PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES:

1. Ttulo: EVALUACION DE LA EFICACIA DE PRODUCTOS QUIMICOS Y BIOLOGICOS EN EL CONTROL DE TIRO DE MUNICION EN EL CULTIVO DE DURAZNO EN CALANA - TACNA

2. Personal investigador:

2.1. Autores:

Ana Saraih Cari Flores Carmen Gabriela Gavancho Paredes Diego Armando Rojas Meza

Escuela Acadmico Profesional de Biologa Microbiologa4to Ao

2.2. Asesor: Dra. Liduvina Sulca Quispe.

3. Tipo de Investigacin:De acuerdo al propsito de la investigacin; y objetivos formulados, el presente estudio rene las condiciones para ser calificado como una investigacin por el mbito ya que ser en laboratorio. Es una investigacin de tipo: descriptiva y experimental de acuerdo a la finalidad de las mismas.4. Rgimen de investigacin Orientada 5. Departamento y Seccin a la que pertenece el proyecto: Departamento de Biologa Microbiologa. rea de Fitopatologa6. Localidad e Institucin donde se desarrollar el proyecto: Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann Laboratorio de botnica, rea de fitopatologaDistrito Calana, Provincia Tacna, Regin Tacna

7. Duracin total del Proyecto: 3 meses

8. Fechas probables de inicio y terminacin8.1. Inicio: 29 de Agosto del 20148.2. Terminacin: 18 de Noviembre del 20149. EtapasNDESCRIPCIONAO 2014

AGOSTOSEPTIEMBREOCTUBRENOVIEMBRE

SEM 4SEM 1SEM 2SEM 3 SEM 4SEM 1SEM 2SEM 3SEM 4SEM 1SEM 2

1Revisin en campoX

2Elaboracin del proyectoX

3Revisin BibliogrficaXXXXXXXX

4MuestreoXXXXXXXXX

5Trabajo in vitro XXXXXX

6Determinacin del controlXX

7Elaboracin de informe (primer avance)X

8Aplicacin del ControlXXX

9ResultadosXX

10Elaboracin y presentacin del Informe finalX

10. Recursos Disponibles:

10.1. Personal: Autores: Ana Saraih Cari Flores Carmen Gabriela Gavancho Paredes Diego Armando Rojas MezaAsesor: Mblga. Liduvina Sulca Quispe

10.2. Material y Equipo:Material biolgico: Hojas y tallo de Durazno, Prunus persicum, apunto de florecerMateriales de laboratorio:Equipos: Microscopio ptico Estereoscopio Autoclave Cocina electrica Balanza Horno Termmetro Incubadora Materiales de vidrio Placas petri de 15 x 10 mm Matraces de 250 ml Pipetas de 0.1,1.5 y 10 ml Vasos precipitados Laminas porta objeto Laminas cubre objeto Baguetas MecheroMateriales de metal y otros Asa de siembra Estiletes Pinzas Bisturis Tijeras Esptulas Bolsa de propileno Papel peridico o absorbenteMedios de cultivo y Reactivos: Azul de lactofenol Alcohol de 70 Ron de quemar Agua destilada Agar PDA

Otros: Cmara fotogrfica Papel kraft Pabilo Algodn Tijera de podar

10.2.1. Material: Agar papa Agua destilada Papa cortada en rodajas Agar Cocina elctrica Vaso de Precipitado Matraz Erlenmeyer Papel Filtro

Tijera de podar Placa Petri Tubos de ensayo Asa de Col Mecheros Alcohol Algodn Bolsas de recoleccin Lupa Estiletes Porta y cubre objetos

10.2.2. Equipos:

Autoclave Incubadora Microscopio

10.3. Locales, laboratorio, etc.Se llevara a cabo en la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohomann en la Facultad de Ciencias de la Escuela Acadmico Profesional de Biologa Microbiologa, ambientes del Laboratorio de Botnica.

11. Presupuesto:11.1. Bienes:11.1.1. Material de laboratorio Algodn Detergente Alcohol 70 Jabn carblico Porta objetos Cubreobjetos Ron de quemar Pabilo Fosforo (paquete) Tapers de plstico Bistur (20 u.) Papel kraft (5 u.) Cinta de embalaje Subtotal

13.83.57.003.005.005.002.502.001.00X5.003.502.001.5054.80

11.1.2. Material fotogrfico Cmara fotogrfica Impresiones subtotal410.0030.00440.0011.1.3. 11.1.4. Material de escritorio Cuaderno de apuntes Papel bon A4 Marcador Subtotal10.0012.003.5025.5011.1.5. 11.1.6. Servicios Movilidad local Viticos Subtotal

TOTAL30.0020.0050.00

570.30

12. Financiacin:Con recursos externos (autofinanciacin)El estudio a realizar ser autofinanciado

II. PLAN DE INVESTIGACION

1. Problema

1.1. Enunciado del problema cientficoCul ser la eficacia de los productos qumicos y biolgicos en el control de tiro de municin que infecta a durazneros?

