donde el medio contiene neomicina y aciclovir sólo deberánsobrevivir las células que hayan integrado el plásmido y que, como consecuenciade la recombinación, hayan eliminado la TK.

Las células troncales embrionales (CTE) son la clave para que el procedimien-to de recombinación homóloga permita la modificación del genoma de ratonescompletos. Estas células se pueden cultivar in vitro fácilmente, y por tanto sepueden someter al procedimiento antes descrito. Más importante, estas células se pueden incorporar al embrión, mediante la inyección al blastocele del embriónen etapa de blastocisto o agregación a embriones en etapa de mórula, y derivaren células de todos los tejidos, incluyendo las que conforman la línea germinal.De estos ratones qquuiimméérriiccooss, llamados así porque están formados por célulastanto donadoras (p. ej., CTE) como del huésped (p. ej., el blastocisto o mórulareferido anteriormente), se pueden derivar animales donde todas las células lle-van la modificación genética a través de simplemente cruzarlos con animales sil-vestres; por ejemplo, si el espermatozoide lleva la modificación genética, el huevofertilizado dará lugar a un ratón donde todas sus células llevan esta modificacióngenética. Estos animales son heterocigotos (+/-) para la mutación (si bien nosiempre, comúnmente la mutación generada es recesiva), por lo que es necesariocruzarlos entre ellos para generar la línea homocigota (-/- ) y así poder analizarel fenotipo resultante.

Usando esta misma tecnología también es posible generar ganancia de funciónmediante la inserción del gen en estudio en un locus particular tal que su expre-sión ahora dependa de un promotor endógeno. A esta estrategia se le llamaknock-in y suele usarse cuando no se cuenta con el promotor que dé el patrón deexpresión requerido mediante la tecnología de microinyección al pronúcleo, refe-rida anteriormente.

Alteraciones genéticas condicionales

1. Sistemas inducibles. Estos sistemas permiten activar o reprimir la expresión deun transgén específico mediante la inyección de un inductor que es inocuo alorganismo. Para esto, el transgén que se quiere activar o reprimir se une a un pro-motor cuya actividad depende del factor transcripcional que responde al induc-tor. Uno de los sistemas más efectivos en los años recientes es el que utiliza lassecuencias reguladoras del gen de tetraciclina del transposón bacteriano Tn10 ysu correspondiente represor específico (p. ej., se une al operador específico en lasecuencia reguladora). La molécula reguladora en este caso es la tetraciclina, sinembargo, este compuesto es tóxico para el ratón por lo que se han derivado aná-logos (p. ej., doxiciclina) con un muy bajo grado de toxicidad. Por otro lado, elrepresor ha sido alterado de tal forma que pueda funcionar en células de mamí-©

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fero como represor o como activador transcripcional. Para lograr esto, se fusionóal represor el dominio de activación transcripcional de la proteína VP16 del virusherpes simple; en este caso la presencia de la doxiciclina impide al transactivador(tTA) unirse a su secuencia blanco en el DNA. Posteriormente, otras mutacionesse introdujeron para que la presencia de la doxiciclina sea requisito para que eltransactivador (rtTA) se una a su secuencia blanco. Así, con estos elementos se hadesarrollado el sistema Tet-ON, en el cual la presencia de doxiclina activa altransgén, y el sistema Tet-OFF, en el cual la doxiclina reprime al transgén.

2. El sistema Cre-loxP. Este sistema permite generar mutaciones asociadas a untejido particular y/o a un momento específico del desarrollo embrionario o lavida adulta.

El eje de la técnica reside en el control de la expresión sitio y/o tiempo especí-fico de una enzima recombinasa cuya actividad depende de secuencias específicas.La recombinasa más utilizada hasta la fecha es la denominada Cre provenientedel fago bacteriano “P1”. Esta enzima reconoce la secuencia denominada loxP,de manera que, cuando dos secuencias loxP se encuentran en la misma dirección(es decir la secuencia del DNA se lee igual de su extremo 5’ al extremo 3’), elfragmento de DNA entre ellas dos se deleta. Así entonces, la aplicación de estatecnología requiere que en primera instancia se le inserten secuencias loxP(comunmente en intrones para no alterar la secuencia codificante y el gen sigasiendo funcional) flanqueando el fragmento de DNA (comunmente uno o másexones) que se quiere deletar del gen X de interés (alelo loxeado; XloxP).

Para mutaciones sitio-específicas (p. ej., en un tejido o tipo celular específico),se producen inicialmente ratones transgénicos (por la técnica clásica de microin-yección pronuclear referida anteriormente) que expresen Cre sólo en un tejido otipo celular determinado (por medio del uso de promotores específicos). Actual-mente ya existe una colección disponible de transgénicos donde Cre se expresade manera restringida en algunos tejidos. El paso siguiente consiste en cruzarestos ratones transgénicos Cre –referidos en inglés como deleters— con los rato-nes que llevan el alelo ‘loxeado’ del gen de interés (para obtener ratones con elgenotipo Cre/+; XloxP/XloxP). La expresión de Cre en el tejido específico (deter-minado por el promotor elegido) hará que los sitios loxP realicen una recombi-nación dejando atrás una deleción, y por lo tanto alelos nulos del gen en cuestión.Frecuentemente, para incrementar la eficiencia de obtener células con los dosalelos nulos depués de la acción de la recombinasa, se incorpora un alelo nulo(Cre/+; X-/XloxP), de tal forma que solo un alelo tiene que ser deletado por larecombinasa. En el caso del KO condicional-temporal, se recurre al empleo depromotores que se activan a tiempo específicos o que son inducibles, como el sis-tema referido en la sección anterior, para controlar la expresión de Cre.

Las técnicas descritas anteriormente ofrecen multitud de posibilidades, dejan-do al ingenio del investigador obtener los resultado deseados. Otras técnicas que


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pudieran acelerar el determinar el fenotipo que se manifiesta en consecuencia deuna disminución en la expresión de un gen particular están actualmente en desa-rrollo. Probablemente las técnicas que tendrán más auge en el futuro cercano sonlas basadas en el proceso de intereferencia al RNA (iRNA).

❚ GANANCIA Y PÉRDIDA DE FUNCIÓN DE GENESREGULADORES DEL ESTADO REDOX

Usando las técnicas descritas anteriormente para alterar la expresión de los genesque codifican para las proteínas asociadas a la producción de las ERO, o a su eli-minación, es posible determinar la función de la proteína oxidante o antioxidan-tes en el desarrollo embrionario o la vida adulta, así como su asociación conenfermedades, algunas de las cuales pudieran presentarse en el humano. Para unamejor evaluación de la función se requiere contar con resultados tanto de ganan-cia de función p. ej., sobreexpresión del gen) como de pérdida de función (p. ej.,mutaciones nulas). A continuación se hace una breve descripción de los efectosque ha resultado de alterar la expresión de proteínas o enzimas antioxidantes.

Superóxido dismutasa

En los mamíferos existen tres tipos de supoeróxido dismutasas, cada una locali-zada principalmente en compartimentos distintos; la SOD1 es esencialmentecitosólica, la SOD2 mitocondrial, y la SOD3 extracelular (véase el capítulo deSuperóxido dismutasa). A la fecha se han producido ratones con mutacionesnulas en los tres genes que codifican para las diversas SOD. Los ratones homoci-gotos para mutaciones nulas en el gen Sod1 (Sod1-/-) o Sod3 (Sod3-/-) nacen sinun fenotipo evidente, lo que indicaría que el desarrollo embrionario puede ocu-rrir en ausencia de las enzimas codificadas por estos genes. No obstante, aunquecada enzima se localiza en distinto compartimiento celular, es posible que hayaun cierto grado de redundancia entre los dos genes, es decir, que la enzima SOD1sea capaz de compensar las funciones de SOD3 o viceversa. En este sentido,dobles mutantes para los genes Sod1 y Sod3 (Sod1-/-; Sod3-/-) también nacen sinfenotipo evidente, indicando que por lo menos estos dos genes no son redundan-tes. En edades posnatales los ratones Sod1-/- y Sod3-/- muestran anormalidadesmoderadas. El mutante en Sod1 tiene una vida corta, pero esto, más que debidoal envejecimiento, es consecuencia del desarrollo de carcinomas hepatocelulares. Elmutante en Sod3, en cambio, no muestra ningún fenotipo aparente en condicio-nes normales, pero cuando estos son estresados con alta tensión de oxígeno, mue-ren prematuramente, lo que no sucede con el mutante en Sod1.


En contraste con los mutantes anteriores, los ratones con mutaciones nulashomocigotas en el gen Sod2 (Sod2-/-), sí muestran un fenotipo severo que causasu muerte en la etapa perinatal. La muerte parece estar asociada a severas alte-raciones neurológicas y cardiacas. Este fenotipo no es compensado por la so-breexpresión de un transgén de Sod1. Puesto que la SOD2 se localiza en lamitocondria y la SOD1 en el citosol, lo anterior pudiera estar indicando que la mitocondria es la principal fuente de superóxido, o los principales blancos deéste están en la mitocondria en condiciones normales.

Los ratones transgénicos que sobreproducen las tres enzimas también se hangenerado. Usando transgenes que codifican para las formas silvestres de las SOD,no se han observado fenotipos en condiciones normales; particularmente la lon-gevidad de estos ratones no parece alterarse, si bien muy altos niveles de SOD2 siparecen reducir su viabilidad y fertilidad. No obstante lo anterior, la sobreproduc-ción de ellas sí lleva a la protección ante insultos. Por ejemplo, se ha observado quela sobreexpresión tanto del gen Sod1 como de Sod2 puede proteger de daño cere-bral o al corazón que ocurre después de una isquemia local. Por otro lado, la sobre-expresión de Sod2 o Sod3 protege el desarrollo de los alveolos pulmonares cuandoratones recién nacidos son sometidos a condiciones de hiperoxia.

Un caso interesante son los ratones transgénicos que se han generado quesobreexpresan el gen Sod1 humano (hSod1) que incluye alguna de las mutacio-nes asociadas a la esclerosis amiotrófica lateral (ALS), enfermedad degenerativacaracterizada por la muerte paulatina de las motoneuronas que inicialmente llevaa parálisis progresiva, y finalmente a la muerte. Los ratones transgénicos queexpresan la hSod1ALS desarrollan la enfermedad de manera muy similar a comoocurre en humanos, sin importar que los dos alelos silvestres de Sod1 del ratónse encuentren presentes. Esto significa que la hSod1ALS tiene una función “nue-va” dominante, más que una disminución o incremento en la actividad de supe-róxido dismutasa, pues la enfermedad no se desarrolla en los animales quecarecen de Sod1 o en los que sobreproducen la forma silvestre de la enzima.

Catalasa

La CAT, en contraste con la mayoría de las peroxidasas de los mamíferos, es laúnica enzima capaz de mantenerse activa a altas concentraciones de peróxido.A pesar que desde hace muchos años se describieron ratones (y también huma-nos) acatalasémicos, estos animales en sí, no tienen una pérdida general de laactividad de catalasa, sino más bien una disminución que no siempre afecta iguala todos los tejidos. Usando la tecnología de knockout recientemente se han pro-ducido ratones con deleciones en el gen (Cas-/-) que carecen totalmente de laactividad de catalasa. Estos animales nacen sanos y, aparentemente, su vida adul-


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ta transcurre sin anormalidades evidentes; sin embargo, estos animales sí mues-tran mayor daño oxidativo, y aparente incremento en la sensibilidad a este tipode daño. Más estudios van a ser necesarios para determinar si la longevidad delos ratones Cas-/- está afectada o si son susceptible a desarrollar alguna enfermedad.

Hepatocitos y fibroblastos de ratones transgénicos que sobreexpresan de 2 a 4veces más Cas que los ratones silvestres, en los mismos tejidos donde normalmen-te se expresa este gen, son resistentes a dosis letales de peróxido, pero inesperada-mente son más sensibles al paraquat y la irradiación gamma. Por otro lado, usandoun promotor específico del corazón se logró sobreexpresar Cas exclusivamenteen este órgano. En estos ratones transgénicos, la catalasa reduce la miocardiopa-tía asociada a ratones diabéticos y la cardiotoxicidad por la droga anticanceríge-na doxorrubicina.

La CAT se localiza mayoritariamente en el peroxisoma. La localización de laenzima en este organelo depende de una secuencia en su extremo carboxilo. Elimi-nando esta secuencia e incluyendo secuencias que determinan la localización de lasproteínas en el núcleo o mitocondria, es posible reubicar la CAT en la mitocondria,el núcleo o el citoplasma. Usando esta estrategia se observó que ratones transgéni-cos que sobreproducen la CAT en la mitocondria, pero no en el núcleo o peroxiso-ma, de varios tejidos incluyendo el corazón, y el cerebro, incrementan la longevidaden un 20%. Estos resultados son consistentes con la propuesta de que la mitocon-dria es la fuente más importante de ERO durante la vida de los mamíferos.

❚ GLUTATIÓN Y GLUTATIÓN PEROXIDASAS

El GSH junto con la Trx se consideran los agentes reductores que, bajo condicio-nes fisiológicas, se encargan de mantener el ambiente reductor intracelular de lamayoría de las células. Éstos pueden actuar directamente sobre algunas ERO,interactuar con proteínas diversas y ser sustratos fundamentales de enzimasantioxidantes (véase más adelante). La biosíntesis de glutatión reducido (GSH)se lleva a cabo por dos enzimas: la γ-glutamilcisteína sintetasa (GCS) y la GSHsintetasa. La primera es la enzima limitante en la síntesis y está formada por dossubunidades, una catalítica y una reguladora. Mutaciones homocigotas en el genque codifica para la subunidad catalítica causan muerte del embrión de ratón a13.5 días de gestación (la gestación completa del ratón es de aproximadamente20 días), tiempo en el cual los primordios de todos los órganos ya se han forma-do. Pudiera ser que la Trx sea la responsable de que se alcancen etapas avanzadasdel desarrollo embrionarios en ausencia de GSH.

Existen cinco genes que codifican para las glutatión peroxidasas (GPx) y quizáun sexto aún no bien caracterizado. Los ratones que llevan mutaciones nulas enambos Gpx1, que codifica para la GPx que se expresa en la mayoría de los tipos


celulares, y Gpx2, aparentemente se desarrollan normalmente, son fértiles y sólomuestran anormalidades moderadas durante la vida adulta normal, incluyendosensibilidad incrementada al estrés oxidativo. En cambio, los embriones de rato-nes que tienen mutaciones en Gpx4 mueren a los 7 días de gestación durante laorganogénesis. Estos datos indican que, aunque pudiera haber redundancia entreciertas GPx, algunas poseen funciones muy especializadas que no pueden ser sus-tituidas fácilmente. La GPx4 es una enzima muy peculiar en cuanto que es acti-va como monómero y es la única enzima capaz de reducir los lípidos peroxidadosproducidos en las membranas celulares. Llama la atención que viva menos unembrión que le falta una peroxidasa, que uno que supuestamente no tiene GSH.Una posible explicación a esta discrepancia es que el embrión recibe cierto aportede GSH de la madre, lo que le permite extender la vida mas allá de la organogé-nesis. Este tipo de fenómenos es necesario considerarlos cuando el producto delgen que se ha mutado es un factor difusible.

De manera similar a la sobreproducción de otras enzimas antioxidantes enratones transgénicos, la sobreexpresión de Gpx1 ofrece protección ante isquemiaexperimental al miocardio o al cerebro, al igual que a otros insultos lo que se aso-cia a incrementos en la sobrevivencia celular. Un caso especial, es la sobreexpre-sión de Gpx4 pues en este caso la enzima evita la muerte celular causada porvarios agentes que inducen la producción de estrés oxidativo, pero esta pareceestar asociada a su localización en la mitocondria, pues el efecto protector sereduce si no se localiza en este organelo. En la mitocondria evita el daño a los fos-folípidos mitocondriales como la cardiolipina, una probable causa de la muertecelular.

Tiorredoxina y peroxirredoxinas

Existen dos tipos de Trx en el ratón, la forma citosólica (Trx1) y la forma mito-condrial (Trx2), cada una codificada por un gen específico. Mutaciones nulas enlos genes que codifican para las Trx son letales para el ratón haciendo evidente elpapel fundamental de estas proteínas para el desarrollo de los mamíferos. Lasmutaciones en Trx1 causan la muerte del embrión poco después de la implanta-ción al útero, probablemente asociado a una reducción de la proliferación en lamasa celular interna (tejido que dará lugar al embrión como tal), mientras que lasmutaciones en Trx2 mueren a la mitad de la gestación mostrando abundante muer-te celular y exencefalia. Por otro lado, Trx1, en ratones transgénicos que sobreex-presan su gen, protege a las células de varios insultos que causan estrés oxidativo;por ejemplo, evita la muerte neuronal causada por isquemia o oxitotoxicidad.

La actividad de la Trx es controlada por la tiorreodoxin reductasa (TrxR) conel requerimiento de NADPH. Tres genes que codifican para esta enzima: TrxR1,


para la forma citosólica; TrxR2, para la forma mitocondrial; y TrxR3, para unaforma aparentemente específica del testículo. Mutaciones nulas en TrxR1 y TrxR2son letales observándose en los embriones muerte celular aumentada y afectaciónen la proliferación celular. Los ratones mutantes TrxR1-/- mueren a la mitad delperiodo de gestación donde parecen afectarse todos los tejidos, pero por lomenos, no es esencial para la supervivencia de los cardiomiocitos; en cambio, losratones TrxR2-/- mueren a los 13.5 días de gestación con anormalidades en el híga-do y el corazón, lugares donde hay cantidades abundantes de la enzima.Tanto paralos genes que codifican para las TrxR como los que codifican para las Trx, los ani-males heterócigos para sus correspondientes mutaciones nulas muestran sensibili-dad al estrés oxidativo, sugiriendo su relevancia en el organismo adulto.

Las peroxirredoxinas (Prx) son pequeñas peroxidasas cuyo sustrato principales la Trx. En mamíferos existen por lo menos 6 genes que codifican para Prx, delos cuales por lo menos tres se han mutado a la fecha: Prx1, Prx2 y Prx6. Es inte-resante que ratones Prx1-/- y ratones Prx2-/- muestran un incremento en el dañooxidativo a los componentes de las membranas y la hemoglobina de reticulocitosy eritrocitos, lo que reduce la vida de estos últimos y provoca anemia hemolíticaque finalmente lleva a su muerte prematura. Este resultado es consistente con elhecho de que los reticulocitos y eritrocitos están sujetos a una enorme pro-ducción de ERO debido a la alta concentración de oxígeno y de hierro del grupohemo. Mutaciones en otros sistemas antioxidantes suelen generar un síntomasimilar, pero al parecer las Prx1 y Prx2 están entre las enzimas antioxidantes másimportantes para mantener bajos los niveles de ERO en estas células. Además, losratones Prx1-/- y Prx1+/- desarrollan tumores que se relacionan con cambios en laactividad de algunos protooncogenes, sugieriendo que la Prx1 actúa como unsupresor de tumores. La Prx2 también parece contribuir a incrementar la proli-feración celular, pues en su ausencia la actividad mitogénica de PDGF se incre-menta notoriamente. De manera paradójica, los fibroblastos provenientes tantode ratones Prx1-/- como Prx2-/- senescen prematuramente, lo que es un signo deque los animales mutantes envejecen más rápido.

La Prx6 se expresa en altos niveles en el pulmón. Ratones transgénicos quesobreexpresan al gen Prx6 en este órgano aumentan la resistencia a daño al pul-món por hiperoxia, mientras que en los ratones nulos en Prdx6 hay más daño alpulmón y mortalidad en respuesta a hiperoxia.

❚ CONCLUSIONES Y COMENTARIOS FINALES

El estudio genético de las enzimas involucradas en el metabolismo de las EROrepresenta una oportunidad para determinar su relevancia fisiológica, y definircuál es su papel específico en procesos del desarrollo o de la vida adulta. Además,©

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los estudios genéticos pueden ser fundamentales para determinar la participaciónde las ERO en el desarrollo de enfermedades diversas, e inclusive para identificarla enzima que es más relevante bajo ciertas circunstancias fisiológicas.

Los estudios realizados con los genes que codifican para proteínas antioxidantesya han dado resultados sorprendentes. Como se describió arriba, al ser elimina-das enzimas que se encuentran en muchas de las células del organismo, como lasSOD, la CAT, y la GPx1, se demostró que la carencia de algunas de ellas no esesencial para la vida del ratón en condiciones controladas, ya que muchas tienenfunciones redundantes; situación similar ocurre para otras enzimas antioxidantes.En contraste, llama la atención que una peroxidasa, la GPx4, sea esencial para laviabilidad del embrión. Por otro lado, en forma esperada, los estudios genéticosrefuerzan el papel vital del GSH y la Trx para el embrión y el ratón adulto. Engeneral, es consenso que la ausencia de alguna proteína antioxidante genere sen-sibilidad a distintos insultos que generan estrés oxidativo, si bien, en algunoscasos, se asocia al funcionamiento de un órgano particular, lo que se explica delpatrón de expresión del gen que la codifica. En forma contraria, la sobreexpre-sión de un gen que codifica para una proteína antioxidantes, siempre protege delestrés oxidativo al órgano o tipo celular donde se dirigió la expresión ectópica enel animal transgénico.

Una pérdida o ganancia de función del gen que codifica para una proteínaantioxidante no sólo afecta la actividad de la proteína antioxidante en sí, sinotambién, por supuesto, produce cambios en los niveles de ERO específicas, lascuales finalmente son las molécula activas. Es decir, una pérdida de función delgen que codifica para una proteína antioxidante lleva a una ggaannaanncciiaa ddee ffuunncciióónnrepresentada por la actividad de la ERO específica que no se eliminó. Por el con-trario, la ganancia de función o sobreexpresión del gen que codifica para la pro-teína antioxidante lleva a una ppéérrddiiddaa ddee ffuunncciióónn,, es decir, la desaparición de unaERO específica. Esta situación se ejemplifica muy bien con la sobreexpresión delgen de distintas enzimas antioxidantes que procesan la misma ERO. En este casola función del gen es secundaria a la función de la ERO, ya que independiente-mente de cual haya sido el gen que se sobreexprese, la desaparición de la EROocurrirá de manera similar. De esta forma obtenemos información de la posiblefunción de la ERO, pero no así de la enzima antioxidante, es decir, no nos dicecuándo ésta es relevante en la degradación de la ERO. Por esta razón, no resultasorprendente que la sobreexpresión de distintas enzimas antioxidantes tengan unefecto protector similar.

Un aspecto que es necesario considerar, particularmente cuando se sobreex-presa un gen, es si todos los componentes que le dan actividad a la proteína sonsuficientes para generar al complejo molecular activo. Casi todas las enzimasantioxidantes son homocomplejos, por tanto, aparentemente no habría una subu-nidad proteínica que pudiera limitar su actividad. Sin embargo, algunas proteínas


antioxidantes, como las GPx y la TrxR, son selenoproteína a las cuales se les tieneque incorporar la selenocisteína a través de un tRNA específico durante la tra-ducción del RNA mensajero. El tRNA para la selenocisteína puede ser limitante,por tanto, la sobreexpresión del gen de alguna seleno-proteína podría limitarse porla cantidad de ese RNA.

