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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el

anhelo de buscar la verdad y la justicia”

 

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA DE CEPAS NATIVAS DE ACTINOMICETOS Y SU EFECTO ANTAGÓNICO SOBRE MICROORGANISMOS

FITOPATÓGENOS

DIANA MARCELA FARFÁN AYALA CAROLINA GUTIÉRREZ TRIVIÑO

APROBADO

____________________________ _____________________________ María Ximena Rodríguez Ph.D. Marcela Franco Correa Ph.D. Directora Co-Directora _____________________________ _____________________________ Balkys Quevedo. Profesor Asociado Ivonne Gutiérrez. Profesor Asistente Jurado Jurado

 

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA DE CEPAS NATIVAS DE ACTINOMICETOS Y SU EFECTO ANTAGÓNICO SOBRE MICROORGANISMOS

FITOPATÓGENOS

DIANA MARCELA FARFÁN AYALA CAROLINA GUTIÉRREZ TRIVIÑO

APROBADO

_____________________________ _____________________________ INGRID SCHULER JANETH ARIAS Decana Académica Directora de Carrera Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias

i 

 

DEDICATORIA

Este trabajo está dedicado a todos los que han aportado a nuestra formación a lo largo de la vida. A Dios por ser nuestra guía y brindarnos la fortaleza espiritual. A nuestros padres y

hermanos por su apoyo permanente, por la confianza que han depositado en nosotras y el inmenso amor que nos han dado. A nuestros amigos por los buenos consejos y enseñanzas

y a Ximena y Marcela por haber creído en nosotras hasta el final. Para ustedes, todos los frutos de esta experiencia.

ii 

 

AGRADECIMIENTOS

MARIA XIMENA RODRÍGUEZ, Docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por haber direccionado el desarrollo del proyecto de manera permanente, por sus enseñanzas, dedicación, comprensión, paciencia, confianza y motivación.

MARCELA FRANCO CORREA, Docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por su comprensión, apoyo, explicaciones y aportes a lo largo del proceso.

A NUESTROS AMIGOS DEL LABORATORIO Yeimy Rivera, Susana Díaz, Carolina Mazo, Diana Vega, Carolina Ortiz, Andrés Hernández Y Rodrigo Muñoz, por los favores realizados y por su apoyo incondicional que permitió la culminación de este proyecto.

A Mile, Paola y Juan David, del laboratorio de aguas por su paciencia y colaboración en todos los momentos de dificultad.

GISELA, por su asesoría en los análisis estadísticos.

A INESITA Y RUCA por habernos consentido tanto y salvarnos de unas cuantas.

iii 

 

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN 1

2. MARCO TEÓRICO 3

2.1. El suelo y su composición 3

2.2. Actinomicetos 5

2.2.1. Características generales 5

2.2.2. Condiciones de crecimiento 8

2.2.3. Composición química 8

2.2.4. Aplicación industrial 10

2.3. Control Biológico 10

2.3.1. Actinomycetes como Agentes Biocontroladores 12

2.3.2. Mecanismos de antagonismo 14

2.3.3. Hongos Fitopátogenos 17

2.3.3.1. Fusarium oxysporum 17

2.3.3.2. Fusarium roseum 18

2.3.3.3. Rhizoctonia solani 18

2.4. Actividades hidrolíticas para control de hongos patógenos 19

2.4.1. Quitinasas 19

2.4.1.1. Producción de Quitinasas 23

2.4.1.2. Uso Biotecnológico de las Quitinasas 24

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 26

4. OBJETIVOS 28

5. METODOLOGÍA 29

5.1. Reconstitución de cepas de actinomicetos 29

5.2. Evaluación de actividad quitinolítica 29

iv 

 

5.2.1. Preparación quitina coloidal 29

5.2.2. Diálisis de la quitina coloidal 30

5.2.3. Evaluación de producción de quitinasas en placa 31

5.2.3.1. Selección de cepas quitinolíticas 31

5.2.3.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad

quitinolítica 32

5.2.3.3. Determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica 32

5.3. Ensayo de la estandarización para la evaluación cuantitativa de la actividad quitinolítica 33

5.3.1. Curvas de calibración para la cuantificación de N-acetilglucosamina y proteínas 33

5.3.2. Determinación del agente precipitante de las proteínas 33

5.3.3. Estandarización de las variables físicoquímicas para la evaluación de la 34

actividad enzimática

5.4. Ensayo de la actividad antifúngica in vitro 37

5.5. Análisis estadístico 38

6. RESULTADOSY DISCUSIÓN 39

6.1 Reconstitución de cepas de actinomicetos 39

6.2. Evaluación de la actividad quitinolítica 41

6.2.1. Medio de cultivo 41

6.2.2. Evaluación de la producción de quitinasas en placa 41

6.2.2.1. Selección de las cepas quitinolíticas 41

6.2.2.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la

actividad quitinolítica 43

6.2.2.3. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica 44

6.3. Estandarización de la prueba para la evaluación cuantitativa de la actividad Quitinolítica 51

6.3.1. Determinación del agente precipitante de las proteínas 51

6.3.2. Estandarización de las variables físicoquímicas para la evaluación de la

v 

 

actividad enzimática 53

6.4. Ensayo de actividad antifúngica in vitro 64

7. CONCLUSIONES 75

8. RECOMENDACIONES 77

9. BIBLIOGRAFÍA 79

10. ANEXOS 101

vi 

 

ÍNDICE DE TABLAS

Nª TABLA PÁG.

 

2.1. Tipos de paredes celulares de los actinomicetos 9

6.1. Detección de microorganismos quitinolíticos en medio mínimo

suplementado con quitina coloidal al 1% 43

6.2. Agrupamiento de Duncan para áreas bajo la curva-Área de

halo de hidrólisis para la actividad quitinolítica en placa 47

6.3. Agrupamiento de Duncan para medición de halo de

hidrólisis durante 9 días de evaluación 48

6.4. Agrupamiento de Duncan para días de medición 49

6.5. Agrupamiento Duncan para la comparación de halos de

hidrólisis de quitina por día 50

6.6. Evaluación agentes precipitantes de proteínas 51

6.7. Concentración de proteína extracto crudo Cepa 25 y Cepa Control 63

6.8. Agrupamiento Duncan de los promedios de los porcentajes de

inhibición de crecimiento radial, para Rhizoctonia sp. enfrentando

a los aislamientos de actinomicetos 66

6.9. Agrupamiento de Duncan de los promedios de los porcentajes

de inhibición de crecimiento radial, para Fusarium sp. enfrentando

a los aislamientos de actinomicetos 68

6.10. Correlación Pearson para porcentaje de inhibición de crecimiento radial para

Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. y área bajo la curva de

vii 

 

producción de quitinasas en ensayo en placa 72

viii 

 

ÍNDICE DE FIGURAS

Nª FIGURA PÁG.

2.1. Estructura molecular de la quitina 19

2.2. Reconocimiento y degradación de la quitina por microorganismos 21

quitinolíticos

5.1. Preparación quitina coloidal 30

5.2. Diálisis de la quitina coloidal 31

5.3. Montaje enfrentamiento dual actinomiceto/hongo.

A. Actinomiceto, B. Hongo fitopatógeno 38

6.1. Aspecto macroscópico cepas 7,8 y 3, crecidas en agar Avena 39

6.2. Hidrólisis de quitina coloidal en placa 43

6.3. Evaluación de la concentración de quitina cepa 4, 12 y 26. A. 0.5%,

B. 1%. C. 2% 46

6.4. Evaluación de la actividad quitinolítica semicuantitativa. A. cepa 26.

B. cepa Control. C. cepa 22 47

6.5. Inducción de quitinasas cepa 25 y Control, empleando medio

quitina coloidal y medio quitina en polvo 54

6.6. Evaluación de la actividad enzimática y específica de las cepas

Control (C) y 25 57

6.7. Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia sp. para cepas

ix 

 

de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición 66

6.8. Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia sp. para

cepas de actinomicetos con los más bajos porcentajes de inhibición 67

6.9. Crecimiento libre de Rhizoctonia sp. en medio YGC 67

6.10. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas

de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición mcelial 68

6.11. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas

de actinomicetos con el más bajo porcentaje de inhibición 69

6.12. Crecimiento libre de Fusarium sp. en medio YGC 69

6.13. Técnica de enfrentamiento dual actinomiceto/hongo para la cepa

Control, A. 67.41% de inhibición micelial de Rhizoctonia sp. B. 64.17%

de inhibición micelial de Fusarium sp 69

6.14. Difusión de metabolitos secundarios en agar PDA, cepa 4 72

x 

 

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO PÁG.

1. Aislamiento e identificación microscópica y macroscópica de cepas de

actinomicetos 101

2. Medios de cultivo 110

3. Curva Patrón para la cuantificación de azúcares reductores en términos

de N- acetilglucosamina 113

4. Curva Patrón para la cuantificación de proteínas, empleando Suero

albúmina de bovino (BSA) como proteína standard 115

5. Valores de medición en milímetros del diámetro de halos de hidrólisis en

agar quitina coloidal al 1% 117

6. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica. Análisis de

varianaza (ANOVA) 118

7. Estandarización de prueba para la evaluación cuantitativa de la

Actividad Quitinolítica 121

8. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR). Enfrentamiento cultivo

dual actinomiceto/hongo fitopatógeno 123

xi 

 

9. Porcentaje de inhibición de crecimiento radia. Análisis de varianza (ANOVA) 124

xii 

 

RESUMEN

El papel ecológico de los actinomicetos en la rizosfera como microorganismos antagonistas

ha generado gran interés en los últimos años. En el presente estudio se evaluó la producción

de enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas por parte de cepas nativas de actinomicetos y su

posible efecto antagónico sobre microorganismos fitopatógenos, Rhizoctonia sp. y Fusarium

sp. En primer lugar se realizó un screening a partir del banco de trabajo constituido por 23

cepas con el fin de determinar cuales presentaban actividad quitinolítica, las cepas fueron

sembradas por método de estría en medio mínimo suplementado con quitina coloidal 1% pH

6.8; 19 de las 23 cepas evaluadas mostraron zona de hidrólisis después de 5 días de

incubación a 25ºC, siendo consideradas preliminarmente como productoras de quitinasas.

Para determinar la concentración más baja de quitina que permitía una mejor visualización

de la hidrólisis enzimática, las cepas 4, 12 y 26 seleccionadas aleatoriamente fueron

sembradas en medio mínimo suplementado con tres concentraciones de quitina coloidal 0.5,

1 y 2%, la concentración de 1% fue la seleccionada para continuar con el ensayo en placa.

Para evaluar la actividad quitinolítica de las 19 cepas seleccionadas se realizó una prueba

semicuantitativa en placa; para su efecto, en medio mínimo quitina coloidal al 1% se

realizaron 4 pozos equidistantes en los cuales se adicionaron 5 µL de un inóculo a una

concentración de 107 cél·mL-1, posteriormente las placas de petri se llevaron a incubar a una

temperatura de 25 ºC por un período de 9 días. Las cepas 24 y 22 presentaron los

promedios de diámetros de halos de hidrólisis más significativos 8,13 y 7,50 mm

respectivamente, en comparación a las demás cepas en estudio; por el contario las cepas

11, 19 y 1 presentaron los promedios de diámetros de halo de hidrólisis más bajos o no

evidenciables. Las cepas control y 25 fueron seleccionadas aleatoriamente para realizar la

estandarización para la evaluación cuantitativa de la actividad quitinolítica. El medio quitina

coloidal al 0.5% demostró ser el medio más adecuado para la inducción de producción de

quitinasas después de 7 días de agitación a temperatura ambiente, encontrándose la mayor

cantidad de azúcares reductores en comparación al medio quitina en polvo al 1.5%. Las

variables temperatura (40 y 50ºC) y proporción enzima/sustrato (1:1, 1:2 y 1:4) mostraron no

generar ninguna influencia sobre la actividad enzimática y actividad enzimática específica

para las dos cepas evaluadas. Adicionalmente se evaluó el efecto que generaba la

precipitación de proteínas con acetona en el proceso de preparación de extracto enzimático,

encontrándose que ésta no concentró la enzima en la medida esperada. La máxima

actividad enzimática específica alcanzada para la cepa 25 fue de 67,944 U/g, mientras que

un valor más bajo se obtuvo para la cepa control (60, 22 U/g). Finalmente se evaluó el efecto

xiii 

 

antagónico de 13 cepas de actinomicetos sobre Rhizoctonia sp y Fusarium sp, para ello se

realizó un enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo fitopatógeno. Las cepas

11, 7 y 4 presentaron los porcentajes de inhibición de crecimiento radial más altos para

Rhizoctonia sp. con valores de 84.44, 74.07 y 68.89% respectivamente; para el caso de

Fusarium sp, las cepas 7, 8, 16,12 y 11 generaron la mayor inhibición sobre su crecimiento

radial, en donde los PICR obtenidos fueron 86,67, 84,17, 82, 50, 80,83 y 80%

respectivamente. Se realizó una correlación entre los valores de área bajo la curva obtenidos

en la determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica y los porcentajes de

inhibición de crecimiento radial (PICR) con el fin de identificar la relación existente entre

éstas dos variables. Los resultados mostraron una correlación de -0.264 entre las variables

área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Rhizoctonia

sp. y de -0.505 entre área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de

inhibición para Fusarium sp., indicando que posiblemente en el efecto antagónico generado

también estuvieron involucrados otros mecanismos adicionales a la acción de las quitinasas.

Palabras claves: actinomicetos, quitinasas, quitina coloidal, antagonismo, fitopatógenos,

Rhizoctonia sp., Fusarium sp.

xiv 

 

ABSTRACT

Actinomycetes ecological roll, at rhizosphere, as antagonistic microorganisms has developed

a huge interest in the last years. This study evaluated the production of hydrolytic enzymes,

chitinases, by native actinomycetes strains and their possible antagonist effect against

phytopathogens (Rhizoctonia sp. and Fusarium sp.) The first step was a screening of the

native actinomycetal strains bank, comprising 23 strains, in order to determine chitinolytic

activity. The strains were inoculated by streaking in a minimal medium supplemented with 1%

colloidal chitin (pH 6.8); 19 of 23 evaluated strains showed a hydrolysis area after 5

incubation days at 25ºC, preliminarily considering them as chitinases producers. In order to

determine the lower chitin concentration which allow the better enzymatic hydrolysis

observation, strains 4, 12 and 26, randomly selected, were inoculated in minimal media

supplemented with 0.5, 1 y 2% colloidal chitin, concentration of 1% was selected for plate

enzymatic assay. A semi quantitative plate assay was performed to test the chitinolytic

activity of the 19 selected strains; to develop this 4 wells were done on a 1% colloidal chitin

minimal medium plate and then inoculated with 5 µL of a cells suspension (107 cell·mL-1). The

plates were incubated at 25 ºC for 9 days. Strains 24 and 22 showed the most significant

hydrolysis halos (8.13 and 7.50 mm, respectively); contrarily strains 11, 19 and 1 did not

show or showed the smaller hydrolysis halos. Then, strains 25 and control were selected for

quantitative chitinolytic activity assay standardization. The higher enzyme activities were

observed with colloidal chitin (0.5%) medium extracts, after 7 days shaking at room

temperature, compared to chitin powder (1.5%) medium extracts. Variables like temperature

(40 and 50ºC) and enzyme/substrate proportion (1:1, 1:2 y 1:4) did not influence the

enzymatic activity for both strains. Additionally, the effect of acetone protein precipitation in

the enzyme extract preparation was evaluated, determining that acetone did not concentrate

proteins as expected. The maximum specific enzymatic activity was reached by strain 25 with

67.944 U/g, while control strain rendered 60.22 U/g. Finally, the antagonist effect of 13

actinomycetal strains towards Rhizoctonia sp and Fusarium sp. was evaluated by dual

cultures actinomycete/fungal phytopathogen. The highest radial growth inhibition

percentages for Rhizoctonia sp., 84.44, 74.07 and 68.89% corresponded to strains 11, 7 and

4, respectively. In the case of Fusarium sp, strains 7, 8, 16, 12 and 11 showed the maximum

inhibition percentages, 86.67, 84.17, 82.50, 80.83 and 80% respectively. A correlation test

between the area under the curve values, obtained for semi quantitative chitinolytic activity,

and radial growth inhibition percentages were performed in order to identify the correlation

between this two variables. The results showed a correlation value of -0.264 between

xv 

 

chitinolytic activity and Rhizoctonia sp. inhibition, and -0.505 between chitinolytic activity and

Fusarium sp. inhibition, suggesting that the antagonist effect involves additional mechanism

rather than chitinases activity.