1.2. Definicin y delimitacin del problema

1.2.1. Conocimientos previos, antecedentes y origen del problema

Origen y descripcin de Prunus persica:

El durazno o melocotn es un rbol deciduo que pertenece a la familia Rosaceae. Es originario del Oeste de China y segn la evidencia arqueolgica y literaria se presume que fue domesticado alrededor del 3.000 A.C. (Desmond y Bassi, 2008). El rbol de durazno puede alcanzar 8 metros de altura, sus hojas son lanceoladas y las flores presentan una gama de colores entre blanco y rosado, segn la variedad. Sus frutos se caracterizan por tener un endocarpio endurecido y un mesocarpio carnoso. En el caso de Prunus persica var. Diamante, la piel es pubescente, mientras que en Prunus persica var. Nectarina la piel es lisa y de coloracin rojiza (Desmond y Bassi, 2008).

Dependiendo de las condiciones climticas en las que se encuentren las plantaciones de durazno, este frutal puede llegar a tener una vida media de 12 a 17 aos, alcanzando su edad productiva a partir del sexto o sptimo ao (Whealy, et.al, 2001).

Caractersticas del ProductoEl durazno Prunus prsica, es un caducifolio de la familia de las rosceas, cuyo fruto es una drupa de gran tamao. Esta fruta pesa alrededor de 90 gramos que contiene una nica y gran semilla encerrada en una cscara dura. La forma del durazno es generalmente semi-esfrica, con un surco longitudinal bien marcado, de piel lisa o pubescente y un color amarillo, rojizo o prpura. La pulpa suculenta es blanca, amarilla o rojiza y puede estar adherida o separada de la nuez. Tiene sabor dulce y olor perfumado, variando la intensidad de acuerdo a la variedad.Entre las especies cultivadas en el Per tenemos: Huayco rojo, huayco crema, nectarina, fortaleza, dixie red, entre las ms importantes.Su uso se da para el consumo humano directo y como ingrediente para la industria de alimentos, bebidas, cosmticos.Un durazno mediano, a pesar de su sabor dulce, no contiene ms de 60 caloras, hecho que lo convierte en un postre ideal para personas sujetas a una dieta baja en caloras.

Enfermedades de durazno en el Ecuador:

SISAGRO (2010) dice: Una de las causas que afecta el rendimiento de este cultivo son los patgenos. Especficamente, en lo que respecta a las enfermedades fngicas, los cultivos nacionales de durazno se encuentran afectados bsicamente por dos tipos de hongos: Taphrina deformans conocida tambin como cloaca, la cual enrolla y daa las hojas y Monilinia spp., causante de la podredumbre morena, conocida as por atizonar y podrir los frutos.

En el pas, las variedades de Prunus persica como Conserveros y Abridores, son susceptibles a contraer otras enfermedades fngicas como Oidium, Tranzchelia pruni-spinoseae, conocida comnmente como roya y Wilsonomyces carpophilus o tambin conocido como Stigmina carpophila es el hongo caracterstico de la enfermedad llamada tiro de municin, la cual causa despigmentacin de hojas y fruto.

Per no es productor a gran escala del durazno fresco.

Se tiene conocimiento que es muy pequea la produccin nacional y no hay registros nacionales que den cuenta de ello, sin embargo se tiene el clima propicio para la produccin a gran escala de dicho producto. El departamento de Ayacucho viene siendo explorado por Sierra Exportadora en la produccin de duraznos, se han desarrollado proyectos de produccin de duraznos los cuales vienen generando resultados positivos.Se brinda a continuacin detalle de la produccin nacional de damasco, (Prunus armeniaca), al ser este fruto es muy parecido al durazno (es casi redondo y con un surco de color amarillento a naranja aunque a veces con tiras rojas en parte encarnadas, aterciopelado, de sabor agradable y con hueso liso de almendra generalmente amargo); produccin que se da en los departamentos Moquegua, Tacna y Arequipa, siendo el primero, el principal productor con 243 toneladas en el ao 2010.Le sigue Tacna con una participacin de 22% y Arequipa con 4%.

Enfermedades

Podredumbre blanca de las races (Armillaria mellea), los rboles con ms de cinco aos de edad que han sido infectados por la enfermedad, muestran un crecimiento terminal pobre y hojas de tamao reducido. El follaje puede permanecer verde hasta mediados del verano, cuando todo el rbol colapsa y quedan las hojas secas adheridas. Se presenta amarillamiento, marchitez y muerte parcial de ramas y ramillas.Marchites del durazno (Verticillium albo-atrum), defoliacin de las ramas afectadas al principio del verano, presencia de hojas blancas opacas antes de caer, puede afectar toda la copa, un lado del rbol o limitarse a un lado de una rama, provocando improductividad durante varios aos.Agalla de corona (Agrobacterium tumefaciens), se caracteriza por la presencia de agallas cerca del cuello y sobre races primarias y secundarias. Cuando las agallas son jvenes la superficie es suave y blanda, de color cremoso y ms o menos esfricas, a medida que crecen se vuelven ms oscuras y de consistencia leosa, superficie spera y agrietadas. Las agallas miden de 0.5 hasta 30 cm de dimetro.Cancro de tallo y ramas (Valsa leucostoma), las cnceres en el tronco principal, horquetas de las ramas, ramas principales y ramas viejas son el sntoma ms evidente de la infeccin, los primeros sntomas se manifiestan con la presencia de gotas de goma sobre las heridas que aparecen a inicios de la primavera, la parte interna de la corteza comienza a degradarse de tal forma que la superficie afectada se deshidrata.Tiro de municin (Coryneum beijerinckii), ataca ramas, yemas, hojas, flores y frutas. En los frutos se observan lesiones circulares hundidas de color rosado o caf-rojizo, al envejecer estas lesiones se tornan negras por la esporulacin del hongo.