Como se mencionó al principio, las ERO no deben considerarse actualmentecomo simples agentes que dañan componentes celulares, sino también comoagentes que pueden actuar como señalizadores intracelulares, necesarios para queocurran normalmente ciertos procesos celulares. En este sentido, los sistemasantioxidantes son reguladores de estas cascadas de señalización. Por ejemplo, laTrx interacciona con Ref1, lo cual es esencial para la regulación redox de la acti-vidad transcripcional del complejo AP1; Ref1/Trx tiene un efecto similar sobreNFκB. En otro caso, la Prx2 interacciona con el receptor a PDGF y de esta formaregula el incremento en peróxido, proveniente de la actividad de la NADPH oxi-dasa, que son necesarios para producir sus efectos mitogénicos. Los estudiosgenéticos pueden permitir evidenciar estas interacciones in vivo mediante elestudio de combinación de mutantes en los genes que codifican para las proteí-nas en cuestión (la interacción no necesariamente tiene que ser física). Por ejem-plo, es de esperarse que mutaciones que mantienen activo al receptor a PDGF(algunas con propiedades oncogénicas) pudieran atenuarse si se sobreexpresa en el mismo ratón la Prx2. De manera similar, la sobreactivación de AP1 (común enalgunos tipos de cáncer) pudiera ser atenuada en la ausencia de Trx.

Dados los abundantes antecedentes que indican que el daño oxidativo es unfactor relevante en el envejecimiento y la longevidad, se ha esperado que anima-les con mutaciones nulas en el gen de alguna enzima antioxidante envejezcanprematuramente, y animales que sobreexpresan ese gen envejezcan más lenta-mente y sean más longevos. Sin embargo, pocos estudios genéticos a la fecha hancontribuido claramente a esta hipótesis, especialmente debido a efectos en pro-cesos colaterales al envejecimiento que causan la muerte prematura del ratón, oporque el gen de la enzima no se sobreexpresa ubicuamente o en el comparti-miento celular adecuado, por lo que los incrementos en la longevidad son sólomoderados. Esta área requiere estudiarse de manera más sistemática para obte-ner conclusiones definitivas en relación a cada uno de los genes que contribuyena mantener el estado redox.

Multitud de estrategias existen actualmente para modificar la expresión géni-ca en forma controlada en el ratón. No obstante, la función de los genes que par-ticipan en el control del estado redox sólo se ha iniciado con las estrategiasbásicas de transgénesis y mutagénesis dirigida. Por ejemplo, la expresión induci-ble y la mutación condicional de genes no se han aprovechado ampliamente paraestudiar la función de proteínas antioxidantes, lo que contribuiría a elucidar lafunción de genes como GPx4, Trx, y TrxR, y determinar los tejidos u órganos©

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donde actúan preferencialmente ciertas ERO o enzimas antioxidantes. Por otrolado, mutaciones en enzimas antioxidantes que aparentemente no genera ningúnfenotipo anormal, pudieran producir trastornos importantes cuando se combinancon mutaciones en otros genes. Por ejemplo, la tumorigénesis inducida por expre-sión de oncogenes o mutaciones nulas en genes de supresores tumorales pudieraverse modificada por cambios en la actividad de enzimas antioxidantes.

Como se mencionó al principio, sin lugar a dudas, el ratón es el organismomodelo que más semejanzas tiene con el humano. Sin embargo, hay otros orga-nismos modelo que por sus posibilidades experimentales, muchas de ellas asocia-das a estudios genéticos, suelen ser convenientes para responder algunaspreguntas que en el ratón pudiera ser más difícil o se llevaría más tiempo lograrla respuesta. Entre los vertebrados, se encuentran el Xenopus (un anfibio), elpollo, y el pez cebra. Este último es particularmente interesante para hacer estu-dios globales de los componentes genéticos que controlan el estado redox en ver-tebrados, pues los muestreos de mutaciones al azar que afectan el estado redoxson mucho más fácil de realizar en este organismo en comparación con el ratón.Aspectos básicos del impacto biológico en animales causado por alteraciones enel estado redox, se pueden realizar en organismo modelo aún más sencillos comoDrosophila melanogaster (la mosca de la fruta) o el nematodo Caenorhyabditiselegans. En estos organismos, dado su corto ciclo de vida y la variedad de estra-tegias genéticas disponibles, ha sido posible estudiar las consecuencias de alterarel estado redox en el envejecimiento y la longevidad. En la presente era posge-nómica, cuando se dispone de la secuencia completa de los genomas de todos losorganismos modelos mencionados, y cada vez es más evidente que las cascadasde señalización se han conservado de manera sorprendente a lo largo de la evo-lución, la integración de la información proveniente de todos los organismosmodelos es fundamental para que en un menor plazo comprendamos el papelfisiológico de las ERO, y como alteraciones en su metabolismo pueden contribuiral desarrollo de padecimientos que afectan al humano.

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SSEECCCCIIÓÓNN IIXX..NNUUTTRRIICCIIÓÓNN

37. Aspectos nutriológicos de los carotenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561

38. Aspectos nutriológicos de la vitamina C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 579

39. Aspectos nutriológicos de la vitamina E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595

40. Actividad física y estrés oxidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613

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AASSPPEECCTTOOSS NNUUTTRRIIOOLLÓÓGGIICCOOSSDDEE LLOOSS CCAARROOTTEENNOOSS

Héctor Bourges Rodríguez

❚ INTRODUCCIÓN

Se conoce como ccaarrootteennooss a una familia muy amplia de pigmentos de naturalezalipídica, de color rojo, naranja o amarillo, que están presentes en innumerablesespecies, desde arqueobacterias hasta algas, hongos, animales y plantas. Su conser-vación en la evolución sugiere que realizan funciones metabólicas importantes.

El nombre carotenos viene del inglés carrot, zanahoria, ya que de este alimen-to se aisló en 1911 el primero de ellos, el hoy llamado ccaarrootteennoo ββ. En ese enton-ces no se le atribuyó ningún papel metabólico, pero en 1930 se descubrió que enel enterocito el caroteno β se convierte en vitamina A (que McCollum y Davishabían descubierto en 1913) por lo que desde esa época se ha considerado a loscarotenos como pprroovviittaammiinnaass AA.

El término ccaarrootteennooiiddeess se emplea para referirse al conjunto de los carotenosy de algunos de sus derivados cercanos con los que comparten muchas caracte-rísticas.

Sus funciones en distintos organismos son diversas:

a) Se cuentan entre las primeras sustancias en la evolución capaces de captarla luz del sol como fuente de energía y se han conservado, de manera que

37

en las plantas superiores siguen compartiendo este papel con la clorofilacomo pigmentos accesorios en la fotosíntesis capaces de captar una gamaamplia de longitudes de onda. En algunas plantas, las epoxixantofilas redu-cen el riesgo de daño por luz.

b) Dan colorido a las plantas y los animales (de manera notable a flamingos ycrustáceos). Además de transmitir belleza al ojo humano, que no es pocacosa, juegan un papel crucial en la reproducción de plantas y animales puesel color de las flores atrae insectos que esparcen el polen y el color de lasplumas de las aves marca los ciclos de apareamiento.

c) En las halobacterias y los animales, algunos carotenos (alrededor de 50) pue-den convertirse en la vitamina A, que a su vez tiene numerosas funcionesmetabólicas. Aunque casi 50 carotenoides pueden convertirse en vitaminaA, sólo el caroteno β, el caroteno α y la criptoxantina tienen importanciapráctica en este sentido.

d) Aunque pueden también actuar como oxidantes, en los sistemas biológicospredomina su efecto antioxidante y por ello se les considera parte del siste-ma de protección del organismo contra radicales libres y otros oxidantes(capítulo 17).

A la fecha se han identificado entre 600 y 800 carotenoides, aún sin tomar encuenta los isómeros, hecho que hace difícil revisarlos en forma particular.

❚ ESTRUTURA QUÍMICA

Los carotenos son hidrocarburos formados por cadenas poliisoprenoides, casisiempre de 40 carbonos, con un complejo sistema de dobles ligaduras conjugadas.La mayoría muestran simetría interna y a menudo tienen una o dos estructurascíclicas en los extremos de la cadena. Por ser lipofílicos tienden a incorporarse enlas membranas celulares y los liposomas e interactuar con ellos.

Los isómeros ttrraannss predominan sobre los cciiss, que son menos estables. Los caro-tenos que consisten sólo de una cadena de hidrocarburo simple, como son porejemplo el caroteno α y el caroteno β, pueden tener cada uno cientos de isóme-ros cciiss posibles.

De los carotenos simples se producen numerosos derivados entre los que cabedestacar:

a) Los ooxxooccaarrootteennooiiddeess o xxaannttooffiillaass, como las criptoxantinas β y α, la luteínay la zeaxantina. Las xantofilas pueden esterificarse con ácidos grasos yhacerse más hidrofóbicos o combinarse con glúcidos y volverse más polares.


La luteína y la zeaxantina no se separan claramente en cromatografía por loque suelen informarse juntas en la mayoría de los estudios.

b) Los cceettooccaarrootteennooiiddeess como la cantaxantina y la astaxantina Estos carotenoi-des pueden formar complejos con proteínas.

En la figura 17-2 del capítulo: Potencial antioxidante de los carotenoides, sepresenta la estructura de algunos de ellos.

❚ BIOSÍNTESIS DE CAROTENOS EN LAS PLANTASY LOS MICROORGANISMOS

La biosíntesis de los carotenos se inicia con el ácido mevalónico que se producea partir de la β-hidroxi-β-metil-glutaril-coenzima A. Los fragmentos de 5 carbo-nos se condensan sucesivamente a compuestos de 10, 15 y 20 carbonos, y dos deéstos se unen para formar el cis,15,15´fitoeno que se deshidrogena para llegar aneurosporeno. Este intermediario puede deshidrogenarse para formar el lliiccooppee--nnoo del cual, por formación de anillos en los extremos de la cadena, se derivan losccaarrootteennooss β y α. Estos dos carotenos se combinan con el oxígeno molecular paraformar mono y di hidro carotenoides o xxaannttooffiillaass, que a su vez pueden dar deri-vados eeppooxxii. El caroteno α se oxigena y produce cetocarotenoides como la can-taxantina. En bacterias, el neurosporeno se metoxila y oxida a cetocarotenoscomo la eessffeerrooiiddeennoonnaa que interviene en la fotosíntesis.

❚ FUENTES EN LA DIETA

Las fuentes de carotenoides más importantes en la dieta humana son la mayoríade los tejidos vegetales de color rojo, naranja, amarillo o verde (puesto que dondehay clorofila hay carotenos), es decir, las verduras, las frutas y algunas semillas. Enlos alimentos se les encuentra en dos formas principales, como solución oleosa (p. ej., en la palma roja) o como parte de matrices complejas con fibras alimen-tarias, polisacáridos digeribles y proteínas (en verduras y frutas).

Por tratarse de numerosas sustancias diferentes es complicado describir susfuentes en forma general. En las cuadros 37-1 y 37-2 se presenta respectivamen-te el contenido de caroteno β y de luteina y zeaxantina en algunos alimentos. Entérminos generales, las mayores concentraciones se encuentran en:

a) CCaarrootteennoo β.. En los chiles secos, el chabacano seco, la zanahoria cocida, eltejocote, la malva, el quelite cenizo, la col china, la calabaza amarilla, la espi-naca cocida y el camote, entre otros.©

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Aspectos nutriológicos de los carotenos • 563

b) CCaarrootteennoo α.. En la zanahoria cocida , el maíz amarillo, la calabaza y en me-nor grado el melón y la naranja.

c) LLiiccooppeennoo.. En muchos frutos rojos, en especial el jitomate cocido, la sandía,la guayaba y, en menor cantidad, el jitomate crudo, el chabacano seco y latoronja rosada.

d) LLuutteeiinnaa yy zzeeaaxxaannttiinnaa. En la col china, la espinaca cocida, las hojas de beta-bel, el brécol y la lechuga. Aunque no aparecen en el cuadro, también sonbuenas fuentes el pimiento rojo y la calabaza.

e) CCrriippttooxxaannttiinnaa.. En la papaya, la naranja, el durazno y el mango.

La cocción suele elevar la digestibilidad y en algunos casos, la molienda de los ali-mentos contribuye a liberar los carotenoides de las matrices en que se encuentran.

❚ DIGESTIÓN Y BIODISPONIBILIDAD

Las proteasas intestinales liberan a los carotenos de su unión con las estructurascelulares de los alimentos. Los carotenos, en especial el caroteno β y el licopeno,se solubilizan junto con otros lípidos de la dieta en las micelas formadas con lassales biliares. Por su parte, los esteres de xantofilas deben ser hidrolizados parapoderse absorber.

Las matrices en las que se encuentran los carotenoides en las verduras y frutasno se rompen del todo durante la preparación culinaria ni durante la digestión,lo que hace que la biodisponibilidad sea muy variable; mientras que la de los


CCuuaaddrroo 3377--11.. CCoonntteenniiddoo ddee ccaarrootteennoo ββ eenn aallgguunnooss aalliimmeennttooss((mmgg//110000 gg ddee ppoorrcciióónn ccoommeessttiibbllee))

Chile (seco)1 10.00 a 60.00 Lengua de vaca 4.00 Hojas betabel 2.60Chabacano (seco) 17.60 Xocoyol 4.00 Mamey 1.50Zanahoria cocida 9.80 Acelga 300 a 400 Brécol crudo 1.30Tejocote 6.40 Nabo 3.00 Mango 1.30Malva 6.00 Romeritos 3.00 Lechuga 1.20Quelite cenizo 6.00 Verdolaga 3.00 Jitomate 0.9Col china 5.40 Camote 3.00 (jugo enlatado)Calabaza amarilla 5.00 Melón 3.00 Jitomate crudo 0.50Espinaca cruda 4.10 Papaya 0.10Cilantro 4.00 Maíz amarillo 0.05Perejil 4.00 Naranja 0.04

1 Mulato, pasilla, morita, ancho, guajillo.

carotenos en la zanahoria cruda es sólo 10%, en las disoluciones oleosas llegahasta 50%.

Las fibras alimentarias, en especial las pectinas, así como la escasez de lípidosen la dieta, la deficiencia de sales biliares, la aclorhidria y otras causas de malaabsorción, reducen la biodisponibilidad de los carotenos.

Absorción

No se conoce aún ningún sistema de transporte de carotenos al través de la mem-brana del enterocito, por lo que se acepta que se absorben por difusión pasivajunto con los monoacil gliceroles y que lo hacen con una eficiencia entre 10 y50%.

La fracción de los carotenos que se absorbe es inversamente proporcional a suaporte dietario. Los más polares se absorben mejor y la luteína se absorbe dosveces más rápido que el caroteno β. El isómero 9 cis del caroteno β se absorbebien, pero no se transporta, por lo que se supone que se convierte en 9 trans. Enel caso del licopeno, algunos isómeros cis (que se pueden producir durante elcocimiento) se absorben mejor que el trans. Los apocarotenales y apocarotenoles βse absorben bien.

Los diversos carotenos interfieren entre si, en forma no competitiva, durantela absorción. Así, el caroteno β reduce la absorción de cantaxantina y luteína; porotra parte, la vitamina E reduce la concentración plasmática de los carotenos, por loque se supone que interfiere con su absorción En este paso, una parte de los ca-rotenos ingeridos se convierte en vitamina A y los que quedan se absorben in-tactos, pasan a la circulación por vía linfática y se almacenan en el tejido adiposo.

Conversión en vitamina A

En este terreno existen aún muchas incógnitas. Desde 1930 se sabe que el caro-teno β se transforma en retinal en el enterocito, pero puede hacerlo también en©

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CCuuaaddrroo 3377--22.. CCoonntteenniiddoo ddee lluutteeíínnaa--zzeeaaxxaannttiinnaa eenn aallgguunnooss aalliimmeennttooss((mmgg//110000gg ddee ppoorrcciióónn ccoommeessttiibbllee))

Col china 16.30 Maíz amarillo 0.80Espinaca cocida 10.20 Zanahoria cocida 0.30Hojas betabel 7.70 Jugo de jitomate enlatado 0.33Brécol crudo 1.80 Jitomate crudo 0.1Lechuga 1.80 Naranja 0.01

el hígado y otros tejidos. Si se observa la estructura química del caroteno β, senota que corresponde con la de dos moléculas de retinol unidas por sus carbonosterminales (carbonos 15 y 15’) por lo que teóricamente se podría convertir enuna cantidad igual de retinol. En la estructura de los demás carotenos converti-bles en vitamina A, sólo una de las dos mitades corresponde con el retinol, por loque su conversión es 50% menos eficiente.

La enzima 15,15’ ccaarrootteennoo ddiiooxxiiggeennaassaa (también presente en el hígado),hidro-liza los carotenos en el citosol del enterocito y los convierte en rreettiinnaall; es todavíaincierto si la ruptura ocurre en el centro de la estructura del caroteno o si la rup-tura es asimétrica, pero se cree que ésta última es poco probable. A su vez, el reti-nal se convierte en rreettiinnooll mediante una aallddeehhííddoo rreedduuccttaassaa y en áácciiddoo rreettiinnóóiiccooque se oxida y se excreta. Algunas xantofilas también pueden ser transformadasen retinol, de manera particular las criptoxantinas.

La eficiencia de la conversión de carotenos en retinal es, en la práctica, muchomenor que la que se esperaría de acuerdo con su estructura química. El carote-no β en solución oleosa rinde 50% de retinal, pero el que está en verduras fritasrinde sólo 5%. La eficiencia de conversión aumenta si hay deficiencia de vita-mina A.

Puesto que la eficiencia de conversión es tan variable, y tan difícil de predecir,continúa en uso la regla práctica establecida por la Organización Mundial de laSalud en 1967 de considerar que el holotrans caroteno β rinde 1/6 de retinal ylos demás 1/12; en otras palabras, para obtener 1 µg de retinol se requieren enpromedio 6 µg de holotrans caroteno β o 12 µg de otros carotenos convertibles.

Unidad de actividad de vitamina A

Dado que en la dieta concurren el retinol y los carotenos, con base en la regla dela OMS se ha creado una unidad de actividad de vitamina A llamada microgra-mo equivalente de retinol (µg Eq o µg ER) con la que se miden los aportes de ladieta y los requerimientos de la vitamina A. Así, un µg ER representa:

1. 1 µg de holo trans retinol o bien.2. 6 µg de holo trans caroteno β o.3. 12 µg de otros holotrans carotenos.4. 3.3 unidades internacionales de vitamina A.5. Si se desconoce de que carotenos se trata, se considera una eficiencia pro-

medio de biotransformación de 1/8. Hay autores que proponen que en vezde 1/8 se utilice 1/21 como factor suponiendo que para obtener 1 µg ER senecesita hasta 21 µg de carotenoides.


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Las combinaciones posibles son por supuesto muy numerosas. Como ejemplosdel cálculo, supóngase:

a) Que la dieta de un individuo A contiene 300 µg de retinol y 4 200 µg de caro-teno β. En este caso, a la cantidad de retinol (300 µg) se le suma 1/6 de la can-tidad de caroteno β (4 200 µg /6= 700 µg), es decir 300+700=1 300 µg ER.

b) Que la dieta de un individuo B contiene 360 µg de retinol y 6 400 µg decarotenos sin especificar. En este caso a la cantidad de retinol (360 µg) se lesuma 1/8 de la cantidad de carotenos (6 400/8 = 800), es decir 360 + 800= 1160 µg ER.

Transporte y distribución

Los carotenos y sobre todo las xantinas luteína y zeaxantina se incorporan, juntocon los ésteres de retinil, en los quilomicrones y permanecen en los rreemmaanneenntteessddee qquuiilloommiiccrroonneess que llegan al hígado. No hace mucho se identificó en el hígadouna proteína fijadora de caroteno, pero aún no se conoce su importancia. Loscarotenos pprriimmaarriiooss salen del hígado a la sangre en las lipoproteínas de baja den-sidad y de muy baja densidad, en tanto que las xantofilas se transportan en las debaja y las de alta densidad en cantidades similares.

11.. CCoonncceennttrraacciióónn eenn eell ppllaassmmaa. Durante el ayuno se encuentran en el plasmaunos 30 carotenoides diferentes cuyo patrón depende de la dieta previa, así comodel intercambio bidireccional entre el plasma y los tejidos, y de su catabolismo.Sin embargo, 60 a 70% del total de carotenos circulantes está representado porla luteína, el licopeno, la zeaxantina, la criptoxantina β, el caroteno β y el carote-no α. El patrón plasmático de carotenos es muy personal, pero muy estable ycambia poco en periodos tan prolongados como un mes.

En el cuadro 37-3 se muestra la concentración de varios carotenos en el suerode una muestra de adultos norteamericanos estudiados como parte de la encues-ta NHANES III. Es interesante que la concentración de licopeno fue mayor enhombres que en mujeres y lo contrario ocurrió con los carotenos α y β.. El taba-quismo reduce hasta 30% la concentración de carotenoides excepto, por razonesdesconocidas, la del licopeno.

Mediante estudios de carga se ha observado que la curva de concentración de ca-roteno β en la sangre tiene dos picos, el primero a las 6 h y otro mayor a las 24 h.

La vida media difiere dependiendo del carotenoide en cuestión y de la canti-dad ingerida. La del licopeno es de 9 a 16 días, la del caroteno β de 10 a 12 días,la del caroteno α de 8 a 17 días, le de luteina/zeaxantina de 12 a 19 días y la decripoxantina β de 11 a 16 días.


22.. CCoonncceennttrraacciióónn ttiissuullaarr. 90% de la poza corporal total de carotenoides seencuentra en los tejidos y sólo 10% en el plasma. La distribución en los tejidos es muy heterogénea; la mayor parte se deposita en el tejido adiposo (65.4%) y, en menor grado, en el hígado (12%), la piel (7.3%) y el músculo (3%). Sinembargo, por cuanto a la concentración que se alcanza por gramo de tejido, des-tacan las glándulas suprarrenales, el testículo, el páncreas y el cuerpo úteo.

Los carotenoides se oxidan a derivados con un número menor de carbonos comoel ácido abscísico, la bixina, los apocarotenales β y la crocetina. La luteína se convier-te en zeaxantina y el licopeno y la cantaxantina prácticamente no se metabolizan.

❚ PAPEL METABÓLICO

Funciones y efectos de los carotenos

Su única función es la de convertirse en vitamina A, pero tienen varios efectos,ya que debido a su estructura química, son capaces de extinguir oxígeno singu-lete y de combinarse con los radicales peroxilo e hidroxilo lo que resulta en laformación de radicales débiles o de no radicales. Por ello se les considera, juntocon la vitamina E, la vitamina C, el glutatión, los flavonoides y el selenio, entrelos antioxidantes de origen alimentario. No obstante que no hay duda de que loscarotenos son antioxidantes, algunos de sus efectos pudieran no tener relacióncon dicho papel sino, por ejemplo, con su interacción con las membranas celula-res a las cuales podrían modular; se podría entonces llamarles moduladores die-téticos más que antioxidantes.

La astaxantina, la cantaxantina, la luteina y en menor grado el caroteno β, esti-mulan y modulan la respuesta inmune in vivo e in vitro, pero las respuestas sonmuy variables por lo que su significado práctico no es claro. Mientras que loscarotenos epoxi estimulan la diferenciación celular.

En cultivo de tejidos, los carotenos aumentan la comunicación entre las célu-las. Dado que lo hacen tanto el caroteno β como la cantaxantina (que no formaretinal), este efecto no se relaciona con la formación de vitamina A.


CCuuaaddrroo 3377--33.. CCoonncceennttrraacciioonneess ddee vvaarriiooss ccaarrootteennooiiddeess eenn eell ppllaassmmaa ddee aadduullttooss nnoorrtteeaammeerriiccaannooss ((μμ mmoollaass//LL))

Licopeno Varones 0.47 Mujeres 0.41Luteína/zeaxantina Varones 0.35 Mujeres 0.13Criptoxantina β Varones 0.13 Mujeres 0.35Caroteno β Varones 0.22 Mujeres 0.28Caroteno α Varones 0.065 Mujeres 0.08

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Asimismo, es posible que modulen algunos aspectos de la reproducción. No sesabe si lo hacen de manera directa o por medio de su conversión en vitamina A,que es claramente indispensable en la reproducción.

