Auto-cuestionario diagnóstico de enfermedades autoinmunes ...
Pruebas para el diagnóstico microbiológico de las Enfermedades … · 2014. 3. 18. ·...
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�Pruebas para el diagnóstico microbiológico de las
Enfermedades Infecciosas empleadas en la práctica clínica (I)
Dr. Juan Carlos Rodríguez Díaz
S. Microbiología
Hospital General Universitario de Alicante
E-mail: [email protected]
http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/
Diagnóstico microbiológico�Pretende detectar e identificar el o los microorganismos responsables del proceso infeccioso y eso es esencial para:• Correcto tratamiento del paciente• Control de la difusión del patógeno
Diagnóstico microbiológico�Métodos directos:
• Detectan al microorganismo de la muestra clínica obtenida del lugar de la infección:• Examen microscópico• Cultivo• Detección de antígenos• Detección de ácidos nucléicos
�Métodos indirectos:• Permiten detectar la presencia de anticuerpos frente al microorganismo en el suero del paciente
� No se aplican simultanéamente sino en función del microorganismo
Toma de muestras
� La toma de muestras se detallará en un seminario monográfico
� Puedes acceder al manual de toma de muestras en el enlace:
http://blogmicrobiologiahgue.wordpress.com/docencia/practicas-diagnostico-microbiologico-enfermedades-infecciosas-dmi/manual-muestras-microbiologia/
Diagnóstico de bacterias: Examen microscópico� La muestra clínica se deposita en un portaobjetos
� Puede visualizarse:• Sin teñir (en fresco)• Tras un proceso de tinción • Gram: Divide a las bacterias en:
• Gram positivos: Color violeta (Staphylococcus)• Gram negativos: Color rojo (Escherichia coli)
• Ziehl Neelsen: Divide a las bacterias en• Acido-alcohol resistentes: Color rosa (Mycobacterium
tuberculosis)
Examen microscópico en fresco
Trichomonas vaginalis Candida albicans
Examen microscópico: tinciones
Ziehl Neelsen positivo
Gram positivo
Gram negativo
Diagnóstico de bacterias: cultivo� Siembra de la muestra en unos medios de cultivo
con los nutrientes necesarios para que se produzca la proliferación bacteriana.
� Sus principales utilidades son:• Más sensibilidad que la tinción• Permite identificar a los microorganismos• Permite estudiar su sensibilidad antibiótica• Permite estudiar la epidemiología de la infección y el control de posibles brotes
Características del cultivo� Se utilizan diferentes tipos de medios:
�Medios básicos: Agar Mueller Hinton�Medios enriquecidos:• AgarSangre: Streptococcus pneumoniae• AgarChocolate(Hemina y NAD) : Haemophilus• BCYEα (L-cisteina): Legionella
• Medios selectivos:• Medio Thayer Martin: Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae
• Mac Conkey: Bacterias Gram negativas
• TCBS: Vibrio cholerae
• Medios diferenciales o cromógenos: CHROMAgar
• Medios de enriquecimiento:• Caldo selenito
Tipos de medios de cultivo
Agar sangre
HemocultivosAgar chocolate
TCBS
Procesamiento de los cultivos� Temperatura de incubación:
• Habitualmente se incuba a 35-37ºC• Campylobacter en heces: 42ºC
� Tiempo de incubación� El tiempo habitual es 24-48 h� Hay bacterias de crecimiento lento: Brucella
� Atmósferas de incubación� Bacterias aerobias o anaerobias facultativas: Escherichia coli,
Staphylococcus aureus.� Bacterias anaerobias: Clostridium, Bacteroides� Bacterias microaerófilas: Campylobacter, Helicobacter� Necesitan 5-10% CO2: Neisseria gonorroheae
Incubación de los medios
Incubador de hemocultivos
Atmósfera de incubación
Identificación bacteriana
� Definición: • Se basa en el estudio de la actividad bioquímica, sensibilidad a determinadas sustancias y crecimiento en presencia o ausencia de oxígeno
�Métodos:• Pruebas bioquímicas clásicas• Pruebas en microplaca
Identificación bacteriana
Detección de antígenos
� Definición: • Permite demostrar la presencia de un microorganismo en una muestra clínica a través de la detección de sus antígenos específicos
� Patógenos en los que se utiliza:• Legionella• Streptococcus pneumoniae• Aspergillus• Cryptococcus
Detección de antígenos
� Definición: • Se basa en la detección mediante métodos inmunológicos (reacción antígeno-anticuerpo) de algunas sustancias segregadas por el patógeno
� Patógenos en los que se utiliza:• Legionella• Streptococcus pneumoniae• Aspergillus• Cryptococcus
Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS
� Definición: • Estos dos genes están presentes en todas las bacterias (16S rRNA) y hongos (ITS) pero su secuencia es diferente en función de la especie
� Procedimiento:• Secuenciación de estos genes y comparación con bases de datos internacionales (Gen Bank u otros)
• Útil para identificar microorganismos con identificación clásica compleja
Secuenciación del gen 16S rRNA e ITS
Espectrometría de masas (malditof)
Definición: • Estudia el perfil proteico del microorganismo (proteoma) mediante la comparación del perfil con una base de datos de los microrganismos más frecuentemente aislados
• Un rayo laser ioniza las proteinas cristalizadas y son aceleradas por un campo electromagnético.