Tiro de municin:

Esta enfermedad tambin afecta a las hojas y frutos, ocasionando manchas de color purpura sobre hojas y frutos. El agente causal es Wilsonomyces carpophilus o tambin conocido como Stigmina carpophila.La enfermedad generalmente comienza afectando hojas, sobre las cuales se forma la mancha purpura y luego su parte central se cae dejando orificio (tiro de municin). La enfermedad tambin comienza a desarrollarse en ambientes secos calurosos en la etapa de crecimiento y maduracin de fruto. La poca hmeda favorece la infeccin a los frutos. El control debe realizarse desde la etapa de cuajado hasta inicio de maduracin (Coca M, 2011).

SntomasLedezma, F (2002) dice las yemas y ramillas son afectadas severamente encondiciones de alta humedad y temperatura comprendida entre 5 a 26 C con una ptima de 15C. Las lluvias de primavera inducen la infeccin del follaje y los frutos.En las ramillas aparecen manchas circulares de color prpura de 2 a 3 mm de dimetro, cuyo dentro luego se oscurece, apareciendo en su superficie ramilletes de esporas de color pardo oscuro. Si esta infeccin es intensa se produce destruccin de ramilla en primavera y comienzo de verano.Las yemas afectadas adquieren un color castao oscuro y aparecen cubiertas de goma. Frecuentemente en las lesiones presentes en ramillas, yemas y frutos se encuentra este exudado gomoso (gomosis).En hojas se presentan manchas de color prpura, a veces rodeadas por un halo angosto verde claro, luego el tejido enfermo se necrosa, separndose del sano que los rodea, dndole al follaje la apariencia tpica de tiro de municin. La presencia del patgeno en ramillas, yemas o frutos, es importante para tener un adecuado diagnstico, puesto que estos sntomas tambin pueden ser provocados por otros agentes o ser problema de nutricin de plantas.

1.2.2. Caractersticas y significado del problema

1.2.3. Delimitacin del problemaInterrogante esencial

2. HiptesisLos fungicidas, productos qumicos, tendrn alta eficacia sobre el wilsonomyces carpophilus agente etiolgico del tiro de municin en cultivos de durazno3. Objetivos

Objetivo General: Evaluar la eficacia de fungicidas sobre el tiro de municion en condiciones de laboratorioObjetivos Especificos: Aislar al hongo fitopatogeno causante de la enfermedad en el rea foliar Aislar e identificar la especie Wilsonomyces carpophilus a partir de muestras foliares y de tallo Determinar el control ms efectivo para el fitopatogeno causante del Tiro de municin

4. DISEO DE INVESTIGACIONEn esta investigacin Se utilizara diferentes diseos para cada tipo de controladorPara controladores qumicos:Se utilizara un diseo completamente aleatorio en el cual consideraremos 4 tratamientos con 5 repeticiones cada una; la unidad experimental consiste en una placa de petri.

Para controladores biolgicos:Los tratamientos seran distribuidos en un diseo completamente al azar, con cinco repeticiones cada uno; la unidad experimental consiste en una placa de petri.

5. VARIABLES Variables independientes Trichoderma sp Pseudomonas sp. Streptomyces sp: Oregano:

Variables dependientesEfecto controlador de los fungicidas y biocontroladores frente a Wisonomyces carpophillus causante del Tiro de municin.

6. PROCEDIMIENTOS6.1. Toma de muestraPara la recoleccin de muestras se extraer hojas del rbol de Prunus persicum, que presenten los posible signos y sntomas que caracterizan a esta enfermedad en diferentes reas de cultivo en el valle viejo de Calana. Luego sern llevadas al laboratorio de Botnica de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohomann para comprobar la presencia del hongo y su posterior aislamiento mediante sembrado en agar y final reconocimiento.La distribucin de las plantas en el terreno: estos diagramas describen algunos de los patrones dentro del terreno que usted puede seguir para la toma de sus muestras. Tomar muestra mnimo 8 submuestras/ha en la cantidad propuesta, segn el cultivo, en la tabla anexa; luego mezclar, empacar y rotular.