Key words: actinomycetes, chitinases, colloidal chitin, antagonisms, phytopathogens,

Rhizoctonia sp., Fusarium sp.

1 

 

1. INTRODUCCIÓN

La rizosfera es un hábitat propicio para el desarrollo de los microorganismos. Son muchas

las poblaciones microbianas que se encuentran asociadas a esta zona del suelo. Las

interacciones entre los microorganismos del suelo y las raíces de las plantas satisfacen los

requerimientos nutritivos básicos para la planta y para las comunidades microbianas

asociadas a ellas (Atlas, 2002). La estructura del sistema radicular contribuye a establecer la

población microbiana en la rizosfera por medio de los exudados radiculares liberados; estos

exudados consisten en una amplia variedad de componentes y sustratos simples de bajo

peso molecular como azúcares, compuestos fenólicos, aminoácidos, ácidos orgánicos y

otros metabolitos secundarios, y componentes de alto peso molecular tales como proteínas

(Sullivan, 2004). Dependiendo de la naturaleza de los componentes en los exudados

radiculares, estos pueden participar en la activación de genes microbianos responsables del

reconocimiento e iniciación de la asociación simbiótica o actuando simplemente como una

fuente de nutrientes y energía para los microorganismos (Sullivan, 2004). Las interacciones

entre las raíces y los microorganismos de la rizosfera se basan principalmente en la

modificación interactiva del ambiente del suelo por procesos como captación de agua por la

planta, liberación de compuestos orgánicos al suelo por las raíces, biodegradación de la

materia orgánica, captura de nutrientes minerales por parte de los microorganismos y

producción microbiana de factores de crecimiento vegetales (Atlas, 2002).

Se han realizado diversos estudios acerca de las interacciones entre plantas y actinomicetos

(Weller, 1988; Benson y Silvester, 1993; Tanaka y Omura, 1993; Locci, 1994),

determinándose que las asociaciones entre estos microorganismos y la raíz de la planta

pueden ser deletéreas o benéficas. Mientras que algunos actinomicetos secretan

compuestos herbicidas o causan daños tales como erupciones en el tejido vegetal, otros

pueden fijar nitrógeno atmosférico simbiótica y no simbióticamente o proteger las raíces

contra las infecciones fúngicas y bacterianas (Valois et al., 1996).

Mediante microorganismos antagonistas se puede llegar a disminuir la actividad de los

patógenos causantes de enfermedades. Esto se consigue mediante la acción directa o

indirecta que ejerce el organismo biocontrolador sobre el patógeno, por medio del efecto que

genera sobre el hospedero o el ambiente donde se desarrolla, causando así una acción

significativa en la interrelación hospedero-patógeno y ambiente. Esta acción puede afectar

2 

 

las estructuras de supervivencia del patógeno y disminuir la gravedad de la infección de éste

sobre el hospedero (Goodfellow y Williams, 1983). El parasitismo sobre hongos patógenos,

facilitado por la producción de enzimas hidrolíticas, está involucrado en el control biológico

de enfermedades fúngicas. Entre las enzimas hidrolíticas, las quitinasas son las de mayor

importancia ya que la quitina es el principal constituyente estructural de la pared celular en la

mayoría de los hongos fitopatógenos. Las quitinasas inhiben la germinación de propágulos y

la elongación del tubo germinal, adicionalmente participan lisando las hifas (Ji y Ku, 1996;

Boer et al., 1998; Kishore et al., 2005).

Las cepas biocontroladoras con una alta expresión de quitinasas, presentan una buena

actividad antifúngica; por el contrario, aquellos microorganismos deficientes en cuanto a la

producción de éstas enzimas muestran tener una actividad antifúngica pobre y una baja

habilidad en el control de la enfermedad (Kishore et al., 2005).

Esta investigación busca determinar la capacidad de cepas nativas de actinomicetos para

producir enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas. Adicionalmente pretende evaluar el efecto

antagónico de estos microorganismos sobre algunos hongos fitopatógenos, de tal manera

que en un futuro pueda ser establecida la relación existente entre las enzimas producidas y

el antagonismo generado por aquellas cepas en las cuales así sea evidenciado.

3 

 

2. MARCO TEÓRICO

2.1. EL SUELO Y SU COMPOSICIÓN

El suelo corresponde a la parte más externa de la corteza terrestre, este puede ser

considerado como un sistema de interacción entre una fase sólida, formada por materia

mineral y orgánica, una fase líquida, y una fase gaseosa. La materia mineral se origina a

partir de las rocas del subsuelo y los procesos edáficos que hayan tenido lugar en su

formación. La materia orgánica procede de la actividad de los organismos vivos del suelo, la

composición y cantidad resulta ser variable. Este sistema complejo alberga una gran

cantidad y variedad de especies vegetales, animales y microbianas (Cavaletti et al., 2006).

Los organismos del suelo establecen relaciones entre ellos de formas variadas y complejas,

contribuyendo también a las características propias del suelo modificando las fases sólida,

líquida y gaseosa del mismo. Los microorganismos resultan ser de gran importancia pues se

relacionan con procesos de edafogénesis; ciclos biogeoquímicos de elementos como el

carbono, el nitrógeno, el oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros metales; fertilidad de

las plantas, protección frente a patógenos, degradación de compuestos xenobióticos, entre

otros (Nogales, 2005). Se considera que el suelo es uno de los ambientes más complejos en

cuanto a vida microbiana se refiere, éste contiene cerca de 109 células bacterianas (por

gramo) y un estimado de 104 especies microbianas distintas por gramo (Cavaletti et al.,

2006).

La rizosfera es el volumen de suelo inmediato a las raíces de las plantas. Interacciones entre

planta, suelo, microorganismos y microfauna, presentes en ésta parte del suelo, generan

una significativa influencia en el crecimiento de las plantas y por ende en el rendimiento de

los cultivos (Antoun y Prevost, 2005). En comparación a las demás partes del suelo el

número de microorganismos en la rizosfera es sustancialmente más alto debido a la

influencia de las plantas; así mismo se presentan modificaciones constantes en la

biodiversidad de los microorganismos generados por los cambios físicos, químicos o

biológicos en las raíces de las plantas o por las excreciones y desechos orgánicos

producidos por éstas (Antoun y Prevost, 2005).

4 

 

Los rizodepósitos de varios exudados, tejidos muertos y raíces en senescencia proveen un

sustrato importante para la comunidad microbiana del suelo generándose un complejo en el

que se relaciona la comunidad con la cantidad y tipo de compuestos liberados. No solo los

rizodepósitos son rápidamente utilizados por los microorganismos, la adición de éstos al

suelo puede también acelerar la descomposición de materia orgánica en el suelo. (Gregory,

2006).

La rizodeposición genera una rizosfera con diferentes niveles y tipos de sustratos

microbianos en comparación al resto del suelo. Esto resulta en una rizosfera que contiene

diferentes poblaciones de bacterias, actinomicetos, hongos, protozoos, virus y nematodos

(Gregory, 2006).

Las raíces liberan un amplio rango de componentes orgánicos, aunque los azúcares y

polisacáridos, ácidos orgánicos y aminoácidos, péptidos y proteínas constituyen la mayor

parte de los rizodepósitos, gran parte de la investigación ha demostrado que otros

compuestos liberados por las raíces pueden actuar como mensajeros que comunican e

inician las interacciones raíz-raíz, raíz-microorganismo y raíz-fauna (Walker et al., 2003). Las

interacciones raíz-microorganismo y raíz-insecto pueden ser positivas (simbióticas) o

negativas para la planta; ellas involucran intercambio y percepción de señales, seguido por

la invasión de la planta por el microorganismo o insecto y cambios estructurales resultantes

de la interacción (Fray, 2002).

Las raíces de las plantas también pueden liberar compuestos que son capaces de

interrumpir la comunicación con las bacterias, reduciendo así su susceptibilidad a la

infección (Fray, 2002). Las bacterias de la rizosfera o rizobacterias se multiplican y colonizan

rápidamente las raíces de las plantas, así como todos los nichos ecológicos que se

desarrollan durante las etapas del crecimiento de éstas. La presencia de estas bacterias en

las raíces puede generar un efecto neutral, benéfico o perjudicial en su desarrollo. Algunas

rizobacterias pueden ocasionar efectos adversos como la producción de fitotoxinas,

descenso de nutrientes disponibles o la inhibición del proceso de micorrización. Por otro

lado, estas bacterias pueden estimular el crecimiento de la planta empleando diferentes

mecanismos como la fijación de nitrógeno atmosférico, la síntesis de hormonas vegetales, la

solubilización de minerales y la síntesis de enzimas. Estas bacterias pueden también

generar modificaciones en la pared celular vegetal dando lugar a cambios bioquímicos y

5 

 

fisiológicos en las plantas; adicionalmente se encuentran involucradas en los mecanismos

de defensa de éstas, pudiéndose generar interacciones entre rizobacterias y patógenos,

rizobacterias y planta y/o rizobacterias y rizosfera (Siddiqui, 2005).

2.2. ACTINOMICETOS

Los actinomicetos representan un grupo ubicuo de microorganismos ampliamente distribuido

en ecosistemas naturales y presentan gran importancia por su participación en la

degradación de materia orgánica (Ghanem et al., 2000). Estos microorganismos resultan ser

abundantes en suelos, sin embargo, también son encontrados en ambientes acuáticos,

dulces y marinos (Leiva et al., 2004), dentro de sus características particulares presentan un

olor típico a suelo húmedo, debido a su actividad metabólica y a la producción de

terpenoides, pigmentos y enzimas extracelulares con las que son capaces de degradar

materia orgánica de origen vegetal y animal (Ezziyyani et al., 2004).

2.2.1. Características generales

Los actinomicetos constituyen un grupo heterogéneo de microorganismos; son bacterias

Gram positivas que se caracterizan por formar filamentos ramificados. El orden de los

Actinomicetales comprende 63 géneros constituyendo, aproximadamente del 20-60% de la

población microbiana del suelo (Ezziyyani et al., 2004).

En la actualidad, los actinomicetos se encuentran incluidos en el domino bacteria debido a

varias razones: la pared celular está compuesta por peptidoglucano y no por quitina o

celulosa, son sensibles a los antimicrobianos pero presentan resistencia a los antifúngicos y

la disposición de su material genético es típicamente procariótica (Salazar et al., 1997),

aunque se caracterizan por presentar un alto contenido de guanina y citosina en su ADN,

siendo éste superior al 55%. Estas bacterias son aerobias y anaerobias, pudiéndose

encontrar en animales o en el hombre; son heterótrofas, por lo cual pueden utilizar fuentes

de carbono simples, complejas y compuestos moleculares orgánicos tales como ácidos,

azúcares, polisacáridos, lípidos, proteínas e hidrocarburos alifáticos. Utilizan como fuentes

6 

 

de nitrógeno amonio, nitratos, aminoácidos, peptonas y un gran número de proteínas

(Leveau y Bouix, 2000).

El ciclo de vida de los actinomicetos comprende cuatro importantes procesos fisiológicos:

crecimiento vegetativo, diferenciación, senescencia celular y muerte. Estas bacterias tienen

la capacidad de formar filamentos ramificados en alguna de sus etapas de crecimiento,

atributo que permite diferenciarlas de otras bacterias Gram positivas (Goodfellow y Williams,

1983). En un ciclo típico de crecimiento, las esporas se convierten en largas hifas

filamentosas que crecen dentro y encima de la superficie de nutrientes; las hifas se van

ramificando y se da paso a la aparición de un micelio que se forma gradualmente. Esta fase

es conocida como una fase vegetativa de crecimiento; el crecimiento filamentoso de los

actinomicetos se encuentra fuertemente condicionado por las propiedades elásticas de las

paredes celulares y las propiedades físicas medioambientales. La fase vegetativa está

seguida por una segunda fase de crecimiento aéreo la cual puede estar acompañada por la

generación de antibióticos, en donde se genera una elongación de hifas constituyendo

estructuras helicoidales, y una división final formando esporas, las cuales dan de nuevo

origen al ciclo de crecimiento vegetativo (Goriely y Tabor, 2002). El crecimiento de los

actinomicetos es más lento en comparación a otras bacterias, el tiempo de multiplicación en

un cultivo oscila entre 2 y 3 horas. Ciertas bacterias como Mycobacterium tuberculosis

poseen un desarrollo aún mas lento, con tiempos de generación superiores a 15 horas

(Leveau y Bouix, 2000).

La diversidad morfológica de estos microorganismos varía desde formas cocoides o

bacilares hasta la formación de un micelio bien desarrollado, así mismo algunos géneros

pueden formar un micelio complejo generador de esporas envueltas en un esporangio, razón

por la cual estas bacterias desarrollan sobre un medio sólido una masa de hifas que

comprenden el micelio de sustrato y el micelio aéreo. La apariencia correosa y pulverulenta

de las colonias se debe a la producción de los conidios o esporas. Los actinomicetos se

asemejan a las bacterias por el contenido de peptidoglicano en su pared celular, siendo

sensibles a la lisozima, y por poseer flagelos similares al bacteriano, los actinomicetos

difieren de los hongos en la composición de la pared celular, al no poseer quitina ni celulosa,

polisacáridos presentes en dicha estructura (Titus y Pereira,2007; Leveau y Bouix, 2000); los

azúcares presentes en la pared celular de los actinomicetos son Madurosa, Arabinosa y

Galactosa (Hidrin et al., 2001).

7 

 

Los actinomicetos abarcan una gran proporción de la biomasa microbiana presente en el

suelo, exceptuando aquellos que presentan condiciones extremas, por esta razón éste

resulta una fuente predominante de aislamiento; sin embargo, la disponibilidad de nutrientes

constituye un factor que controla su desarrollo (Goodfellow y Williams, 1983). La mayoría de

los actinomicetos usualmente aislados del suelo pertenecen al género Streptomyces, ya que

son los géneros que crecen fácilmente en medios sintéticos, caracterizándolos como los más

comunes del suelo. Éstos han sido ampliamente estudiados por la industria farmacéutica

debido a su habilidad para producir antibióticos (Goriely y Tabor, 2002). Las bacterias del

género Streptomyces son aerobias estrictas, catalasa positivas y, no se colorean como

ácido-alcohol-resistentes con la coloración de Ziehl-Neelsen, crecen en la superficie de

medios simples o complejos (medios de Sabouraud, Bennett, Lowenstein-Jensen), formando

filamentos ramificados (hifas) aéreos, que poseen cadenas de conidias que no se

fragmentan. Sólo Streptomyces, Nocardia, Actinomadura y Nocardiopsis forman micelios

aéreos en los cultivos (Hidrin et al., 2001). Los cultivos muestran su crecimiento entre dos y

diez días de incubación a una temperatura de 25ºC, aunque algunos pueden llegar a

desarrollarse entre los 27 y 30ºC, y algunos termófilos entre los 45–55ºC, los cuales resultan

ser muy importantes en la transformación de diversos residuos orgánicos en el proceso de

compostaje. Las colonias presentan aspecto ceroso, pulvurulento, de color blanco grisáceo,

común en la mayoría de los Streptomyces, variando de color crema a negro, como sucede

con S. somaliensis; sin embargo, estos aspectos no son específicos, y dependen de las

condiciones de cultivo (Hidrin et al., 2001); cabe resaltar que éstos géneros en particular

presentan una esporulación significativa en comparación con otros actinomicetos (Titus y

Pereira, 2007; Park et al., 2002).

La presencia de estas bacterias filamentosas y demás microflora del suelo genera una

importante influencia en la fertilidad de éste y en la salud de la planta participando en el

crecimiento de ésta e incrementando el área de absorción superficial de sus sistemas

radiculares. Los microorganismos del suelo, especialmente aquellos capaces de colonizar la

rizosfera ayudan a las plantas en la toma de nutrientes altamente vitales, tales como fósforo,

nitrógeno y potasio a partir del suelo; siendo así como la productividad y sostenibilidad de los

sistemas agrícolas resultan ser dependientes de los procesos funcionales de las

comunidades microbianas del suelo (Johansson et al., 2004; Ikeda et al., 2006).