• Las proteinas se separan en función del tamaño y la carga
� Utilidad:• Identificación rápida de los microorganismos más habituales
Espectrometría de masas (malditof)
Diagnóstico de la infección urinaria
� Definición: Presencia de microoorganismos en orina• Cistitis: infección de vías bajas• Pielonefritis: Infección de vías altas
� Etiología más frecuente• Bacterias de la flora intestinal: • Escherichia coli• Proteus• Klebsiella• Enterococcus
Diagnóstico de la infección urinaria
�Muestras:
• Muestra: Frasco estéril con orina recién recogida o mantenida a 4ºC
• Adultos: Segunda parte de la micción tras limpieza de los genitales externos
• Pacientes sondados: Pinchar la sonda con jeringa en el lugar establecido para ello
• Niños pequeños: Bolsa colectora que debe retirarse cada 30 minutos
Diagnóstico de la infección urinaria
�Métodos diagnósticos:• Sedimento urinario: Es de gran valor para valorar la calidad de la muestra y la presencia de leucocitos• Leucocitos sin bacterias (Cultivo negativo)• En tratamiento antibiótico• Uretritis por Chlamydia o Micoplasma que no se diagnostican por los métodos habituales• Tuberculosis renal
Diagnóstico de la infección urinaria
�Métodos diagnósticos:
• Sistemas de cribado rápido:• Tiras reactivas• Detección de nitratasa bacteriana• Detección de esterasa leucocitaria
• Recuento de lecucocitos y bacterias por citometría de flujo de forma automatizada
Diagnóstico de la infección urinaria
�Métodos diagnósticos:
• Cultivo: Se inocula de forma cuantitativa la orina en una serie de medios de cultivo:• Agar sangre: Medio enriquecido para el aislamiento de los patógenos más frecuentes• Agar CLED y Agar Mac Conkey: Medio diferencial que ayuda a la identificación preliminar
Diagnóstico de la infección urinaria
� Interpretación del recuento en el cultivo: • Debe hacerse en función de:
• Forma de recogida de la muestra• Clínica del paciente• Presencia de piuria• Microorganismo aislado
• En muestras tras punción suprapúbica o directamente del riñón: Cualquier recuento es significativo• Sondaje vesical: 103 bacterias/mililitro• Bacteriuria con piuria: 103 bacterias/mililitro• Bacteriuria asintomática: 105 bacterias/mililitro
Diagnóstico de la infección urinaria
Medios de cultivo
Diagnóstico de la infección urinaria
Sedimento urinario
Tiras reactivas
Citometría de flujo
Diagnóstico de la neumonía bacteriana
• Definición: Infección del parénquima pulmonar• Tienen etiología muy variada en función de la edad, del estado inmunológicos y de otros factores
• En personas previamente sanas es frecuente:• Streptococcus pneumoniae• Micoplasma pneumoniae
• En personas con factores predisponentes• Pseudomonas aeruginosa• Staphylococcus aureus• Enterobacterias
Diagnóstico de la neumonía bacteriana
•
Diagnóstico de la neumonía bacteriana
•
Diagnóstico de la neumonía bacteriana
� Cultivo: • Muestra de esputo de buena calidad (Tinción de Gram con
presencia de leucocitos) o muestras invasivas (BAS, BAL, cepillado bronquial) • Cultivo en:
• Agar sangre. Aislamiento de Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis
• Agar Mac Conkey: Enterobacterias, Pseudomonas y Acinetobacter
• Agar chocolate:Haemophilus influenzae• Medio BCYEα: Legionella pneumophila.• BAL y Cepillado bronquial se hace cultivo cuantitativo en
Agar chocolate
Diagnóstico de la neumonía� Detección de antígenos:
�Muestra a procesar:
�Muestras respiratorias:
�Virus respiratorio sincitial
�Gripe A, gripe B
�Pneumocystis carinii
�Aspergillus
�Orina:
�Streptococcus pneumoniae
�Legionella pneumophila
Diagnóstico de la neumonía� Detección de anticuerpos:
� Muestra a procesar:�Suero del paciente