1. AISLAMIENTO DEL PATOGENO:El aislamiento se realiz a partir de hojas de durazneros procedentes de fundos del distrito a trabajar, las cuales mostraban sintomatologa del tiro de municin. Las hojas se lavaron en agua corriente, se sumergieron en una solucin de hipoclorito de sodio al 5 % durante 5 minutos, se enjuagaron con agua destilada estril y se dejaron secar sobre papel toalla para luego ser colocadas en la cmara de siembra (cmaras hmedas). Luego se cortaron las hojas afectadas en pequeas porciones las cuales se sembraron en placas Petri conteniendo medio nutritivo Papa-Dextrosa- Agar (PDA). Las placas sembradas se incubaron a 25 C por siete das, y por ultimo se obtendran placas con cultivo puro.

2. IDENTIFICACION DEL PATOGENO:Se cogera un poco del micelio de los cultivos del hongo fitopatogeno y se procedera a realizar la tecnica de la cina skoch, la cual consiste en pegar la cinta al micelio formado por la colonia de hongos y adehirlo sobre una gota de lactofenol inoculada en una lamina portaobjeto; se extendera bien la cinta y se procedera a observar el microscopio.Una vez ubicado las estructuras fructificativas se procedera identificarlos basandonos en las claves de Barnett & Hunter.

3. PRUEBA DE PATOGENICIDAD:La prueba de patogenicidad se realizar sobre plntula. El hongo se cultiv en placas petri conteniendo PDA y luego se inocularan en suelo previamente esterilizado con bromuro de metilo a razn de una placa petri por cada cuatro kilogramo de suelo. El suelo inoculado se dejara incubar por quince das, luego se distribuirn en macetas de un kilogramo cada una donde se trasplantarn las plntulas de durazno. Se efectuaron riegos interdiarios. La infeccin se acelerara a 6 horas a una temperatura de 25 C, y de las plantulas afectadas se procedera a reaislar el hongo tal como se indic en el aislamiento.

4. CONTROLADORES:4.1 PRUEBA DE FUNGICIDAS IN VITROSe evaluaran diversos fungicidas disponibles y de diversas formulaciones, considerndose productos de contacto. Se utilizara el mtodo del alimento envenenado, esto es, PDA licuado mezclado con cada fungicida, por separado, a la dosis comercial recomendada; se homogenizara la mezcla y se plaquear. Una vez solidificado el medio se sembrara una rodaja de 0.8 cm del hongo crecido en PDA al centro de cada placa petri. Las Placas sembradas se incubaran a 25 C por durante siete das y diariamente se medir el dimetro de crecimiento. Los fungicidas utilizados figuran en el siguiente cuadro, los cuales se evaluaron con elDiseo Completo al Azar (DCA), con 4 tratamientos y con 5 repeticiones por tratamiento.

TRATAMIENTONOMBRE COMERCIALNOMBRE TCNICOCONCENTRACION EMPLEADATIPO

T1 OXICLORURO DE COBREOXICLORURO DE COBREOXICLORURO DE COBRE1g/100mlC

T2 FERBAM 76 WGDitiocarbamato0,22g/100mlC

T3 CAPTAN 83 WPcaptanftalamida0,18g/100mlC

T4 Dithane NTmancozebDitiocarbamato0,21g/100mlC

Te----

4.2 PRUEBA CON BIOCONTROLADOREESEl control biolgico es el uso de organismos (o de sus metabolitos o subproductos) que son enemigos naturales de una plaga o patgeno, con el fin de reducir o eliminar sus efectos dainos en las plantas o sus productos. De manera similar al uso de gatos para controlar poblaciones de ratones o el uso de bacterias benficas (como los lactobacilos) para preservar alimentos o prevenir infecciones gastrointestinales, el control biolgico de plagas y patgenos ha sido utilizado en la agricultura de manera emprica desde sus inicios. La razn principal por la cual muchos productos agrcolas no son destruidos completamente por las plagas y las enfermedades es la presencia natural de agentes de control biolgico: organismos capaces de antagonizar con las plagas o patgenos, reduciendo sus efectos nocivos. El desarrollo y aplicacin de este potencial de la naturaleza cobra cada vez mayor importancia, y seguramente tendr un gran impacto en la agricultura en el futuro cercano.La seleccin de microorganismos benficos se basa principalmente: 1) en la habilidad de los antagonistas para colonizar rpidamente la superficie de la fruta y las heridas y persistir en ellas en niveles efectivos, 2) en su capacidad para superar al patgeno en la adquisicin de nutrientes y 3) en que sobreviva y se desarrolle bajo una amplia gama de condiciones ambientales (Wisniewski y Wilson, 1992). Segn Wilson y Wisniewski (1989) y Spadaro y Lodovica (2004) las caractersticas ptimas que debe poseer un antagonista microbiano son las siguientes: genticamente estable, efectivo a bajas concentraciones, no exigente en requerimientos nutritivos, hbil para sobrevivir condiciones adversas del medio ambiente, incluyendo refrigeracin y almacenamiento controlado, efectivo para una amplia gama de microorganismos patgenos en una variedad de frutas y hortalizas, fcil de producir y en medios de bajo costo, fcil de manipular, resistente a los fungicidas, compatible con procedimientos de procesos comerciales, no patognico en el hospedero y que no produzca metabolitos secundarios dainos a la salud humana. (Bautista-Baos, 2006)