2.2.2. Condiciones de crecimiento

8 

 

La adición de materia orgánica a los suelos estimula la multiplicación y actividad de los

actinomicetos. Los suelos alcalinos y neutros resultan ser más favorables para el desarrollo

de estas bacterias; el rango de pH óptimo para las actividades de estos microorganismos se

encuentra entre 6.5 y 8.0. Los actinomicetos al ser principalmente aerobios se desarrollan

favorablemente en suelos bien aireados; suelos con humedades entre el 80 y el 90% son

perjudiciales para el crecimiento de los actinomicetos. El porcentaje de actinomicetos en la

población total microbiana incrementa en la profundidad del suelo, sin embargo pueden ser

encontrados en la superficie de éste. Los géneros Streptomyces, Nocardia, y

Micromonospora se encuentran frecuentemente como habitantes del suelo (Titus y Pereira,

2007).

2.2.3. Composición química

Las células de los actinomicetos químicamente están compuestas por un 45% de carbono y

un 10% de nitrógeno, el contenido lipídico varía de un 12 a un 65% (Titus y Pereira, 2007).

Su pared celular difiere químicamente según los grupos, dando paso a la identificación y

clasificación de los mismos; básicamente se diferencian siete tipos de pared celular,

teniendo en cuenta el aminoácido diaminado, los azúcares característicos y la presencia de

glicina en el puente interpeptídico (Tabla 2.1).

9 

 

TIPOS DE PARED

CELULAR

AMINOÁCIDO DIAMINADO

AZÚCARES CARACTERÍSTICOS

GLICINA EN EL PUENTE

INTERPEPTÍDICO

MICROORGANISMOS REPRESENTATIVO

I L-DAP NA + Streptomyces

Intrasporangium

II m-DAP NA + Actinoplanes

Micromonospora

III m-DAP Madurosa - Microbispora, Frankia

IV m-DAP Arabinosa, Galactosa - Corynebacterium

Nocardia

V N.A. NA - Actinomyces israelii

VI N.A. Galactosa - Oerskovia turbata

Cellulomonas

VII DAB NA + Agromyces

NA (no aplicable, o bien no se detecta un azúcar diferencial); DAB (Ácido diaminobutírico); DAP (Ácido diaminopimélico).

Tabla 2.1. Tipos de paredes celulares de los Actinomicetos (Serrano y Sandoval, 2008; Duque y Quintana,

2008).

Algunas especies presentan hexosamina en la pared celular en un 2 a un 18%.

Adicionalmente especies como Streptomyces y Nocardia contienen alanina, metionina,

valina, arginina, lisina, leucina, hexosamina, isoleucina, ácido glutámico, treonina y

asparagina (Titus y Pereira,2007). De igual manera se presentan diversos tipos de

peptidoglucano que se clasifican de acuerdo al tipo de aminoácido ubicado en la posición 3

de la cadena lateral del tetrapéptido, a la posición del puente entre dos cadenas vecinas

(posición 3 y 4 para peptidoglucano tipo A y 2 y 4 para peptidolucano tipo B) y al tipo de

péptido presente en la cadena interpeptídica (Serrano y Sandoval, 2008).

2.2.4. Aplicación industrial

10 

 

Los actinomicetos son cuantitativa y cualitativamente importantes en la rizosfera, pueden

influir en el crecimiento de las plantas y la protección de sus raíces contra la invasión por

hongos patógenos. Adicionalmente éstos pueden participar en la formación de micorrizas, y

en la producción de compuestos herbicidas e insecticidas (Crawford et al, 1993).

Los actinomicetos participan principalmente en procesos de degradación de materia

orgánica, incluyendo lignina y quitina, así como en la formación y estabilización de pilas de

compostaje y humus (Titus y Pereira, 2007). Además de la función ecológica de los

actinomicetos, estos microorganismos son de suma importancia debido a que han

demostrado ser la fuente más importante de metabolitos secundarios bioactivos de valor

industrial y comercial (Ezziyyani et al., 2004).

Los antibióticos constituyen la aplicación industrial más importante de los actinomicetos.

Éstas moléculas de origen natural manifiestan, a bajas concentraciones, actividades

biológicas con efecto antibacteriano, antifúngico, anticanceroso, antiviral o antiparasitario.

Adicionalmente, estas bacterias tienen la capacidad de sintetizar enzimas hidrolasas

extracelulares que permiten la descomposición de la materia orgánica o la degradación de

las paredes de hongos o plantas (Leveau y Bouix, 2000). Los actinomicetos son

considerados como los principales organismos involucrados en la producción de quitinasas y

en consecuencia en la descomposición de la quitina en el suelo; teniendo en cuenta que la

quitina es un componente significativo de la pared celular de la mayoría de los hongos,

resulta lógico asumir que los actinomicetos pueden atacar las hifas y esporas de los hongos,

pudiendo ser considerados como potenciales agentes de control biológico (Ames, 1989).

2.3. CONTROL BIOLÓGICO

Las enfermedades de las plantas causadas por hongos son una de las mayores

preocupaciones en el campo de la agricultura. En el suelo se encuentran diversos hongos

patógenos tales como Pythium, Fusarium, Rhizoctonia y Phytophthora, los cuales atacan

cultivos de importancia económica ya sea atacando la raíz o las semillas antes de la

germinación o posterior a que dicho proceso germinativo se haya llevado a cabo, resultando

en grandes pérdidas monetarias. Muchos microorganismos quitinolíticos poseen la habilidad

de controlar hongos fitopatógenos pero en ciertos casos no resultan ser satisfactorios, entre

11 

 

otras razones, por causas ambientales. Es entonces como surge la necesidad de encontrar

cepas altamente quitinolíticas que contribuyan al desarrollo de un agente biocontrolador

potencial (Gohel et al., 2006).

La ecología microbiana se ha ido convirtiendo en una alternativa biológica para el control de

plagas de plantas. El control biológico se encuentra dividido en efectos directos e indirectos,

en los efectos directos se presenta competencia por nutrientes o por espacio, producción de

enzimas líticas, antibióticos y parasitismo. Cuando se generan cambios biológicos y

bioquímicos en las plantas tales como tolerancia al estrés y mayor adsorción de nutrientes

inorgánicos, el control biológico está dado por efectos indirectos los cuales incrementan

resistencia por parte de la planta ante el patógeno (Gohel et al., 2006).

El uso de agentes químicos para el control de patógenos ha mostrado problemas como por

ejemplo la resistencia que la cepa patógena puede llegar a adquirir, con el fin de reducir el

uso de éstos se ha estudiado el control biológico en plantas para el tratamiento de

enfermedades causadas por fitopatógenos (Compant et al., 2005). Según Weller (1988), los

microorganismos que colonizan la rizosfera son ideales para ser utilizados como agentes

para el control biológico contra las enfermedades transmitidas por el suelo. La habilidad del

microorganismo control para mantener una densidad poblacional suficiente en la rizosfera

por un largo periodo de tiempo es crítico para el éxito del método de biocontrol (Getha et al.,

2005).

Para determinar si un microorganismo puede ser empleado como agente biocontrolador se

deben tener en cuenta características tales como: competencia significativa en la rizosfera,

mantener in-situ un tamaño poblacional considerable, colonización rápida de la raíz,

capacidad de antagonizar patógenos de rápido crecimiento y producción estable de agentes

antifúngicos (Neiendam et al., 1998). Un agente ideal de control biológico de hongos

patógenos generadores de síntomas infecciosos en la raíz de las plantas debe mostrar una

suficiente actividad antagónica en la rizosfera y ser capaz de reducir significativamente la

enfermedad (Yuan y Crawford, 1995).

Actualmente el biocontrol ya es considerado como una de las prácticas de manejo de

enfermedades de las plantas causadas por los patógenos fúngicos del suelo, principalmente

de los géneros Rhizoctonia, Sclerotium, Pythium, Phytophthora y Fusarium entre otros. En la

12 

 

lucha por la erradicación de dichas especies, resulta importante la selección de potenciales

bioantagonistas que puedan ser utilizados como controladores biológicos para lo cual es

necesario realizar ensayos in vitro que generen una orientación respecto a su capacidad

antagónica y permitan que posteriormente puedan ser formulados y utilizados en pruebas de

campo (Duñabeitia et al., 2007). La búsqueda de microorganismos nativos puede ser eficaz

en el control biológico de fitopatógenos y una alternativa principal a la utilización de

productos químicos (Ezziyyani et al., 2004).

2.3.1. Actinomicetos como agentes biocontroladores

Los actinomicetos se caracterizan por producir enzimas con actividad antimicrobiana,

aspecto que ha sido evaluado en relación al biocontrol de fitopatógenos (Crawford et al.,

1993; Anderson y Wellington, 2001; Park et al., 2002). El parasitismo de los hongos

patógenos, facilitado por la producción de enzimas hidrolíticas, está involucrado en el control

biológico de enfermedades fúngicas. Entre las enzimas hidrolíticas, las quitinasas son de

suma importancia teniendo en cuenta que la quitina es el mayor constituyente de la pared

celular en la mayoría de los hongos fitopatógenos. Las quitinasas inhiben la germinación de

las esporas fúngicas y la elongación del tubo germinal, y lisan los tipos hifales (Kishore et al.,

2005). Hasta la fecha se sabe que varios antifúngicos activos contra hongos patógenos se

han aislado y caracterizado a partir de cepas de Streptomyces sp (Aizawa et al., 1982; Kim

et al., 1999; Hwang et al., 2001; Rodríguez et al., 2002; Remsing et al., 2003).

Varias cepas de Streptomyces sp han mostrado suprimir el crecimiento de fitopatógenos in

vitro, muchos de sus metabolitos han sido usados para inhibir el crecimiento de éstos

patógenos in vivo, algunos de estos metabolitos incluyen macrólidos, benzoquinonas,

aminoglucósidos entre otros. De igual forma, enzimas extracelulares como quitinasas y β-

1,3- glucanasas desempeñan una significativa función en la actividad antifúngica y

biocontroladora, siendo posiblemente responsables del micoparasitismo potencial ejercido

por algunas cepas de Streptomyces sp. y la supresión de enfermedades de las plantas, que

se observa cuando el suelo es modificado, siendo suplementado con pared celular fúngica,

quitina y/o laminarina (González et al., 2003). Estudios de Streptomyces sp. han reportado la

capacidad que tienen los microorganismos de esta especie para generar efecto antagónico y

control sobre una amplia gama de enfermedades de las plantas, en su gran mayoría

generada por compuestos de origen antibiótico y no enzimático. En la década de los años

13 

 

50´s Pridham y colaboradores reportaron la represión de al menos una enfermedad

generada en plantas tratadas en invernadero por 9 de los 10 metabolitos secretados por

Streptomyces sp. Así mismo, Reddi y Rao (1971) reportaron el control de Pythium y

especies de Fusarium nativas, patógenos de plantas de tomate y algodón respectivamente

en suelos infestados artificialmente. Otros estudios muestran la represión del desarrollo de

estos fitopatógenos empleando Streptomyces sp en forma de esporas y micelios o

combinación de los dos (Yuan y Crawford, 1995).

La adición de quitina al suelo ha sido estudiada como un posible método para el control de

hongos patógenos. El suplemento del suelo con quitina puede facilitar el incremento en el

número de organismos quitinolíticos que podrían degradar la quitina de la pared celular de

los hongos, conllevando a la supresión de los patógenos. Otra posibilidad es usar los

actinomicetos directamente como productores de quitinasas actuando contra la pared celular

de los patógenos fúngicos (Gomes, 1999).

Se han realizado estudios que determinan el efecto de microorganismos quitinolíticos

aislados de la rizosfera y del suelo no rizosférico sobre el desarrollo de hongos patógenos,

determinándose que los microorganismos rizosféricos presentan mayor actividad quitinolítica

en comparación a los no rizosféricos. Streptomyces violaceusniger, microorganismo

asociado la rizosfera de Paraserianthes falcataria, ha demostrado antagonismo frente a

hongos fitopatógenos tales como Pythium sp., Phytophthora sp. y Fusarium sp.; esto ha

permitido determinar que existen diferencias en el perfil de las quitinasas basado en el

hábitat a partir del cual fueron aislados (Trejo et al., 1998; Sembiring et al., 2000).

En el mar se encuentra acumulada una alta proporción de quitina, presumiendo que la

mayoría de bacterias marinas tienen la capacidad de degradar este polímero, sin embargo

estudios han reportado que son pocas las bacterias marinas capaces de hidrolizarlo (0,4-

19%). El uso de enzimas quitinolíticas presenta gran importancia en la industria de comida

de mar, de ahí los numerosos estudios en donde se comparan las enzimas derivadas de

organismos terrestres con las de origen marino, mostrando que éstas últimas presentan una

mayor tolerancia a condiciones altas de salinidad y pH, presentando un posible potencial

biotecnológico (Han et al., 2008).

14 

 

La actividad de los actinomicetos como patógenos de humanos, animales y plantas ha sido

más que compensada por los beneficios que éstos tienen en el suelo, tales como

antagonistas de patógenos en plantas, estimuladores de crecimiento vegetal, productores de

biocidas, productores de antibióticos e hiperparásitos de hongos. Los actinomicetos han

desempeñado un importante papel en el control de los fitopatógenos, sin embargo han

recibido poca atención como agentes de control biológico de nemátodos y parásitos de

plantas (Park et al., 2002).

Estos microorganismos son de suma importancia en la rizosfera, en la medida en que

pueden influir sobre el crecimiento vegetal y proteger las raíces de las plantas contra la

invasión de hongos patógenos (Crawford et al., 1993). Además de la función ecológica, los

actinomicetos han demostrando ser la fuente más importante de metabolitos secundarios

bioactivos de valor industrial y comercial. Estos microorganismos se encuentran entre los

agentes biocontroladores más estudiados, especialmente aquellos pertenecientes al género

Streptomyces sp., los cuales se conocen ampliamente por la capacidad de producir

antibióticos y compuestos bioactivos que participan en el control de patógenos de las plantas

(Goodfellow y Williams, 1983; Fermino et al., 2006). Diferentes especies de Streptomyces

han sido estudiadas extensivamente como potenciales agentes controladores contra hongos

fitopatógenos tales como Pythium ultimum, Fusarium oxysporum, Sclerotinia homeocarpa,

Phytophthora fragariae, Phytophthora infestans y Verticillium dahliae (Franco-Correa, 1999;

Getha et al., 2005).

Los actinomicetos al producir metabolitos secundarios biológicamente activos, tales como

quitinasas, son agentes prometedores en el biocontrol de hongos patógenos de plantas

(Ezziyyani et al., 2004).

2.3.2. Mecanismos de antagonismo

Los métodos de biocontrol se han puesto en práctica para tratar enfermedades causadas en

las plantas por los patógenos presentes en el suelo; por ésta razón el suelo representa una

fuente óptima para el aislamiento de microorganismos con actividad antagónica, los cuales

pueden ser empleados como agentes de control (Goodfellow y Williams, 1983).

15 

 

Entre los mecanismos de acción que utilizan los microorganismos antagonistas para el

control biológico se encuentran: antibiosis, competencia, parasitismo, lisis celular y

resistencia inducida en el hospedero. Diversos investigadores citan a las quitinasas,

glucanasas y proteasas como enzimas involucradas en el control biológico de fitopatógenos

(Nuero, 1995; Aceves et al., 2005).

La antibiosis es el fenómeno mediante el cual un organismo antagonista inhibe o destruye a

otro organismo por medio de la producción metabólica de pequeñas moléculas tóxicas

volátiles y de enzimas líticas, las cuales disuelven o dañan polímeros estructurales, como

quitina y β- 1,3- glucanos de la pared celular en la mayoría de los hongos fitopatógenos,

produciendo un efecto adverso sobre su desarrollo, actividad metabólica y diferenciación.

Entre mayor sea la cantidad de productos metabólicos, el poder antagónico se incrementa

(Aceves et al., 2005). En la antibiosis no se requiere contacto directo entre el

microorganismo antagonista y el patógeno, debido a que el efecto negativo que se está

ejerciendo es generado por la molécula de antibiótico, razón por la cual la inhibición del

crecimiento del fitopatógeno puede continuar incluso después de la muerte del antagonista;

por el contrario el parasitismo involucra un contacto directo entre el hospedero y el parásito,

éste último sustrae todos los nutrientes necesarios para su desarrollo a partir del hospedero

e involucra la producción de enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular del

hospedero (Di Pietro et al., 1993; Nuero, 1995).