Funciones de la vitamina A

Puesto que parte de los carotenos se convierten en vitamina A conviene revisarbrevemente las funciones de dicha vitamina. Aunque no están del todo clarasdesde el punto de vista metabólico, se sabe que interviene en el crecimiento y enla diferenciación celular (como ácido retinoico) y en la reproducción, el mante-nimiento de los epitelios, la visión nocturna (como retinal) y la expresión génica.

En la visión nocturna, la transmisión de estímulos luminosos ocurre mediantevarios pasos que incluyen la transformación de retinal en 11-cis retinal, y su aso-ciación con la opsina, lo cual mantiene abiertos los canales de sodio de los basto-nes externos. Los cambios del potencial de membrana se transmiten mediantesinapsis hasta el cerebro, donde se integran los impulsos nerviosos.

La participación del ácido retinoico en la expresión génica ocurre mediante suunión con el receptor nuclear específico 8RAR9 que regula la iniciación de latrascripción en la región promotora de un gen conocido como RAREs. Por mediode este proceso, el ácido retinoico es indispensable para el crecimiento y la dife-renciación celular.

La vitamina A interviene en muchos otros procesos fisiológicos, incluyendo laespermatogénesis, el desarrollo fetal, la respuesta inmunológica, el gusto, la audi-ción, el apetito y el crecimiento de linfocitos. La vitamina A parece compartir conlas hormonas tiroideas un efecto modulador sobre la actividad de la hormona decrecimiento. A su vez, esta hormona estimula la captación de retinol por los teji-dos en crecimiento.

La suplementación con vitamina A en poblaciones deficientes, mejora el cre-cimiento, pero también disminuye la morbilidad y mortalidad por enfermedadesinfecciosas, lo cual hace difícil distinguir si la mejoría se debe directamente a lavitamina o a la disminución de las infecciones. En niños, la deficiencia de la vita-mina eleva la susceptibilidad a infecciones y el riesgo de muerte, particularmen-te por sarampión y diarrea.

❚ ASOCIACIONES EPIDEMIOLÓGICAS

La cantidad de carotenos ingerida tiene asociaciones epidemiológicas muy inte-resantes. Conforme la ingestión de carotenos es mayor, disminuye la incidenciade varias neoplasias (pulmón, cabeza y cuello, esófago, colorrectal, mama, cérvix,


piel y próstata). El licopeno, que inhibe la proliferación de células tumorales invitro y el crecimiento de tumores en ratones y que además es un buen extingui-dor de radicales libres, parece tener particular efecto en el caso del cáncer depróstata.

También se ha observado que se disminuye el riesgo de las enfermedades coro-narias, posiblemente porque los carotenos reducen la oxidación de lipoproteínasde baja densidad que son aterogénicas.

Su ingestión aminora las manifestaciones de la porfiria eritropoyética, así comoel riesgo de cataratas y de la degeneración macular senil. En la mácula, la luteínay la zeaxantina se encuentran en concentraciones elevadas que indican la existen-cia de un proceso de depósito específico de estas xantofilas de las que se sabe queprotegen de la luz azul. Se ha visto que quienes se encuentran en el quintil másalto de ingestión de carotenoides tienen 43% menos riesgo de degeneraciónmacular que los que se encuentran en el quintil más bajo; la asociación es másalta con el consumo de espinaca y col china que son ricos en xantofilas. Sinembargo no se observa asociación con la concentración de xantofilas en el suero

Existen informes del efecto de la suplementación con carotenoides sobre lasmanifestaciones de la infección por VIH. Como antecedentes cabe mencionarque:

1) En animales y seres humanos el caroteno β y la cantaxantina (que no se con-vierte en vitamina A) estimulan la respuesta inmune; 2) En pacientes con VIH elcaroteno β en cantidades elevadas eleva la relación CD4/CD8 y mejora la respues-ta a vacunas; 3) Los pacientes infectados con VIH tienen 50%. menos caroteno βen el suero y la suplementación con carotenos alivia las manifestaciones. En unterreno más firme, se ha informado que la halocintiaxantina, que es un epoxica-rotenoide, inhibe en forma bastante especifica la DNA polimerasa dependientede RNA del virus y tiene por lo tanto un posible efecto sobre la reproducción delvirus. Por supuesto, este hallazgo merece confirmación y mayor estudio.

En relación con los cánceres y otros padecimientos señalados arriba, cabenotar, sin embargo, que los estudios de suplementación con grandes cantidades(20 a 50 mg) de caroteno β no muestran reducción de su incidencia; en el cán-cer de pulmón puede incluso elevar la incidencia o gravedad dado que en grancantidad y en un ambiente rico en oxígeno tiene efecto pro oxidante. Las razo-nes de que haya asociación estadística pero no haya efecto de la suplementacióncon caroteno β pueden ser que:

1. La asociación primaria real sea con la cantidad ingerida de las verduras y fru-tas cuyo color se debe a carotenos.

2. El caroteno β no sea activo o a que sólo lo sea en fases tempranas de lasenfermedades.


3. La suplementación inhiba la absorción de otros carotenos que si tenganefecto.

4. La ingestión del caroteno β sea un marcador inespecífico de mejor salud.

❚ CAROTENOS Y NUTRICIÓN

En nutriología se define nnuuttrriimmeennttoo como toda sustancia que proviene de la dietay cumple una o más funciones en el metabolismo normal. A los nutrimentos seles clasifica en iinnddiissppeennssaabblleess eenn llaa ddiieettaa si el organismo no es capaz de sinteti-zarlos y entonces la dieta es su única fuente y en ddiissppeennssaabblleess eenn llaa ddiieettaa si tienecapacidad de sintetizarlos y no es absolutamente obligatorio ingerirlos.

Los carotenoides provienen de la dieta y tienen funciones metabólicas demanera que cumplen las dos características que definen a un nutrimento y pue-den considerarse como tales para el ser humano. Puesto que el ser humano nopuede sintetizar ninguno de los carotenoides, en una primera aproximación se les puede considerar nutrimentos iinnddiissppeennssaabblleess eenn llaa ddiieettaa.

Sin embargo, la situación no es tan clara como pudiera parecer porque la únicafunción metabólica de los carotenoides plenamente aceptada hasta ahora es laconversión de algunos de ellos en vitamina A, situación que obliga a tres consi-deraciones:

a) Sólo serían nutrimentos los casi cincuenta carotenoides que se convierten envitamina A y no el resto que son la mayoría.

b) La conversión en vitamina A es más eficiente en el caso del caroteno beta,pero también ocurre a partir de otros carotenoides de manera que para estafunción se pueden sustituir unos con otros. Por consiguiente, no es posibleespecificar como nutrimento una sola sustancia sino que, a manera de vitá-meros, lo sería todo el grupo de carotenoides convertibles. Esto mismo ocurreen el caso de muchas vitaminas como la vitamina E que está constituida por8 vitámeros, la B6 por 3 vitámeros y la A por 3 vitámeros, por citar ejemplos.

c) En la dieta actual del ser humano existe vitamina A preformada en cantida-des variables la cual puede sustituir parcial o totalmente a los carotenoidesy en este último caso, por lo menos en lo que respecta a esta función, loscarotenoides podrían ser sustituidos. Se diría entonces que son nutrimentosdispensables en la dieta. Empero, este no sería el caso si la dieta no contu-viera vitamina A preformada o si se comprobaran otras funciones de loscarotenoides que no se relacionen con la vitamina A.

Con respecto a la ausencia de vitamina A preformada en la dieta cabe seña-lar que:©

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a) Por razones de acceso limitado a los alimentos de origen animal, la mayoríade los seres humanos no ingieren la vitamina o la ingieren en pequeñas can-tidades y en cambio ingieren una cantidad importante de carotenoides, demanera que dependen de ellos y en este caso frecuente se les puede consi-derar nutrimentos indispensables en la dieta.

b) Se piensa que es muy probable que, como miembro del orden de los prima-tes, la alimentación natural del ser humano es herbifrugívora obligatoria yque éste es el régimen que sus antepasados han seguido durante millones deaños. Si se acepta lo anterior, seguramente durante la mayor parte de su his-toria la especie humana ingería gran cantidad de carotenos y muy poco onada de retinol. En este caso, cabe suponer que lo que se descubrió comovitamina A no es sino uno de los derivados metabólicos de algunos carote-noides los cuales tienen las funciones que se asignan a la vitamina A y talvez alguna otra.

Con respecto a que los carotenoides tengan otras funciones, es de suponerseque la de antioxidantes es una de las más factibles. Sin embargo, muy probable-mente se trate de una función fisicoquímica más que metabólica y no exclusivade los carotenoides ya que el sistema antioxidante del organismo tiene numero-sos componentes tanto de origen dietético como no dietético.

Ante tantas condicionantes, tal vez lo más apropiado sería considerar a loscarotenos como nutrimentos indispensables ccoonnddiicciioonnaaddooss.

❚ REQUERIMIENTOS Y RECOMENDACIONES

Cabe recordar que las rreeccoommeennddaacciioonneess que sirven como valores de referenciapara propósitos de evaluación y planificación, se establecen con base en la infor-mación que se tiene sobre los requerimientos medidos en algunos individuos. Losrequerimientos de carotenos no se conocen y su estudio es muy difícil porque susfunciones no están bien establecidas con excepción de su conversión en vitami-na A, de manera que a lo más se les puede relacionar con los requerimientos yrecomendaciones de dicha vitamina.

En cuanto a los requerimientos de la vitamina A, si bien se han estudiado, noson del todo claros debido a que la existencia de reservas hepáticas complica lainterpretación de los resultados. Se calcula que las personas sanas utilizan 6.7 μgde retinol/kg de peso corporal/día (465 μg/día para una persona de 74 kg). Paraestablecer las recomendaciones de vitamina A hay que tomar en cuenta la bio-disponibilidad, las reservas hepáticas y la variabilidad interindividual del requeri-miento. Se considera que una reserva hepática de retinol de 20 μg/g de tejidohepático, permite mantener la concentración adecuada en el suero (30 μg/dL) y


cubrir las necesidades tisulares. A pesar de estas bases, las recomendacionesactuales son sólo tentativas y constituyen una “ingestión diaria sugerida” (IDS).Las IDS Mexicanas 2004 de vitamina. A se presentan en el cuadro 37-4.

❚ DEFICIENCIA

Aunque seguramente se afectan sus funciones, la deficiencia de carotenos no seha descrito como tal por la dificultad para separar sus funciones de las de la vita-mina A y otros antioxidantes. Por supuesto, si la deficiencia de carotenos se acom-paña de insuficiente ingestión de vitamina A se observará el cuadro de deficienciade esta última.

Con respecto a la deficiencia de la vitamina A, los signos y síntomas principa-les son la anorexia, la detención del crecimiento, la gerosis, las geroftalmia, lasmanchas de Bitot, la ceguera nocturna y el aumento en la frecuencia y gravedadde las infecciones.

La anorexia se atribuye a disgeusia por degeneración de las papilas de la len-gua. La detención en el crecimiento en los niños afecta tanto al peso como a lalongitud. Se conoce como ggeerroossiiss a la queratinización de la piel y mucosas queadquieren la apariencia de estar secas o viejas. La ggeerrooffttaallmmiiaa es la gerosis de laconjuntiva y la cornea; si es grave puede llegar a querotomalacia (reblandeci-miento) con perforación y pérdida de la vista ante agresiones que normalmenteserían poco graves.

La geroftalmia comienza por desorganización del epitelio columnar, queratini-zación de la superficie y disminución en la secreción de mucina. Cuando la defi-©

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CCuuaaddrroo 3377--44.. IInnggeessttiióónn ddiiaarriiaa ssuuggeerriiddaa ddee vviittaammiinnaa AA ((MMééxxiiccoo 22000044)) ((µµgg EERR//ddííaa))

Niños de 1 a 3 años 300 µg ER/díaNiños de 4 a 8 años 400 µg ER/díaNiños de 8 a 13 años

Hombres 580 µg ER/díaMujeres 590 µg ER/día

Púberes de 14 a 18Hombres 730 µg ER/díaMujeres 570 µg ER/día

Adultos de 19 a 70 añosHombres 730 µg ER/díaMujeres 570 µg ER/día

Embarazadas 640 µg ER/díaLactantes 1 100 µg ER/día

ciencia progresa, aparecen despulimiento conjuntival y corneal y numerososdefectos puntiformes que le dan apariencia de cáscara de naranja. Estas lesionesconfluyen hasta formar ulceraciones reversibles. Si la lesión es profunda, la repa-ración después del tratamiento deja una cicatriz blanquecina en la cornea (leu-coma). La queratomalacia es la lesión ocular más grave ya que se puedeacompañar de pérdida total de la visión.

Las manchas de Bitot no siempre se presentan; son lesiones con aparienciaespumosa que aparecen en la conjuntiva sobre la esclerótica. La ceguera noctur-na es la incapacidad de ver en condiciones de iluminación pobre y obedece aldéficit de resíntesis de rodopsina.

De no corregirse, la deficiencia de vitamina A puede causar la muerte que esmás temprana si hay infecciones, lo que sugiere alguna función de la vitamina enel sistema de defensa secundario (más allá de la integridad tegumentaria que,obviamente, está afectada).

La deficiencia de vitamina A es la deficiencia vitamínica más frecuente en laactualidad y constituye un problema de salud pública en por lo menos 73 paísesy afecta a alrededor de cinco millones de niños, sobretodo en Asia y África Es lacausa principal de ceguera infantil en el mundo. Cerca de 500 000 preescolaresdesarrollan geroftalmia de manera anual; la mitad de ellos se agravan hasta per-der la vista, y cerca de 60% mueren por complicaciones infecciosas. Excepto enHaití, en América Latina, la deficiencia de vitamina A es moderada y concentra-da en zonas de extrema pobreza, en las que el consumo dietario es escaso y cons-tituido más por carotenos que por retinol, los lípidos en la dieta son escasos y laexposición a las infecciones es mayor.

En México las formas graves no son frecuentes. En el ámbito nacional la pre-valencia de geroftalmia está entre 2.5 y 6.6%. En la ciudad de México el consu-mo de vitamina A parece ser cercano a la recomendación, aún en el estratosocioeconómico marginal. Mediante mediciones de retinol en el suero, en laEncuesta Nacional de Nutrición 1999 se encontró valores de deficiencia (retinolen el suero < 10 μg/dL) en apenas 4% de los niños rurales menores de 2 años. Laprevalencia de deficiencia moderada (retinol en el suero > 10 a < 20 μg/dL), fue25.1% en niños entre 2 y 8 años de edad en áreas rurales, pero sin diferencias entreregiones. En mujeres no se encontró deficiencia, pero sí agotamiento de reservas en15% de las embarazadas, más en las urbanas que en las rurales, con prevalencia másalta en las regiones centro (28.6%) y norte (15.8%) que en la sur (9%).

❚ TOXICIDAD

Mientras que la vitamina A es potencialmente tóxica, los carotenos no parecenserlo aunque, en principio, cualquier antioxidante puede en grandes cantidades


tener efectos pro oxidantes. El más estudiado es el caroteno β, del que no se hadetectado toxicidad por vía oral. Esto puede deberse a que, como ya se explicó,este caroteno: 1) no se absorbe bien; 2) su absorción intestinal disminuye si lacantidad ingerida aumenta; o 3) su conversión a vitamina A, que sí es tóxica, eslenta.

El exceso en la ingestión y absorción de carotenos da origen a la hhiippeerrccaarroottee--nnoossiiss que es benigna y se caracteriza por la coloración amarillenta de la piel, enespecial en las palmas de las manos y plantas de los pies, que desaparece en algu-nas semanas si se interrumpe la ingestión excesiva. El diagnóstico diferencial conla ictericia hepática se basa en que la esclerótica del ojo no se pigmenta con caro-tenos y sí con bilirrubina. Las xantofilas podrían ser más tóxicas que el caroteno βpues se ha visto que el exceso de cantaxantina se precipita en la retina y la afec-ta aunque en forma reversible.

Cabe comentar que en estudios de suplementación con caroteno β en los quese esperaba una reducción de la incidencia de cáncer pulmonar se observó justa-mente lo contrario.

De la vitamina A se ha encontrado toxicidad con dosis de 3 000 ugER ingeri-das crónicamente o de 10 000 μg ER administradas de manera aguda. Consisteen alteraciones óseas, hepáticas e hipertensión endocraneana, todas ellas de bajaletalidad. Las cantidades tóxicas mencionadas son prácticamente imposibles dealcanzar con una dieta normal, aun cuando sea muy rica en la vitamina y los casosde intoxicación ocurren por ingestión de preparaciones farmacológicas de vitami-na A. En animales de experimentación, se ha encontrado teratogenicidad que seexplica por la participación del ácido retinoico en la expresión génica. En unestudio de casos y testigos, las mujeres embarazadas que recibieron vitamina Aen cantidades mayores a 3 000 μg ER por día tuvieron un riesgo de teratogéne-sis mayor y por ello, la Sociedad Americana de Pediatría recomienda que lasmujeres embarazadas no excedan una ingestión diaria de 3 000 μg ER, especial-mente durante el primer trimestre.

❚ CONCLUSIONES

Queda claro con lo mencionado a lo largo de este capítulo, que todavía falta porestudiar y entender las funciones de un grupo tan numeroso y diverso de sustan-cias. En este aspecto es necesario, además, distinguir las funciones propiamentedichas, de los efectos y de las asociaciones epidemiológicas. Aunque estén biendemostrados en un sistema biológico, los efectos no son necesariamente específi-cos, ni generalizables y no representan una función comprobada. Por su parte, lasasociaciones epidemiológicas son hallazgos estadísticos que no prueban causali-dad, ya que pueden obedecer a la casualidad o a terceros factores que afecten las©

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dos variables asociadas. No obstante, si son sistemáticos y consistentes, los efec-tos y las asociaciones pueden ser útiles para generar hipótesis de causalidad.

Para concluir puede decirse que es importante considerar a los carotenos comonutrimentos iinnddiissppeennssaabblleess ccoonnddiicciioonnaaddooss, cuya presencia es fundamental en ladieta.

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AASSPPEECCTTOOSS NNUUTTRRIIOOLLÓÓGGIICCOOSSDDEE LLAA VVIITTAAMMIINNAA CC


❚ INTRODUCCIÓN

Entre los numerosos intermediarios que se producen en el metabolismo, tanto enlas plantas como en los animales, se encuentra el ácido ascórbico, un compuestohidrosoluble de 6 carbonos, muy parecido a la glucosa, que tiene la capacidad dedonar electrones y regresar con facilidad a su estado reducido. Gracias a estacaracterística, cumple una gran diversidad de funciones como antioxidante ycomo cofactor enzimático.

Sin embargo, hay al respecto excepciones notables. Si bien las plantas y lamayoría de los animales producen ácido ascórbico a partir de la glucosa, las espe-cies que conforman el orden de los primates, incluido por supuesto el ser humano,así como el cobayo, algunos murciélagos y algunas aves, no lo pueden sintetizarpor carecer de la gguulloonnoollaaccttoonnaa ooxxiiddaassaa debido, se supone, a una mutación en elgen correspondiente ocurrida hace unos 30 millones de años.

Este error innato del metabolismo hubiera conducido a la extinción de lasespecies mencionadas de no ser porque el ácido ascórbico abunda en los tejidosvegetales frescos (los que hoy se conocen como vveerrdduurraass yy ffrruuttaass) y porque seabsorbe con facilidad en el intestino, de manera que una dieta basada en dichostejidos puede sustituir de manera eficaz la síntesis.

38

Así, la respuesta adaptativa a esta grave alteración metabólica fue la adopciónde una dieta acorde con dicha alteración, con lo que se reestableció la armoníaentre genoma y ambiente. Por supuesto, las especies afectadas se tornaron enton-ces herbifrugívoras de forma obligatoria; como consecuencia de ello, en los casosen que no disponen de tejidos vegetales frescos, sufren la deficiencia que en suforma extrema se conoce como escorbuto y que, de no corregirse, es mortal.

De lo anterior se desprende que para el ser humano el ácido ascórbico es unnnuuttrriimmeennttoo, es decir una sustancia que tiene funciones metabólicas y se obtienede la dieta. Puesto que el ser humano no lo puede sintetizar, se le clasifica comonutrimento iinnddiissppeennssaabbllee eenn llaa ddiieettaa..

Dado que hay ocasiones en que, en efecto, no se dispone de tejidos vegetalesfrescos, el escorbuto ha acompañado a la humanidad desde la más remota antigüe-dad. Ya el papiro de Ebers y algunos escritos de Hipócrates describen este cuadroy desde entonces muchos textos médicos han hecho referencia al padecimiento.

Puesto que, por razones de conservación, los barcos no solían llevar verduras ofrutas en sus bodegas, a raíz del inicio de los viajes prolongados por mar en el sigloXV, el escorbuto se convirtió en azote de las tripulaciones, causando más bajasque otros avatares propios de la vida en el mar. En 1497 Vasco de Gama perdióa la mitad de su tripulación en su expedición al Cabo de Buena Esperanza a causadel escorbuto y en su bitácora describe: “muchos de nuestros hombres enferma-ron, sus manos y sus pies se hincharon y sus encías se inflamaron por encima desus dientes al grado de no poder comer”. En 1535, Jacques Cartier informó que,con excepción de tres marineros, toda su tripulación presentó escorbuto y aun-que la relación entre esta enfermedad y la dieta era evidente desde mucho antes,fue Cartier el primero en describir un tratamiento rápido a base de una infusiónde unas hojas frescas que le ofrecieron los indígenas de Terranova.

En 1753, el médico naval escocés James Lind publicó su “Tratado sobre elescorbuto” en el que describe uno de los primeros estudios clínicos controladosque registra la historia de la ciencia. En este estudio se estableció claramente elvalor de la frutas frescas (jugo de limones y naranjas) para el tratamiento delescorbuto; sin embargo habrían de pasar varios decenios antes de que la armadainglesa utilizara este conocimiento para establecer la ordenanza de que, en lasbodegas de los barcos, se contara con un abasto suficiente de limones para preve-nir la enfermedad.

En 1907, gracias a un error afortunado, Holst y Fröelich lograron producirescorbuto en cuyos que, como los primates, son incapaces de sintetizar ácidoascórbico; concluyeron que las frutas y verduras frescas tenían un efecto anties-corbútico que se perdía si se las calentaba o cocía. En 1925 Szent-Györgi logróaislar una sustancia cristalina de las glándulas suprarrenales y de algunos cítricosa la que llamó ácido hexurónico y en 1932 los grupos de Szent-Györgi y de Kingllegaron de manera independiente a la conclusión de que el ácido hexurónico y


el agente antiescorbútico son la misma sustancia y le llamaron ácido ascórbico,nombre que viene de la contracción en inglés de “anti-scurvy” En 1933 los gru-pos de Haworth en Birmingham y Karrer en Zurich lograron, también en formaindependiente y casi simultánea, elucidar la estructura del ácido ascórbico.

Todos estos descubrimientos ocurrieron en plena “era de las vitaminas” demanera que el ácido ascórbico y su forma oxidada, el ácido deshidroascórbico,quedaron clasificados como vitamina C.

❚ ESTRUCTURA QUÍMICA

El término vitamina C designa a los dos compuestos con actividad antiescorbú-tica: el ácido L-ascórbico y el ácido L-deshidroascórbico (figura 18-1 del capítu-lo: Potencial antioxidante del ácido ascórbico).