I. MECANISMO DE ACCION:

Competencia por nutrientes: La competencia por nutrientes y espacio, son los principales componen tes en el modo de accin de las levaduras antagonistas. Por ejemplo, en ctricos el control potencial de la levadura Pichia guilliermondii en el sitio de infeccin se revirti mediante la adicin de nutrientes exgenos (Arras et al., 1998). En ese estudio, la aplicacin de bajas dosis de glucosa en las heridas del fruto previamente tratadas con Pichia guilliermondii e inoculadas con Penicillium italicum aumentaron la incidencia de la pudricin. Uno de los aspectos que respalda la teora de la competencia por nutrientes esta estrechamente relacionada con aspectos de la maduracin de los frutos, es decir que la disminucin de la actividad del El control biolgico en la reduccin antagonista se reduce drsticamente a medida que el fruto madura. Por ejemplo, en frutos de limn la habilidad de Pseudomona cepacia para disminuir el desarrollo de Penicillium digitatum, se redujo a medida que el fruto cambi de coloracin verde a amarilla, parmetro fisiolgico que indica un avance en la maduracin (El Ghaouth et al., 2002). Resultados similares se reportaron en naranjas y limones en donde la efectividad antagonista microbiana de Candida saitoana fue mayor en frutos de la primera estacin que en los de la estacin tarda (El Ghaouth et al., 2000). Se cree que la disminucin en la actividad del antagonista se debi al incremento en nutrientes disponibles como resultado de los cambios bioqumicos asociados a la maduracin. (Bautista-Baos, 2006)II. CONTROLES BIOLOGICOS QUE SE USARAN:

a) Trichoderma sp

aa) Localizacin del rea de estudio: El presente trabajo se realizara en el laboratorio de Fitopatologa de la UNJBG Tacna.

ab) Microorganismos en estudio: Las cepas nativas de Trichoderma spp. se obtendrn de suelo colectado en las 10 fundos de durazno infectadas con Wilsonomyces carpophilus con grados de incidencias de hasta el 100%, ubicadas en la localidad de Santa Rita, municipio de Calana, Tacna, Per. De cada sitio de muestreo se colectaran cinco submuestras de 1 kg de suelo cada una, bajo el esquema del mtodo cinco de oros (Figura 01), se mezclaran y homogeneizaran, tomndose 1 kg como muestra representativa del sitio. Se considera cada submuestra de suelo de los primeros 20 cm de profundidad, eliminando la materia orgnica superficial (Michel, 2001).

Figura 01: Esquema de divisin de una superficie homognea a muestrear y distribucin de los puntos de muestreo. Mtodo cinco de oros.Fuente: (Elizondo Barron & Castillo Tovar, 2012)

Los aislamientos en el laboratorio se realizaran directamente del suelo por el mtodo de dilucin en placa. El suelo se diluye en proporcin 1/1000 (p/v), de esta suspensin, una alcuota de 0.5 mL se deber dispersar uniformemente sobre la superficie de una placa Petri con el medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA).Las placas se incubaran a 25C, 12 h luz/oscuridad y 40% de humedad relativa por siete das (Michel, 2001). En total se utilizaran 4 cajas Petri por cada muestra de suelo bajo un diseo completamente al azar. Las colonias se reconocern por su crecimiento rpido y las caractersticas morfolgicas observadas al microscopio compuesto (Barnett y Hunter,1972). Para cada muestra de suelo se aislaran y contabilizaran las colonias que apareceran durante los 7 das despus de la siembra. De cada aislamiento se realizaran cultivos monospricos. Las cepas se mantendran a 25C en tubos inclinados con medio de cultivo PDA hasta su uso.

Seleccin de cepas nativas de Trichoderma spp. Utilizando el mtodo del papel celofn (Dennis y Webster, 1971)Se elegirn los aislamientos de Trichoderma spp. con mayor habilidad para inhibir el crecimiento del micelio de W. carpophilus.Papel celofn estril y cortado a la medida de la caja Petri (9.0 cm de dimetro) se debe colocar bajo condiciones aspticas sobre el medio de cultivo PDA, inmediatamente se proceder a inocular cada caja en la parte central con discos de 5 mm de dimetro de cada uno de los diferentes aislamientos de Trichoderma spp. de 10 das de crecimiento. Despus de la inoculacin, las placas se incubaran a 25C, 12 h luz/oscuridad y 40% de humedad relativa por 2 das; pasado este tiempo, el papel celofn con el crecimiento del hongo antagonista se deber retirar cuidadosamente para evitar que esporas del hongo se desarrollaran sobre el PDA.Inmediatamente se inoculara nuevamente el centro de esta misma placa Petri con un disco de 5 mm de W. carpophilus. El cultivo se debe incubar nuevamente a 12 h luz/oscuridad, 25C y 40% de humedad relativa; el dimetro de la colonia se debe medir a los 8, 16 y 24 das despus de la siembra, tiempo en el que el testigo deber cubrir totalmente la placa. El nmero de tratamientos ser de 5 cepas de Trichoderma spp. Obtenidas de las diferentes muestras de suelo, distribuidos bajo un diseo completamente al azar con cuatro repeticiones. La variable a considerar ser el porcentaje de inhibicin del crecimiento del micelio de W. carpophilus, calculado con la siguiente formula:

%inhibicin = [(D1 - D2) / D1] x 100 (Worasatit et al., 1994)

Dnde:D1 = dimetro de la colonia de W. carpophilus creciendo en placas con PDA libre de inhibidores. D2 = dimetro de la colonia de W. carpophilus creciendo en placas donde antes creci Trichoderma spp. sobre el papel celofn.