� Estudios a realizar:�Detección de IgM�Estudio de seroconversión: Incremento de la cantidad de anticuerpos al estudiar dos sueros del enfermo separados 3-4 semanas�De positivo bajo a positivo alto�De negativo a positivo alto
� Microorganismos: Micoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetti, Chlamydophila pneumoniae
Diagnóstico de la neumonía� Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):
� Muestra a procesar:�Muestras respiratorias
� Estudios a realizar:�Detección del genoma del microorganismo en la muestra
� Microorganismos: �Hay sistemas de PCR múltiple que detectan muchos patógenos
�Mycobacterium tuberculosis�Gripe�Citomegalovirus
Diagnóstico de la neumonía bacteriana
Streptococcus pneumoniaeLegionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
� Procesos más frecuentes:�Meningitis/encefalitis�Abscesos cerebrales
� La etiología de las meningitis/encefalitis puede ser muy variada:�Bacterias: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae
�Virus: Enterovirus, virus herpes 1 y 2, arbovirus�Hongos: Cryptococcus neoformans�Parásitos: Amebas de vida libre
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
� Diagnóstico de las infecciones bacterianas:• Tinción de Gram del LCR:
• Método rápido y orientativo de la etiología• Cultivo del LCR:
• Confirmación de la tinción y estudio de la sensibilidad antibiótica
• Agar sangre, chocolate y Thayer Martin • Detección de antígenos en el LCR: Streptococcus pneumoniae
• Reacción en cadena de la polimerasa: S. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis
• HEMOCULTIVO
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
� Diagnóstico de las infecciones viricas:• Los cultivos celulares son técnicas complicadas y lentas
• Reacción en cadena de la polimerasa: • Enterovirus• Herpes 1 y 2• Varicella• Virus JC• Arbovirus
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
� Diagnóstico de las infecciones fúngicas:
�La etiología más frecuente es Criptococcus neoformans
�Procedimiento diagnóstico:
�Cultivo en agar saboureaud
�Detección de antígeno en LCR y sangre: Criptolatex
� Diagnóstico de las infecciones parasitarias:
� Toxoplasma: Detección del genoma por PCR� Amebas de vida libre:
�Tinción�Cultivo �PCR
Diagnóstico de las infecciones del sistema nervioso central
� Diagnóstico serológico:
�La búsqueda de anticuerpos en LCR es una técnica útil en algunos casos�Neurobrucelosis: Rosa de bengala y aglutinación�Neurosífilis: VDRL�Sarampión: Presencia de Ac de producción intratecal
� Es imprescindible analizar los resultados con un estudio de los mismos marcadores en suero para:�Confirmar la infección por el patógeno�Confirmar la integridad de la barrera hematoencefálica mediante el estudio del cociente entre la albúmina o la IgG entre suero y líquido
Diagnóstico de la meningitis bacteriana
Listeria monocytogenes
Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis
Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital
� Patógenos más importantes:
Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital
� Patógenos más importantes:
Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital
� Diagnóstico de Treponema pallidum (sífilis)• Sífilis primaria: Observación del Treponema pallidum (chancro):IFD ,tinción con plata ,Campo oscuro
• Diagnóstico serológico:• Pruebas no treponémicas: RPR y VDRL• Pruebas treponómicas: TPHA (aglutinación) , FTA (inmunofluorescencia), ELISA IgG e IgM• Criterios:• Todos los resultados positivos de pruebas no treponémicas deben ser confirmados por pruebas treponémicas
• En caso de sospecha de sífilis primaria o terciaria, hay que hacer siempre una prueba treponémica
Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital
� Diagnóstico de Neisseria gonorrhoeae (gonorrea)• Cultivo en agar Thayer Martin • Tinción de Gram: en el hombre la presencia de diplococos gramnegativos es diagnostica (95%)
• Exige transporte rápido al laboratorio e incubación en atmósfera con CO2
• Detección de genoma del microorganismo por PCR
• Diagnóstico de Chlamydia trachomatis (uretritis no gonocócica)
• Sólo puede cultivarse en cultivos celulares y no se hace habitualmente
• Detección de genoma del microorganismo por PCR
Diagnóstico de las enfermedades del tracto genital
� Diagnóstico del protozoo Trichomonas vaginalis• Cultivo en medio Roiron• Visualización en fresco de la muestra recién extraída: Observación de la motilidad del parásito
• Exige transporte rápido al laboratorio
• Diagnóstico del virus herpes genital
• Detección de genoma del microorganismo por PCR• Habitualmente la etiología se asocia a herpes 2
• Diagnóstico del papilomavirus
• Detección de genoma del microorganismo por PCR• Genotipificación ya que hay genotipos con diferente
patogenicidad: verrugas genitales o promotores de procesos cancerosos
Diagnóstico de las enteritis� Etiología más frecuente
Diagnóstico de las enteritis� Etiología más frecuente
Diagnóstico de las enteritis bacterianas
� Salmonella
� Cultivo en medio SS y enriquecimiento en caldo selenito� Identificación fenotípica y serotipificación: Múltiples
serotipos� Campylobacter
� Cultivo en medios especificos (Skirrow): Incuba a 42ºC en atmósfera microaerófila
� Shigella. Cultivo en medios específicos (Mc Conkey y SS)� Yersinia: Cultivo en medios específicos (CIN)� Escherichia coli enteropatógenos: Detección del genoma
de los serotipos patógenos por PCR� Vibrio cholerae (TCBS y enriquecimiento)
Diagnóstico de las enteritis bacterianas
� Clostridium difficile
� Cultivo en medio anaerobio: Sólo se realiza en centros de referencia debido a su complejidad
� Detección de Antígenos del patógeno� Detección de las toxinas producidas por el mismo� Detección del genoma del microorganismo por PCR
� Otros microorganismos productores de toxinas: El diagnóstico se realiza detectando la toxina preformada por métodos serológicos� Staphylococcus aureus� Bacillus cereus� Clostridium perfringens� Clostridium botulinum
Diagnóstico de las enteritis viricas � Virus gastrointestinales
� Rotavirus� Adenovirus� Norovirus� Astrovirus
� Diagnóstico� Microscopía electrónica: Técnica poco usada por su
complejidad� Detección de antígenos� Detección del genoma viral por PCR
Diagnóstico de las enteritis parasitarias
� Protozoos
� Giardia� Entamoeba histolytica� Cryptosporidium
� Helmintos: Ascaris, Taenia, Enterobius vermicularis� Diagnóstico
� Microscopía tras proceso de concentración de las heces� Necesidad de procesar un mínimo de tres muestras� Tinciones especiales: Cryptosporidium� Detección del genoma por PCR: Entamoeba� Técnica de Graham: Enterobius vermicularis (oxiuros)
Protozoos: flagelados
Protozoos flagelados: Amebas
Protozoos ciliados
Protozoos: Apicomplexa
Cryptosporidium spp
Isospora belli
Protozoos: Microspora
Enterocytozoon spp
Platelmintos: cestodos
Platelmintos: tremátodos
Nemátodos
Trichuris trichiura
Nemátodos
Nematodos
Strongyloides stercoralis
Diagnóstico de bacteriemia• Presencia de bacterias en sangre de forma persistente
• Antes del tratamiento antimicrobiano se inoculan, con sangre del paciente sin anticuagulante 2 o 3 parejas de botellas de hemocultivos (aerobias y anaerobias)
• Es muy importante descontaminar la piel ante de las extracciones de sangre para prevenir la contaminación de los frascos con flora bacteriana de la piel
• Los hemocultivos se incuban a 37ºC en sistemas automáticos que detectan crecimiento microbiano.
• En caso de positividad : Tinción Gram (cuyo resultado se informa de inmediato ) y subcultivo a medios sólidos.