La fórmula molecular del ácido ascórbico es C6H8O6 y la del ácido deshidro-ascórbico es C6H6O6. El ácido ascórbico es un sólido blanco, inodoro, soluble confacilidad en agua, un poco en etanol y casi nada en disolventes polares. En soluciónacuosa se oxida con más rapidez a la forma diceto, que es el ácido deshidroascór-bico, el cual tamibén se reduce con facilidad para reformar al ácido ascórbico o bien se oxida irreversiblemente a ácido dicetogulónico y se convierte luego enlos ácidos oxálico y treónico.

El ácido ascórbico es la forma enólica de una α cetolactona de 6 carbonosparecida a la glucosa, dos de cuyos carbonos (2 y 3) ionizables le dan caracterácido; el carbono 5 es asimétrico y el enantiómero natural es el L. Su nombre quí-mico es 2,3 dideshidro-L-treo-hexano1,4 lactona. En el pasado recibió los nom-bres de ácido cevitámico, acido hexurónico y ácido L-xiloascórbico. Es unasustancia termolábil y que se oxida fácilmente.

Los dos vitámeros se interconvierten fácilmente, pero el deshidroascorbato esmenos estable. Se ha propuesto que el ácido semideshidroascórbico es tambiénun vitámero, pero no se ha aceptado.

La forma D se conoce como ácido isoascórbico, ácido D-araboascórbico oácido eritórbico, que es muy empleado como antioxidante en la industria deembutidos y cervecera (en lugar del ácido ascórbico que es más costoso), peroque no tiene actividad vitamínica.


En el cuadro 38-1 se presenta el contenido de vitamina C en algunos alimentos.La vitamina C se encuentra tanto en plantas como en animales, pero la mayor©

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Aspectos nutriológicos de la vitamina C • 581

parte (90% o más) del ácido ascórbico en la dieta humana proviene de los tejidosvegetales frescos, es decir de las verduras y las frutas, que son las fuentes natura-les con mayor concentración. Todas lo contienen aunque se destacan la guayaba,el mango, el chile poblano, el nopal, el tomatillo, la chaya y los cítricos. Tambiénse puede encontrar en los productos industrializados a los que se les ha agregadovitamina C como antioxidante. El chile contiene una elevada concentración deácido ascórbico, pero no suele ser una fuente significativa debido a la pequeñacantidad que por lo general se ingiere de este alimento. En los alimentos, la vita-mina C se encuentra fundamentalmente como ascorbato y sólo entre un 10 a20% como ácido deshidroascórbico.

La cantidad de ácido ascórbico presente en un alimento dado es muy variable,a veces hasta por un factor de 10 veces, según la variedad, la época del año y laforma de transportarlo, y prepararlo. La cocción o la exposición al aire (por ejem-plo en un alimento rebanado o en jugo) destruye buena parte de la vitamina acti-va; no obstante, la célebre regla de consumir cinco porciones diarias de verduraso frutas generalmente garantiza un aporte de 200 mg/día, que es muy superior alrequerimiento y a la cantidad necesaria para evitar el escorbuto, que en el adul-to es 8 a 10 mg/día. Aunque el ácido deshidroascórbico representa apenas 10%en la dieta, su cantidad aumenta con la oxidación que ocurre durante el almace-namiento de los alimentos.

Las vísceras como el hígado y los riñones aportan cantidades muy bajas y sucocción casi lo elimina. Las carnes, el huevo y la leche de vaca no contienen ácido


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Toronja 200 a 400 Tangerina ~150 Coliflor 50 a 90Guayaba 100 a 400 Naranja ~150 Fresa 50 a 90Mango 100 a 300 Guanábana ~140 Piña 20 a 50Chile Poblano2 300 Marañón ~150 Tejocote ~ 50Nopal2 ~250 Alfalfa ~130 Papaya ~ 50Perejil2 ~250 Mandarina ~110 Durazno ~ 40Tomatillo2 ~250 Capulín ~100 Melón ~ 30Chaya2 150 a 300 Chiles diversos 60 a 150 Plátano < 20Col2 100 a 180 Brécol 70 a 160Col Bruselas2 100 a 180 Espinaca ~ 80Zapote 50 a 200 Limón ~ 70

1 Existe gran variación de acuerdo con el estado de madurez, la variedad y la época del año2 La cocción reduce considerablemente los valores.

ascórbico aunque la leche materna humana sí lo contiene (alrededor de 62 mg/La los dos meses de lactancia y 42 mg/L a los 120 días posparto con un promedioglobal cercano a los 40 mg/día) y cubre las necesidades del niño lactante. El con-tenido de la vitamina C en la leche puede variar dependiendo del estado de nutri-ción materno en vitamina C. Vega Franco informa un contenido promedio de 50mg/día en leches de madres mexicanas.

En México, de acuerdo con las encuestas de consumo, las fuentes más impor-tantes de vitamina C en orden de importancia son la naranja, el jitomate, el tomateverde, el plátano, el limón, la papaya, la zanahoria, la calabacita y la papa. Exis-te además consumo estacional de guayaba, mandarina y mango, ricos en vitami-na C. Cabe destacar que las familias de mayores recursos económicos consumenmás frutas que verduras mientras que las de menos recursos compran más verdu-ras que frutas.

❚ DIGESTIÓN Y BIODISPONIBILIDAD

Absorción

En las especies que no pueden sintetizar a la vitamina (primates, cobayos yotros), los dos vitámeros se absorben en forma eficaz en el intestino delgado,principalmente en el íleon, pero el ácido L-deshidroascórbico se absorbe mejorque el L-ascórbico. Ambos pasan al interior del enterocito mediante un mecanis-mo de transporte activo, dependiente de sodio y de energía, saturable y sensiblea la cantidad ingerida; la proporción de ácido ascórbico que se absorbe es inver-samente proporcional a la cantidad ingerida. Así, por ejemplo, si la ingestión esde 30 mg/día, se absorbe casi 100%, pero si es de 180, 1 500 o 12 000 mg/día,la absorción se reduce respectivamente a 80, 50 y 16%. Si la ingestión se fraccio-na la cantidad total absorbida es mayor. Existe también una forma de transportepasivo que opera si la cantidad que se ingiere de la vitamina es muy elevada.

Una vez en el interior del enterocito, el ácido deshidroascórbico se reduce y seconvierte en ácido ascórbico.

Si la ingestión es mayor de 200 mg/día, parte del ácido ascórbico se convierteen la luz intestinal en bióxido de carbono que pasa a la circulación y se expulsa enel aire espirado; esta conversión aumenta con la ingestión. El ácido ascórbico queno se absorbe y que se mantiene intacto puede causar diarrea y molestias gas-trointestinales.

Se ha observado que las dietas altas en cinc o en pectinas disminuyen la absor-ción de la vitamina C, en tanto que la presencia de extractos naturales de cítricosla incrementa.

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Los dos vitámeros se transportan en el plasma a los tejidos en forma libre. En elplasma, igual que en la saliva, la concentración de ácido ascórbico es muy baja ydepende de la cantidad ingerida. En un estudio con varones adultos que ingerían100 mg/día, la concentración plasmática de ácido ascórbico alcanzó alrededor de1 mg/dL. La saturación plasmática se alcanza alrededor de los 10 a 11 mg/dL (60μmol/L). El escorbuto aparece clínicamente cuando la concentración plasmáticaes < 0.2 mg/dL.

Aunque se distribuye a todos los tejidos, el ácido ascórbico se concentra demanera particular en la hipófisis, las glándulas suprarrenales, el cristalino, el cere-bro, el hígado, el riñón, el páncreas y los leucocitos. Los eritrocitos, linfocitos yneutrófilos lo absorben en forma de ácido deshidroascórbico. El ojo tiene una ele-vada concentración de ácido ascórbico, lo que es consistente con la hipótesis deque protege el cristalino, la cornea y la retina contra radicales libres generados porfotolisis. La concentración del ácido ascórbico en el semen es hasta 10 vecesmayor que la del plasma, por lo que se cree que protege a las proteínas del esper-matozoide de la oxidación.

Lo mismo que en el enterocito, en los diferentes tejidos el paso de los dos vitá-meros al citosol se realiza mediante un mecanismo de transporte activo saturabley el ácido L-deshidroascórbico pasa 10 y 20 veces más rápido que el L-ascórbi-co. Una vez en el interior de las células, la ácido deshidroascórbico reductasatransforma el ácido L-deshidroascórbico en ácido L-ascórbico en presencia deglutatión reducido (GSH).

Se ha visto que la insulina favorece el paso del ácido deshidroascórbico al cito-sol y que la glucosa lo inhibe, por lo que los pacientes diabéticos pueden tenerconcentraciones plasmáticas de ácido deshidroascórbico anormalmente elevadas.

La poza corporal total de ácido ascórbico en el adulto es de alrededor de 1500 mgo 20 mg/kg de peso corporal; en el caso de que la poza se encuentre en 300 mg omenos (2.8 mg/kg), aparece el escorbuto. El recambio diario es de 3% de la pozacorporal total, de manera que si ésta es de 1500 mg se pierden unos 45 mg/día ysi la poza es de sólo 300 mg, se pierden 9 mg/día.

La vida media del ácido ascórbico es de 16 a 20 días, pero es muy variable e inver-samente proporcional a la cantidad ingerida. Por ejemplo, si se ingiere 30 mg/día lavida media es de 40 dias, pero si se ingiere 180 mg/día se reduce a sólo 8 días.

Excreción urinaria

El ácido ascórbico que los tejidos no captan permanece en el plasma y llega al riñónque lo reabsorbe eficientemente mediante un sistema de transporte activo depen-


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diente de Na+. El umbral de reabsorción tubular es del orden de 1.2 mg/dL deplasma de manera que si la concentración plasmática sobrepasa este valor, elácido ascórbico se excreta intacto en la orina. La relación entre concentraciónplasmática y urinaria es linear desde 1.2 mg/dL hasta 4.0 mg/dL de plasma y des-pués tiene una cinética sigmoide que conserva la vitamina cuando es escasa y laexcreta si es abundante. La excreción obligatoria en el adulto parece ser demenos de 8 mg/día.

El ácido deshidroascórbico que no se reconvierte en ácido ascórbico, se transfor-ma irreversiblemente en dicetogulonato que termina formando ácido oxálico, ácidotreónico y otros metabolitos.

Homeostasia

La combinación del mecanismo intestinal que absorbe al ácido ascórbico en pro-porción inversa a la cantidad ingerida, con el mecanismo de reabsorción tubularque lo conserva cuando es escaso y lo excreta cuando está en exceso, da lugar aun control homeostático muy fino de su concentración en el plasma y de su con-tenido corporal total.

❚ PAPEL METABÓLICO Y FUNCIONES DEL ÁCIDO ASCÓRBICO

El ácido ascórbico tiene numerosas funciones en el organismo humano, la mayo-ría de las cuales se basan en su característica de ser un agente reductor reversi-ble que se regenera fácilmente en presencia de GSH o de NADPH. Por ser uneficaz donador de electrones, actúa como antioxidante en muchos sistemas bio-lógicos.

Es importante distinguir las funciones propiamente dichas de los efectos y delas asociaciones epidemiológicas. Aunque estén bien demostrados en un sistemabiológico, los efectos no son por fuerza específicos ni generalizables; por su parte,las asociaciones epidemiológicas son hallazgos estadísticos que no prueban cau-salidad, ya que pueden obedecer a la casualidad o a terceros factores que afectenlas dos variables asociadas. De cualquier forma, si son sistemáticas y consistentes,las asociaciones pueden ser útiles para generar hipótesis etiológicas. A continua-ción se agrupan de manera general las funciones del ácido ascórbico y se anotanalgunas asociaciones epidemiológicas.


Antioxidante

Aunque todavía no se ha demostrado una relación del tipo dosis respuesta entrela ingestión de la vitamina C y su función como antioxidante en el organismo, esclaro por su estructura química, que tiene actividad antioxidante (véase el capí-tulo Potencial antioxidante del ácido ascórbico) por lo que se acepta que es partedel sistema de extinción de radicales libres ya que:

1. Neutraliza con eficacia a los radicales hidroxilo, peroxilo, superóxido, peró-xido reactivo, oxígeno singulete e hipoclorito.

2. Actúa como antioxidante en forma indirecta abasteciendo electrones pararegenerar las formas reducidas activas de otros antioxidantes como el gluta-tión, los tocoferoles y los flavonoides. El ácido ascórbico reduce al glutatiónoxidado (GSSG) y el GSH reduce al ácido deshidroascórbico, es decir queglutatión y ácido ascórbico se regeneran mutuamente según sea necesario;es interesante que el GSH alivia algunos síntomas del escorbuto y el ácidoascórbico reduce el progreso de las cataratas por deficiencia de glutatión.

3. Protege a los lípidos plasmáticos y lipoproteínas de baja densidad contra laperoxidación posiblemente mediante la neutralización en fase acuosa delradical peroxilo y la regeneración de tocoferoles reducidos.

4. Se cree que en los neutrófilos elimina los radicales libres que se producendurante su función y el efecto del ácido hipocloroso generado por la mielo-peroxidasa durante la inflamación, por lo que la presencia de ácido ascórbi-co en estas células sería crítica.

5. Protege al ácido fólico contra la oxidación.6. Protege al DNA contra mutagénesis e inicio de carcinogénesis por daño oxi-

dativo.

Cofactor o cosustrato de enzimas

El ácido ascórbico es cofactor o cosustrato de 8 enzimas que participan en la sín-tesis de la colágena, la carnitina, la noreadrenalina y de otros neuropéptidos, asícomo en el metabolismo de la tirosina y en la amidación de péptidos. Su funciónen estos procesos metabólicos es mantener reducidos al hierro o al cobre.

1. En la síntesis de colágena la vitamina C funciona como cofactor reductor dela prolil hidroxilasa y de la lisil hidroxilasa en las reacciones de hidroxilaciónde prolina y de lisina unidas a péptido, necesarias para estabilizar la triple héli-ce en la tropocolágena. La prolil hidroxilasa requiere oxígeno molecular y lafunción del ácido ascórbico es reducir al hierro de férrico a ferroso y, en la


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reacción catalizada por la lisil hidroxilasa, reduce al cobre. También se harelacionado al ácido ascórbico con la expresión génica de algunos tipos decolágena, con la secreción celular de procolágena y con la síntesis de otroscomponentes del tejido conectivo como elastina, fibronectina, proteoglica-nos, matriz ósea y fibrilina. En estudios in vitro se ha demostrado que lavitamina es capaz de inhibir la síntesis de diversas enzimas involucradas enla degradación de la colágena, particularmente las metaloproteasas de ma-triz extracelular.

2. En la síntesis de las carnitina la vitamina C participa junto con el hierro. Lacarnitina se requiere en el transporte de los ácidos grasos al interior de lamitocondria para su oxidación y generación de ATP. Por su parte, la forma-ción de acilcarnitinas posiblemente contribuye a mantener cantidades sufi-cientes de coenzima A no esterificada, que se requiere para el metabolismooxidativo de una gran variedad de compuestos.

Modulador de la absorción de hierro

El ácido ascórbico estimula la absorción duodenal del hierro no hemínico solubi-lizándolo aun en presencia de taninos y fitatos y reduciéndolo a la forma ferrosaque es la que se puede absorber.

Otras Funciones

El ácido ascórbico participa en:

1. La inactivación de xenobióticos por oxigenasas de función mixta relaciona-das con el citocromo P450 y de hormonas lo mismo endógenas que exógenas(como los anticonceptivos orales).

2. El sistema inmunitario, ya que estimula la producción de interferón, la res-puesta quimiotáctica y proliferativa de los neutrófilos y la síntesis de algunosanticuerpos. Es posible que ésta sea la razón de que la deficiencia de ácidoascórbico se acompañe de mayor susceptibilidad a infecciones. Por ello, sehan probado dosis farmacológicas (por arriba de la dosis de saturación tisularque es 100 mg/día), como profilaxis o tratamiento de padecimientos comoel catarro común, pero los resultados en este sentido son contradictorios.

3. La síntesis de AMP y GMP cíclicos.4. La excreción de colesterol por vía biliar.5. La sulfatación del tejido conjuntivo.6. La síntesis de prostaglandinas y posiblemente de serotonina.


7. La producción de células gliares y de mielina.8. La inhibición de la liberación de histamina y en el aumento de su degrada-

ción, por lo que tiene efecto antihistamínico. Es posible que este efecto searesponsable del prestigio popular de la vitamina en el manejo del catarrocomún ya que podría reducir algunos síntomas aunque no influya en elpadecimiento mismo.


Varios estudios sugieren que el ácido ascórbico podría un tener efecto preventivoen contra de las enfermedades en las que se supone que participa la oxidación (ate-roesclerosis, cáncer, catarata, entre otras), pero aún hay controversia al respecto.

Las asociaciones más notables son:

1. CCoonn eell rriieessggoo ddee ccáánncceerr.. Se ha mostrado que a mayor consumo de ácidoascórbico se reduce el riesgo de cáncer de la cavidad bucal, esófago, estóma-go y páncreas; aunque la información es más escasa, parece ser que tambiénse reduce el riesgo de cáncer de pulmón, cervicouterino, del recto y mama-rio. En cambio no se ha visto que se reduzca el riesgo de cáncer de colón,vesícula, ovario o próstata. Por supuesto, el cáncer es una enfermedad mul-tifactorial en la que la deficiencia de vitamina C sería sólo uno de los posi-bles factores.

2. CCoonn llaa eennffeerrmmeeddaadd ccoorroonnaarriiaa.. Se ha encontrado asociación entre concentra-ción plasmática baja de ácido ascórbico y mayor riesgo de enfermedadescardiacas e hipertensión, que se atribuye a que la vitamina puede inhibir laoxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) inducida por meta-les pesados y radicales libres Es interesante que en estudios clínicos se haobservado que, con dosis tan diversas como de 40 a 1 000 mg/día por pe-riodos que de 1 a 4 semanas, puede disminuir la concentración de LBD, asícomo la concentración de malondialdehído (MDA) y sustancias reactivas alácido tiobarbitúrico, indicadores ambos de peroxidación de lípidos Sinembargo, los resultados que sugieren un papel terapéutico de la vitamina Cen estas enfermedades son contradictorios.


En el adulto, el escorbuto clínico se evita con la ingestión de 10 o 15 mg/día, perolas recomendaciones diarias en diferentes países son de 45 a 80 mg. Convienerecordar que las rreeccoommeennddaacciioonneess que sirven como valores de referencia para


propósitos de evaluación y planificación, se establecen con base en la informaciónque se tiene sobre los requerimientos que se han medido en algunos individuos.

Requerimientos

En el caso de la vitamina C se suelen establecer con base en:

1. La ingestión que se necesita para saturar a los leucocitos, en especial a losneutrófilos, ya que esta variable se relaciona con la reserva hepática. Se haobservado que si los neutrófilos están saturados en 80%, pueden evitar laformación de ERO durante la fagocitosis y la activación de los neutrófilos yel organismo cuenta con suficiente cantidad de ácido ascórbico para cubrirsus necesidades metabólicas. Mediante estudios del contenido de la vitami-na en neutrófilos y suponiendo que el papel antioxidante de la vitamina Ctiene un efecto lineal, se calculó que con una ingestión de 75 mg/día (± 19.4%) se alcanza la saturación de los neutrófilos sin pérdidas urinariasimportantes En las mujeres embarazadas, Casanueva et al. han establecidoque una concentración leucocitaria menor de 102 nmol/108 células entre lassemanas 28 y 32 de la gestación, se asocia con un riesgo significativo mayorde ruptura prematura de las membranas corioamnióticas y que, con unsuplemento de 100 mg/día de vitamina C a partir de la semana 20 de ges-tación, es posible asegurar que la reserva leucocitaria de ácido ascórbico semantendrá en valores adecuados.

2. La saturación plasmática (11.2 ± 0.2 mg/dL en varones y 9.9 ± 0.5 mg/dLen mujeres) se alcanzó con consumos de vitamina C de 85 mg/día ± 25%.

Recomendaciones

Las recomendaciones mexicanas de vitamina C del 2004 se muestran en el cua-dro 38-2. El promedio ponderado de acuerdo con la distribución demográfica dela población mexicana es 60 mg/día El tabaquismo eleva en 35 mg/día el recam-bio de vitamina C en relación con los no fumadores, lo que podría aumentar suriesgo de estrés oxidativo. Por ello, se recomienda a los fumadores una ingestiónadicional de por lo menos 35 mg/día.

No hay justificación para ingerir cifras mayores que las recomendadas ni parautilizar suplementos de 1 g o más a diario. Por una parte, las recomendacionescontemplan siempre un margen adicional de seguridad y por la otra, si la inges-tión es excesiva la absorción se reduce y los excesos en el plasma se eliminan enla orina. Como ya se explicó, no es difícil satisfacer las recomendaciones ya que©

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el consumo diario de 5 porciones de frutas o verduras provee tres veces más ácidoascórbico que lo recomendado y 15 veces más que lo necesario para evitar elescorbuto. No obstante, hay individuos que pueden sufrir la deficiencia, sobretodo la subclínica.

❚ DEFICIENCIA

La deficiencia franca de vitamina C, el escorbuto, se presenta cuando la poza cor-poral total es menor de 2.8 mg/kg de peso y la concentración de vitamina C enel plasma es < 0.2 mg/dL.

Este cuadro se caracteriza por fragilidad capilar, cicatrización defectuosa(ambas atribuibles a trastornos en la síntesis de colágena), hiperqueratosis folicu-lar, anemia, engrosamiento de las articulaciones, artralgia, edema, trastornos psi-quiátricos (hipocondría, depresión e histeria), debilidad, lasitud, fatiga fácil ymayor susceptibilidad a infecciones. La fragilidad capilar da lugar a equimosis,petequias, inflamación y hemorragia gingival, pérdida de piezas dentarias, hemo-rragias perifoliculares, hemartrosis y, en los niños, hemorragias subperósticas yosificación inadecuada con la consecuente disminución en el crecimiento.

En niños alimentados con leche de vaca (que prácticamente no contiene ácidoascórbico) durante el primer semestre de su vida se puede presentar el síndromede Moeller-Barlow, que se caracteriza por el engrosamiento de las uniones hueso car-tílago particularmente en la caja torácica, dolor en articulaciones, anemia y fiebre.


CCuuaaddrroo 3388--22.. RReeccoommeennddaacciioonneess mmeexxiiccaannaass ddee iinnggeessttiióónn ddee vviittaammiinnaa CC ((22000044)) ((mmgg//ddííaa))

Niños de 1 a 3 años 15Niños de 4 a 8 años 25Niños de 9 a 13 años 45Púberes de 14 a 18 años

Hombres 65Mujeres 57

Adultos de 19 a 70Hombres 84Mujeres 75

Adultos mayores de 70 añosHombres 80Mujeres 70

Embarazadas 138Lactantes 128

Durante el embarazo la deficiencia marginal de vitamina C se ha asociado conruptura prematura de membranas corioamnióticas, con mayor mortalidad neona-tal y con menores pesos al nacimiento.

En México, el escorbuto franco no es frecuente, pero las formas subclínicas dedeficiencia de ácido ascórbico podrían serlo particularmente en vista de la dismi-nución que está experimentando el consumo de verduras y frutas. Mediante lasconcentraciones de ácido ascórbico en el plasma se estima que hay deficiencia(subclínica) en 37% de los menores de 2 años y en casi 50% de las mujeres, convalores similares en localidades rurales y urbanas, pero con mayor prevalencia enlas regiones Norte y Sur del país. En embarazadas, la prevalencia tiende a sermayor en las localidades rurales que en las de las urbanas, pero en las no emba-razadas no se encontró diferencia. La prevalencia más alta se encontró en laregión Norte.