La lisis celular, genera la degradación enzimática total o parcial de la pared celular del

patógeno. La actividad de las enzimas quitinasas y β-1,3-glucanasas se encuentran

involucradas en la hidrólisis de la pared celular fúngica, causando la inhibición de

crecimiento microbiano. Así mismo, las plantas también pueden sintetizar enzimas

hidrolíticas, las cuales pueden ser inducidas por el ataque de hongos fitopatógenos o por la

presencia de sustancias químicas como el etileno. Los hongos también secretan de manera

constitutiva o inducida, enzimas de éste tipo generando la hidrólisis de la pared celular de

otros hongos o de su propia pared cuando en medio de cultivo estas se encuentran como

única fuente de carbono. Actualmente, Trichoderma sp. es uno de los pocos agentes

antagonistas que se encuentra disponible comercialmente para el biocontrol de patógenos

en el suelo, se ha reportado que este género produce quitinasas y β-1,3-glucanasas que

inhiben el crecimiento de Fusarium oxisporum f.sp. radicis-lycopersici y Rhizoctonia solani en

16 

 

medios de cultivo que contienen las paredes de éstos microorganismos como única fuente

de carbono disponible (Nuero, 1995).

La liberación de enzimas extracelulares como quitinasas y β- glucanasas por parte de

algunos microorganismos hace parte de un mecanismo de defensa contra patógenos como

hongos ya que éstas degradan polímeros estructurales como quitina y glucano

respectivamente, presentes en la pared celular de estos organismos, actuando como

agentes de protección (Gomes et al., 2000). Estas enzimas han mostrado ejercer un

significativo control biológico, por este motivo algunas estrategias suponen la expresión de

los genes que codifican para estas enzimas en plantas, para así aumentar y/o reforzar la

defensa primaria ante un ataque de patógenos, suprimiendo la colonización del tejido

vegetal. La expresión de estos genes conduce a una más rápida interacción y neutralización

de los fitopatógenos (Gohel et al., 2006).

Adicionalmente, entre los mecanismos de acción que impiden la infección de la planta por el

patógeno se encuentran la competencia y la inducción de resistencia sistémica en la planta.

Los saprofitos compiten por los nutrientes disponibles en la rizosfera mientras que los

patógenos lo hacen por zonas de infección en la raíz. Mediante la resistencia sistémica se

induce una respuesta de defensa en la planta por agentes bióticos o abióticos, la raíz puede

ser colonizada por microorganismos que desencadenan una cascada de reacciones de

defensa contra el patógeno (Larkin y Fravel, 1999).

Los actinomicetos tienen la capacidad de producir una amplia variedad de hidrolasas

extracelulares que les otorga un importante papel en la descomposición de la materia

orgánica en el suelo. Adicional a su función activa en la descomposición, los actinomicetos

parecen tener importancia entre la flora microbiana de la rizosfera (Valois et al., 1996).

El antagonismo de los actinomicetos contra hongos ha sido demostrado para una amplia

variedad de patógenos de plantas, tales como Alternaria, Rhizoctonia, Verticillum, Fusarium

y Macrophomina sp. Además, los actinomicetos del género Streptomyces han sido usados

comercialmente para el control de los daños en plantas. Por ejemplo, la cepa 5406 de

Streptomyces sp. ha sido usada en China por mas de 30 años para proteger los cultivos de

algodón de patógenos del suelo (Valois et al., 1996). Adicionalmente, Lahdenpera y

17 

 

colaboradores (1991) desarrollaron un biofungicida que contiene células de Streptomyces

griseoviridis para proteger los cultivos contra infecciones de Fusarium y Alternaria. Por otro

lado, estudios han reportado que Streptomyces sioyaensis exhibe antagonismo contra varios

hongos patógenos como Pythium aphanidermatum, Colletotrichum higginsianum,

Acremonium lactucum y Fusarium oxysporum (Hong et al., 2002).

2.3.3. Hongos fitopatógenos

2.3.3.1. Fusarium oxysporum

Fusarium oxysporum es un hongo que se presenta principalmente como saprófito en el

suelo, o como patógeno especializado, siendo capaz de generar enfermedad a un amplio

rango de hospederos. Entre los síntomas generados en la planta por este fitopatógeno se

encuentra el amarillamiento parcial de las hojas y el doblamiento de los brotes hacia el lado

de la planta enferma, así mismo se presentan fenómenos de enanismo y disminución del

crecimiento por parte de la planta. Los síntomas avanzan lentamente de manera ascendente

hasta causar un marchitamiento generalizado y en consecuencia la muerte. Fusarium

oxysporum penetra la epidermis de la raíz, la corteza y la endodermis, entra a los vasos del

xilema, colonizando el sistema vascular e interfiere en la capacidad de la planta para adquirir

agua y nutrientes (Garcés de Granada et al., 2001; Sastoque, 2006).

En agar papa dextrosa Fusarium oxysporum presenta un crecimiento rápido a 25ºC,

macroscópicamente se puede evidenciar un micelio aéreo abundante, algodonoso y con

pigmentación que varía de blanco a rosa durazno y generalmente un pigmento púrpura o

violeta más intenso al reverso de la colonia. Este hongo se caracteriza por producir tres tipos

de propágulos: microconidias, macroconidias y clamidosporas; estas últimas tienen paredes

muy gruesas, lo cual las hace muy resistentes a condiciones ambientales desfavorables y a

la ausencia de hospedantes (Garcés de Granada et al., 2001; Sastoque, 2006).

2.3.3.2. Fusarium roseum

18 

 

Fusarium roseum es un fitopatógeno que se puede evidenciar en plantas jóvenes y se

manifiesta como una podredumbre rosada o violácea desde la base del esqueje hasta el

segundo nudo de la planta de clavel. Las lesiones que se manifiestan de color café rojizas se

van extendiendo a partir de los tejidos infectados de manera ascendente hasta llegar a la

base de la planta, la decoloración vascular de la planta a diferencia de la generada por

Fusarium oxysporum solo se presenta en la zona inmediatamente cercana a los tejidos

podridos (Sastoque, 2006).

2.3.3.3. Rhizoctonia solani

Rhizoctonia solani es uno de los hongos más importantes reconocido como patógeno de

plantas, provocando la pudrición de raíces y órganos subterráneos y aéreos. Se caracteriza

por producir basidiosporas y no producir esporas asexuales (conidios). Es un hongo de

hábito saprófito, aunque en algunos casos puede formar micorrizas sobre orquídeas u otras

plantas. Presenta pigmentación hifal dematiácea, estrechamiento de hifa y formación de

septos doliporos a una distancia corta del ápice a la ramificación de la hifa y células

multinucleadas en la hifa vegetativa joven. Macroscópicamente las colonias jóvenes de éste

hongo se caracterizan por ser blancas, algodonosas adheridas al medio de cultivo, aunque

dependiendo de la especie, pueden llegar a tornarse cremosas o amarillentas. Al producirse

la maduración, la colonia puede tomar una coloración marrón.

Rhizoctonia solani se caracteriza por ser un buen competidor capaz de colonizar diferentes

sustratos y tolerar cambios amplios de ambiente, éstas características favorecen su

supervivencia y su acción patogénica sobre tejidos juveniles vegetales. Este fitopatógeno

ocasiona pérdidas importantes en plantas perennes y anuales, incluyendo la mayoría de los

cultivos hortícolas que se desarrollan dentro o sobre el suelo. El damping-off o caída de las

plántulas es una de las enfermedades más conocidas, que a través de un estrangulamiento

ocasiona necrosis del tallo a nivel de cuello en plántulas recién emergidas. Adicionalmente,

este hongo es causante de una reducción en el vigor de las plantas y en la producción de

tubérculos en cultivos de papa (Tovar, 2008).

2.4. ACTIVIDADES HIDROLÍTICAS PARA CONTROL DE HONGOS PATÓGENOS

19 

 

2.4.1. Quitinasas

La quitina es un homopolímero formado por residuos de N-acetil-D-Glucosamina con enlaces

β-1,4. Su estructura es similar a la de la celulosa exceptuando que el grupo hidroxilo (-OH),

presente en el carbono dos de la celulosa, es reemplazado por un grupo acetamida

(NH.CO.CH3) en la estructura de la quitina (Figura 2.1.). Este polímero es el recurso

renovable más abundante después de la celulosa. Se encuentra ampliamente distribuido en

la naturaleza como un componente estructural de hongos (22% - 44%), insectos y

crustáceos (25% - 58%) y protozoos (Hoster et al; 2005, Mukherjee y Sen, 2006;

Bhattacharya et al., 2007).

Figura 2.1. Estructura molecular de la quitina (Fuente: Sabry, 1992).

La quitina y sus derivados presentan un especial interés por encontrarse involucrados en

diferentes actividades biológicas como inmunoadjuvantes, floculantes de lodos en aguas

residuales y disminución del uso de agroquímicos. El uso comercial de ésta se centra en la

necesidad de desarrollar soluciones enzimáticas de quitinasas estables y de bajo costo.

Los residuos de mariscos han reportado ser una adecuada fuente de quitina, lo cual

promueve aún más el valor económico de los productos marinos (Wang y Chang, 1997). Se

ha demostrado que oligómeros de quitina y el quitosano (quitina con baja acetilación) tienen

actividades antitumorales, inmunoreguladoras, antibacterianas y antifúngicas (Guo et al.,

2004). La pesca comercial de crustáceos y su proceso subsiguiente, generan grandes

cantidades de residuos que pueden ser un problema ambiental si no son tratados de la

20 

 

manera adecuada. Estos residuos pueden ser aprovechados por medio de métodos

biológicos ó químicos, desarrollando procesos que involucren la hidrólisis enzimática del

polímero (Sastoque et al., 2007).

El proceso biológico es llevado a cabo mediante la acción de quitinasas, hidrolizando el

enlace glucosídico β1-4 (Sastoque et al., 2007). La quitina es hidrolizada por un complejo

quitinasa que comprende tres enzimas: exoquitinasa, endoquitinasa y β-N-

acetilglucosaminidasa. La primera hidroliza el extremo no reductor de la cadena de quitina;

la segunda cliva los enlaces internos β- 1,4 glicosídicos de N-acetilglucosamina y la última

hidroliza unidades secuenciales de N-acetilglucosamina en el extremo no reductor del

sustrato. El clivaje enzimático que realizan las quitinasas se lleva a cabo aleatoriamente en

la naturaleza en toda la estructura del polímero, esto genera la liberación de compuestos

solubles de bajo peso molecular de N-acetilglucosamina como quitotetraosa, quitotriosa,

quitobiosa y pequeños oligosacáridos los cuales resultan ser los más predominantes y

pueden ser utilizados como sustrato por la β-N-acetilglucosaminidasa. El microorganismo

quitinolítico reconoce la quitina por colisión aleatoria u otro mecanismo; la degradación de

este polímero se lleva a cabo por la acción del complejo quitinolítico extracelular,

generándose oligosacáridos que pueden entrar a la célula a través de la zona

periplasmática. Estos oligosacáridos posteriormente son degradados a residuos de N-

acetilglucosamina, los cuales son trasportados al citoplasma mediante la vía del fosfoenol-

piruvato empleando el sistema N-acetilglucosamina fosfotransferasa. Finalmente la N-

acetilglucosamina fosfato sufre una conversión en dos pasos, en el primero de ellos pierde

su grupo acetil y en el segundo se libera amonio, generando como productos finales

amoniaco, acetato y fructosa-6-fosfato (Figura 2.2.) (Sastoque, 2006; Bhattacharya et al.,

2007).

21 

 

Figura 2.2: Reconocimiento y degradación de la quitina por microorganismos quitinolíticos (Fuente: Yu et al., 1991).

Di Pietro y colaboradores (1993) estudiaron la producción de enzimas quitinolíticas del tipo

endoquitinasas, glucosaminidasas y quitiobiosidasas, indicando la existencia de un complejo

patrón funcional y regulatorio para éstas enzimas, involucradas en funciones como la

liberación de nutrientes a partir de sustratos de quitina, micoparasitismo, competencia y

funciones reguladoras en el desarrollo fúngico.

Las quitinasas son glicosil hidrolasas y se encuentran presentes en una gran variedad de

organismos tales como bacterias, hongos, insectos, plantas y animales. Estas enzimas

22 

 

juegan roles fisiológicos y ecológicos importantes. Los invertebrados requieren quitinasas

para la degradación parcial de sus exoesqueletos viejos y las plantas como un mecanismo

de defensa contra hongos patógenos (Hoster et al., 2005). Las bacterias producen

quitinasas principalmente para degradar quitina y usarla como fuente de energía.

Adicionalmente, algunas quitinasas de bacterias quitinolíticas son agentes potenciales para

el control biológico de enfermedades de plantas causadas por diversos hongos

fitopatógenos, pues hidrolizan la quitina presente en la pared celular del hongo. Las

bacterias fitopatógenas también pueden ser controladas por estas enzimas debido a que

algunas presentan actividad lisozimal, lo cual permite la degradación de la pared celular

bacteriana (De la Cruz et al., 1992). Estas enzimas pertenecen a muchas especies

bacterianas, entre las más conocidas se encuentran los géneros Aeromonas, Serratia,

Myxobacter, Vibrio, Streptomyces y Bacillus (Hoster et al., 2005).

Las quitinasas se clasifican en dos categorías generales: las endoquitinasas clivan la quitina

aleatoriamente en sitios internos, generando multímeros de N-acetilglucosamina de bajo

peso molecular, tales como quitotetraosa, quitotriosa y diacetilquitobiosa. Las exoquitinasas

pueden dividirse en dos subcategorías: quitobiosidasas que se encargan de catalizar la

liberación progresiva de diacetilquitobiosa iniciando en el terminal no reductor de la quitina, y

las β-(1,4) N-acetilglucosaminidasas, que clivan los productos oligoméricos de las

endoquitinasas y quitobiosidasas, generando monómeros de N-acetilglucosamina. Una ruta

alternativa involucra la deacetilación de la quitina a quitosano, que es finalmente convertido

a residuos de glucosamina por acción de la quitosanasa (Dahiya et al., 2006).

Las quitinasas presentan diferente talla molecular que va desde 20 kDa hasta 90 kDa, las

quitinasas bacterianas oscilan entre 20 y 60 kDa, presentando un peso molecular similar a

las quitinasas secretadas por las plantas (25 – 40 kDa) pero menor a las enzimas producidas

por los insectos (40 – 85 kDa). Las quitinasas resultan ser activas en diferentes rangos de

temperatura y pH, esta variación se ve reflejada de acuerdo a la fuente de aislamiento,

permitiendo que las quitinasas sean empleadas en diferentes procesos que difieren en las

condiciones de pH y temperatura (Bhattacharya et al., 2007).

Las quitinasas se encuentran clasificadas en dos familias de glicosil-hidrolasas (18 y 19),

sobre la base de la similitud de la secuencia de aminoácidos. La familia 18 de quitinasas se

distribuye en una amplia variedad de organismos incluyendo bacterias, hongos, virus,

23 

 

plantas y animales. Por otro lado, estudios han reportado la secreción de enzimas de la

clase I, II y IV por plantas y Streptomyces griseus HUT 6037 (quitinasas C) las cuales

pertenecen a la familia 19. (Itoh et al., 2003)

La quitinasa C (chiC) fue la primera quitinasa bacteriana de la familia 19 descubierta en

Streptomyces griseus HUT 6037, la cual mostró generar la inhibición de la extensión hifal de

Trichoderma reesei in vitro; por el contrario en cultivos de arroz la familia 19 no generó esta

misma inhibición. Sin embargo estudios han reportado el incremento de resistencia en

plantas a enfermedades fúngicas por la introducción del gen chiC en plantas de arroz

(Mitsutomi et al., 1995; Tanabe et al., 2000).

2.4.1.1 Producción de quitinasas

Las quitinasas de origen microbiano han sido producidas por medio de fermentación líquida

continua y fermentación alimentada. Adicionalmente, la fermentación en fase sólida y los

sistemas celulares bifásicos han sido usados para la producción de quitinasas.