Actividad antagnica de Trichoderma spp. Sobre Wilsonomyces carpophilus Se utiliz la tcnica de Cherif y Benhamou (1990). Para cada tratamiento en placa Petri con PDA se deposit en un extremo de la caja un disco de 5 mm de dimetro con micelio activo de colonias fungosas de un mes de edad de W. carpophilus, se dejara desarrollar por un perodo de 16 das por su crecimiento lento. Transcurrido este tiempo, en el otro extremo de la caja se depositaran discos de 5 mm de Trichoderma spp. incubndose a 25C, 12 h luz/oscuridad y 40% de humedad relativa. Se tomaran lecturas cada 24 h para determinar el nmero de das al primer contacto entre las hifas de los dos hongos. A los 15 das despus de la siembra de Trichoderma spp. se clasificara el tipo de antagonismo segn Bell et al. (1982)

TIPO DE ANTAGONISMOOBSERVACION

1Trichoderma sobrecrece completamente al patgeno y cubre totalmente la superficie del medio

2Trichoderma sobrecrece las dos terceras partes de la superficie del medio

3Trichoderma y el patgeno colonizan cada uno aproximadamente la mitad de la superficie y ningn organismo parece dominar al otro

4El patgeno coloniza las dos terceras partes de la superficie del medio y parece resistir a la invasin por Trichoderma

5El patgeno sobrecrece completamente a Trichoderma y ocupa la superficie total del medio

El nmero de tratamientos para esta prueba corresponder a las tres cepas de Trichoderma spp. seleccionadas con el porcentaje de inhibicin del micelio de W. carpophilus mas alto, distribuidos bajo un diseo completamente al azar con cuatro repeticiones.

Anlisis estadstico:Los datos obtenidos para cada uno de los ensayos se someteran a un anlisis de varianza y una prueba de comparacin de medias de Tukey (P = 0.05), con el paquete estadstico SPS (2010). En el caso de los datos en porcentajes, antes de someterlos al ANOVA y prueba de Tukey, se les realizara la transformacin angular de X + 0.5

b) Pseudomonas sp.

ba) Localizacin del rea de estudio: El presente trabajo se realizara en el laboratorio de Fitopatologa de la UNJBG Tacna.

bb) Microorganismos en estudio: Para el aislamiento de cepas ambientales se partira de muestras de agua y tierra recogidas en el entorno hospitalario, que fueron tranportadas al laboratorio donde se procesaran de la siguiente manera:

Se inocula medio TSB (1:10) con cada una de las muestras recogidas y se incubaran durante 24 horas a 37 C (Enriquecimiento de las muestras). Los cultivos enriquecidos se utilizan para inocular de GSP Agar, mediante la utilizacin de un hisopo esteril. Las placas de GSP se incuban durante 24 horas a 37 C, y las colonias a obtener sern resembradas e identificadas.Las colonias de color azul violeta (presunta Pseudomonas spp) sern aisladas e identificadas siguiendo mtodos microbiolgicos estndar.Una vez aislado el antagonista. Se preparara 1 Erlenmeyer con 150mL de caldonutritivo (HIMEDIA Nutrient agar ) estril .Se incub a temperatura ambiente por cinco das. Para la preparacin del grupo antagonista en solucin se sembraran 50mL de caldo previamente inoculado con el antagonista con un tiempo de crecimiento de 72 horas y se incubara a temperatura ambiente durante 5 das. Luego se realizara el recuento de las UFC/mL.

Actividad antagnica de Pseudomonas spp. Sobre Wilsonomyces carpophilus:Para estudiar el efecto del antagonista sobre el crecimiento de W. carpophilus en medio slido (placa petri) se utilizara el mtodo Kirby-Bauer o difusin en agar, donde se sembrara por extensin con esptula de Drigalsky en tres placas de agar Sabouraud, 0,1 mL de cada fitopatgeno con una concentracin de 102 UFC/mL. Inmediatamente, se tomaron discos de papel de filtro de 5mm de dimetro con una pinza estril y se sumergira en la suspensin del antagonista a una concentracin de 102 UFC/mL, para luego sembrarse sobre las placas. Se incubara durante cinco das a temperatura ambiente.