❚ TOXICIDAD

En condiciones normales, la intoxicación con ácido ascórbico es muy poco pro-bable debido a la fina homeostasia de la concentración plasmática de la vitaminaen la que la proporción que se absorbe decrece conforme se eleva la ingestión ylos excesos se eliminan en la orina. Así, el ácido ascórbico no es claramente tóxi-co en dosis hasta de 1 o 2 g/día.

Se ha informado que la ingestión de dosis mayores o “megadosis” (≥ 3 a 4 g/día)puede causar gastritis, litiasis urinaria por oxalatos, hiperuricemia y escorbuto porrebote (deficiencia al pasar de las megadosis a cantidades normales). Las moles-tias gastrointestinales (distensión, dolor abdominal, cólicos, náuseas y diarrea detipo osmótico) son el único signo que se encuentra consistentemente en sereshumanos; estas molestias empiezan a ser notorias a partir de un consumo de 3 000 mg/día de ácido ascórbico y son francamente manifiestas con 4 000 mg/día.

El incremento en la excreción urinaria de oxalatos que son productos delmetabolismo de ácido ascórbico y en algunas ocasiones formación de cálculosurinarios, puede ocurrir en sujetos susceptibles, por lo que a quienes tienden aformar cálculos renales se les debe prevenir de no consumir megadosis de la vita-mina. En concentraciones elevadas, el ácido ascórbico tiene actividad prooxidan-te e incrementa el estrés oxidativo

También se han informado la destrucción oxidativa y la disminución en laabsorción de la vitamina B12, el incremento en la absorción del hierro que puedeinducir saturación, el incremento en la demanda de oxígeno y la erosión del es-malte dental.

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Límite superior de consumo

Aunque se necesitan más estudios para afinar las cifras, las recomendacionesmexicanas del 2004 señalan los límites superiores de consumo diario que semuestran en el cuadro 38-3.

❚ CONCLUSIONES

El ácido ascórbico es un nutrimento indispensable en la dieta, cuyas funcionesmetabólicas se relacionan principalmente con los efectos antioxidantes, ademásde que puede actuar como cofactor de enzimas y facilitador en la absorción delhierro.

❚ REFERENCIAS

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Niños de 1 a 3 años 400 mg/díaNiños de 4 a 8 años 650 mg/díaNiños de 9 a 13 años 1 200 mg/díaPúberes 14 a 18 años 1 800 mg/díaAdultos 2 000 mg/díaEmbarazadas 2 000 mg/díaMujeres lactantes 2 000 mg/día

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AASSPPEECCTTOOSS NNUUTTRRIIOOLLÓÓGGIICCOOSSDDEE LLAA VVIITTAAMMIINNAA EE


❚ INTRODUCCIÓN

La vitamina E tiene 8 vitámeros; cuatro ttooccoolleess y cuatro ttooccoottrriieennoolleess (figura 39-1),que si bien no se convierten unos en otros, ni tienen todos el mismo grado deactividad biológica, comparten un buen número de funciones metabólicas. Dadoque el ser humano no es capaz de sintetizar estas sustancias, como grupo se lesclasifica como nutrimentos iinnddiissppeennssaabblleess eenn llaa ddiieettaa..

La vitamina E es en varios sentidos eessppeecciiaall,, pues difiere de otras vitaminas enlos siguientes aspectos:

1. La forma en que se le descubrió (véase más adelante Bosquejo histórico).2. La diversidad de manifestaciones de su deficiencia en animales.3. La dificultad que ha habido para ubicar su función metabólica y para encon-

trar su cuadro clínico de deficiencia en seres humanos.4. La carencia de transportadores específicos en la membrana del enterocito y

en el plasma.5. Su rápido recambio entre el plasma, el hígado y la estabilidad de su concen-

tración en el plasma.6. La capacidad del organismo para conservarla.

39

7. Su depósito, aparentemente no funcional, en el tejido adiposo.8. La discordancia entre la actividad biológica y la actividad fisicoquímica de

sus vitámeros.

❚ BOSQUEJO HISTÓRICO

La mayoría de las vitaminas se descubrieron como resultado del estudio de enfer-medades por deficiencia que durante milenios afectaron gravemente a la huma-nidad como el escorbuto, el beri-beri, la pelagra, la geroftalmia, el raquitismo y laanemia perniciosa, entre otras. En cambio, la vitamina E se descubrió como con-secuencia de la búsqueda de vitaminas nnuueevvaass mediante la estrategia de emplearmodelos animales y usar dietas sintéticas, es decir dietas preparadas con la com-binación de ingredientes más o menos purificados que sólo contenían los nutri-mentos hasta entonces conocidos.

En 1920, en la Universidad de California en Berkeley, Evans y Bishop observa-ron que las ratas alimentadas con ddiieettaass ssiinnttééttiiccaass en las que la fuente de lípidosera manteca rancia, desarrollaban distrofia muscular y no eran capaces de repro-ducirse debido a la degeneración espermática en el macho y a la reabsorción fetalen las hembras embarazadas. En 1922 encontraron que ese cuadro se podía pre-venir si en la dieta se incluían pequeñas cantidades de levadura, lechuga fresca,alfalfa deshidratada, germen de trigo, avena, carnes o leche y, sobre todo, aceitesvegetales comestibles. Puesto que el aceite de hígado de bacalao, fuente bienconocida de las vitaminas A y D, no tenía ese efecto preventivo, para Evans y Bishop era claro que se encontraban ante una vitamina aun no descrita.

De los alimentos mencionados antes, estos investigadores lograron extraer, endisolventes orgánicos, la sustancia responsable del efecto preventivo, a la que lla-maron primero ffaaccttoorr XX y poco después vviittaammiinnaa EE (dado que las letras A, B, Cy D ya habían sido asignadas). En 1936 el propio Evans encontró tres ésteres conactividad de vitamina E (los actuales tocoles α, β y γ) y en 1938 acuñó el térmi-no tocoferol, voz derivada del griego tocos (descendencia, parto) y ferein (llevara ) por lo que significa alcohol que hace posible el parto. El δ-tocol se aisló en1949 y los tocotrienoles diez años más tarde.

A pesar de que se ha buscado en forma insistente el cuadro de deficiencia devitamina E en el ser humano, e incluso se ha intentado producirlo experimental-mente, hasta hace apenas unos lustros no se había tenido éxito por lo que se hacíareferencia a la vitamina E como la vviittaammiinnaa eenn bbúússqquueeddaa ddee ddeeffiicciieenncciiaa.. La ane-mia en niños con mala absorción de lípidos se describió apenas en 1965 y la neu-ropatía periférica en 1985.

En el caso de otras vitaminas, conforme progresaba el conocimiento, se lesencontraron funciones metabólicas específicas. En cambio, la función de la vita-


mina E permaneció confusa durante más de 70 años debido a que su principalpapel metabólico radica en su capacidad antioxidante, función que afecta infini-dad de estructuras anatómicas y vías metabólicas.

❚ ESTRUCTURA QUÍMICA

Tanto los tocoles como los tocotrienoles están formados por un anillo de ccrroommaa--nnooll con un grupo hidroxilo o alcohol (-OH) en la posición 6, uno a tres metilos(-CH3) y una cadena lateral de ffiittiilloo de 16 carbonos En los ttooccoolleess la cadena la-teral está saturada mientras que en los ttooccoottrriieennoolleess tiene 3 insaturaciones (figu-ra 39-1).

En ambas familias se llama α al vitámero 5,7,8 trimetil, β al 5, 8 dimetil, γ al7, 8 dimetil y δ al 8 monometil. Como en la cadena de ffiittiilloo hay 3 centros qui-rales, los tocoles que la industria farmacéutica obtiene por síntesis tienen 8 eessttee--rreeooiissóómmeerrooss (RRR, RSR, RSS, RRS, SRR, SRS, SSR y SSS). Los estereoisómerosson las moléculas que pueden estar en diferentes disposiciones espaciales, peroque tienen la misma fórmula química. De ellos, los que son imágenes en espejouno de otro, y que no se puedan sobreponer se llaman eennaannttiióómmeerrooss.. La formasintética que se utiliza en los suplementos, es una mezcla racémica (mezcla deenantiómeros a la misma concentración) de los 8 estereoisómeros del α−tocofe-rol y se le conoce como hhoolloo rraacc αα-ttooccooffeerrooll. Su actividad es hasta 3 veces menorque la del RRR α-tocol que es el estereoisómero más activo.

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Aspectos nutriológicos de la vitamina E • 597

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1CH3

CH2

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R1 =

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Tocoles

TocotrienolesVitamina E

— CH2 - CH2 - C — CH2 — H

R2 = — CH2 - CH = C — CH2 — H

CH3

CH3

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α = 5, 7, 8-trimetil (forma activa)β = 5, 8-dimetilγ = 7, 8-dimetilδ = 8-metil

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3

FFiigguurraa 3399--11.. Estructura química de la vitamina E.

En la práctica, sólo tienen importancia los tocoles RRR y de ellos la formaprincipal es el isómero RRR del α-tocol (o α-tocoferol) cuya actividad es la másalta y por ello se le toma como unidad (equivalente de tocoferol). Los demás vitá-meros no se convierten en α-tocol pero pueden tener cierta actividad biológica.

Por facilidad, el término tocoferoles se aplica a todos los vitámeros y si se usaen singular (tocoferol), en general se refiere al α-tocol.


La vitamina E se encuentra en la fracción lipídica de numerosos alimentos, par-ticularmente en los de origen vegetal ya que sólo las plantas son capaces de sin-tetizar tocoferoles. En términos generales, la concentración de vitamina E en losalimentos es proporcional a su contenido de ácidos grasos poliinsaturados, lo quesugiere que su presencia en el alimento tiene como propósito proteger dichos áci-dos grasos de la oxidación. En el cuadro 39-1 se muestra el contenido de vitami-na E de algunos alimentos.

Son buena fuente de la vitamina el girasol, las almendras, el germen de trigo,el cacahuate, otras semillas ricas en aceite como las de algodón, cártamo, soya ymaíz, así como los aceites extraídos de ellas y sus derivados (mayonesa, aderezos,entre otros) y la espinaca (la vitamina se concentra en los cloroplastos).

La proporción en que se encuentran los distintos vitámeros e isómeros difierede un alimento a otro; así, por ejemplo, el RRR α-tocol que es el estereoisómeromás activo, abunda en el aceite de germen de trigo, cártamo y girasol mientrasque en los aceites de soya y maíz predominan el γ tocol y los tocotrienoles. Losaceites de algodón y palma contienen α y γ-tocoferoles en cantidades similares, yel de palma también es rico en tocotrienoles.

Los tocoferoles que ingieren los animales se depositan en el tejido adiposo y elhígado, por lo que algunos alimentos de origen animal pueden contenerlos. La


CCuuaaddrroo 3399--11.. CCoonntteenniiddoo ddee vviittaammiinnaa EE ddee aallgguunnooss aalliimmeennttooss yy pprroodduuccttooss mmgg//110000 gg

Aceite de germen de trigo 192 Mayonesa 2Aceite de girasol 51 Espinaca 1Almendras 26 Huevo 1Germen de trigo 18 Pan integral 0.9Cacahuate 7 a 13 Verduras y frutas 0.5Margarina 12 Carnes 0.5Mantequilla 4 Leche de vaca 0.1

leche humana contiene alrededor de 5 mg/L; suponiendo una producción de 780mL/día, el aporte diario sería de alrededor de 3.8 mg.

Los suplementos vitamínicos contienen ésteres de los isómeros RRR naturaleso bien el ya mencionado holo rac α tocol que está formado por los 8 estereoisó-meros sintéticos.

Para la población mexicana, las fuentes principales de vitamina E en la dietason los aceites vegetales comestibles (1.3 mg/día), pero la tortilla de nixtamal ylos frijoles contribuyen en forma importante.

❚ DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN

Por su carácter liposoluble, los tocoferoles se ingieren junto con los triacil glice-roles de la dieta. No se conoce en la membrana del enterocito ningún vectorespecífico para absorber tocoferoles, por lo que al parecer se absorben disueltosen los ácidos grasos que se liberan durante la digestión. Este proceso es inespecí-fico; no distingue entre los vitámeros, por lo que todos se absorben en la mismaproporción que oscila entre 15 y 45% de la cantidad ingerida, y disminuye con-forme la cantidad que se ingiere es mayor.

Así, la absorción de los tocoferoles depende de la digestión adecuada de tria-cil gliceroles en la que participan la lipasa pancreática, las fosfolípidos, las salesbiliares, los ácidos grasos y los monoacilgliceroles que forman las micelas duran-te la digestión. Los ésteres de tocoferoles ingeridos en suplementos deben serhidrolizados mediante esterasas. Una vez en el interior del enterocito, los 8 vitáme-ros se incorporan en los qquuiilloommiiccrroonneess que se expulsan a la circulación linfática.


El transporte y distribución de la vitamina E se realizan mediante las lipoproteí-nas del plasma. Los qquuiilloommiiccrroonneess (Q) contienen los tocoferoles provenientes dela dieta y, cuando por efecto de la lipasa lipoproteínica, pierden lípidos y se con-vierten en rreemmaanneenntteess ddee qquuiilloommiiccrroonneess (rQ), la mayor parte de los tocoferolespermanece en los rQ y una parte menor se libera al plasma y se incorpora en lipo-proteínas de alta densidad (HOL; del inglés, high density lipoprotein).

Mediante un mecanismo aún no esclarecido, los rQ son captados por el híga-do, que los emplea para sintetizar lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL; delinglés, very low density protein) que pasan a la circulación y se convierten luegoen lipoproteínas de baja densidad (LDL; del inglés, low density lipoprotein).

Así, la mayor parte del total de tocoferoles, los que vienen en los rQ, llegan alhígado en menos de cinco minutos después de la absorción y ahí se incorporan en©

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las VLDL mencionadas. Este proceso es muy complejo y en él interviene la pprroo--tteeíínnaa ddee ttrraannssffeerreenncciiaa ddeell αα ttooccooll (α-TTP) que al parecer es exclusiva del hepato-cito y la placenta; esta proteína es necesaria para el transporte intracelular detocoferoles de los liposomas a los microsomas y tal vez participa en la incorpora-ción de tocoferoles en VLDL. El vitámero predominante (> 80%) en las VLDL quesalen del hígado a la circulación es el RRR α-tocol por el que α-TPP tiene la pre-ferencia mayor. Se han descrito varios defectos genéticos de α-TPP que son muyraros pero que conducen a un cuadro grave de deficiencia de vitamina E.

La vitamina que pasó al plasma directamente y se incorporó a las HDL circu-lantes, se transfiere a las demás lipoproteínas (LDL y VLDL) y a los tejidos. Latransferencia de vitamina E entre lipoproteínas es significativa, llega a represen-tar 10% del total circulante por hora y en ella interviene la proteína de transfe-rencia de fosfolípidos (PLTP plasmática).

En resumen, los tocoferoles pueden pasar directamente a las lipoproteínas delplasma sin preferencia por algún vitámero o bien ser incorporados en formaselectiva (preferencia por el RRR α-tocol) en las VLDL que el hígado secreta alplasma más tarde.

Como se puede apreciar, la concentración y tipo de tocoferoles en el plasmadepende de la secreción selectiva de RRR α-tocol por el hígado, en la que el prin-cipal determinante es la α-TPP y no de la absorción intestinal que no discriminaentre los distintos vitámeros.

Aunque la vitamina E absorbida por el intestino abandona el plasma en ape-nas 5 min, el flujo de α-tocoferol desde el hígado hace que la concentración plas-mática sea muy estable y sea útil como indicador de deficiencia (se consideradeficiencia si la concentración es inferior a 10 nmol o 5 μg de α-tocoferol/mL (o bien 0.8 mg α-tocoferol/g de lípidos totales o 2.8 mg/g de colesterol).

El recambio de RRR α-tocol en los tejidos se ha estudiado en ratas y cuyos yse ha visto que difiere mucho de un tejido a otro. Es muy rápido en eritrocitos,hígado y bazo, lento en el corazón, músculo y médula espinal, y sumamente lentoen el cerebro que retiene α-tocoferol aún bajo condiciones de agotamiento deltejido nervioso; los nervios periféricos son excepcionales ya que muestran mayorrecambio y son sensibles a la suplementación y al agotamiento.

Almacenamiento

No se conoce ningún órgano o tejido que retenga y la libere a la vitamina E deacuerdo con las necesidades, es decir que funcione propiamente como almacén.Más de 90% de la vitamina E tisular se encuentra en el tejido adiposo, pero no enlas membranas como se esperaría sino en los triacilgliceroles de reserva; se desco-


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noce los posibles mecanismos de liberación de la vitamina E de los tejidos perose sabe que durante las etapas de pérdida de peso, en las que el tejido adiposolibera ácidos grasos a la circulación, no se libera vitamina E por lo que es incier-to qué tan disponible se encuentra la vitamina E en el tejido adiposo. Por otraparte, en individuos con deficiencia, el contenido de α-tocol en el tejido adiposoes bajo.

La vitamina E tiene un recambio muy lento en el tejido adiposo, tanto que sise modifica la proporción de los vitámeros en la dieta, el efecto tarda más de 2años en reflejarse en dicho tejido; por ello, la composición del tejido adiposoconstituye un indicador muy adecuado del estado de vitamina E en el largoplazo; en este sentido, se considera deficiencia de vitamina E si la concentraciónes menor de 100 μg de α-tocol /mg de triacilgliceroles.

Catabolismo y excreción

Debido a que su absorción es relativamente mala, la mayor parte de la vitaminaE ingerida se excreta en el excremento. Por su parte, la vitamina absorbida se reci-cla muy activamente y poco se llega a catabolizar y a excretar por otras vías comola bilis, la orina y tal vez la piel (glándulas sebáceas); la notable capacidad delorganismo para conservar la vitamina E explica en buena medida por qué ha sidotan difícil encontrar el cuadro de deficiencia.

El producto principal del catabolismo de los tocoferoles es la tocoferil quinonaque se puede reducir a hidroxiquinona y conjugarse para formar el glucuronato,el cual se excreta en la bilis o bien se degrada en el riñón a ácido tocoferónicoque se excreta en la orina.

En estudios empleando cargas (más de 50 mg) se han encontrado dímeros, trí-meros y otros derivados que no se observan en condiciones normales, algunos taninteresantes como un compuesto natriurético derivado del γ-tocoferol.

❚ PAPEL METABÓLICO Y FUNCIONES DE LA VITAMINA E

La vitamina E es el principal antioxidante de la fase lipídica. Ya desde mediadosdel siglo XX se había percibido que los tocoles y tocotrienoles son moléculas concapacidad antioxidante y se supuso que esa podría ser su papel metabólico. Aun-que sin duda una de las funciones de la vitamina E es formar parte del sistemaantioxidante del organismo, también tiene funciones no relacionadas con su acti-vidad antioxidante. A continuación se revisan brevemente unas y otras.


Función antioxidante

La vitamina E tiene la capacidad de interrumpir la cadena de propagación deradicales libres y así previene o reduce el daño oxidativo que éstos causan y queson evidentes en la anemia hemolítica y en la neuropatía periférica.

La vitamina E es un neutralizador muy efectivo del radical peróxilo que seproduce por auto oxidación en los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) que se encuentran en los fosfolípidos de las membranas celulares y subcelulares,en las lipoproteínas plasmáticas y en los tejidos. Al proteger los AGPI intracelu-lares, la vitamina evita daños estructurales así como sus consecuencias metabóli-cas en gran cantidad de reacciones.

La protección de los AGPI tiene lugar gracias a que el radical peroxilo (ROO•)tiene mil veces más afinidad por la vitamina E que por los AGPI y de esa formason los tocoferoles los que se oxidan; brevemente, el -OH del núcleo fenólico dela vitamina reduce al ROO• y lo convierte en hidroxiperoxilo (ROOH) y el toco-ferol queda convertido en el radical tocoferoxilo•. Este radical pasa de la mem-brana celular a la fase acuosa donde se rreeggeenneerraa al ser reducido por el ácidoascórbico, el GSH o algún otro donador hidrosoluble de electrones. Surge así elconcepto de cciicclloo ddee llaa vviittaammiinnaa EE ya que la vitamina ejerce su función oxidán-dose en lugar de que se oxiden los AGPI y regenerándose para seguir cumplien-do su función. Como parte del sistema antioxidante, los donadores hidrosolublesde electrones también se regeneran.

En estudios en animales se ha observado que la vitamina E, el selenio y ciertosantioxidantes sintéticos pueden sustituirse entre si parcialmente. Esto se explicaporque algunas selenio enzimas forman parte del sistema antioxidante del orga-nismo y por ello la deficiencia de selenio eleva los requerimientos de vitamina Ey agrava las manifestaciones de su carencia. Sin embargo, la función de los tocofe-roles es insustituible debido a sus características singulares de ser un antioxidanteliposoluble que se regenera con facilidad y que el organismo conserva con gran efi-cacia. Por supuesto, la función antioxidante de la vitamina E es parte de todo unsistema muy complejo y su efecto dependerá del estado de dicho sistema.

Funciones no relacionadas con la actividad antioxidante

Las siguientes funciones son específicas para un vitámero en particular.

• El α-tocoferol inhibe a la proteína cinasa C interfiriendo con su fosforila-ción. Esta enzima regula la proliferación del músculo liso de los vasos.

• El α-tocoferol inhibe la fosfolipasa A2 que metaboliza el ácido araquidóni-co hacia eicosanoides y consecuentemente, reduce la agregación plaquetaria.


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• El γ-tocotrienol estimula la degradación de la 3 OH 3 metil glutaril CoAreductasa y tiene por ello efecto hipocolesterolémico; en un estudio seencontró que con la administración de γ-tocotrienol. disminuye el tamañode la placa carotídea. El α-tocoferol tiene el efecto contrario pues compitecon el γ-tocotrienol.

• El succinato de α-tocoferol induce apoptosis en células tumorales por lo quetiene potencial como agente anticancerígeno.

• Como los β, γ y δ-tocoles pueden nitrarse in vitro se ha especulado sobre laimportancia potencial de su reacción con óxido nítrico.

Las siguientes funciones son generales (no son específicas para determinadovitámero). La vitamina E:

• Modula la actividad de enzimas microsómicas.• Modula la respuesta inmunitaria y es necesaria para la función de los linfoci-

tos T. Junto con el selenio protege a los macrófagos durante la fagocitosis.• Es necesaria para la gestación y el desarrollo fetal. Cabe comentar que la

α-TTP transporta α-tocoferol al través de la placenta.• Interviene en la expresión génica.• Promueve la eritropoyesis normal y estabiliza los eritrocitos.


En diversos estudios se ha observado que la cantidad que se ingiere de vitaminaE se asocia con menor incidencia, riesgo o gravedad de varias enfermedades pordaño oxidativo como:

1. La enfermedad cardiovascular La reducción en el riesgo coronario y en el da-ño por reperfusión después de isquemia de miocardio se atribuye a que in vi-tro la vitamina E disminuye la oxidación de LDL y la agregación de plaquetas.

2. Algunas neoplasias.3. La preeclampsia.4. Las cataratas.5. La retinopatía en niños prematuros.6. La anemia del prematuro por el uso de fórmulas deficientes en α-tocol.7. La inmunodeficiencia senil.

Cabe recordar que las asociaciones epidemiológicas no prueban causalidadpero, si son sistemáticas y consistentes, pueden ser útiles para generar hipótesis alrespecto.