Diagnóstico de bacteriemia
Infecciones por microorganismos anaerobios
• Se asocian a las siguientes infecciones:
– Gangrenas
– Peritonitis y otras infecciones intraabdominales
– Neumonías por aspiración
– Abscesos
– Bacteriemias
– Abscesos cerebrales
Infecciones por microorganismos anaerobios
• Los microorganismos se mueren en contacto con el oxígeno, por lo tanto:– El cultivo debe hacerse lo más rápidamente posible, si no es
posible, hay que inocular las muestras en medios de transporte– Se requieren medios de cultivo específicos e incubación en
atmósfera sin oxígeno– Las torundas no son aceptables, es imprescindible que las
muestras se tomen con jeringa o mediante biopsia– Los géneros más importantes son:
• Clostridium• Bacteroides• Prevotella• Fusobacterium
Cultivo de microorganismos anaerobios
• Están presentes en la flora normal de la piel o mucosas de las personas sanas por tanto no tienen interés clínico si se aíslan de estas localizaciones:– Esputos– Exudados vaginales– Heces– Piel
Infecciones sistémicas por hongos filamentosos
• Los hongos más frecuentemente implicados son:– Aspergillus
– Mucor
– Fusarium
• Diagnóstico:– Cultivo de las muestras: Poca sensibilidad y especificidad. Necesidad de confirmación en varias muestras y con datos clínicos
– Detección de antígenos de Aspergillus: galactomanano
Infecciones por Candida
• C. albicans es la más patógena. Otras especies implicadas son:– C. parasilopsis
– C. tropicalis
– C. krusei
• Produce:– Infección de piel y mucosas
– Candidiasis sistémica en inmunodeprimidos
Infecciones por Candida
• En caso de sospecha de infección sistémica: hemocultivos
• En otras infecciones:– Tinción de Gram como método rápido
– Cultivo de las lesiones en medio de Saboureaud. Crecen en 1-2 días. Pueden crecer en agar sangre o agar chocolate
– Identificación de la especie por métodos fenotípicos o genotípicos
Candida spp.
Candida spp.
Candida spp.
Candida spp.
Candida spp.
Infecciones por dermatofitos
Llamadas comunmente tiñas: Tinea corporis
Tinea crucis
Tinea barbae
Onicomicosis
Pie de atleta
Trichophyton, Microsporum, Epidermophytum
Se adquieren a partir de personas enfermas, de animales domésticos o a partir del suelo
Infecciones por dermatofitos
Diagnóstico rápido: Prueba del KOH (visualización directa de las lesiones)
Cultivo en medio de Saboureaud y micosel (Saboureaud y actidiona) durante 30 días a 30/37ºC
Identificación del hongo aislado en cultivo mediante tinción de azul de lactofenol y algunas pruebas bioquímicas (urea)
Dermatofitos
Dermatofitos
Dermatofitos
Dermatofitos
Dermatofitos
Otras infecciones por hongos
Pitiriasis versicolor (Malassezia furfur)Diagnóstico clínico
Esporotricosis (Sporothrix)Por infección de heridas con esporas presentes en el suelo o en vegetales
Hongo dimórfico: Cultivo en saboureaud y BHI durante 30 días a 30/37ºC respectivamente
Identificación mediante microscopía y demostración de dimorfismo(levadura, hongo filamentoso)
Sporothrix
Sporothrix
Infecciones por Leishmania
• Leishmaniasis visceral: Kala azar• Muestra a procesar. Médula osea
• Lesiones cutaneas o mucocutáneas (Botón de oriente, uta, espundia, etc)
• Muestra a procesar: Aspirado o biopsia de la lesión
• Asociado muchas especies del género, en función de la zona geográfica y de la clínica: L. infantum, L. donovani, L. peruviana, L. amazonensis, etc.
• Diagnóstico por:• Visualización del parásito en las lesiones por tinción de Giemsa
• Cultivo en medio NNN
• PCR.
• Serología (útil en L. visceral)
Leishmania
Leishmania
Leishmania
Leishmania
Leishmania
Phebotomus y Lutzomya
Infecciones por Plasmodium
• Produce la malaria o el paludismo
• Enfermedad muy frecuente en el trópico
• Necesidad de diagnóstico rápido– No crece en los medios para bacterias: hemocultivos
– Métodos específicos:• Visualización del parásito en tinción de Giemsa de los hematies de la sangre periférica
• Detección de antígeno
• Detección del genoma del protozoo por PCR
Infecciones por Plasmodium
Infecciones por Toxoplasma
• Se asocia• Inmunocompetentes: Generalmente asintomático o fiebre con adenopatías
• Gestante: Infección congénita
• HIV: Cuadro neurológico por reactivación de quistes cerebrales
• Diagnóstico:• Inmunocompetentes: Estudios serológicos (IgM, seroconversión y avidez de la IgG)
• Gestantes: Serología de la madre y PCR en líquido amniótico
• Inmunodeprimidos: Detección del genoma por PCR
Infecciones por Toxoplasma
Infecciones por Schistosoma
• 2º enfermedad tropical más prevalente (después del paludismo)
• Se transmite por la entrada de larvas a través de la piel cuando se introduce en agua
• Diagnóstico:• Visualización de los huevos en la orina o en las heces del paciente