Generalmente, las quitinasas producidas por los microorganismos son inducidas

naturalmente. Se ha estudiado que la producción extracelular de quitinasas es influenciada

por los componentes del medio tales como fuentes de carbono, y de nitrógeno, provenientes

de residuos agrícolas como arroz y salvado de trigo, entre otros (Bhushan et al., 1998;

Dahiya et al., 2005). Un efecto de la glucosa en el incremento en la producción de quitinasas

fue mostrado por Bhushan y Hoondal (1998) cuando ésta fue usada con quitina en un medio

de producción. Sin embargo Miyashita y colaboradores (1991) reportaron un efecto contario

en donde la producción de quitinasas se vio inhibida en presencia de glucosa. Por otro lado,

Dahiya y colaboradores (2006) encontraron un aumento en la producción de quitinasas

cuando se empleó salvado de trigo en combinación con quitina. Muchos otros factores

físicos tales como la aireación, pH y temperatura de incubación también pueden afectar la

producción de las quitinasas. Por otro lado Bhushan y Hoondal (1998) reportaron una

estimulación en la producción de quitinasas por Bacillus sp. BG-11 cuando al medio de

crecimiento se le adicionaron aminoácidos como triptófano, tirosina, glutamina y arginina

(0,1mM). Algunos otros métodos como la inmovilización (Bhushan y Hoondal, 1998),

sistemas bifásicos celulares (Chen y Lee, 1995), fermentaciones en fase sólida, y otros, han

sido usados para mejorar la producción de quitinasas a partir de diferentes microorganismos

(Bhushan y Hoondal 1998).

24 

 

2.4.1.2. Uso Biotecnológico de las Quitinasas

Las quitinasas son de interés biotecnológico debido a su potencial uso como agentes

preservantes de alimentos y semillas y para la ingeniería de plantas con resistencia a

hongos fitopatógenos (Hoster et al., 2005). De igual manera éstas pueden estar involucradas

en la salud humana, participando por ejemplo en soluciones oftalmológicas junto con

microbiocidas. Un medicamento de uso directo a partir de quitinasas ha sido sugerido para la

terapia de enfermedades fúngicas potenciando la actividad de drogas antifúngicas. Estas

también pueden ser usadas como potenciales aditivos en cremas antifúngicas y lociones

debido a sus aplicaciones tópicas (Dahiya et al., 2006).

Preparaciones de quitinasas han sido empleadas para producir diversos quitooligosacáridos,

glucosaminas y N-acetilglucosamina con un inmenso potencial farmacéutico. Los

quitooligosacáridos son potencialmente útiles en la medicina para humanos. Por ejemplo la

quitohexaosa y la quitoheptaosa mostratron actividad antitumoral. Una quitinasa generada a

partir de Vibrio alginolyticus fue usada para preparar quitopentaosa y quitotriosa a partir de

quitina coloidal (Murao et al., 1992). Para lograr obtener oligómeros con una longitud de

cadena deseada se requiere hacer uso de combinaciones específicas de enzimas

quitinolíticas; por ejemplo, la producción de quitooligosacáridos requiere altos niveles de

endoquitinasa y bajos niveles de N-acetilglucosaminidasa y exoquitinasa, mientras que la

producción de N-acetilglucosamina requiere alta proporción de exoquitinasa y N-

acetilglucosaminidasa (Aloise et al., 1996). Alternativamente, la actividad de

transglicosilación de una variedad de endoquitinasas y N-acetilglucosaminidasas puede ser

también útil para generar quitoligómeros (oligómeros con cambios en las uniones

glicosídicas y glicopéptidos) (Dahiya et al., 2006).

A nivel ambiental, el uso de microorganismos o sus secreciones para prevenir a las plantas

de patógenos e insectos ofrece una alternativa o un complemento para el control de

enfermedades vegetales (Dahiya et al., 2006). Adicionalmente éstas pueden ser adicionadas

como suplemento a los fungicidas e insecticidas comúnmente usados no solo para hacerlos

más potentes sino también para minimizar la concentración de ingredientes activos

sintetizados químicamente de los insecticidas y fungicidas que de lo contrario resultan ser

altamente nocivos para el medio ambiente (Bhushan y Hoondal, 1998)

25 

 

Las enzimas de tipo quitinasas han recibido especial importancia por el control que ejercen

sobre los hongos patógenos del suelo. Singh y colaboradores (1999) reportaron la supresión

de Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum por Streptomyces sp. 385, demostrando la

fuerte acción antagónica de enzimas quitinasas y otras sustancias antifúngicas sobre el

fitopatógeno causante del marchitamiento de plantas de pepino.

Los actinomicetos se consideran los organismos dominantes involucrados en la

descomposición de quitina en el suelo (Ames, 1989). En especial, especies del género

Streptomyces, han sido reportadas como microorganismos productores de enzimas

extracelulares líticas como las quitinasas, y mencionados como agentes antagonistas

prometedores para el biocontrol debido a la reacción de hidrólisis sobre el micelio de los

hongos en suelos ácidos y hojarascas que catalizan estas enzimas (Gomes et al., 2001). Las

especies pertenecientes al género Streptomyces se consideran como el principal grupo

microbiano quitinolítico en el suelo debido a su habilidad para degradar quitina, han

mostrado ser los mayores degradadores de quitina in vitro, en comparación a otras bacterias

y hongos que demostraron constituir entre el 1 a 3% y el 1%, respectivamente, de la

población quitinolítica (Metcalfe et al., 2002).

Los actinomicetos endofíticos han sido aislados de varios tejidos de plantas y algunos de

ellos han mostrado un alto potencial como agentes biocontroladores contra hongos

fitopatógenos. Algunas cepas de actinomicetos endofíticos que producen quitinasas podrían

proteger contra hongos fitopatógenos en tejidos de plantas (Taechowisan et al., 2003).

Teniendo en cuenta esto, el papel de las quitinasas de los actinomicetos en la actividad

fúngica podría ser estudiada, ya que estos microorganismos pueden contribuir a su planta

hospedera con alguna protección natural contra infecciones, participando en técnicas de

control biológico llegando a ser una aproximación importante para facilitar la agricultura

sostenible (Wang et al., 2002; Taechowisan et al., 2003).

26 

 

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Las enfermedades generadas por hongos se han convertido en una de las mayores

preocupaciones para la producción agrícola, por este motivo ha surgido la necesidad de

buscar alternativas para aumentar el rendimiento de los cultivos y poder mantener constante

el suministro de alimentos. Se ha demostrado que el uso de productos químicos como

fungicidas y pesticidas (pentaclorofenol, sodio borato, cobre y arsenato) en el control de las

enfermedades causadas en plantas genera efectos perjudiciales para el medio ambiente y

los seres humanos. Por otra parte, estudios basados en técnicas de biología molecular

buscan el desarrollo de plantas transgénicas que presenten resistencia a los patógenos

causantes de la enfermedad, sin embargo son pocos los informes que han reflejado el

desarrollo de resistencia por parte de la planta. Esto genera la necesidad de emplear otras

técnicas para contrarrestar el efecto negativo generado en las plantas a causa de la acción

de los fitopatógenos (Gohel et al., 2006). De igual manera, la fertilidad del suelo se ha visto

influenciada por la intensificación de su uso agrícola, generándose un descenso en el

contenido de materia orgánica, nitrógeno total y cationes básicos intercambiables, así como

el incremento de la concentración de fósforo soluble en el suelo debido a la aplicación

frecuente de fertilizantes, fungicidas y pesticidas (Álvarez y Anzuelo, 2004). Los productores

han creado una dependencia de estos agroquímicos como un método relativamente fiable

para la protección de los cultivos ayudando con la estabilidad económica de sus operaciones

(Compant et al., 2005).

Los fungicidas químicos son ampliamente usados en la agricultura; sin embargo el uso

excesivo de éstos ha llevado a un deterioro en la salud humana y en el ambiente

contribuyendo a la generación de alteraciones en el suelo de tipo químico como pérdida de

nutrientes, acidificación, salinización y sodificación, aumento de la toxicidad por liberación y

concentración de determinados elementos químicos; y alteraciones físicas como pérdida de

estructura, disminución de la permeabilidad y disminución de la capacidad de retención de

agua (Brissio, 2005). Adicionalmente, la aplicación de dichos productos de origen industrial

tiene un alto costo para el mantenimiento de los cultivos y pueden generar resistencia de los

patógenos hacia los mismos (Prapagdee et al., 2008). Por otro lado, en muchos casos, se

presentan enfermedades en los cultivos para las cuales las soluciones químicas son muy

pocas, inefectivas, o simplemente no existen (Compant et al., 2005).

27 

 

En consecuencia de lo anterior, surge la necesidad de identificar métodos alternativos para

la protección de las plantas, menos dependientes de químicos y más seguros a nivel

ambiental. Los microorganismos antagonistas son ampliamente usados para el control de

enfermedades de plantas causadas por hongos. Muchas especies de actinomicetos,

particularmente aquellas pertenecientes a los géneros Streptomyces, son bien conocidos

como agentes antifúngicos. La actividad antagonista de Streptomyces sp. contra los hongos

patógenos usualmente está relacionada con la producción de compuestos antifúngicos y

enzimas hidrolíticas extracelulares. Las quitinasas y las β-1,3-glucanasas son enzimas

importantes en la lisis de paredes celulares de hongos, por ejemplo de Fusarium oxysporum

y Sclerotinia minor (Prapagdee et al., 2008).

El uso de tecnologías limpias, incluye el empleo de biofertilizantes usando inóculos fúngicos

y bacterianos sobre el sustrato edáfico en el que se desarrollan las plantas, o sobre las

semillas antes de la siembra, evitando los efectos secundarios de los métodos actuales de

fertilización y protección frente a plagas (Ramos, 1999). La aplicación de dichos

microorganismos como agentes de control biológico requiere un profundo estudio de su

comportamiento en condiciones controladas, los ensayos previos a los experimentos de

campo son absolutamente necesarios antes de su aplicación a gran escala (Ramos, 1999).

Los actinomicetos, son microorganismos que han sido poco evaluados como

biocontroladores de hongos fitopatógenos, por tal razón se decidió evaluar la capacidad de

aislamientos de actinomicetos para sintetizar enzimas involucradas en la degradación de la

pared celular de patógenos fúngicos, y como complemento de investigaciones adicionales y

paralelas, se pueda pensar en estas bacterias como sustituyentes de fungicidas de uso

común, minimizando los efectos perjudiciales sobre el suelo y generando efectos benéficos

adicionales característicos de los microorganismos promotores del crecimiento vegetal.

28 

 

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar la producción de enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas por parte de cepas nativas

de actinomicetos y su posible efecto antagónico sobre algunos hongos fitopatógenos.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Establecer las condiciones óptimas para inducir y detectar la producción de

quitinasas.

• Evaluar la capacidad de cepas nativas de actinomicetos para sintetizar quitinasas.

• Evidenciar el efecto antagónico de cepas nativas de actinomicetos sobre hongos

fitopatógenos (Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.).

29 

 

5. METODOLOGÍA

5.1. RECONSTITUCIÓN DE CEPAS DE ACTINOMICETOS

A partir del banco de cepas de actinomicetos del Laboratorio UNIDIA de la Pontificia

Universidad Javeriana, las cuales fueron aisladas e identificadas microscópicamente y

macroscópicamente previamente por Duque y Quintana (2008) (Anexo 1), se realizó la

reconstitución de 23 aislamientos de actinomicetos y de la cepa de Streptomyces sp.

proporcionada por el Laboratorio de Biotecnología, estudiada como cepa quitinolítica por

Sastoque (2006), la cual fue empleada como cepa Control.

En la reconstitución se tomaron 40mL de medio avena líquido (avena comercial en hojuelas

y sacarosa, pH 6.8), y se inocularon con 100 µL de cada uno de los aislamientos

crioconservados. Cada medio inoculado se incubó en agitación a 120 rpm durante 5 días a

20ºC. A continuación se sembraron placas de agar avena suplementado con nistatina 0.1%

(v/v) y se incubaron a 25ºC durante 10 días, obteniéndose así el banco de trabajo constituido

por 24 aislamientos, el cual se mantuvo viable por pases sucesivos en agar avena (Anexo

2).

5.2. EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA

5.2.1 Preparación de quitina coloidal

La quitina coloidal fue preparada siguiendo el protocolo de Skujins y colaboradores (1965)

modificado por Rodríguez (2001) con una variación en el volumen a utilizar de H3PO4. Para

su efecto se tomaron 10 g de quitina comercial (SIGMA) y se disolvieron en 150 mL de

H3PO4 concentrado (85%), la mezcla fue dejada en agitación durante 48 h a 4ºC. La

solución resultante fue filtrada empleando fibra de vidrio, posteriormente se adicionó etanol

acuoso al 50% alcanzando un volumen final de 300 ml. A continuación la mezcla se colocó

en agitación hasta que se observó una solución homogénea y de aspecto coloidal. Se

realizaron 15 lavados con agua destilada mediante centrifugación a 4500 x g a una

30 

 

temperatura de 10ºC con el fin de alcanzar un pH cercano a la neutralidad (Figura 5.1), la

concentración final de la quitina coloidal fue estimada de acuerdo al volumen final obtenido.

La quitina coloidal empleada para el ensayo de actividad enzimática fue dializada contra

agua destilada durante 48 h.

Figura 5.1. Preparación Quitina coloidal

5.2.2. Diálisis de la quitina coloidal

Con el fin de evitar contaminaciones en la quitina coloidal a dializar, las membranas fueron

pretratadas con una solución que contenía NaHCO3 100mM y EDTA 10 mM a 60 ºC durante

2 horas, repitiéndose la incubación con solución fresca. Una vez finalizadas las

subsiguientes dos horas de tratamiento, la solución fue reemplazada con agua destilada,

siguiendo el procedimiento de incubación anteriormente señalado. Se realizaron 5 ciclos de

lavado con agua destilada, con el fin de eliminar trazas de la solución inicial. Luego de

incubar las membranas a 4 ºC, estas se transfirieron a un frasco que contenía agua destilada

con cloroformo (0.1% v/v) mientras eran utilizadas.

31 

 

Las membranas pretratadas fueron cortadas para obtener fragmentos de 25 cm.

Posteriormente 30 mL de quitina coloidal fueron adicionados en cada uno de los fragmentos

obtenidos. Una vez selladas las membranas se ubicaron en un recipiente con agua destilada

en agitación a 4 ºC durante 48 h, como se observa en la figura 5.2 (Wright, 2004).

Con el fin de determinar la concentración final de la quitina dializada se relacionó el volumen

obtenido tras el proceso de diálisis con el inicial, la quitina fue llevada a una concentración

final de 0,5% (p/v) empleando una solución tampón de fosfato de potasio (K2HPO4 0.1M,

KH2PO4 0.1M pH 6.0), la preparación fue almacenada a 4 ºC para su posterior uso (De la

Cruz et al., 1992; Kamil et al., 2007).

Figura 5.2. Diálisis de la Quitina Coloidal

5.2.3. Evaluación de producción de quitinasas en placa

5.2.3.1. Selección de cepas quitinolíticas

Se realizó un screening a partir del banco de trabajo con el fin de seleccionar las cepas de

actinomicetos que presentaban actividad quitinolítica. Las cepas de actinomicetos fueron

sembradas por método de estría en medio mínimo, preparado a partir de soluciones stock de

K2HPO4 y KH2PO4 3%, MgSO4.7H2O y CaCl2, FeCl3 y NaCl (Hoster et al., 2005; Franco,

2008). El medio fue suplementado con quitina coloidal al 1% (p/v) como única fuente de

carbono. Para determinar la viabilidad de las cepas, se empleó medio mínimo suplementado

32 

 

con glucosa 1% (p/v) como única fuente de carbono, el pH de los medios de cultivo fue

ajustado a 6.8 (Anexo 2). Después de 5 días de incubación a 25ºC las cepas que

presentaron zonas de hidrólisis en el medio con quitina coloidal 1% (p/v), fueron

consideradas como posibles cepas productoras de quitinasas; se seleccionaron 19 cepas del

banco para continuar con el estudio.

5.2.3.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad

quitinolítica

La concentración óptima de quitina coloidal para el estudio se determinó empleando las

cepas 4, 12, 26 (seleccionadas al azar) y Control, previamente seleccionadas como cepas

quitinolíticas en la evaluación en placa; éstas fueron sembradas en medio mínimo con 3

concentraciones de quitina coloidal: 0,5, 1 y 2% (p/v) (Taechowisan et al., 2003) para

determinar la concentración más baja que permitía una mejor visualización de la hidrólisis

enzimática; dichas concentraciones fueron evaluadas por triplicado para cada una de las

cepas ya mencionadas (Anexo 2).