❚ ACTIVIDAD VITAMÍNICA

En el cuadro 39-2 se muestra la actividad biológica y la actividad fisicoquímica,como antioxidantes, de los distintos vitámeros. Como se aprecia, en el caso de lostocoles hay correlación estrecha entre su actividad biológica y su capacidad antio-xidante, pero esto no se observa en el caso de los tocotrienoles y de algunos isó-meros, es decir que las actividades biológica y fisicoquímica de los distintosvitámeros de la vitamina E no siempre coinciden. Los 8 estereoisomeros sintéti-cos de holo rac α-tocol tienen la misma capacidad antioxidante, pero difieren enactividad biológica y cabe notar que el análogo tetrametilado del RRR α-tocoltiene la misma actividad bilológica pero es 1.5 veces más antioxidante.

Entre las razones de esta discrepancia se encuentran que la vitamina tiene fun-ciones que no se relacionan con su papel antioxidante y que la función biológicadepende en alto grado de la afinidad de cada vitámero con la α-TTP y no direc-tamente de su capacidad antioxidante Como se ve en la tercera columna del cua-dro 39-2, la actividad biológica de cada vitámero y su afinidad por la α-TTP sonsemejantes.

En preparados farmacéuticos se han usado las unidades internacionales (UI) ylas de la farmacopea de los EUA, que no se recomiendan, pero que algunos usan.


CCuuaaddrroo 3399--22.. AAccttiivviiddaadd ddee llaa vviittaammiinnaa EE((%% ddee RRRRRR αα--ttooccooll))

AAffiinniiddaadd ppoorrVViittáámmeerroo BBiioollóóggiiccaa FFiissiiccooqquuíímmiiccaa αα--TTTTPPRRR α-tocol 100 100 100β-tocol 40 60 38γ-tocol 10 a 30% 25 9δ-tocol 1 27 2α-tocotrienol 30 100 12β-tocotrienol NDγ-tocotrienol NDδ-tocotrienol NDAnalogo1 100 150Acetato de α-tocoferil 2α-tocoferil quinona 2SRR α-tocol 11

1 Análogo tetrametilado de RRR α-tocol.ND, no detectable.

Una USP equivale a 1mg de acetato de holo rac α-tocol, 0.67 mg de RRR α-tocolo 0.74 de acetato de RRR α-tocol.


Como los tocoferoles no se convierten unos en otros y el α-tocol es el más acti-vo, el requerimiento de vitamina E se refiere en realidad al de α-tocol. Dada ladiferente actividad biológica de los distintos vitámeros, los recomendaciones devitamina E se expresan en términos del miligramo equivalente de α-tocoferol(mgEq) que es igual a 1 mg de RRR α-tocoferol, 2 mg de β-tocoferol, 10 mg deα-tocoferol γ, 3.3 mg de α-tocotrienol o 1.4 mg de α-tocoferol racémico.

Puesto que a mayor ingestión de AGPI se necesita más vitamina E para prote-gerlos, el requerimiento de tocoferoles está íntimamente ligado con la cantidadque se ingiere de AGPI y con la cantidad de otros antioxidantes como el selenio,carotenos y mercapto aminoácidos (que reducen la necesidad de vitamina E).Como las fuentes de vitamina E y de AGPI suelen ser las mismas, es difícil ele-var la ingestión de tocoferoles sin elevar la de AGPI.

Mediante la cuantificación de la ingestión necesaria para prevenir la hemólisispor peróxido de hidrógeno, se ha encontrado que el requerimiento de tocoferoles 0.4 a 0.8 mgEq/g AGPI y, si se trata de AGPI de cadena larga, aumenta a 1.5mg/g. En un adulto, 0.4 mg equivalentes de α-tocoferol por gramo de AGPI enla dieta equivale a unos 10 mg/día.

Las recomendaciones mexicanas del 2005 para la vitamina E se presentan enel cuadro 39-3. Como se observa, se trata de valores de ingestión diaria sugerida(IDS) debido a que no hay todavía suficiente información para dar IDR.

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MMééxxiiccoo 22000055

GGrruuppoo ddee eeddaadd IIDDSS LLSSCC((aaññooss)) mmgg EETT mmgg EETT

1 a 3 6 2004 a 8 7 3009 a 13 11 60014 a 18 15 800Adultos 15 1 000Mujer embarazada 15 800Mujer lactante 19 1 000

❚ VALORACIÓN DEL ESTADO DE NUTRICIÓN EN VITAMINA E

Como el cuadro clínico es muy raro y muy tardío, conviene valorar el estado devitamina E mediante mediciones de tocoferoles en el plasma y en el tejido adi-poso y mediante pruebas funcionales (hemólisis, etano o pentano en aire espira-do, pruebas neurológicas y electrofisiológicas). Como ya se señaló, se consideraque hay deficiencia de la vitamina si la concentración plasmática es inferior a 5 μg de α-tocoferol /mL (o bien a 0.8 mg α-tocoferol /g de lípidos totales o a 2.8mg/g de colesterol) y si el tocoferol en el tejido adiposo es menor de 100 μg deα-tocol /mg de triacilgliceroles.

❚ DEFICIENCIA

Los signos de deficiencia en animales que describieron originalmente Evans y Bishop y que se muestran en el cuadro 39-4, se pueden explicar en parte porperoxidación de los lípidos de las membranas celulares que afecta la funciónmitocondrial y de transporte y favorece el deterioro celular.

En el ser humano la deficiencia clínica es muy poco frecuente. No se encuen-tran manifestaciones clínicas aun en condiciones experimentales con consumomuy escaso y lográndose valores plasmáticos bajos. En voluntarios alimentadoscon una dieta pobre en tocoferol durante largo tiempo, a los 2 años los valores enplasma ya eran bajos y los eritrocitos más lábiles a la hemolisis, pero no había ane-mia ni otras manifestaciones clínicas.


CCuuaaddrroo 3399--44.. SSiiggnnooss ddee ddeeffiicciieenncciiaa ddee vviittaammiinnaa EE eenn aanniimmaalleess

Rata- Degeneración del epitelio germinal del testículo- Reabsorción de los fetos- Distrofia muscular- Necrosis hepática- Degeneración renal- Hemólisis

Otras especies- Pérdida de albúmina plasmática (pollo, guajolote)- Encefalomalacia y diátesis exudativa (pollo)- Esteatitis (pollo, puerco)- Distrofia muscular (aves y roedores)

En caso de presentarse, la deficiencia de vitamina E tarda meses en corregirsea pesar del tratamiento. Sus manifestaciones principales se muestran en el cuadro39-5. La deficiencia en el adulto tiene manifestaciones fundamentalmente neu-rológicas (hiporreflexia profunda, pérdida de la sensación de posición y de vibra-ción, pérdida del equilibrio, oftalmoplejía y miastenia) En los niños con malaabsorción de lípidos, la deficiencia puede ser más grave pues su sistema nerviosoes más susceptible.

Las causas de deficiencia de vitamina E se resumen en el cuadro 39-6 y a con-tinuación se comenta algunas de ellas.

Causas genéticas

Se han descrito varios defectos genéticos de α-TTP. Aunque son sumamenteraros, muestran el cuadro de deficiencia en todo su esplendor. Este cuadro seconoce como ataxia con deficiencia de vitamina E (ADVE) y sólo se logra controlar con megadosis de la vitamina de 800 a 1 000 mg diarios. La apolipo-proteína B es necesaria para la absorción de lípidos por lo que en la hipobetali-poproteinemia y en la abetalipoproteinemia éstos no se absorben. Al no formarsequilomicrones tampoco se producen LDL ni LVDL

La hipobetalipoproteinemia homocigótica es un defecto que ocasiona recam-bio acelerado de las lipoproteínas cuya concentración plasmática disminuye. Laabetalipoproteinemia es un defecto en una enzima microsomal que no permitela unión de lípidos a la apolipoproteína B y no pasan a la circulación; para mane-jar esta defecto se requiere suplementar 100 a 200 mg/kg peso, es decir unos 5 a7 g de tocoferol, ya que sólo se retiene 1% de la vitamina E ingerida.

En estas dos enfermedades, durante el primer año vida hay esteatorrea, neuro-patía periférica progresiva, reducción del crecimiento, acantocitosis, retinitis pig-mentosa y ataxia progresiva.

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CCuuaaddrroo 3399--55.. CCuuaaddrroo ccllíínniiccoo ddee ddeeffiicciieenncciiaa ddee vviittaammiinnaa EE eenn eell sseerr hhuummaannoo

• Neuropatía periférica• Ataxia espinocerebral• Miopatía del músculo esquelético• Retinopatía pigmentada• Anemia hemolítica

Causas alimentarias

Las dietas muy bajas en lípidos, como las que se prescriben para el tratamientode dislipoproteinemias o de obesidad, automáticamente son pobres en vitaminaE y además hacen más difícil su absorción. Con frecuencia, estas dietas son rela-tivamente altas en AGPI lo que eleva el requerimiento de vitamina E y empeorala deficiencia.

Las fórmulas en las que se utiliza aceite de soya o de maíz como fuente de lípi-dos son ricas en AGPI y, si bien contienen γ-tocol y toco trienoles, no contienenα-tocol. En consecuencia, cuando representan el total de la dieta como ocurre enla alimentación enteral y paraenteral o en el manejo de recién nacidos pretérmi-no o pequeños para la edad gestacional, se produce deficiencia de la vitamina. Siademás en estos casos se administran suplementos de hierro (que es muy oxidan-te) se facilita el estrés oxidativo y se observa anemia hemolítica.


CCuuaaddrroo 3399--66.. CCaauussaass ddee ddeeffiicciieenncciiaa ddee vviittaammiinnaa EE

a) Genéticas- Defectos genéticos de α-TTP- Trastornos en el metabolismo de lipoproteínas: hipobetalipoproteinemia

y abetalipoproteinemia

b) Alimentarias- Dietas muy bajas en lípidos- Uso de fórmulas deficientes en α-tocol o ricas en AGPI en la alimenta-

ción de recien nacidos prematuros o pequeños para la edad gestacional,alimentación enteral o parenteral

c) Alteraciones en la digestión o en la absorción de lípidos- Enfermedades que causan colestasis crónica (cirrosis biliar primaria, atre-

sia de las vías biliares, estasis de los ductos biliares intrahepáticos, síndro-me de Alagille, síndrome de colestasis familiar, hepatitis neonatal idiopá-tica)

- Fibrosis quística e insuficiencia pancreática- Síndrome de intestino corto- Enfermedad de Crohn- Trombosis mesentérica- Seudo obstrucción intestinal- Esteatorrea crónica (síndrome de asa ciega, linfangiectasia intestinal,

enfermedad celiaca, pancreatitis crónica)

d) Desnutrición grave en niños

Causas digestivas

La deficiencia de vitamina E casi siempre es secundaria a mala digestión o malaabsorción de lípidos. Por supuesto, los padecimientos que afectan la digestión delos lípidos y se acompañan de esteatorrea, como la insuficiencia pancreática porpancreatítis o fibrosis quística, el síndrome de intestino corto, la enfermedadceliaca y las hepatopatías colestáticas (al haber insuficiente cantidad de bilis, ladigestión y absorción de lípidos se deprime), pueden reducir casi por completola absorción de la vitamina. La deficiencia secundaria a estos padecimientos tardavarios años, a veces décadas, en presentarse debido a la gran eficiencia con la queel organismo conserva la vitamina, a la existencia de tocoferol en muchos tejidosy a que la dieta no suele ser pobre en vitamina E.

Que se presente o no la deficiencia clínica y su grado depende de la ingestión,absorción y recambio de los tocoferoles, del grado de estrés oxidativo, de la can-tidad de ácidos grasos poliinsaturados que se ingieran y del estado funcional dela red antioxidante (en la que participan enzimas y nutrimentos).

❚ TOXICIDAD

La vitamina E tiene muy baja toxicidad intrínseca en cantidades hasta cien vecespor arriba de la recomendación. Si a ello se agrega que es muy difícil que la dietahumana la contenga en exceso, que la absorción de tocoferoles oscila entre 15 y45% de lo ingerido y que se reduce aun más conforme aumenta la ingestión, sepuede concluir que el exceso de vitamina E por razones dietéticas es práctica-mente imposible. Los límites superiores de consumo (LSC) de vitamina E semuestran en el cuadro 39-3.

El exceso experimental de la vitamina se acompaña de fatiga, debilidad muscular, cólicos, diarrea y reducción en la coagulación Si bien no hay indiciosde que ocurra in vivo, conviene tener presente que in vitro y en ausencia deantioxidantes de fase acuosa, la vitamina E oxidada se convierte en un prooxi-dante que, además, tiene larga vida.

❚ CONCLUSIONES

La vitamina E es un nutrimento indispensable en la dieta ya que es el principalantioxidante de la fase lipídica. La vitamina E neutraliza al ROO• producido en losácidos grasos poliinsaturados que se encuentran en los fosfolípidos de las membra-nas celulares y de los organelos, por lo que protege a la células de daños estructu-rales y diversas consecuencias metabólicas en gran cantidad de reacciones. En el ser©

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humano la deficiencia clínica, así como la ingestión en concentraciones tóxicas esmuy poco frecuente; no obstante, es importante estudiar estos efectos en modelosexperimentales para lograr una mejor comprensión de esta vitamina.

❚ REFERENCIAS

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AACCTTIIVVIIDDAADD FFÍÍSSIICCAA

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Pilar Milke García

❚ INTRODUCCIÓN

Desde hace algún tiempo, se ha relacionado al estrés oxidativo con la fisiopato-logía de muchas enfermedades, pero afortunadamente, las células poseen múlti-ples mecanismos para protegerse del daño causado por los diferentes procesos deoxidación. Algunos componentes de la dieta que se encuentran en las frutas y lasverduras particularmente, son fuentes importantes de agentes protectores. Entreellos, las vitaminas A, C y E, los minerales como el selenio y las sustancias conpropiedades antioxidantes como la luteína, los licopenos, la zeaxantina, la quer-cetina, los isotiocianatos, la catequina, entre otros. No obstante, es importanteverificar su seguridad y potencial antioxidante. En los alimentos también puedenencontrarse sustancias que actúan como prooxidantes. Tal es el caso de los ácidosgrasos poliinsaturados, algunas toxinas derivadas de plantas y microorganismos, yalgunos pesticidas.

Como se ha visto a lo largo de este libro, el estrés oxidativo es una alteraciónen el equilibrio entre la producción de prooxidantes durante el metabolismoaeróbico normal y la síntesis de antioxidantes. Una de las condiciones en las quepodría esperarse un incremento de la actividad oxidativa, dada la gran demandaenergética y consumo de oxígeno, es el ejercicio. Esto, aunado a las otras causas

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de estrés oxidativo que ya se han mencionado como son la radiación, el metabo-lismo de xenobióticos entre los que se encuentran los contaminantes ambienta-les y algunos fármacos, así como una función inmunológica anormal. Si estaoxidación sobrepasa la capacidad antioxidante del organismo se produce dañocelular (en sus lípidos, proteínas y ácidos nucleicos) y todo ello puede repercutiren el rendimiento físico. Esta es la base teórica de la suplementación de antioxi-dantes en el deportista, aunque ciertamente este tema constituye aún un exten-so campo de investigación.

❚ ACTIVIDAD FÍSICA Y ESTRÉS OXIDATIVO

Las reacciones que mantienen un organismo vivo están acopladas de tal maneraque las reacciones que producen energía (procesos de oxidación) están compen-sadas por reacciones que eliminan los subproductos que pueden iniciar el dañoen los órganos y a los tejidos. Durante la práctica deportiva, el metabolismo se veaumentado varias veces, lo que produce una mayor cantidad de especies quími-cas altamente reactivas (ERO, malondialdehído, isoprostanos) que el organismodebe neutralizar. Se ha calculado que el ejercicio aumenta entre 10 y 20 veces elconsumo total de oxígeno en el cuerpo, y que el flujo de este gas en las fibras delmúsculo esquelético periférico activo puede aumentar entre 100 y hasta 200veces. Durante el metabolismo oxidativo, del 0.1 al 0.5% del oxígeno consumidodurante la respiración no se convierte en agua durante la cadena respiratoria, sinoque forma radicales superóxido (véase la sección III).

Las principales fuentes de estrés oxidativo son la producción de superóxidomitocondrial, los mecanismos de isquemia-reperfusión y la autooxidación decatecolaminas (véase la sección III). El ejercicio también genera ERO radicaleslibres en los siguientes casos:

1. Cuando se incrementa la concentración de adrenalina y otras catecolaminas.Se produce ERO durante su metabolismo de inactivación.

2. Durante la producción de ácido láctico en el ejercicio excesivo, ya que eneste proceso se puede convertir un radical libre relativamente débil (su-peróxido) en uno mucho más agresivo (hidroxilo).

3. Cuando se produce una respuesta inflamatoria al daño muscular secundariopor efecto del sobreentrenamiento.

Es bien sabido que el ejercicio tiene muchos efectos benéficos para la salud,pero el ejercicio intenso aumenta el flujo de oxígeno y produce eventos intrace-lulares que pueden aumentar la producción de ERO y ERN. Es por eso que el


estrés oxidativo se asocia a una disminución del rendimiento físico, a la fatiga,daño y dolor muscular, así como a la disminución de la respuesta inmunitaria, ala vulnerabilidad (p. ej., a lesiones) y a los procesos de inflamación. También seha reportado una recuperación más prolongada después del ejercicio intenso, aúnen personas entrenadas. En teoría algunas de las condiciones asociadas al ejerciciointenso, como la hipoxia tisular local, la isquemia-reperfusión, o las temperaturastisulares muy elevadas y el daño inducido por estiramiento muscular, podrían tam-bién aumentar la producción de ERO y producir disfunción mecánica. En el dañopor estiramiento, por ejemplo, el estrés oxidativo aumenta la actividad de la mie-loperoxidasa (MPO) y enzimas productoras de radical superóxido, las xantina oxi-dasas (XO) y superóxido dismutasas (SOD). El daño muscular de inicio tardíoposterior al ejercicio prolongado se relaciona parcialmente a la inflamación vía lainfiltración fagocitaria causada por las ERO. Sin embargo, las ERO inducen no sóloel daño muscular por el ejercicio y la propagación de una respuesta inflamatoriaaguda subsecuente, sino que también favorecen la eliminación del tejido muscu-lar dañado por el propio ejercicio a través de la acción de los neutrófilos, y por esoel potencial papel de los antioxidantes en limitar la respuesta inflamatoria pos-ejercicio puede verse afectada.Así, el entrenamiento a corto plazo podría, en dadocaso, proteger al músculo del daño inducido por ejercicio y de la inflamación.

Después del ejercicio extenuante se producen los siguientes efectos:

1. En las fibras musculares se genera un metabolismo anaeróbico que favorecela acidosis local, lo que promueve la liberación de oxígeno de la hemoglobi-na y de hierro de la transferrina.

2. En los eritrocitos se produce autooxidación de la hemoglobina.3. Se acumulan intermediarios de la peroxidación lipídica en el suero, como el

malondialdehído (MAD) y la LDL oxidada. Además, se forman radicalescon el óxido nítrico y residuos de la tirosina, y aumenta la concentración yauto-oxidación de las catecolamina. Este fenómeno, a su vez, produce nor-malmente superóxido y otros radicales.

4. En el endotelio, el ejercicio intenso agota la reserva celular de ATP, y subomba dependiente de calcio se altera. El aumento intracelular de calcioactiva proteasas dependientes de calcio (calmodulina), que escinden unpéptido de la xantina deshidrogenasa, convirtiéndola en su forma de oxida-sa, la que a su vez genera radicales superóxido e hidroperóxidos.

5. Durante el ejercicio intenso, se incrementa el flujo sanguíneo a los múscu-los, por lo que el hígado, el riñón y el tracto gastrointestinal reciben menosdel 20% del flujo basal. Después del ejercicio, estos órganos se reperfundeny se produce un fenómeno de isquemia-reperfusión, que se caracteriza poruna acumulación de ERO en los órganos reperfundidos.

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Actividad física y estrés oxidativo • 615

Por otra parte, aún cuando un exceso de oxidantes daña los tejidos, una bajaconcentración de éstos actúa como moléculas mensajeras que inician numerososprocesos fisiológicos, y de esta forma es posible que algunos de los efectos bené-ficos asociados al ejercicio estén realmente mediados por oxidantes.

❚ EJERCICIO Y ANTIOXIDANTES

Se ha discutido mucho sobre la importancia real del fenómeno de oxidación en eldeporte, de sus efectos en el rendimiento deportivo y de la necesidad de suple-mentación de antioxidantes, ya que se cree que los antioxidantes del organismo noson suficientes como para neutralizar las especies oxidantes generadas durante elejercicio excesivo. Sin embargo, a la fecha no hay consistencia en los estudios queintentan asociar el estrés muscular, metabólico, hormonal o inflamatorio inducidopor el ejercicio con las concentraciones de antioxidantes, de tal forma que puedeno haber evidencia para recomendar la suplementación de antioxidantes a perso-nas físicamente activas por encima de lo que puede aportar una dieta equilibrada.

Antioxidantes en plasma

El plasma obtenido de la sangre de humanos contiene enzimas como la catalasa, lasuperóxido dismutasa (SOD), la glutatión peroxidasa (GPx), además de gluta-tión (GSH) y pequeñas cantidades de otras moléculas con actividad antioxidan-te. En cuanto a las vitaminas con función antioxidante, la vitamina C o ascorbatoes la más abundante en plasma. Sin embargo, el ascorbato plasmático es uno delos primeros compuestos que se oxidan, y al agotarse se empiezan a oxidar losgrupos tiol, la bilirrubina, el ácido úrico y la vitamina E. Otro mecanismo antio-xidante es el transporte dentro y fuera de los eritrocitos, ya que en estas célulasse producen muchos procesos reductivos.

En cuanto a las proteínas antioxidantes más importantes en el plasma seencuentran la ceruloplasmina, la albúmina, la transferrina, la haptoglobulina y lahemopexina. Las tres primeras secuestran iones hierro y cobre pero generan radi-cales hidroxilo.

Antioxidantes enzimáticos

Se ha sugerido que, para adaptarse al estrés oxidativo generado por el ejercicio,el organismo aumenta las defensas antioxidantes y disminuye la producción deoxidantes y la fuga de radicales durante la fosforilación oxidativa. De hecho, en


los últimos años se ha discutido mucho el efecto que causa el ejercicio sobre lasconcentraciones plasmáticas de antioxidantes y enzimas relacionadas con sumetabolismo.

Se ha encontrado que cuando el ejercicio es prolongado e intenso, puede haberuna reducción transitoria del contenido de algunas vitamina y del estado redoxdel glutatión (GSH) (esto se discutirá más adelante). Por otro lado, se ha demos-trado que con sólo un episodio de ejercicio de suficiente intensidad se estimulala actividad de las enzimas antioxidantes. Así, el ejercicio aagguuddoo incrementa laproducción de superóxido por parte de los neutrófilos aunque el entrenamientode resistencia (ejercicio ccrróónniiccoo), por el contrario, suprime la inducción del supe-róxido (disminuye la concentración de SOD extracelular). Esto puede significarque el entrenamiento de resistencia aumenta las reservas de dicha enzima en lostejidos y, de alguna forma, puede considerarse un índice de entrenamiento deresistencia. Retomando la idea de que el entrenamiento de resistencia de altaintensidad disminuye el estrés oxidativo producido por el ejercicio, se entiendeque después del entrenamiento aumenta el VO2max (el volumen máximo de oxí-geno que el organismo es capaz de utilizar durante el máximo esfuerzo posibleen uno a seis segundos. Es una expresión de la máxima capacidad funcional. Enla práctica, esto se traduce como la capacidad cardiovascular o cardiopulmonar,uno de los factores más asociados al rendimiento físico, o la capacidad de extraeroxígeno a nivel celular), no cambia la actividad de las enzimas oxidativas (SOD,GPx y catalasa) en los eritrocitos y aparentemente los neutrófilos producenmenos anión superóxido. El entrenamiento también disminuye el aumento en laperoxidación en la membrana eritrocitaria. Sin embargo, otros estudios han mos-trado que el eennttrreennaammiieennttoo rreegguullaarr ddee rreessiisstteenncciiaa promueve un aumento tantode la SOD como de la GPx de las células musculares activas, al igual que deGSH, sobre todo cuando el ejercicio es de alta intensidad.

