Purificación de proteínas Parte II 20 Agosto, 2013
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Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés
Métodos de Baja
resolución
Precipitación con sales, solventes, temperatura o pH
Métodos de Alta
Resolución
Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad
Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante
Características Procedimiento
Solubilidad 1. Salting in2. Salting out
Carga iónica 1. Cromatografia de intercambio iónico
2. Electroforesis
Polaridad 1. Cromatografía de adsorción2. Cromatografía en papel3. Cromatografía en fase reversa4. Cromatografía interacción
hidrófoba
Tamaño molecular 1. Dialisis y ultrafiltración2. Electroforesis en gel3. Cromatografía de filtración en
gel4. Ultracentrifugación
Especificidad de unión 1. Cromatografía de afinidad
Sal más usada: Sulfato de Amonio
Solubilidad de las proteínas en Sulfato de Amonio
FibrinogenoMioglobina
Lactato deshidrogenasa 1.1.1.27
Homogenización
1) 100 g de pechuga de pollo troceado (sin grasa ni tejido conectivo)2) Licuar en frío (3 Vol de Amortiguador por gramo de tejido, 3
pulsos/3 seg.)3) Filtrar mezcla en gasa. Tomar fracción cero (F0)4) Centrifugar a 7,000 rpm 4° C 10 min. 5) Decantar sndnte y tomar fracción 1 mL (F1)6) Guardar fracciones a -20°C
Precipitación por salado
1) 25 mL del sndnte en vaso de pp. 2) Agitar en hielo y añadir lentamente 8.15 g de sulfato de amonio
(55 % de saturación)3) Centrifugar a 4°C a 10,000 rpm 10 min. 4) Registrar volumen y tomar 1 mL fracción 2 (F2) Guardar a -20°C5) Realizar segunda precipitación para llegar a 75 %, repetir pasos 2 y
36) Descartar el sndante 7) Resuspender botón o pellet en 1 mL de agua8) Distribuir en 3 tubos, uno de ellos con 1 mL. Guardar a -20°C
pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.pH solución< pI= proteína carga(+) por protonaciónpH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble
CromatografíaEs un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes.
Volumen de columna
Muestra aplicada
Matriz
Tapónporoso
Eluyente
Eluyente Proteínas separadas
Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna.
Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.
Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica.
Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.
MASA
TAMAÑO
Å
Å
kDa
PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa
molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor
masa molecular
APLICACIONES
Desalado de proteínas
Purificación de proteínas
Determinación del peso molecular de las proteínas
TIPOS DE MATRIZGRANULOS DE UN
MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO
Dextranos con enlaces cruzados
Agarosa Poliacrilamida
En esta práctica se utilizará el gel dextrano.
FASE ESTACIONARIA
Tipo Peso molecularLímite de
fraccionamiento (daltons)
Agua retenida(g/g gel sec)
Volumen de gel hidratado (ml/g
gel seco)
G10 Hasta 700 1.0 2
G15 Hasta 1500 1.5 3
G25 1000 - 5000 2.5 5
G50 1500 - 30 000 5.0 10
G75 3000-80 000 7.5 12-15
G100 4000 - 150000 10.0 15-20
G150 5000 – 400 000 15.0 20-30
G200 5000 – 800 000 20.0 30-40
Las proteínas son moléculas cargadas
• De
• Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos
• Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea
Cromatografía de intercambio iónico
Intercambio aniónico
Fase estacionaria cargada positivamente
Intercambio catiónico
Fase estacionaria cargada negativamente
GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
Cromatografía de Afinidad
Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.
75
50
37
25
kDa Pellet
W. Succinogenes30 kDa
M. Genitalium28 kDa
Flo
w
Wash
Pu
r. P
rot.
Pellet
Flo
w
Wash
Pu
r. P
rot.
IOJAP
VENTAJAS:No hay restricción por volumen. EspecificidadPureza del producto final
DESVENTAJAS:Precio (alto) Condiciones de elución drásticasLigando específico no disponible o inadecuado
Métodos espectrofotométricos
Ventajas de la técnica RápidaPrecisa Versátil Fácil de usar Eficiente en costo
MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS
Método de Absorción No se pierden las muestras
Interfieren compuestos que absorben en el UV
MÉTODOS COLORIMÉTRICOS
Biuret Específico para proteínas, muestra pocas interferencias es barato
Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL
Lowry Tiene bastante sensibilidadde 0,1-1 mg/mL.
No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio
Bradford Muy sensible0,5 -1,4 mg/mL
Muestra interferencias con detergentes