Anlisis estadstico:Los datos obtenidos para cada uno de los ensayos se someteran a un anlisis de varianza y una prueba de comparacin de medias de Tukey (P = 0.05), con el paquete estadstico SPS (2010). En el caso de los datos en porcentajes, antes de someterlos al ANOVA y prueba de Tukey, se les realizara la transformacin angular de X + 0.5

c) Streptomyces sp:Las bacterias de gnero Streptomyces son muy abundantes en el suelo.Muchos miembros de esta familia prefieren los suelos neutros o alcalinos. Otros utilizan suelos cidos como hbitat natural. Se los encuentra entre los principales productores de compuestos bioactivos y de enzimas extracelulares. Pueden liberar a su entorno enzimas que le permiten utilizar materiales orgnicos como algodn, lana, hidrocarburos y goma. Adems pueden degradar polmeros naturales como lignina (Anderson y Wellington, 2001; Madigan, 2005; Kmpfer, 2006).Su efectividad como agente de biocontrol ha sido probada contra bacterias, hongos y algunos protozoos y nematodes (Dicklow y col., 1993; Coelho y col., 1995; Trejo-Estrada y col., 1998; Kim y col., 1999; Ouchdouch y col., 2001).

ca) Localizacin del rea de estudio: El presente trabajo se realizara en el laboratorio de Fitopatologa de la UNJBG Tacna.

cb) Microorganismos en estudio:

Aislamiento, recuento e identificacin de Streptomyces:El aislamiento de cepas de Streptomyces se realizara utilizando la tcnica de Panthier y col. (1979) a partir de muestras de suelo (campos de produccin de cereales, campos sin labranza y huertas orgnicas) del Distrito Calana, provincia de Tacna.Las muestras de 10g de suelo seran molidas en mortero estril adicionando una pequea alcuota de agua. Este homogenizado sera transferido a un erlemeyer con 90ml de agua fenolada. La suspensin debe agitarse 10min en agitador mecnico (110 golpes/min). Se realizaran diluciones sucesivas 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 en agua. Alcuotas de 100l de cada una de ellas seran sembradas sobre placas de APD adicionado con cicloheximida (200mg/l). Las placas se incubaran a 28C durante 7 das.Se debe realizar el estudio macro y micromorfolgico de las colonias desarrolladas.Aquellas que presenten caractersticas compatibles con el gnero Streptomyces seran inoculadas en APD e incubadas durante 7das a 28C. Se realizaran suspensiones de esporos en caldo PD adicionado con glicerina en csp 20% V/V. Las suspensiones deben conservarse a -20C para estudios posteriores (Korn-Wendisch y Kutzner, 1992; Williams y col., 1989).

Ensayos de interaccin Streptomyces W. carpophilus:Cada uno de los Streptomyces aislados se sembrara por estras en placas de APD e incubado 48h a 28C. A cada una de las placas se les inoculara por rociado con una suspensin 106conidios/ml de cada HT/HP. Luego de 7 das de incubacin a 28C se registra el dimetro de las zonas de inhibicin (Z) producidas por los Streptomyces sobre el desarrollo de las cepas fngicas (Fig 02).

FIGURA 02: Esquema BC para ensayar la actividad biolgica de P

Ensayos de interaccin BAL-HT/HP/Streptomyces:Las cepas de BAL, conservadas a -20C, seran repicadas a caldo MRS e incubadas a 30C toda una noche. A partir de tales cultivos se sembraran estras de 2 cm de longitud sobre placas de agar MRS que se incubaran 48h a 30C en anaerobiosis. Dichas placas fueron luego cubiertas con una preparacin de APD soft conteniendo 105conidios/ml de cada uno de los HT/HP/Streptomyces. Las placas seran luego incubadas aerbicamente a 30C por 5 das determinndose en ese momento el dimetro de la zona de inhibicin (Z) alrededor de las estras (Fig 02) (Magnusson y Schnurer, 2001).

d) Oregano:

da) COLECTA DEL MATERIAL VEGETAL:Las hojas de organo (Origanum vulgare) sern colectados en predios de CPM. Los Palos, Tacna, Per los cuales sern trasladados en bolsas de plstico al Laboratorio de Qumica Orgnica, Facultad de Ciencias, UNJBG para la preparacin del extracto.

db) OBTENCIN DE EXTRACTO VEGETAL:Se emplearan 300 g de material fresco por litro de solvente. Se obtendr el hidrolato del organo.

dc) METODO:Hidrolato por destilacin: para el proceso de extraccin se utiliz el material vegetal fresco, bien picado y macerado, en un solvente que consiste de una solucin de agua y alcohol etlico (10:1). Para obtener el extract se emplea un destilador adaptado para este fin. El material vegetal se coloc dentro de la marmita del destilador junto con el solvente, se tap hermticamente para hacer el proceso de extraccin continuo mediante la aplicacin de calor y presin constante, el vapor fue conducido a un condensador y mediante enfriamiento con agua corriente se obtuvo el hidrolato.

dd) DISEO EXPERIMENTAL:Los tratamientos seran distribuidos en un diseo completamente al azar, con cinco repeticiones cada uno; la unidad experimental consiste en una placa de petri. En todas las pruebas se incluy un testigo absoluto. Para determinar los efectos de los tratamientos estudiados, a los datos obtenidos se les practicara un anlisis de varianza y la prueba de comparacin de Tukey al 5%.