Las controversias respecto a la inducción enzimática radican en que éstainducción puede ser específica para algunas enzimas e, incluso, órganos y depen-de del tipo de ejercicio realizado. Por ejemplo, el entrenamiento puede regular laCu-Zn SOD en tejidos aeróbicos. Sin embargo, en otros estudios se ha visto queni el ejercicio de resistencia ni el agudo aumentan la concentración plasmática deCuZn-SOD, pero el ejercicio agudo después de entrenar sí aumenta la Mn-SOD.Igualmente, se ha visto que sólo después del ejercicio agudo aumenta el nivel deperoxidación lipídica, lo que confirma que las personas que realizan ejerciciointenso tienen mayor estrés oxidativo.

Esta regulación inducida por el entrenamiento aparentemente se limita a losmúsculos esqueléticos altamente oxidativos, y al parece no influye tanto en los sis-temas antioxidantes del corazón o el hígado. Por otro lado, aparentemente laadaptación al entrenamiento de la Mn-SOD y otras enzimas antoxidantes se pro-duce principalmente en las fibras musculares tipo IIa.©

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Todas las enzimas antioxidantes (SOD, catalasa, GPx) requieren elementostraza (Cu, Zn, Mn, Fe, Se) para su biosíntesis o como factores prostéticos, y par-ticularmente cuando la célula se encuentra en estado de estrés oxidativo duran-te el ejercicio agudo y crónico. Aunque estos elementos no se consideranantioxidantes, su papel en la defensa celular contra el estrés oxidativo es impor-tante, y el ejercicio agudo y crónico altera su metabolismo.

Antioxidantes no enzimáticos (vitaminas y glutatión)

La vitamina E es un antioxidante intramembranal y por tanto, un estabilizadorde la membrana celular. En los últimos 40 años se ha suplementado con vistas amejorar el desempeño deportivo, disminuir el daño muscular inducido por ejer-cicio y maximizar la recuperación. Sin embargo, a la fecha no existen evidenciasconcluyentes. Aún con dosis varias veces mayores a las recomendadas, las concen-traciones tisulares y séricas de vitamina E apenas aumentan moderadamente. Dehecho, la mayoría de la evidencia parece no mostrar efectos significativos de lasuplementación de vitamina E en el desempeño, entrenamiento o velocidad derecuperación posejercicio ni en deportistas recreativos ni profesionales. La defi-ciencia de vitamina E, sin embargo, exacerba la producción muscular y hepáticade radicales libres y aumenta la lipoperoxidación y disfunción mitocondrial enratas sometidas a ejercicio. Por otro lado, tampoco se ha visto que el ejercicio alte-re significativamente la concentración de esta vitamina en suero o tejidos.

En cuanto a la vitamina C, tampoco se ha logrado establecer claramente suimportancia en la protección contra el estrés oxidativo durante la práctica deporti-va. Su principal función es el reciclaje del radical de vitamina E (radical tocoferilo)para formar nuevamente vitamina E (véase Sección V). Aunque su efecto apa-rentemente es más notable en el corazón que en otros órganos, aún así no evitala disminución en el tiempo de resistencia y alteraciones mitocondriales causadaspor la deficiencia de vitamina E.

Tanto el ayuno-realimentación como el ejercicio exhaustivo influyen en laconcentración de GSH en el hígado y el músculo esquelético, y estos cambiospueden estar controlados por la síntesis hepática de GSH y su liberación debidoa una situación hormonal (en ratas ejercitadas la insulina es menor y el glucagónmayor que en las ratas en reposo). El GSH reducido tiene múltiples funciones enel proceso de protección de tejidos del daño oxidativo durante el ejercicio. Redu-ce a los peróxidos de hidrógeno y orgánicos, secuestra al oxígeno singulete y alradical hidroxilo, y reduce los radicales de tocoferol directa o indirectamente através del radical semideshidroascorbato, previniendo la lipoperoxidación. ElGSH puede reciclarse a expensas de NADPH, una fuente relativamente ilimita-da de equivalentes reductores. El 90% del GSH se sintetiza de novo en el híga-


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do, aunque puede movilizarse a otros tejidos como el músculo esquelético, si esque si ve incrementado el estrés oxidativo. El GSH hepático disminuye con elejercicio, pero el GSH y el glutatión total (GSH más glutatión oxidado, GSSG)aumenta en el músculo ejercitado de acuerdo con la intensidad del ejercicio, aun-que hay controversias al respecto. Poco se sabe de las consecuencias de una defi-ciencia de GSH cuando existe un estado de estrés oxidativo inducido porejercicio en varios tejidos; sólo se sabe que su depleción aumenta, lógicamente, laproducción de ERO, aumentando a su vez la lipoperoxidación y activación deenzimas antioxidantes.

Por último, la suplementación con tioles puede ser beneficiosa durante el ejer-cicio agudo o crónico, y para proteger del daño de isquemia-reperfusión, por loque se ha utilizado N-acetilcistenína, GSH libre y GSH acetil monoéster.

Existen evidencias de que la suplementación de antioxidantes combinada conel tratamiento antitiroideo con metimazol puede ser útil en la disminución delestrés oxidativo.

Las discrepancias en los diversos estudios sobre el uso de antioxidantes y vita-minas en la dieta para reducir el daño muscular inducido por el ejercicio refle-jan la diversidad de antioxidantes estudiados, la naturaleza (tipos) y tiempos delejercicio (duración; suplementación antes, durante o después del ejercicio;entrenamiento versus competencia), la edad, la condición física de las personasestudiadas y la metodología para evaluar el estrés oxidativo. Existe evidencia con-troversial en cuanto a que la suplementación de antioxidantes pueda mejorar eldesempeño o rendimiento deportivo, aunque muchos estudios sugieren que losantioxidantes disminuyen el daño inducido por ejercicio, y así la intervención con antioxidantes es más a largo que a corto plazo.

En conclusión, la evidencia de que la suplementación dietética con antioxidan-tes mejora la capacidad de ejercicio es limitada, y además no se ha logrado esta-blecer que el ejercicio vigoroso incremente la necesidad de aumentar el consumode antioxidantes en la dieta, por lo que existe una clara necesidad de continuarlos estudios alrededor de este tema. Los esfuerzos deben dirigirse hacia el esta-blecimiento de las necesidades individuales de los deportistas y para promoveruna dieta alta en antioxidantes.

❚ MÉTODOS DE MEDICIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVODURANTE EL EJERCICIO

Poco estudios miden directamente la cantidad de radicales libres generadosdurante el ejercicio, debido a la vida media tan corta que tienen (típicamenteentre 10-6 y 10-12 seg); así como por falta de metodologías sofisticadas para medireste fenómeno. Por ello, los investigadores en este tema utilizan mediciones indi-


rectas para tratar de establecer al grado de estrés oxidativo al que está sometidoun tejido. La determinación de los niveles de peroxidación lipídica se ha utiliza-do como el principal indicador de radicales libres inducidos por la práctica depor-tiva, sabiendo que éstos alteran e inactivan los complejos enzimáticos, dañan elDNA y RNA y promueven las mutaciones. El malondialdehído (MDA) en la san-gre y el pentano en el aliento son indicadores indirectos de la peroxidación lipí-dica. Aún así, no todos los estudios demuestran que existe un aumento en estosmarcadores, dada la variación intersujeto. Sin embargo, algo claro es que se reco-mienda utilizar más de un índice de lipoperoxidación durante el ejercicio comolos dienos conjugados y lipoperóxidos. En cuanto a la degradación de proteínas,enzimas y ácidos nucleicos, la 8-hidroxi-desoxiguanosina (8-OHdG u 8oxod-Guo) urinaria es un marcador estable de DNA sin reparar, elevado de maneraimportante después de un maratón.

La medición de radicales libres, daño a lípidos y DNA, así como el estadoredox, por ejemplo, la concentración de glutatión oxidado contra reducido(GSH/GSSG), son también mediciones del estrés oxidativo, al igual que los sus-tratos reactivos del ácido tiobarbitúrico (TBARS) y la mieloperoxidasa (MPO).

El daño tisular e inflamación local pueden detectarse con un ejercicio de altaintensidad (60% del VO2max), observándose leucocitosis (neutrocitosis) y unaumento en la activación neutrofílica.

❚ EJERCICIO Y ENVEJECIMIENTO

Desde hace mucho tiempo se sabe que el ejercicio tiene muy variados beneficiosfísicos, metabólicos y psicológicos. El ejercicio puede también tener un papelprofiláctico en la sarcopenia por edad, ya que el estrés oxidativo del músculo enpersonas mayores está relacionado con la generación de ERO y cambios en el sis-tema de defensa de antioxidantes. El estrés oxidativo aumenta en corazón e híga-do conforme la edad y se sabe que las ERO están implicadas en el proceso delenvejecimiento.

Los beneficios del ejercicio regular en edades avanzadas incluyen una dismi-nución en el riesgo de enfermedades cardiovasculares, cáncer, osteoporosis y dia-betes. Los mecanismos implicados se relacionan con la disminución del tejidoadiposo, la alteración de los perfiles lipídicos y hormonales, las adaptaciones delas proteínas receptoras y transportadoras, y el mejoramiento en el acoplamientomitocondrial. Además como se ha mencionado aquí, existen algunas evidencias(aunque controversiales) de que se podría mejorar el sistema de defensa antio-xidante. El ejercicio regular, además, disminuye los signos del envejecimiento(deterioro asociado al envejecimiento) e incrementa la media de la esperanza devida en ratas, alrededor de un 10%. Algunos tipos de ejercicio también mejoran


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la función del músculo esquelético y promueven la adaptación vascular y el mante-nimiento de la masa muscular. Por otro lado, el ejercicio agudo en personas mayoresno entrenadas puede aumentar el estrés oxidativo, aunque las sesiones moderadasrepetidas inducen adaptaciones que previenen el daño oxidativo masivo.

De manera aparente, a pesar de la producción de ERO, el músculo en personasmayores tiene una disminución en la expresión génica de enzimas antioxidantes,quizás por una disminución en la señalización celular. Aunque hay una modifica-ción en la producción de las enzimas antioxidantes durante el envejecimiento, nose ha logrado definir si el ejercicio modifica la expresión de estas enzimas. El ejer-cicio no exhaustivo tiene, por eso, importantes beneficios, ya que induce un estrésoxidativo ligero que estimula la expresión de ciertas enzimas antioxidantes, aun-que siempre se requieren entrenamientos repetidos para lograr este efecto. Elenvejecimiento disminuye la adaptación natural del organismo al entrenamientocon respecto a las enzimas antioxidantes, y por ello se plantea la necesidad de lasuplementación de antioxidantes exógenos en estas circunstancias. El envejeci-miento, además, aumenta la incidencia de daño muscular y respuesta inflamato-ria y los mecanismos de reparación muscular y regeneración disminuyen.

En la actualidad, se piensa que las enzimas hepáticas y miocárdicas antioxidan-tes disminuyen con la edad, mientras que las enzimas relacionadas con el meta-bolismo del GSH en el corazón aumentan de manera significativa. No obstantepoco es lo que se conoce con respecto al entrenamiento físico en estos sistemashepáticos o miocárdicos, aunque se ha sugerido que el ejercicio puede causar res-puestas adaptativas en la glutatión peroxidasa.

Debido a que el ejercicio extenuante aumenta el flujo de oxígeno muscular yproduce eventos intracelulares relacionados con el daño oxidativo, se discuten losbeneficios del ejercicio extremo o agudo en personas mayores, ya que son mássusceptibles al daño oxidativo por cambios estructurales y bioquímicos que faci-litan la formación de ERO. Existen aún muchas preguntas críticas por responder:si el ejercicio modula la expresión génica de enzimas antioxidantes en la edadavanzada, si el ejercicio previene la sarcopenia, si se debe suplementar a estas per-sonas cuando son físicamente activos y otras cuestiones.

❚ CONCLUSIONES

El ejercicio extenuante se caracteriza por un aumento en el consumo de oxígenoy una alteración en la homeostasia prooxidante-antioxidante que modifica elestado redox celular. Durante el ejercicio se han identificado al menos tres rutasmetabólicas como fuentes principales de generación intracelular de radicaleslibres: la cadena respiratoria mitocondrial, el metabolismo de xantina oxidasa ylos polimorfonucleares.


Aunque se sabe que las ERO disminuyen la reserva de vitaminas antioxidan-tes y GSH y causan daño oxidativo en el músculo ejercitado o en ejercicio, elefecto del entrenamiento en la inducción de enzimas antioxidantes es diferencial:en algunos músculos aumenta la actividad de ciertas enzimas, mientras que enotros la disminuye. La depleción de los sistemas de antioxidantes aumentan lavulnerabilidad de varios tejidos y componentes celulares a las ERO. Sin embargo,los sistemas enzimáticos y no enzimáticos tienen gran versatilidad y adaptabili-dad en respuesta al ejercicio agudo y crónico.

Debido a que el ejercicio exhaustivo, agudo y crónico, aumentan el consumode antioxidantes, se puede suponer que la suplementación de antioxidantes espe-cíficos puede ser beneficioso. No obstante, aún se cuestiona si la suplementacióncon antioxidantes en la dieta en las personas que realizan ejercicio es deseable.

❚ EL FUTURO

Se requiere llevar a cabo más investigaciones con respecto a la utilidad de lasuplementación antioxidante y su precisión durante la práctica deportiva tantoprofesional como recreativa, así como sobre el impacto en la suplementación cró-nica y sus efectos, tanto positivos como negativos, sobre el estado redox celular,así como sus efectos secundarios o contraproducentes. Hay que ahondar en losbeneficios del ejercicio y suplementación de antioxidantes durante el envejeci-miento, y finalmente estudiar la interacción de los antioxidantes con los ácidosgrasos poliinsaturados y el hierro.

❚ REFERENCIAS

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AAcantocitosis, 607Acatalasemia, 196Aceites, 135Acetaminofén, 263Acetato de desoxicorticosterona, 246Acetil colinesterasa, 369L-acetil-carnitina, 368N-acetil-cisteína, 371N-acetil-β-D-glucosaminidasa, 249Acetilación, 148, 150, 155, 159N-acetilcisteína, 338Ácido(s)

abscísico, 516acetilsalicílico, 116araquidónico, 69, 78, 143, 361, 397ascórbico, 30, 279, 287, 294, 324, 508, 579,

581aspártico, 108, 113benzoico, 312cafeico, 304carboxílicos, 304cevitámico, 581

cinámicos, 304, 312cítrico, 452clorogénico, 305criptoclorogénico, 305D-araboascórbico, 581dicetogulónico, 581docosahexaenoico, 439eritórbico, 581fenólicos, 304ferúlico, 304fosfatídico, 512γ-amino butírico, 519galacturónico, 304gálico, 304glucurónico, 304D-glucurónico, 306graso(s), 63, 136

araquidónico, 137insaturados, 293linoléico, 137linolénico, 137monosaturados, 137omega, 380poliinsaturados, 40, 137, 439, 602

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NNOOTTAA:: Los números de página en nneeggrriittaass indican cuadros y en cursivas corresponden a figuras

ÍÍNNDDIICCEE

hexurónico, 580, 581hidroxicinámico, 305hipobromoso, 32hipocloroso, 32, 75, 586iboténico, 369isoascórbico, 581isoclorogénico, 305kaínico, 369L-ascórbico, 581L-deshidroascórbico, 581L-xiloascórbico, 581láctico, 614linoleico, 143, 202linolénico, 202, 439lipoico, 281mercaptúrico, 258neoclorogénico, 305nítrico, 4663-nitropropiónico, 369nitroso, 466nucleicos, 30, 34, 37, 100, 124, 460orgánicos, 304oxálico, 112p-cumárico, 304p-hidroxibenzoico, 304quinolínico, 369retinóico, 566, 569salicílico, 196, 514shikímico, 306sináptico, 304sulfénico del glutatión, 42sulfhídrico, 28tiobarbitúrico, 323, 478, 620tricarboxílicos, 34úrico, 30, 86, 100, 466vainillínico, 304

Acilcarnitinas, 587Acilglicerol, 380Aclorhidria, 565Aconitasa, 169Acroleína, 130Acuaporinas, 509Adenina (A), 77, 85, 87, 120, 224, 462Adenocarcinoma de pulmón, 248Adrenodoxina, 64Agliconas-flavonoides, 306AIBN (azabisisobutironitrilo), 20AINE (antiinflamatorios no esteroideos), 116Alanina, 42, 180Alantoína, 86Albúmina, 100, 616Alcanos, 143Alcoxilo, 122, 275Aldehídos, 35, 143, 286, 566

Aldehidooxidasa, 85Alelopatía, 521Aleurona de semillas, 518Alilbenceno, 305S-alilcisteína, 368Alopurinol, 400Alquilo, 275Alquilperóxidos, 111Amikacina, 430Amiloides, 179Aminas, 3043-amino-1,2,4-triazol, 185Aminoacídicos, 255Aminoácidos, 62, 206

alifáticos, 110066azufrados, 110066de proteínas, 105excitadores, 373

Aminoglucósidos, 430Aminotriazol, 403AMPA-kainato, 372Anemia

hemolítica, 236perniciosa, 596

Aneuploidías, 161Aneurisma aórtico abdominal, 245Angiotensina II, 246, 408Anión, 3Ankirina, 494Anoxia, 526Antiapoptóticos, 238, 480Antibiótico, 546Antígenos de leucocitos humanos, 244Antiinflamatorios, 238Antimicina, 57, 335

A, 55Antioxidantes, 33, 181, 211, 230, 238, 271,

319, 332200, 352, 586cáncer y, 355endógenos, 322, 361enzimáticos, 326, 616fenólicos, 355intracelulares, 324naturales, 291, 443no enzimáticos, 326, 618

Antocianidinas, 305, 308Antocianinas, 306Anuros, 534AO (aldehidooxidasa), 85AOX (oxidasa alternativa), 510AP1 (proteína activadora 1), 492Apocarotenales, 565Apocarotenoles β, 565Apolipoproteína, 99

626 • Acilcarnitinas/Apolipoproteína (Índice)

B, 607Apoptosis, 158, 228, 298, 454, 477Arabinosa, 304L-arabinosa, 306Arginina, 110066, 112L-arginina, 41, 400, 423Arqueobacterias, 185Arsénico (As), 461Arteriosclerosis, 181Artritis reumatoide, 69Asbestosis, 275Ascorbato, 31, 40, 277, 361, 443Asparragina, 108Aspartato, 371Aspartil, 112Asplenia, 237Astaxantina, 563, 568Astrocitos, 281Ataxia progresiva, 607Ateroesclerosis, 143, 244, 471Autooxidación, 361Auxinas, 519Azabisisobutironitrilo, 20Azida, 75

BBacterias, 73, 185

anaerobias, 202Barrera

hematoencefálica, 241macromolecular, 416

Benzidina, 38Benzopireno, 355Betaína, 40BHA (hidroxianisol butílico), 355BHT (hidroxitolueno butílico), 355Bilirrubina, 100, 233, 236, 240, 575Biliverdina, 33, 233, 240Blastocisto, 547Bleomicina, 399, 410Bradicinesia, 362Bromación, 11Bromoperoxidasa, 38, 42Bromuro de trifenilmetano, 4Broncoconstricción, 466Burkholderia cepacia, 80Butionina sulfoximina, 406, 411

CCadena respiratoria, 50, 331

mitocondrial, 49, 50, 331, 351Calmodulina, 41, 114, 512, 615

Calpaínas, 365Cáncer, 248, 332, 454, 469

de próstata, 297hereditario, 348mamario, 180, 227, 297

Cantaxantina, 563, 568CAR (carotenoides), 281Carbohidratos, 377Carbonilitos, 6Carbonilos, 116Carbono

α, 114alílico, 273aromático, 304β, 114piramidal, 8

Carboxilo, 174Carcinogénesis, 119, 352, 469Cardiolipina, 265, 552Cardiomiocitos, 488, 553Cardioprotección, 246Carnitina, 586, 587Caroteno, 561

α, 562, 564β, 273, 563dioxigenasa, 566

Carotenoides, 269, 273, 561Carotenos, 443Caspasas, 479CAT (actividad de la catalasa), 527, 543Catabolismo de purinas, 86Catalasas, 37, 183, 184, 235, 398, 402, 497,

506, 550Catalasas-peroxidasas, 186, 190Catecolaminas, 361, 397Catepsina, 444Catequina, 308, 613Células

aerobias, 234amadrinas, 436animales, 136apicales, 519β, 181bipolares, 436cancerosas, 226de hepatoma, 226de Kupffer, 73, 339, 378del músculo, 82donadoras, 547endoteliales, 82, 336, 416epiteliales, 82, 210eucarióticas, 390fagocíticas, 73, 197fotorreceptoras, 442©

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Apoptosis/Células • 627

hepáticas, 336, 383inmunológicas, 352interplexiformes, 436linfoides, 228neoplásicas, 229nerviosas, 361, 436neuronales, 359pilosas, 427renales humanas, 286

Ceramida, 482Ceruloplasmina, 100, 284, 616Cetocarotenoides, 563Chalconas, 306Chasmagnathus granulata, 528, 529Choque térmico, 172Cianobacterias, 25Cianocobalamina, 31Ciclooxigenasas, 137, 351, 417Ciclosporina, 407Cirrosis, 265, 377

alcohólica, 381Cisplatino, 246, 408, 427Cisteína, 42, 102, 105, 110066, 115, 139, 201,

253, 260L-cisteína, 255Cisteinil-glicina, 258Citocina (C), 120, 340

proinflamatoria, 381Citoplasma, 551Citosol, 26, 249, 322, 390Coenzima Q, 34Colagenasa, 338Colágena, 586Colesterol, 63, 202, 244, 472

ésteres del, 296Colinesterasa, 366Colorimetría, 144CoPP (protoporfirina de cobalto), 243COX (ciclooxigenasas), 351Criptoxantina, 564Cromatografía, 144

gaseosa-espectrometría de masas, 285Crotonaldehído, 130

DDCF (dicloroflueresceína), 334Deferoxamina, 399, 400, 402Dehidroascorbato reductasa, 508DEN (dietilnitrosamina), 356Descarboxilación, 113Desferrioxamina, 371Desfosforilación, 490Deshidroascorbato, 581

2’-desoxiguanosina, 125Desoxiadenosina, 131Desoxicitidina, 1312-desoxiguanosina, 129Desoxiribosa, 469Dexametasona, 228DHA (ácido dehidroascórbico), 280Diabetes, 181, 247

mellitus, 469Diacetato de fluoresceína, 38Diacilglicerol, 77, 78Diasteroisómeros, 129Dicloroflueresceína, 334Dicromato de potasio, 236, 249Dietilmalato, 263Dietilnitrosamina, 356Difenilhidrazina, 39Difenoles, 34Dihidroetidio, 545Dihidroxiácido deshidratasa, 35Dihidroxifenilalanina, 39Dihidroxilación, 310Dimetiltiourea, 400, 402, 404Dinitrato de isosorbida, 428Dinitrógeno, 25Dinucleótido

adenina nicotinamida, 379de nicotinamida, 74, 85, 462

Diosmetina, 308Dioxígeno (O2), 25, 61, 194Dioxinas, 463Diquat (DQ), 462Dislipoproteinemias, 608Disulfiram, 352Ditrieritrol, 88DNA, 119, 127, 150, 450DOCA (acetato de desoxicorticosterona), 246Donepezil, 366Dopamina, 362Doxiciclina, 547DTT (ditrieritrol), 88