5.2.3.3. Determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica

A partir de cada una de las cepas de actinomicetos seleccionadas para el estudio se realizó

un recuento de conidios en Cámara de Neubauer hasta obtener un inóculo de 107 cél·mL-1. A

cada caja de petri estéril se le adicionó 30 mL de medio mínimo con quitina coloidal 1% (p/v)

pH 6.8, para formar una capa de espesor grueso, posteriormente se realizaron cuatro pozos

con capacidad de 30 µL a una distancia equidistante, a continuación se agregaron 20 µl de

agar agua con el fin de conformar una capa sellante, y sobre esta capa se adicionaron 5 µL

del inóculo (Anexo 2). Este procedimiento se realizó en los cuatro pozos formados. Los

volúmenes empleados se seleccionaron de acuerdo a la estandarización realizada. El

montaje fue llevado a cabo por triplicado para cada una de las cepas evaluadas. Las placas

de petri se llevaron a incubar a una temperatura de 25ºC por un período de 9 días, y se

realizaron mediciones del diámetro de los halos de hidrólisis que se iban formando en el

medio los días 3, 5, 7 y 9.

33 

 

5.3. ENSAYO DE LA ESTANDARIZACIÓN PARA LA EVALUACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA

5.3.1. Curvas de calibración para la cuantificación de N-acetilglucosamina y proteínas

La cuantificación de azúcares reductores se realizó siguiendo el método de Somogyi Nelson,

modificado por Rodríguez (2001) (Anexo 3). Por medio de una curva de calibración se

determinó la concentración de N-acetilglucosamina a partir de una solución de 0.4 µg·µL-1. A

partir de ésta se prepararon soluciones a diferentes concentraciones, usando como diluyente

agua destilada. Se estableció un rango de concentraciones que iba desde 0.08 hasta 0.36

µg·µL-1., la curva fue realizada con 3 repeticiones. Por otro lado la cuantificación de

proteínas se llevó a cabo siguiendo el método de Bradford (1976) (Anexo 4), realizando una

curva patrón con suero albúmina de bovino (acrónimo del inglés: BSA), partiendo de una

solución concentrada de 2000 µg·mL-1, de igual manera se prepararon soluciones con

concentraciones diferentes, usando cloruro de sodio (NaCl 0.15M) como diluyente. El rango

varió de 50 µg·mL-1 hasta 1400 µg·mL-1, la curva se realizó con 3 repeticiones (Rodríguez,

2001).

5.3.2. Determinación del agente precipitante de las proteínas

Con el fin de determinar el agente a emplear para obtener una mejor precipitación y

concentración de la enzima, se realizó un ensayo con una muestra de BSA a diferentes

concentraciones (0.4 y 0.8 mg mL-1) y volúmenes (1.5, 2 y 3.0 mL), las cuales fueron

tratadas con sulfato de amonio y acetona, determinando la concentración de proteína

posterior al tratamiento y así lograr definir el agente con mayor eficiencia para dicho proceso.

A partir de una solución patrón de BSA 1 mg·mL-1se prepararon dos soluciones de ésta

misma proteína (0.4 mg·mL-1 y 0.8 mg·mL-1), empleando NaCl (0.15 M) como diluyente. A

partir de estas soluciones se transfirieron 3 volúmenes (1.5; 2.0 y 3.0 ml) a tubos tipo falcon

de 15 ml para obtener un total de 3 tubos por volumen para cada una de las concentraciones

de BSA, teniendo en cuenta que las muestras fueron evaluadas por triplicado.

34 

 

Posteriormente se realizó la precipitación de las muestras para el ensayo. Para el caso de la

acetona, la cual se encontraba fría, se adicionó un volumen equivalente al doble del volumen

de proteína transferido inicialmente a cada uno de los tubos falcon; el tratamiento fue

realizado por separado para las dos concentraciones de BSA. Por otro lado la precipitación

con sulfato de amonio se llevó a cabo adicionando un volumen de una solución saturada al

80% calculada a partir de la siguiente fórmula:

Donde

Vs: Volumen de la solución saturada de Sulfato de amonio

VP: Volumen de la solución de proteínas

X1: Fracción de saturación inicial

X2: Fracción de saturación final

Las muestras tratadas con acetona fueron almacenadas a -20ºC por 24 horas mientras que

las muestras tratadas con sulfato de amonio se conservaron a 4ºC por el mismo periodo de

tiempo. Luego de 24 horas, las proteínas precipitadas fueron recuperadas por centrifugación

a 13000 x g por 30 min a una temperatura de 4 ºC, posteriormente el pellet obtenido fue

resuspendido en 1ml de una solución tampón de fosfato de potasio (K2HPO4 0.1M, KH2PO4

0.1M, pH 6.0). La cuantificación de las proteínas se llevó a cabo siguiendo el método de

Bradford (1976). Las absorbancias leídas en el espectrofotómetro a una longitud de onda de

595nm fueron convertidas a concentraciones de miligramo de proteína por mililitro utilizando

la curva de calibración de BSA.

5.3.3. Estandarización de las variables físicoquímicas para la evaluación de la actividad enzimática

35 

 

Para determinar el efecto del tipo de quitina sobre la inducción de actividad enzimática, se

realizó una evaluación de la quitina coloidal y la quitina en polvo (Sigma) como única fuente

de carbono.

Con el fin de estandarizar las variables estudiadas se seleccionaron las cepas 25 y control

para llevar a cabo la prueba. Para su efecto se realizó un recuento de conidios en Cámara

de Neubauer hasta obtener un inóculo de 109 cel·mL-1. A un erlenmeyer con capacidad de

250 mL, se le adicionó 50 mL de medio mínimo líquido quitina coloidal 1% (p/v) (Anexo 2) y

500 µL del inóculo; por otro lado a 50 mL de medio mínimo líquido quitina en polvo 1.5 %

(p/v) (Anexo 2) se le adicionaron 500 µL del mismo inóculo. Cada erlenmeyer fue puesto en

agitación a 120 rpm a temperatura ambiente por 7 días. Al séptimo día de incubación se

realizó el muestreo del volumen total contenido en los erlenmeyers, ya que en los resultados

de la prueba en placa se obtuvo el aumento más significativo entre los días 5 y 7 para la

cepa evaluada (25). A continuación se realizó una doble centrifugación del volumen

muestreado a 7000 rpm en una centrifuga Einac 121010 durante 15 minutos para remover

las células y otras partículas interferentes. Dicho procedimiento fue realizado por triplicado

para cada una de las cepas. El sobrenadante obtenido fue almacenado a -20ºC.

El efecto de la precipitación sobre la actividad enzimática y la actividad enzimática específica

se determinó mediante el estudio de dos tratamientos: Uno que incluía un proceso de

precipitación (5x y 10x), y otro sin precipitación. Para llevar a cabo el tratamiento que incluía

precipitación, 45 mL del sobrenadante almacenado a -20ºC de cada una de las cepas fue

precipitado empleando acetona, para concentrar 5 veces la enzima se tomaron 15 mL del

sobrenadante y se mezclaron con 30 mL de acetona, adicionalmente para lograr una

concentración de 10 veces, 60 mL de acetona fueron adicionados a 30 mL del

sobrenadante. Las muestras tratadas fueron almacenadas a -20ºC por 24 horas.

Trascurridas las 24 horas las proteínas precipitadas fueron recuperadas por centrifugación a

13000 x g por 30 minutos a una temperatura de 4ºC, posteriormente el pellet obtenido fue

resuspendido en 3 mL de una solución tampón de fosfato de potasio (K2HPO4 0.1M, KH2PO4

0.1M, pH 6.0). Las muestras de cada tratamiento (5x y 10x) fueron almacenadas a -20ºC. El

montaje fue realizado por separado para cada una de las cepas evaluadas en los dos

medios de cultivo medio mínimo quitina coloidal y medio mínimo quitina en polvo.

36 

 

Con el fin de determinar las condiciones óptimas para evaluar la actividad enzimática y la

actividad enzimática específica de las quitinasas, se estudió la influencia que tienen las

variables temperatura y proporción enzima/sustrato sobre las actividades mencionadas.

El procedimiento fue realizado tomando las muestras tratadas con acetona (5x-10x) y el

sobrenadante no tratado con este agente almacenados a -20ºC, correspondientes a cada

una de las cepas (25 y control) y sustratos evaluados. El volumen de sobrenadante (enzima)

tomado fue dependiente de cada una de las proporciones enzima/sustrato a estudiar: 1:1

(150 µL de enzima y 150 µL de sustrato); 1:2 (100 µL de enzima y 200 µL de sustrato) y 1:4

(50 µL de enzima y 200 µL de sustrato). Como sustrato se empleó la quitina coloidal al 0.5%

(p/v) dializada y almacenada a 4 ºC. Una vez conformadas las mezclas enzima/sustrato, se

incubaron en un baño termostatado durante 1 hora, evaluando dos temperaturas (40ºC y

50ºC) (Gupta et al., 1995; Gomes et al., 2000; Gomes et al., 2001).

A continuación se determinó la concentración de azúcares reductores por medio de la

reacción de Somogyi-Nelson, utilizando una curva patrón de N-acetilglucosamina (GlcNAc),

siguiendo el protocolo de Rodríguez (2001) (Anexo 3). La unidad de actividad enzimática fue

definida como la cantidad de enzima que genera la liberación de 1 µmol de GlcNAc en un

minuto (Gomes et al., 2000). Igualmente se determinó la concentración de proteína por el

método de Bradford (1976), las absorbancias leídas fueron convertidas a concentraciones de

miligramo de proteína por mililitro utilizando la curva de calibración de concentraciones

conocidas de BSA (Anexo 4).

Con el fin de evitar interferentes en los resultados, se realizó la cuantificación de proteínas

en medio mínimo líquido quitina en polvo 1.5 % (p/v) y en medio líquido quitina coloidal 0.5

% (p/v). Para su efecto, se realizó un montaje en erlenmeyers conteniendo 50 ml de medio

mínimo quitina en polvo y 50 mL de medio mínimo quitina coloidal, el montaje se realizó por

triplicado para cada uno de los tratamientos. Los erlenmeyers se incubaron en agitación a

120 rpm a temperatura ambiente durante 7 días. Posteriormente se realizó una doble

centrifugación del medio recuperado en cada erlenmeyer a 7000 rpm en una centrifuga

Einac 121010 durante 15 minutos. La concentración de azúcares reductores se determinó

por medio de la reacción de Somogyi-Nelson y la concentración de proteína mediante el

método de Bradford (1976).

37 

 

5.4. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO

Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de actinomicetos se

realizó un enfrentamiento en cultivo dual, actinomiceto/hongo fitopatógeno siguiendo una

combinación de los protocolos de Crawford y colaboradores (1993) y Gravel y colaboradores

(2005). Los patógenos evaluados se seleccionaron por ser hongos asociados a

enfermedades del suelo presentes en trébol blanco: Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.,

proporcionados por el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Colombia

y el Laboratorio de Micología de la Pontificia Universidad Javeriana respectivamente.

Se realizó una siembra masiva ocupando un espacio de 3 cm de distancia a partir de uno de

los extremos de la caja de cada una de las cepas evaluadas en agar PDA (Anexo 2) pH 6.8

por triplicado, posteriormente éstas fueron puestas en incubación a 25ºC durante 10 días,

hasta observar la esporulación de las colonias. A continuación se inoculó un disco de agar

YGC de 0.5 cm (Anexo 2) donde previamente se encontraba crecido el hongo a evaluar

(Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.) a una distancia de 3 cm del extremo opuesto a la siembra

del actinomiceto. Por otro lado se evaluó la viabilidad del hongo fitopatógeno sin interactuar

con otro microorganismo, el cual fue inoculado por técnica de disco de agar en el centro de

una caja de petri con agar PDA (Figura 5.3); después de 8 días de incubación se realizó la

medición del crecimiento libre e influenciado del fitopatógeno con el fin de determinar el

porcentaje de inhibición de crecimiento radial del fitopatógeno (PICR) generado por el

actinomiceto, el cual fue calculado mediante la siguiente fórmula:

PICR: (Crecimiento libre - Crecimiento influenciado) X 100 Crecimiento libre

38 

 

5.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados obtenidos en la evaluación de actividad qutinolítica y en el ensayo de la

actividad antifúngica in vitro fueron sometidos a un análisis de varianza de clasificación

simple (ANOVA), siendo las medias con diferencias significativas comparadas según la

prueba de rangos múltiples de Duncan para P≤0.05, con el fin de determinar si las variables

en estudio cepa, días y réplicas y cepa y réplicas, respectivamente, presentaban variabilidad

en el modelo. Adicionalmente se realizó un análisis del comportamiento del diámetro de los

halos de cada una de las cepas evaluadas según el área bajo la curva para observar así la

tendencia general a través del tiempo, para ello se empleo la fórmula reportada por Istifadah.

Por otro lado se realizó una correlación de Pearson entre los valores de área bajo la curva

obtenidos en la determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica y los porcentajes

de inhibición de crecimiento radial (PICR), para identificar la relación líneal existente entre

estas dos variables cuantitativas.

 

Donde

Y: Diámetro del halo t: Día de medición.

Figura 5.3. Montaje enfrentamiento dual Actinomiceto/hongo. A. Actinomiceto, B. Hongo Fitopatógeno.

39 

 

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 RECONSTITUCIÓN DE LAS CEPAS DE ACTINOMICETOS

Para la realización del estudio se seleccionaron 23 aislamientos de actinomicetos del banco

de cepas del grupo UNIDIA de la Pontificia Universidad Javeriana. Los viales con las cepas

de actinomicetos conservadas en glicerol, se reconstituyeron para contrarrestar el estrés

generado por la congelación que afecta la actividad metabólica del microorganismo,

garantizando la estabilización y recuperación total de los procesos moleculares (Sánchez y

Corrales, 2005). Se empleó medio avena líquido, que posiblemente favoreció el intercambio

molecular iónico y la recuperación de la actividad metabólica de la membrana celular

rápidamente (Sánchez y Corrales, 2005). Una vez finalizado el periodo de reconstitución,

cada una de las cepas fue sembrada masivamente en agar avena. Inicialmente se

observaron colonias ligeramente húmedas y algo brillantes, pero con el transcurrir del tiempo

se volvieron opacas y secas adquiriendo una textura pulverulenta (Figura 6.1); según León y

colaboradores (2007) este cambio en la morfología hace referencia a los estados de

conversión por los que pasan las hifas aéreas hasta llegar a la formación de esporas.

 

Figura 6.1. Aspecto macroscópico cepas 7, 8 y 3, crecidas en agar Avena. 

El agar empleado para la siembra masiva, fue un medio altamente nutritivo cuyo

componente principal es la hojuela de avena procesada, la cual resulta ser uno de los

cereales más completos por sus cualidades energéticas y nutritivas, presentando en su

40 

 

contenido proteínas, hidratos de carbono, lípidos, vitaminas y minerales como Sodio,

Potasio, Calcio, Fósforo, Magnesio, Hierro, Cobre y Zinc (Longevus, 2007). Este medio pudo

haber favorecido el crecimiento de los actinomicetos y el desarrollo de las características

propias de éstos, las cuales permitieron corroborar que las cepas trabajadas correspondían

a bacterias filamentosas.

Transcurrido el periodo de incubación, se realizó una confirmación de las características de

los actinomicetos a nivel microscópico y macroscópico. El reconocimiento macroscópico se

realizó teniendo en cuenta factores claves y propios de este tipo de microorganismos. Las

colonias crecidas presentaban bordes no regulares y se encontraban fuertemente adheridas

a la superficie del medio, mostrando una consistencia dura y compacta. Las características

de coloración del micelio sobre el sustrato también fueron utilizadas para facilitar el

reconocimiento de estos microorganismos. Las cepas evaluadas presentaban variedad de

colores de micelio, principalmente del micelio aéreo, mostrando pigmentaciones que variaron

en los tonos blanco, gris, azul, rosa, crema y amarillo principalmente. Estas coloraciones no

mostraron ser exclusivas del micelio, sino que se difundieron en el medio, alterando la

coloración del mismo. La variedad de colores refleja la presencia de diversas especies y

también la capacidad de estos microorganismos de producir pigmentos melanoides, tal como

lo reportó Fialho De Oliveira (2003), quien encontró comportamientos macroscópicos

similares. Adicionalmente se observó una apariencia pulverulenta como consecuencia de la

formación de largas cadenas de esporas altamente hidrofóbicas, las cuales se originan de la

subdivisión de la hifa aérea que surge a partir de la hifa del sustrato, característica puntual

del crecimiento de éste tipo de microorganismos sobre medio sólido (Hodgson, 1992). Otra

característica que permitió inferir que las cepas reconstituídas eran actinomicetos fue la

presencia de un fuerte olor a tierra húmeda generado por la capacidad de estas bacterias

filamentosas para producir terpenoides al final de la fase exponencial de crecimiento (Wu y

Chen, 1995; Fialho De Oliveira, 2003).