5. PRUEBA DE FUNGICIDAS EN INVERNADERO:Se realiz despus de seleccionar los fungicidas en la prueba in vitro. Para esto se procedi dela siguiente manera:

a. Preparacin del sustrato:El sustrato, suelo arena (1:1), fue esterilizado con bromuro de metilo. Luego de quince das de ventilado se humedeci a capacidad de campo para la inoculacin.

b. Preparacin del inculo:El hongo, W. carpophilus, se sembrara en placas petri con PDA y de all se sembr en medio lquido caldo de Papa-Dextrosa-Oxitetraciclina (PDO) previamente esterilizado. Despus de 30 das de incubacin a 25 C, se licu a baja velocidad para fragmentar el micelio y homogenizar la mezcla.

c. Preparacin de las semillas:Las plntulas de durazno se desinfestaran con los fungicidas seleccionados en la prueba in vitro a la dosis comercial recomendada.Las plntulas del testigo no fueron tratadas con fungicida alguno.

d. Inoculacin:La inoculacin del sustrato se realizara agregando 10 cc. de licuado por cada kilogramo de suelo estril, el cual se distribuy en bolsas plsticas transparentes de poliestireno y se dejaran incubar a la sombra por un periodo de 30 das con la finalidad de que el hongo se establezca en el sustrato.

e. Siembra:El suelo inoculado e incubado se distribuy en macetas de un kilogramo y se sembraron las plntulas desinfestadas. Se emple el Diseo Completo al Azar con 9 tratamientos (plntulas desinfectadas) y un testigo (plntulas sin desinfectar), con cinco repeticiones cada uno. En cada repeticin se sembraron aproximadamente 1 plntula.

f. Evaluaciones:Las evaluaciones de realizaran a los treinta das, midindose los siguientes parmetros: hojas con sntoma y hojas sin sntomas

7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

PDF:

Coca Mario. Boletn tcnico Enfermedades del fruto en durazno. Recuperado el 25 de septiembre de 2013 de: http://www.agr.umss.edu.bo/documentos/754852294ARCHIVOSI.pdf Desmond R. Layne y Daniele Bassi. The Peach: Botany, production and uses. Biddles: Kings Lynn. 2008. Dr. Victor Manuel Coria Avalos, Dr. Jose Luciano Morales Garcia, Ing. Juan Jose Alcantar Rocillo. ENFERMEDADES DEL DURAZNO Prunus prsica (L.) Batsch. EN MICHOACAN. F.T. Arroyo; J.F. Herencia; C. Santamara; M. Castejn; A. Daza. INCIDENCIA DEL CRIBADO EN DIFERENTES CULTIVARES DE CIRUELO JAPONS EN CULTIVO ECOLGICO. IFAPA Centro Las Torres-Tomejil. Junta de Andaluca - Espaa. Ing. M Sc. Cadenas. Universidad Nacional Agraria la Molina. FITOPATOLOGIA GENERAL. Dpto. Academico de Entomologia y Fitopatologia. Ing. Luis Miguel Colonia Coral. Universidad Nacional Agraria la Molina. MANEJO INTEGRADO DE PLAGAS EN EL CULTIVO DE MELOCOTN. Pichupampa Leoncio Prado Huaura Lima, Peru 2012. Ing. Vladimir Humberto Baza Avelar. Programa Nacional de Frutas de El Salvador. GUA TCNICA DEL CULTIVO DEL MELOCOTN. Santa Tecla, El Salvador, octubre de 2004. Ing. Agr. Walter Nievas, INTA - EEA Alto Valle - Coord. del rea Desarrollo Rural, wnievas@correo.inta.gob.ar. Ing. Agr. Carmina Besada, INTA - AER Valle Medio - Cambio Rural, cbesada@correo.inta.gob.ar. EL CULTIVO DE DURAZNEROS Y PELONES EN EL VALLE MEDIO DEL RIO NEGRO. Argentina, septiembre 2012. Klever M.Garcia Snchez. "MANUAL CULTIVO DE DURAZNO" EN LAS PROVINCIAS DE HUANUCO y PACHITEA 2013. Milagro Mata H. Loengrin Umaa T. Jose Luis Chaves C. PROTOCOLO PARA LA RECOLECTA, DESCRIPCION, IDENTIFICACION Y MANTENIMIENTO DE HONGOS. Museo Nacional de Costa Rica. Agosto, 2006. Organismo Pblico Sierra Exportadora. DURAZNO FRESCO. Lima Per

Pginas web:

http://www.sinavimo.gov.ar/plaga/wilsonomyces-carpophilus http://www.infoagro.com/frutas/frutas_tradicionales/melocoton2.htm http://www.larepublica.pe/07-03-2013/no-se-exporta-durazno-de-calana-por-baja-produccion

02 de Setiembre del 2014

Firma de los alumnosFirma del Asesor de Tesis