EEcosistemas, 459Ejercicio

agudo, 617crónico, 617exhaustivo, 618físico, 300regular, 620

Elastosis, 293Electroatractores, 10Electrodo de Clark, 27

628 • Ceramida/Electrodo de Clark (Índice)

Electrorretinograma, 442Enatiómeros, 597Encefalina, 369Endocitosis, 296Endotoxinas, 286, 423Enfermedad(es)

alcohólica hepática, 69cardiacas, 230celiaca, 609coronarias, 296crónico degenerativas, 468de Alzheimer, 230, 248, 325, 359, 365de Huntington, 248, 359, 368de Kawasaki, 245de Ménière, 430de Parkinson, 55, 180, 248, 325, 359, 362de porfirias, 235de Wilson, 377, 388del desorden osteogénico de Shionogi, 283granulomatosa crónica, 35hepática, 265

alcohólica, 379isquémicas, 269neurodegenerativas, 179, 248, 359

de Parkinson, 451neurológicas, 230renales, 245vasculares, 180virales, 229

Envejecimiento, 119, 447, 537, 620Eosinófilos, 73Epicatequinas, 308Epigenética, 147, 157Epoxicarotenoide, 570Epoxixantofilas, 562ERN (especies reactivas de nitrógeno), 395,

487ERO (especies reactivas de oxígeno), 137, 395,

487, 501, 525, 543Esclerosis

amiotrófica lateral, 550lateral amiotrófica, 179, 180, 359, 371

Escorbuto, 584Espermatogénesis, 211Espiroimino-dihidantoínas, 129Esteatohepatitis

alcohólica, 380no alcohólica, 69, 380, 384

Esteatosis, 377Estereoisómeros, 597Ésteres gálicos, 308Esteroides, 63Estreptidina, 432Estreptomicina, 430, 432

Estrés, 119abiótico, 502, 515biótico, 502, 515mecánico, 506oxidativo, 69, 97, 120, 147, 230, 319, 435,

450, 477, 506, 532, 613envejecimiento y, 447posisquémico, 337

salino, 506Etanol, 116, 185, 336, 381, 581Etileno, 143Etopóside, 228Eucariotas, 185Excitotoxicidad, 484

coclear, 429Explosión oxidativa, 75, 352, 513

FFactor

2 relacionado con NF-E2, 496activador de plaquetas, 440de crecimiento, 226

de fibroblastos, 416del endotelio vascular, 488derivado de plaquetas, 416epidérmico, 488neural, 230neuronal, 488vascular endotelial, 333

de despolimerización de actina, 520de necrosis tumoral, 68, 228, 263, 480de transcripción, 228nuclear, 228

Fenilalanina, 102, 108Ferredoxina, 508Ferritina, 100, 238, 284, 399, 497Fibroblastos, 226, 335, 378, 379, 416, 488Fibropatía, 28Fibrosis, 69, 377

hepática, 378, 387quística, 609

Flavina, 31, 76, 87, 187, 224hidroxilasa, 339semiquinona, 397

Flavohemoglobinas, 43Flavonas, 306, 308, 312Flavonoides, 305Flavonoles, 306, 308Flavononas, 312Flavoproteínas, 34Fluoroclorocarbonos, 30Fluorocromo, 334Formilquiniurenina, 108©

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Electrorretinograma/Formilquiniurenina • 629

Fosfatidilcolina, 78Fosfatidilinositol-4,5-difosfato, 78Fosfoinosítidos, 512Fosfolipasa, 77

D, 519Fosforilación, 148, 150, 490

oxidativa, 331, 335, 452Fotoquimioterapia, 32Fotorrespiración, 28, 504Fotosensibilidad, 462Fructosa-1,6-difosfato fosfatasa, 38

GGABA (ácido γ-amino butírico), 519D-galactosa, 306β-galactosidasa, 456Galantamina, 366Gamaglutamil transpeptidasa, 528Gasterópodos, 526, 534Gen de longevidad, 448Genoma, 546

eucariótico, 148, 156heterocromatina en, 154

Gentamicina, 403, 427, 430Geroftalmia, 573, 596Gerontogenes, 448Ginkgo biloba, 365Glicerol, 40, 406Glicina, 42, 110066, 253Glucación, 107, 116Glucagón, 68Glucógeno, 79Glucolato oxidasa, 504Glucosa, 181, 247, 304, 367Glucósidos, 306Glucosilación, 107, 116, 174Glutamato, 253, 262, 367, 371L-glutamato, 255Glutamil, 112γ-glutamilciclotransferasa, 253γ-glutamilcisteína, 551γ-glutamiltranspeptidasa, 253Glutamina, 203Glutarredoxina, 260, 281, 515Glutatión, 40, 253, 400, 551

mitocondrial, 260, 264, 336oxidado, 201, 269peroxidasa, 142, 201, 336, 355, 398, 451,

507, 551preoxidasa, 54reducido, 142, 201, 269, 371, 451reductasa, 226, 508S-transferasas, 142, 451, 528

S-α-transferasa, 382sintetasa, 309

GPx (enzima glutatión peroxidasa), 201, 226,528

Gravitropismo, 519GSH (glutatión), 201, 253GSSG (glutatión oxidado), 201Guanina (G), 85, 120Gulonolactona oxidasa, 279, 579

HHalobacterias, 562Halocintiaxantina, 570Halogenación, 14Hemocromatosis, 353, 377, 388Hemoglobina, 49, 234, 406Hemooxigenasa, 62, 233, 463Hemoperoxidasas, 37Hemopexina, 616Hemoproteínas, 192, 234, 397Hepatitis

A, 386alcohólica, 384B, 353, 377C, 353, 377crónica, 377fulminante, 386viral, 386

Hepatocarcinoma, 382Hepatocitos, 255, 378, 381, 488Hepatoma de Novikoff, 219Hepatomegalia, 237Hepatopatía

alcohólica, 332, 336colestática, 609

Hepatotoxinas, 391Heptametoxiflavona, 313Herbicidas, 461Herbifrugívoras, 580Heteroátomos, 16Heterocromatina, 160, 161Heterodímeros, 483Heterólisis, 193Hexaclorobenceno, 462Hexachloroetano, 465Hexoquinasas, 313Hexosas, 37Hibridoma de células T, 226Hidrocarburos policlorados, 463Hidrolasas, 313Hidrólisis ácida, 112Hidroperóxidos, 113, 122, 137, 184, 323Hidroxianisol butílico, 355

630 • Fosfatidilcolina/Hidroxianisol butílico (Índice)

Hidróxido, 19Hidroxikinurenina, 370Hidroxilasas, 313, 3334-hidroxinonenal, 137, 144, 286, 350, 381Hidroxitolueno butílico, 355Hidruro de tributilestaño, 20Hipercarotenosis, 575Hipercolesterolemia, 418Hiperglucemia, 441Hiperglucemia crónica, 469Hiperlipidemia, 384Hipermetilación, 150Hiperoxia, 234, 246Hiperuricemia, 91Hipocatalasemia, 197Hipocondría, 590Hipometilación, 151Hiporreflexia profunda, 607Hipoxantina, 85, 396Hipoxia, 86, 91, 234, 246, 331, 442, 526Hirsuteno, 20Histidina, 102, 115, 139Histonas, 150, 153HLA (antígenos de leucocitos humanos), 244HO (hemooxigenasa), 233Holoenzima, 255Homeostasia celular, 450Homohexámeros, 192Homotetrámeros, 192

IIctericia, 386IDS (ingestión diaria sugerida), 573, 605IL (interleucina), 219, 227, 247Ileocolitis, 212Inmersión e hipoxia, 530Inmunoglobulinas G, 74Inositoltrifosfato, 78Insecticidas

organoclorados, 461organofosforados, 461

Interleucina, 68, 219, 298, 417Isocumarinas, 305Isoenzimas, 203Isoflavonas, 306, 313Isoleucina, 35, 110066Isoprostanos, 420Isotiocianatos, 613Isquemia, 234, 241, 336

cerebral, 332

LLDL (lipoproteínas de baja densidad), 309

Leucocitos, 397eosinófilos, 32neutrófilos, 32polimorfonucleares, 338

Leucoma, 574Licopeno, 563, 564, 570, 613Lindano, 462Linfadenitis, 80Lípidos, 100, 135, 377

insaturados, 30microsomales, 465oxidados, 243peroxidación de, 137, 144, 399peroxidados, 286, 545poliinsaturados, 135

Lipoalcoxilos, 43Lipofilicidad, 463Lipohidroperóxidos, 111Lipooxigenasa, 34, 137Lipoperoxidación, 43, 68, 101, 107, 130, 137,

138, 350, 387, 462, 614, 620Lipoperóxidos, 32, 139, 620Lipoperoxilos, 43Lipopolisacáridos, 74, 117733, 243, 402Lipoproteínas, 135

de alta densidad, 211de baja densidad, 211, 588, 599de muy baja densidad, 599oxidadas, 111

Lipoxigenasa, 397Lisil hidroxilasa, 586Lisina, 110066, 112, 139Longevidad, 447LPS (lipopolisacárido), 74, 173, 243LPx (lipoperoxidación), 462Luteína, 272, 563, 613

MMacrófagos, 73Malonaldehído, 130, 286, 322Malondialdehído, 107, 137, 350, 399, 588, 620Malonilcoenzima A, 306Manganeso catalasas, 192MAO (monoaminooxidasa), 361MDA (malondialdehído), 107mDNA (DNA mitocondrial), 450Melatonina, 365, 371Memantina, 366Mesozeaxantina, 272Metahemoglobina, 34, 43Metales, 461Metaloides, 461Metaloproteínas, 100©

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Hidróxido/Metaloproteínas • 631

Metaloproteinasas, 338Metalotioneína, 529Metamioglobina, 43Metano, 11Metil-jasmonato, 516N-metil-D-aspartato, 363Metilación, 148, 150Metilglioxal, 35Metimazol, 619Metionina, 102, 105, 110066, 113, 114, 139

oxidación de, 109sulfóxido reductasas, 102

Miastenia, 607Micrococcus luteus, 185Microcuerpos, 503Micronutrimento, 211Microorganismos, 27, 194, 563Mieloperoxidasa, 42, 79, 615, 620Mimetics, 545Miocardiopatías, 180, 287Miocarditis, 230Miofibroblastos, 379Mioglobina, 234, 406Mitocondria, 26, 35, 49, 170, 322, 334, 339,

397, 503mNOS (óxido nítrico sintetasa mitocondrial),

57Mo (molibdeno), 85Molibdeno, 85, 87MOM (monooxigenasas microsomales), 63Monoacilgliceroles, 599Monoaminooxidasa, 361Monodehidroascorbato, 508

reductasa, 508Monofosfato de guanosina cíclico, 287, 438Monooxigenación, 66Monooxigenasas, 61

microsomales, 63Monosulfóxido, 110

Monóxido de carbono, 33, 465de nitrógeno, 29, 41

Mórula, 547Motoneuronas, 550MPO (mieloperoxidasa), 615Msr (metionina sulfóxido reductasas), 102Mutagénesis, 119Mycobacteria, 80Myotis lucifugus, 534Mytilus edulis, 536

NNADH (nicotinamida adenín dinucleótido

reducido), 49Naftalenos, 30Naproxeno, 116Necrosis, 383, 454, 479Nefrotoxicidad, 236

por ciclosporina, 407por cisplatina, 408por gentamicina, 403

Neolignanos, 305Neuropatía

demencial, 365humana, 360

Neurotoxicidad, 367Neurotoxinas, 373Neutrófilos, 73NGF (factor de crecimiento neuronal), 488Nicotiana tabacum, 31Nimesulida, 116Nitrato, 25, 403

reductasa, 517Nitritos, 4034-nitro-β-caroteno, 273Nitrógeno, 17, 119

especies reactivas de, 57, 400, 4878-nitroguanina, 127Nitroprusiato de sodio, 429Nitrosaminas, 297Nitrosativo, 359S-nitrosilación, 225S-nitrosoglutatión, 42Nitrosoperoxocarbonato, 42Nitrotirosinas, 352NMDA (N-metil-D-aspartato), 363NO (óxido nítrico), 91Nocardia, 80Normoxia, 332, 442NOS (óxido nítrico sintasa), 91NOX (enzimas NADPH oxidasas), 73, 488Nucleoproteínas, 380Nucleótidos, reparación por escisión de, 158Nutrición, 291, 571Nutrimento, 571, 580

OOftalmoplejía, 607Olefinas, 30Oligonucleótidos, 401

632 • Metaloproteinasas/Oligonucleótidos (Índice)

Oncogenes, 155, 348Oreochromis niloticus, 529Organelos, 503

celulares, 172Ortodihidroxiestructura, 310Ortodihidroxifenil, 310Osteoblastos, 281Otala lactea, 535Otitis media, 428Oxidación, 17, 545

de xenobióticos, 478del ascorbato, 281productos de la, 326

Oxidantes, 181, 319, 332200electrofílicos, 102

Oxidasa, 235alternativa, 510de xantina, 34

Óxido de deuterio, 32de hierro, 26nítrico, 29, 57, 69, 91, 122, 287, 396, 415,

440en el oído, 427endotelial, 423inducible, 423isoforma inducible, 396sintasa, 91, 423sintasa inducible, 338, 417sintetasa endotelial, 287sintetasa mitocondrial, 57

nítrico, 423Oxidorreducción, 6, 184Oxidorreductasa, 313

glutatión peroxidasa, 203Oxígeno, 17, 119, 319

atmosférico, 501atómico, 29especies reactivas de, 29, 73, 334, 347, 487molecular, 501singulete, 29, 31, 54, 75, 98, 128

Oxiradicales, 461Oxitotoxicidad, 5528-oxo-desoxiadenosina, 125Oxocarotenoides, 5628-oxodGuo, 1272-oxoglutarato, 2628-oxogua, 2852-oxohistidina, 1085-oxoprolina, 256Ozono, 29, 299, 466

PPancreatítis, 609Parametoxianfetamina, 223Paraquat (PQ), 462Parkinsonismo, 363Parvaalbúmina, 369PDGF (factor de crecimiento derivado de pla-

quetas), 488Penicilina, 430Peroxidación, 137

lipídica, 140, 286, 321, 528, 529Peroxidasas, 184, 187, 194, 235

nomenclatura de, 118844Peróxido, 5

de hidrógeno, 29, 36, 54, 75, 122, 169, 183,334, 335, 419, 487, 501

lipídico, 213orgánico, 4

Peroxil dimetilado, 461Peroxinitrito, 29, 41, 57, 91, 108, 122, 125,

170, 203, 334, 342, 349, 368, 383, 418, 432,440

Peroxiredoxina, 507Peroxirradicales, 122Peroxirredoxinas, 194, 336, 552Peroxisomas, 197, 259, 509, 510Phorbol myristate acetate, 77Phrynops Hilarii, 528Pirimidinas, 469Pirimidopurinona cíclica, 131Piroxicam, 116Pirrolidona, 112PKC (proteína cinasa C), 295Plaguicidas, 461

clorofenólicos, 463Plasmodiun polycephalum, 41Poliadenilación, 546Policlorobifenilos, 470Policloruro de vinilo, 18Polifenoles, 303Polifenoles-epigalocatechin-3-galato, 365Polimerización, 17

del estireno, 18Polímeros, 18, 143, 306Polimetilacrilato, 18Polimorfismo, 245, 248Polineuropatía amiloide, 181Polioles, 40Poliquetos, 526Porfiria, 31

cutánea, 462

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Oncogenes/Porfiria • 633

Porfirinas, 31Preeclampsia, 247Presenilina, 365Profilina, 520Prolactina, 86Prolil hidroxilasa, 586Prolina, 110066

hidroxilasa, 313, 586Prooxidantes, 332200Propenilbenceno, 305Prostaciclina, 416Proteasas intestinales, 564Proteína(s)

α-sinucleína, 362activadora 1, 492β-amiloide, 179antiapoptótica Bcl-2, 456antioxidantes, 554Bid, 482celulares, 479cinasa, 78chaperonas, 41de estrés térmico, 418de heterocromatina, 161desacoplantes, 504fibrinolíticas, 417fosfatasa, 295fragmentación, 112G heterotriméricas, 77globular, 220huntingtina, 368no madura, 481nuclear, 228retinoblastoma, 154rodopsina, 437transportadoras, 504

Proteinasa α-1, 114Proteinuria, 237Proteosoma 26S, 494Protohem-IX, 187Protooncogenes, 348Provitaminas A, 561Pterinas, 31Purinas, 85, 469

hipoxantinas, 396PVC (policloruro de vinilo), 18

QQuercetina, 613Quercitina, 308Quilomicrones, 567, 599Quimioluminiscencia, 30, 322Quimiosinas, 338, 340

Quimiotaxis, 74, 219Quimioterapia, 327Quinoles, 34Quinona, 31

reductasa, 497Quinurenina, 108

RRabdomiolisis, 405Radiación, 468

iónica, 468ultravioleta, 172

Radical(es)alcohoxilo, 103, 105alilo, 10alquilo, 19, 103alquilperoxilo, 103aniones, 6ascorbilo, 277, 280, 281bromo, 13carotenoide, 276cationes, 6de bromo, 14de halógeno, 30del ascorbato, 280fenoxilo, 34hidroperoxilo, 35, 122hidroxilo, 19, 39, 75, 98, 122, 183, 349libres, 3, 352

reducción, 17transposición de, 15, 16

lipoperoxilo, 295metilo, 14peroxilo, 294semidehidroascorbato, 294sencillos, 8superóxido, 75, 98, 122tiilo, 105tocoferilo, 618triclorometil, 294trifenilmetilo, 4vinilo, 9

Radioquímica, 7Radioterapia, 327Ramnosa, 304L-ramnosa, 306Raquitismo, 596RC (restricción calórica), 453Reacción

de abstracción radical, 15de β-fragmentación radical, 16de catalasa, 193de desproporción, 14

634 • Porfirinas/Reacción (Índice)

de dimerización, 13de Fenton, 19, 39, 75, 79de Haber-Weiss, 79de halogenación, 11de Mehler, 503de oxidorreducción, 5de peroxidasa, 193de polimerización del estireno, 18óxido-redox, 53

Redox, 53Reestenosis vascular, 245Reoxigenación, 529Repercusión, 526Reperfusión, 241, 331, 336Resistencia sistémica adquirida, 513Resonancia

de spin electrónico, 5electrónica paramagnética, 27

Retículo endoplasmático, 246, 504Reticulocitos, 553Retinitis pigmentosa, 607Retinol, 566, 574

sérico, 382Retinopatía, 332, 435Rivastigmina, 366Rodamina, 36Rodenticidas, 461Rodopsina, 574Rotenoides, 306Rotenona, 55, 75RSA (resistencia sistémica adquirida), 513

SSAC (S-alilcisteína), 368Saccharomyces cerevisiae, 37Salud humana, 459Scaphiopus couchii, 535Sefarosa, 174Selenio (Se), 201, 371, 382Seleno-proteína, 555Selenocisteína, 201, 224, 555Selenoenzima tiorredoxina reductasa, 281Selenol, 201Selenoproteínas, 201Semiquinonas, 34Senescencia, 160, 454Seudocatalasa, 185sGC (guanilato ciclasa soluble), 239SIDA, 311Síndrome

cerebrohepatorrenal, 198de daño hepático, 462

de distrés respiratorio del adulto, 472de Down, 178de intestino corto, 609de Sjögren, 69de Werner, 456de Zellweger, 198

Sistemaantioxidante, 69, 531cardiovascular, 418Cre-loxP, 548de defensa antioxidante, 536fibrinolítico, 417inmunológico, 298microsomal, 61MOM, 63nervioso entérico, 423oxidativo microsómico del etanol, 379protector contra ERO, 451triciclito del hirsuteno, 20ubiquitina-proteosoma, 362visual, 435

SO (sulfitooxidasa), 85SOD (superóxido dismutasa), 31, 169, 335,

502, 527, 543, 615Spin, 26

electrónico, 3STD (estreptidina), 432STP (estreptomicina), 432Succinato deshidrogenasa, 52, 169Sulfanilamida, 492Sulfato, 306

de heparán, 174Sulfenamida, 492Sulfhidrilos, 253, 263, 528Sulfitooxidasa, 85Sulfona, 114Sulfóxido, 113

de metionina, 108, 115Sulfoxina-butionina, 309Sulfuro de hidrógeno, 28Sumoilación, 148Superóxido, 29, 33, 183, 614

dismutasa, 54, 169, 382, 395, 506, 527, 549Sus scrofa, 530Sustancia

negra, 362P, 369

Sustrato la mieloperoxidasa, 38

TTabaquismo, 299Tapsigargina, 228

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Redox/Tapsigargina • 635

Taurosporina, 228TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbi-

túrico), 323Tejidos

cancerosos, 347embrionarios, 544

Tenoiltrifluoroacetona, 335Teoría del envejecimiento

por daño en DNA, 452por radicales libres, 449

Termogénesis, 533Tetraciclina, 547Tetracloruro de carbono, 465Tetrahidrobiopterina, 287, 400Tetrahidropterinas, 34Thamnophis sirtalis parietalis, 527Timidino cinasa, 546Timina (T), 32, 120Tioles, 259, 383, 466Tiorredoxinas, 219, 260, 385, 497, 515, 543,

552Tirosina, 42, 102, 108, 115, 586TNF (factor de necrosis tumoral), 68Tobramicina, 430α-tocoferilo, 142Tocoferoles, 291

α, 291Tocoles, 597

α, 597estructura química, 597

Tocotrienoles, 291, 595, 597Tracto

gastrointestinal, 81, 212genitourinario, 81

Transferasas, 313Transferrina, 100, 284, 616Transgén, 546

de Sod1, 550Translocación, 349Transposición, 16TRAP (antioxidante total de plasma), 324Trehalosa, 40Tricloroetileno, 347Triclorometanol, 465Trióxido de dinitrógeno, 43

Triptófano, 42, 102, 115, 203Trisomía 21, 179Trombosis, 419Tromboxano, 408Troxol, 368Trx (tiorredoxina), 219, 543

UUbiquinol, 34Ubiquinona, 34

oxidorreductasa, 51Ubiquitina, 114Ubisemiquinona, 29, 34, 57, 397UQ (ubiquinona), 51Urocinasa, 417

VVasculitis en niños, 245Vasodilatación coronaria, 246Vasoespasmo, 419VEGF (factor de crecimiento del endotelio

vascular), 488Virus

de la hepatitis, 347de la inmunodeficiencia humana (VIH), 229del papiloma humano, 347

Vitámero, 597Vitamina

A, 31, 382, 562B12, 31C, 276, 297, 443, 583E, 141, 276, 291, 443, 618

XXanthosoma sagittifolium, 270Xantina, 85

deshidrogenasa, 85, 615oxidasa, 85, 122, 170, 339, 351, 396oxidoreductasa, 85, 514

Xantofilas, 273, 443, 562, 563, 575XDH (xantina deshidrogenasa), 85Xenobióticos, 34, 62, 258, 391

636 • Taurosporina/Xenobióticos (Índice)

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Radicales Libres y Estres Oxidativo

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