Por medio de la realización de una tinción de Gram, se confirmó microscópicamente que el

total de las cepas empleadas eran Gram positivas, presentando filamentos con

ramificaciones, observándose en algunos casos septos en el micelio (Serrano et al., 2003).

41 

 

6.2. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA

6.2.1. Medio de cultivo

Para la realización de un ensayo in vitro de evaluación de actividad quitinolítica, la selección

de un medio de cultivo resulta ser un factor determinante para el crecimiento de los

microorganismos y la producción de metabolitos (Shanmugaiah et al., 2008). Se decidió

emplear el medio reportado por Hoster y colaboradores (2005), modificado por Franco-

Correa (2008), medio mínimo con adición de quitina coloidal como única fuente de carbono y

cloruro de amonio como fuente inorgánica de nitrógeno para evaluar la actividad quitinolítica

de los aislamientos de actinomicetos (Anexo 2). Se utilizó quitina coloidal debido a que

diversos autores han encontrado una producción notable de quitinasas cuando los distintos

medios la contienen (Wen et al., 2002; Sandhya et al., 2005; Ahmadi et al., 2008;

Shanmugaiah et al., 2008; Sharaf, 2005); adicionalmente, para la evaluación de la actividad

enzimática y actividad enzimática específica la quitina fue dializada con el fin de eliminar

sales y compuestos de bajo peso molecular que pudieran interferir en la reacción

enzima/sustrato. El medio contenía sales minerales, las cuales favorecieron el crecimiento

de los microorganismos; Hsu y Lockwood (1975) demostraron en su estudio un crecimiento

más efectivo de aislamientos de actinomicetos marinos cuando se empleó agar quitina

coloidal con sales minerales, en relación a lo obtenido en un medio ausente de éstas. Así

mismo, para la selección del medio, se tuvo en cuenta lo reportado por Safarida y

colaboradores (2006), quienes señalaron la importancia de los micronutrientes tales como

Potasio, Magnesio y Calcio en la conservación de la conformación estructural de las

enzimas. Lo anterior favorece el estudio en la medida en que un buen crecimiento inicial

puede permitir una mejor producción de quitinasas ya que la densidad del inóculo es un

factor que puede afectar la producción de enzimas (Nawani y Kapadnis, 2005).

6.2.2. Evaluación de la producción de quitinasas en placa

6.2.2.1. Selección de las cepas quitinolíticas

La evaluación se inició con 23 aislamientos de actinomicetos, de los cuales 19 fueron

capaces de utilizar la quitina coloidal como única fuente de carbono (Tabla 6.1.), mostrando

42 

 

crecimiento y presentando una zona de hidrólisis alrededor de la colonia como se observa

en la Figura 6.2., indicando actividad quitinolítica (Kamil et al., 2007; Swiontek et al., 2007).

Se puede corroborar la habilidad de los microorganismos del suelo como los actinomicetos

para hidrolizar quitina, ya que un alto porcentaje (82,6%) de los aislamientos de

actinomicetos mostraron presentar actividad quitinolítica para esta prueba en placa, lo cual

coincide con lo reportado por Blaak y colaboradores (1993) y Mukherjee y Sen (2006),

quienes demostraron la capacidad de Streptomyces olivaceoviridis y Streptomyces

venezuelae P10, respectivamente, para hidrolizar quitina; de igual manera Taechowisan y

colaboradores (2003) demostaron en su estudio que la mayoría de los aislamientos

evaluados eran quitinolíticos. A su vez, Strzelcz y colaboradores (1990), Fermino y

colaboradores (2006) y Tahtamouni y colaboradores (2006) reportaron en su evaluación un

alto porcentaje de actinomicetos capaces de emplear la quitina como fuente de carbono

siendo del 100, 60 y 83%, respectivamente

En contraste, las cepas identificadas como 6, 9, 23 y 30 presentaron crecimiento pero no

halo de hidrólisis, por lo cual no fueron consideradas como cepas quitinolíticas y en

consecuencia fueron eliminadas del estudio; probablemente trazas de azúcar del medio

avena les permitió alcanzar un crecimiento muy leve sobre este medio de cultivo, teniendo

en cuenta que los actinomicetos son nutricionalmente versátiles, siendo capaces de crecer

en un medio con limitación de nutrientes (El-Nakeeb y Lechevalier, 1962; Thangapandian et

al., 2007).

43 

 

Medio mínimo suplementado con quitina coloidal al 1%

Cepas Presencia de hidrólisis Cepas Presencia de

hidrólisis

Control + 14 + 1 + 16 + 2 + 18 + 4 + 19 + 5 + 21 + 6 - 22 + 7 + 23 - 8 + 24 + 9 - 25 +

10 + 26 + 11 + 27 + 12 + 30 -

Tabla 6.1. Detección de microorganismos quitinolíticos en medio mínimo suplementado con quitina coloidal al 1%. 

 Figura 6.2 Hidrólisis de quitina coloidal en placa.

6.2.2.2. Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad quitinolítica

Para la determinación de la óptima concentración de quitina para la visualización de los

halos de hidrólisis se realizó un montaje tomando 3 cepas aleatoriamente (Cepas 4, 12 y

26), previamente seleccionadas como quitinolíticas en la evaluación en placa. Dichas cepas

fueron sembradas en medio mínimo utilizando tres concentraciones de quitina coloidal

reportadas en la literatura 0.5% (Shanmugaiah et al., 2008), 1% (Kamil et al., 2007) y 2%

(Ogawa et al., 2002; Salazar et al., 2006;). A la concentración de 0.5%, las zonas de

hidrólisis que rodeaban las colonias de las bacterias eran difíciles de visualizar, a las

concentraciones 1 y 2% se evidenció un aumento en la hidrólisis, generándose un

44 

 

aumento en la claridad del medio como se observa en la Figura 6.3., por tal motivo se

decidió emplear la concentración de 1% (siendo la menor concentración de las dos que se

visualizaron) para la realización de la prueba semicuantitativa, teniendo en cuenta factores

económicos y el prolongado tiempo que toma la preparación de este sustrato. La razón por

la que las zonas de hidrólisis no fueron visualizadas al emplear una concentración de 0.5%,

puede deberse al hecho que la inducción de la producción de quitinasas se ve estimulada

por el incremento de la concentración de la quitina coloidal (Sharaf, 2005). Adicionalmente el

emplear una concentración más alta de quitina coloidal posiblemente genera una opacidad

visula del medio, lo que puede facilitar la observación de los halos de hidrólisis.

 

Figura 6.3. Evaluación de la concentración de quitina Cepa 4, 12 y 26. A, 0.5%. B, 1%. C. 2%.

6.2.2.3. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica

La actividad quitinasa puede ser evaluada cuantitativamente mediante la determinación del

desarrollo de zonas de aclaramiento alrededor de las colonias crecidas en el agar quitina

coloidal. El potencial de los aislamientos para la producción de quitinasas se determinó con

base en el radio de la zona de aclaramiento y el tamaño de la colonia (Gohel et al., 2006). La

actividad quitinolítica fue detectada semicuantitativamente para cada una de las cepas en

45 

 

medio quitina coloidal al 1%, siguiendo la metodología de siembra en pozo. La cepa control

de Streptomyces sp, previamente había mostrado producir quitinasas según estudios

realizados por Sastoque (2006), motivo por el cual fue usada como cepa control para el

estudio.

El tamaño de las colonias y los halos fue medido. Las cepas 24 y 22 mostraron tener un

buen potencial quitinolítico evidente por su crecimiento e hidrólisis de quitina en placa,

presentando un halo de hidrólisis de 8.133 y 7.508 mm respectivamente, indicando una

mejor difusión de las enzimas quitinolíticas (Ahmadi et al., 2008) (Figura 6.4). Por el

contrario las cepas 1 y 19 no generaron halo de hidrólisis y en la cepa 11 el diámetro de

hidrólisis alcanzado (0.125 mm) después de los 9 días de evaluación fue muy pequeño en

comparación a las demás cepas en estudio. Estos resultados pueden ser explicados como

consecuencia de la concentración de inóculo empleada, ya que ésta pudo no haber sido

suficiente para lograr observar un efecto hidrolítico en el medio de cultivo, teniendo en

cuenta los estudios de Patidar y colaboradores (2005) quienes observaron un incremento

lineal en la producción de quitinasas cuando la concentración del inóculo aumentaba. Por

otro lado es posible que se haya presentado una pérdida de actividad por parte de estas

cepas debido a una unión inespecífica del centro activo de la enzima (quitinasas) con el

sustrato (quitina) (Álvarez y Del-Barrio, 2008), teniendo en cuenta que esta unión no se

efectúa por una simple adsorción inespecífica sino que tiene lugar a través de una

localización concreta de la enzima, llamada centro activo, en donde se establecen múltiples

interacciones no covalentes entre los aminoácidos que forman el centro activo y el sustrato,

pudiéndose, en consecuencia, no generar la hidrólisis enzimática de la quitina (Franco,

2007). De igual manera puede que estas cepas hayan perdido su actividad quitinolítica,

teniendo en cuenta lo encontrado previamente en donde se ha señalado que subcultivos

continuos pueden tener efectos negativos en la producción de metabolitos secundarios por

parte de los microorganismos, resaltando el caso de un Streptomyces ambofaciens el cual

perdió cerca del 20% de su capacidad para producir Espiramicina tras cuatro subcultivos, es

así, como puede suponerse que esto mismo haya ocurrido en estas cepas en relación a la

producción de quitinasas (Taddei et al., 1999).

46 

 

Figura 6.4. Evaluación de la actividad quitinolítica semicuantitativa. A, cepa 26. B, cepa Control. C, cepa 22.

Se realizó un ANOVA analizando el área bajo la curva (teniendo en cuenta los cuatro

tiempos de evaluación), en donde la variable de interés fue el área del halo de hidrólisis

generado alrededor de las colonias crecidas en medio quitina coloidal al 1%. Es importante

tener en cuenta que el tratamiento control fue codificado como cepa 0. Este cálculo fue

realizado con el fin de determinar el comportamiento del diámetro de los halos de cada una

de las cepas evaluadas para observar de esta manera la tendencia general a través del

tiempo, siguiendo lo estudiado por Istifadah y colaboradores (2006). Los resultados del

análisis de varianza (Anexo 6) muestran un p - valor <0.0001 indicando que el modelo

general es estadísticamente significativo y permite identificar la variabilidad que existe en la

variable de interés. De igual manera se realizó la evaluación de las variables cepa y réplica

con el fin de determinar su aporte al estudio. El p – valor de la variable cepa fue <0.0001 por

lo cual se pudo inferir que la Cepa es una variable que explica el comportamiento del

crecimiento del área del halo, siendo un factor de interés y de comparación por lo que no

debe ser eliminada del modelo. Por su parte la variable réplica presentó un p – valor de

0.1971 indicando que no existe diferencia estadísticamente significativa, confirmando que a

nivel de réplica éstas se comportaron como tales en el estudio.

La comparación entre los promedios de áreas de halo de hidrólisis por cepas y por días fue

realizado por medio de la prueba del rango múltiple de Duncan para áreas bajo la curva, los

resultados demuestran que existen diferencias estadísticamente significativas entre éstos,

de manera tal que permitieron conformar seis grupos de acuerdo a la similitud de los valores

de sus medias con variaciones desde aproximadamente 49 hasta 0.5 (Tabla 6.2.).

47 

 

Cepa Media Agrupamiento Duncan24 48,817 A 22 44,317 A 14 35,137 B 26 34,75 B 5 23,417 C

25 20,833 C D 2 20,333 C D 4 18,667 C D E 7 17263 D E

27 19,917 D E 0 16,25 D E

21 15,417 D E F 12 12,667 E F G 8 10 F G

18 9,117 G 10 8,733 G 16 7,375 G 11 0,5 H19 0 H1 0 H

Tabla 6.2. Agrupamiento de Duncan para áreas bajo la curva – Área de halo de hidrólisis para actividad

quitinolítica en placa.

Con el fin de comparar la medición (mm) de los halos formados a través de los días de

evaluación por cada una de las cepas, se tomaron los datos iniciales sin calcular el área total

de crecimiento del halo durante los 9 días de medición, calculando el promedio de los datos

de diámetro de los halos obtenidos en los cuatro tiempos de medición. De acuerdo al

análisis de varianza realizado, el modelo mostró ser adecuado ya que presentó un p – valor

para la variable cepa de <0.0001, lo que fue confirmado por el R cuadrado obtenido que

establece una variabilidad de los datos del 84%. Por otro lado se observó que las variables

cepa y día incluidas en el modelo resultaron ser válidas pues presentaron un p - valor de

<0.0001. Este resultado coincide con lo esperado, teniendo en cuenta que la medición del

diámetro del halo es diferente en los tiempos de evaluación. Por su parte, la variable réplica

presentó nuevamente un p - valor superior a 0.05 (0.2333), lo que confirmó que las réplicas

no presentaron diferencias significativas entre ellas (Anexo 6). La tabla 6.3 presenta las

comparaciones de los promedios de las mediciones de los halos a lo largo de 9 días de

evaluación entre las diferentes cepas, presentándose una vez más diferencias significativas

entre los resultados que conllevaron a la formación de 6 grupos, en donde se observa que

las cepas 24 y 22 permanecieron en una posición superior en relación a las demás cepas,

como consecuencia de haber presentado los mayores diámetros de halo. Los resultados

48 

 

muestran que el ordenamiento de las cepas y los grupos conformados según el

agrupamiento de Duncan en función de los promedios de los diámetros de los halos, en los

cuatro tiempos de medición es el mismo que el obtenido con los datos para el área bajo la

curva, siendo así buenas aproximaciones para observar el comportamiento general de los

aislamientos en el transcurso del tiempo de evaluación.

Cepa Media Agrupamiento Duncan24 8,1333 A 22 7,5083 A 14 5,8108 B 26 5,75 B 5 3,8542 C

25 3,5833 C D 2 3,2917 C D 4 3,0833 C D E 7 2,8288 D E

27 2,625 D E 0 2,6042 D E

21 2,375 D E F 12 1,9167 E F G 8 1,6771 F G

18 1,5708 G 10 1,5333 G 16 1,3125 G 11 0,125 H19 0 H1 0 H

Figura 6.3. Agrupamiento de Duncan para medición de halo de hidrólisis durante 9 días de evaluación.

Para evaluar las diferencias del comportamiento de las mediciones de los halos del total de

las cepas por día, se realizó un agrupamiento de Duncan que mostró presentar diferencias

significativas entre cada uno de los días de medición. Según los resultados obtenidos, el

tamaño del halo aumentó en función del tiempo, conformándose así 4 grupos, en donde se

evidenció que la mayor variación se presentó entre los días 3 y 5 (Tabla 6.4.). Esto coincide

con lo señalado por Gadelhak y colaboradores (2005) y Tsay y colaboradores (2006),

quienes reportaron un periodo de 5 días para la producción de quitinasas en placa para

Streptomyces sp y actinomicetos en general respectivamente.

49 

 

Día Media Agrupamiento 9 4.3822 A 7 3.4919 B 5 2.6844 C 3 1.4712 D

Tabla 6.4. Agrupamiento de Duncan para días de medición.

Con el fin de realizar la comparación de las cepas dentro de cada uno de los días de

medición, se decidió realizar un nuevo agrupamiento, para cada día de medición se ajustó

un modelo de análisis de varianza. Los p -valor obtenidos para el modelo fueron <0.0001

para todos los días de evaluación, indicándonos que el modelo es bueno y expresa

variabilidad. El mismo resultado fue obtenido para la variable cepa por lo que nuevamente se

infiere que valores de medición estadísticamente significativos fueron obtenidos

dependiendo de cada una de las cepas. En el caso de la variable réplica los valores

obtenidos fueron: 0.1844; 0.1384; 0.5460 y 0.3359, para los días 3, 5, 7 y 9 respectivamente.

Como se observa, se encontraron valores por encima de 0,05, explicando una vez más que

experimentalmente la variable réplica se comporta adecuadamente (Anexo 6).

Las medias de la variable de interés de las cepas fueron agrupadas y comparadas para cada

uno de los días; es así como se obtuvo la formación de distintos grupos dependiendo del día

de medición. En el día 3 se obtuvieron 4 grupos, en el día 5 se formaron 5 grupos y en los

días 7 y 9 se observó la conformación de 6 grupos (Tabla 6.5.).

Como se observa la máxima medición alcanzada al día 9, fue de aproximadamente 11.4

mm, diversos autores señalan que un tamaño de halo significativo debe encontrarse por

encima de los 5 mm (Taechowisan et al., 2003; Shanmugaiah et al., 2008), por lo tanto, bajo

esta condición, solo las cepas 2, 14, 22, 24, 25 y 26 superarían lo que la literatura presenta.

Sin embargo, para efectos del estudio, todas las cepas que presentaron hidrólisis enzimática

fueron seleccionadas para la prueba de antagonismo, teniendo en cuenta que los datos

preliminares no siempre coinciden con la información obtenida en un screening secundario,

que por lo general consiste en pruebas cuantitativas de la enzima secretada por las cepas

en medio líquido, a lo largo de diferentes tiempos de incubación (Gómez et al., 2004). Es

importante resaltar que de las 19 cepas en evaluación, aproximadamente el 53%

50 

 

presentaron actividad quitinolítica en placa superiores a las obtenidas en la cepa control,

para las condiciones de evaluación.

Tabla 6.5. Agrupamiento Duncan para la comparación de halos de hidrólisis de quitina por día.

A pesar que, en los días definidos de medición se obtuvo la formación de diferente número

de grupos, y que estos pertenecían a diversas cepas, los máximos y los mínimos a partir del

día 5 siempre fueron conservados. Se encontraron cepas como las 2, 12, 21, 27 y control, en

las cuales no se evidenció la formación de un halo de hidrólisis al día 3 de medición, pero si

al día 5 de medición; teniendo en cuenta que se trabajaron cepas diferentes, el metabolismo

entre una y otra pudo haber variado generando la hidrólisis de la quitina en diferentes

tiempos; estudios previos con actinomicetos han señalado diferentes tiempos de incubación

para poder evidenciar el halo de hidrólisis, El Fiky y colaboradores (2003) estudiaron un

tiempo de incubación de 3 días para que las zonas de hidrólisis fueran evidenciadas, por el

contrario Ahmadi y colaboradores (2008) y Shamungaiah y colaboradores (2008)

evidenciaron los halos de hidrólisis a los 10 y 5 días de incubación respectivamente. Como

se mencionó anteriormente las variaciones más representativas en relación al tamaño del

halo se presentaron entre los días 3 y 5 de medición, en algunas cepas ésta variación se

51 

 

hizo menos notoria a lo largo del tiempo de evaluación, esto pudo deberse a una

disminución en la producción de quitinasas por efecto de la represión por catabolitos.

Estudios previos realizados por Leisner y colaboradores (2008) demostraron que cuando

adicionaron glucosa a placas con agar quitina se generó una reducción en el tamaño de las

zonas de aclaramiento sugiriendo de esta manera que la actividad quitinasa esta sujeta a la

represión catabólica.

6.3. ESTANDARIZACIÓN DE LA PRUEBA PARA LA EVALUACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA

6.3.1. Determinación del agente precipitante de las proteínas

Con el fin de comparar y seleccionar el agente precipitante que permitiera una mayor

recuperación de proteínas a partir de las muestras de suero albúmina de bovino (acrónimo

del inglés BSA), se evaluaron dos agentes de precipitación: sulfato de amonio (80% de

saturación) y acetona fría. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 6.6.

Agente de precipitación

Concentración BSA mg/ml

Volumen: BSA (ml)

Cantidad BSA (mg) (pre-

tratamiento)

Concentración BSA (mg/ml)

(post-tratamiento)

Cantidad BSA (mg)

(post-tratamiento)

Porcentaje de

recuperación de BSA (%)

Acetona

0,4 1,5 0,6 6,469 6,469 1078,199 0,4 2 0,8 270,479 270,479 33809,819 0,4 3 1,2 323,865 323,865 26988,725 0,8 1,5 1,2 1487,019 1487,019 123918,210 0,8 2 1,6 1133,623 1133,623 70851,450 0,8 3 2,4 1667,105 1667,105 69462,689

Sulfato de amonio 80% saturación

0,4 1,5 0,6 33,455 33,455 5575,758 0,4 2 0,8 123,918 123,918 15489,693 0,4 3 1,2 409,415 409,415 34117,931 0,8 1,5 1,2 41,422 41,422 3451,816 0,8 2 1,6 395,019 395,019 24688,692 0,8 3 2,4 610,486 610,486 25436,921

Tabla 6.6. Evaluación agentes precipitantes de proteínas.

52 

 

Los resultados muestran que tras el proceso de precipitación se recuperó mayor cantidad de

proteína en relación a la cantidad de la cual se partió, obteniéndose por ende porcentajes de

recuperación superiores al 100%. Posiblemente esto pudo haber sido ocasionado por la

acción de interferentes en la reacción de Bradford que pudieron aumentar la lectura de las

absorbancias. Frente a esto, diversas posibilidades han sido sugeridas, Nobel (2000)

encontró que ciertas interacciones proteína – químico y químico – colorante interfieren en el

ensayo; la interferencia de los componentes no protéicos ocurre debido a su habilidad de

generar cambios en los niveles de equilibrio del colorante, bien sea por unión directa o por

modificación del pH. Por otro lado, es posible que la acetona haya generado interferencia en

la reacción debido a que se empleó en una concentración final superior (66.3%)a la sugerida

para el proceso de precipitación (10%) (Nobel, 2000). De igual manera, Bradford (1976)

explica que la acetona genera un cambio de 0.069 en la absorbancia cuando es leída a 595

nm, lo cual equivale a 6.21 µg de albúmina sérica bovina, aumentando en consecuencia el

valor obtenido en la lectura. Otro factor que pudo generar estas alteraciones en los

resultados es el aumento de la temperatura del reactivo Azul de Coomassie Brillante G

cuando éste se encuentra a temperatura ambiente, lo cual puede afectar las medidas de

absorbancia a 595 nm generando un aumento de los valores, y así se aportan falsos

positivos en las lecturas realizadas (Pierce, 2004). En el caso de la precipitación con sulfato

de amonio la interferencia pudo ser ocasionada por la alta concentración de esta sal (4.84

M), ya que no se realizó un proceso de diálisis para eliminar los remanentes del sulfato de

amonio. Bradford (1976) muestra que no se evidencia interferencia cuando este agente

precipitante se encuentra en una concentración de 1M, sin embargo al encontrarse alrededor

de 4 veces más alta, pudo posiblemente generar alteraciones en la reacción. De igual

manera, cabe la posibilidad que al reutilizar celdas para realizar la lectura de las

absorbancias, en la limpieza de éstas puede que no se haya generado una completa

remoción de partículas presentes generando un aumento en los resultados obtenidos

(Pierce, 2004). Finalmente, es importante resaltar que la concentración del stock empleado

no fue confirmada a través de la cuantificación de proteínas por el método de Bradford, lo

cual, en el caso de que la concentración teórica inicial no fuera la real, podría haber

contribuido a la obtención de los elevados porcentajes de recuperación. Teniendo en cuenta

los resultados, es necesario realizar una repetición del ensayo, con el fin de determinar el

agente precipitante que permite obtener los mejores rendimientos. Sin embargo, se decidió

seleccionar la acetona para realizar el proceso de precipitación y así continuar con el

ensayo, debido a la dificultad que presentó la solubilización del sulfato de amonio en la

preparación de la solución saturada empleada para llevar a cabo el proceso de precipitación

y al hecho que la acetona evita tener que realizar un proceso de diálisis.

53 

 

6.3.2. Estandarización de las variables fisicoquímicas para la evaluación de la actividad enzimática

Las quitinasas son normalmente producidas por un amplio rango de microorganismos, en

donde se pueden destacar las bacterias, que participan en el proceso de descomposición de

la quitina liberando como principal producto N-acetilglucosamina, monómero que también

resulta ser una fuente importante de carbono y nitrógeno para los microorganismos

(Donderski y Trzebiatowska, 1999).

Para la evaluación de la influencia que genera el tipo de sustrato sobre la actividad

enzimática y actividad enzimática específica se emplearon las cepas 25 y control. La cepa

25, fue seleccionada aleatoriamente ya que presentaba un diámetro de halo intermedio en

comparación a las demás cepas evaluadas.

Teniendo en cuenta que la actividad quitinolítica puede verse inducida por el uso de

sustratos como quitina coloidal o residuos industriales más complejos como el extracto de

camarón (Sastoque et al., 2007), se realizó un cultivo bajo las condiciones señaladas en la

metodología utilizando medio mínimo líquido suplementado con quitina coloidal al 0.5% (p/v)

y medio mínimo líquido suplementado con quitina en polvo al 1.5% (p/v), según reportes

previos de De la Cruz et al. (1992), el pH del medio fue ajustado a 6.8. El montaje realizado

se muestra en la Figura 6.5, cabe resaltar que se seleccionó un período de 7 días de

incubación, ya que fue el tiempo en el cual se observó la producción más significativa de

quitinasas según la prueba realizada en placa para la cepa 25. La quitina coloidal se utilizó

en una concentración de 0.5% (p/v) debido a que estudios previos han mostrado un nivel

máximo de inducción de la producción de quitinasas en microorganismos como Bacillus sp

NCTV2 (Wen et al., 2002), Alternaria alternata (Sharaf, 2005) y Trichoderma harzianum (El-

Katatny et al., 2000; Sandhya et al., 2005) cuando dicha concentración fue usada

(Shanmugaiah et al., 2008). En los resultados obtenidos, se encontró que una mayor

actividad enzimática fue alcanzada cuando se empleó el medio suplementado con quitina

coloidal como única fuente de carbono (Figura 6.6.) (Anexo 7). Esto es comparable con lo

reportado por Taechowisan y colaboradores (2003) quienes demostraron una alta

producción de quitinasas por S. aureofaciens CMUAc130, empleando quitina coloidal al 1%

(p/v) como sustrato en medio mínimo líquido pH 7, después de 7 días de incubación en

agitación a 30ºC, indicando así la alta especificidad por este sustrato en comparación a otros

54 

 

como quitina cruda, quitina molida y pared celular de Schizosaccharomyces sp. De igual

manera Il’ina et al. (2004) estudiaron la hidrólisis de la quitina empleando una preparación

enzimática a partir de una cepa de Trichoderma reesei, en donde la mayor cantidad de

azúcares reductores se produjo al utilizar quitina tratada con ácido ortofosfórico (quitina

coloidal) como fuente de carbono en comparación a cuando se empleó quitina cristalina en

polvo de concha de cangrejo. La producción de enzimas extracelulares del tipo quitinasas en

un medio de cultivo como éste ocurre debido a la capacidad que tienen los actinomicetos

quitinolíticos para crecer empleando este sustrato como fuente de carbono y nitrógeno, en

donde la producción de estas enzimas puede verse altamente inducida por el polímero como

tal y/o por paredes celulares fúngicas (Trejo et al., 1998; Shanmugaiah et al., 2008).

Figura 6.5. Inducción de quitinasas Cepa 25 y Control, empleando medio quitina coloidal y medio quitina en polvo

La mayor producción de azúcares reductores liberados por acción de las quitinasas

inducidas en el medio quitina coloidal puede deberse a la fácil accesibilidad que presenta

este sustrato para los microorganismos en comparación a la estructura cristalina de la quitina

en polvo (Nawani y Kapadnis, 2005). Los materiales coloidales presentan moléculas que

resultan ser más accesibles para generar la hidrólisis enzimática en relación a sustratos

densos que muestran una organización molecular más cerrada generando una estructura

cristalina (Gómez et al, 2004); al presentar la quitina en polvo un ordenamiento

conformacional regular genera una matriz sólida cristalina, en donde las fuerzas

intermoleculares como lo son los puentes de hidrógeno que pueden formarse entre dos

grupos hidroxilo (HO——HO), el hidrógeno del grupo amida y los oxígenos de los grupos

hidroxilo (HO——HN) y entre los hidrógenos de los hidroxilo y el grupo carbonilo (C=O——

HO) generan una mayor estabilidad a esta estructura (González et al., 2002; Peniche, 2006).

55 

 

Il’ina et al. (2004) establecieron que aparentemente el tratamiento de la quitina con ácido

ortofosfórico genera una pérdida de la disposición regular de las cadenas de N–

acetilglucosamina, aumentando así el número de regiones amorfas y por ende afectando la

estructura cristalina al no presentar un ordenamiento regular, dejando estos puntos más

accesibles a la acción de las hidrolasas. De igual manera, Gómez y colaboradores (2004),

determinaron que utilizando ácido clorhídrico las moléculas de polisacáridos eran inducidas

a su separación en la quitina coloidal, facilitando la accesibilidad a este sustrato por parte de

los microorganismos.

El oxígeno disuelto, favorecido por el volumen de medio de cultivo empleado en relación a la

capacidad del erlenmeyer utilizado para el cultivo, pudo haber influenciado la producción de

quitinasas, y por ende la liberación de N–acetilglucosamina por parte de los aislamientos

evaluados al afectar la fisiología y el metabolismo de los microorganismos aeróbicos,

teniendo en cuenta los reportes de Wang y colaboradores (2008), quienes señalaron que el

oxígeno disuelto incrementa con el decrecimiento del volumen del medio de cultivo a una

velocidad de agitación constante. Por otro lado, el pH y tiempo de incubación empleados en

el estudio pudieron también favorecer la producción de quitinasas en medio mínimo quitina

coloidal por las cepas de actinomicetos evaluadas, lo cual coincide con las condiciones

reportadas por Taechowisan y colaboradores (2003) y con lo señalado por Shanmugaiah y

colaboradores (2008), quienes muestran que la mayoría de bacterias tienen un nivel máximo

de inducción de quitinasas a pH neutro o ligeramente ácido.

Aunque se obtuvieron mejores resultados cuando la quitina coloidal fue empleada, los

valores obtenidos de los análisis realizados en el laboratorio fueron muy bajos o no fueron lo

suficientemente altos en comparación a otros estudios. González-Franco y colaboradores

(2003) presentaron actividades enzimáticas de 33850; 29660; 18590 y 29290 U g-1 en su

estudio con cepas de Streptomyces hygroscopicus y Streptomyces lydicus empleando

quitina coloidal como fuente carbono; por otro lado Hoster y colaboradores (2005) obtuvieron

una actividad enzimática de 250 U g-1 con la cepa MG3 de Streptomyces griseus en medio

mínimo enriquecido con quitina coloidal al 0.7%. Los bajos resultados obtenidos en este

estudio pueden estar asociados con la presencia de quitotriosas y quitobiosas que pudieron

interferir en la producción de quitinasas, haciéndolas indetectables. Otra posibilidad es que

en el medio de cultivo a causa del metabolismo de los actinomicetos se hayan presentado

inhibidores de quitinasas (Donderski y Trzebiatowska, 1999). Por otro lado, la N-

56 

 

acetilglucosamina pudo posiblemente formar un inhibidor catabólico de la síntesis de

quitinasas, tal como ocurre en el caso de la glucosa en la degradación de la celulosa en

relación a la síntesis de celulasas (Donderski y Trzebiatowska, 1999); otros estudios han

mostrado que la producción de quitinasas en los microorganismos es controlada por un

sistema represor-inductor en donde la quitina o los productos de su degradación participan

como inductores o represores según sea el caso; Saito y colaboradores (1998) detectaron

que el gen glk A (gen que codifica para la glucosa kinasa) participa en la represión de la

producción de quitinasas; el estudio se realizó insertando un fragmento de DNA que

contenía este gen en una cepa mutante de Streptomyces lividans, defectuosa para la

represión por glucosa, a partir de esto se encontró que el microorganismo recuperó su

habilidad para emplear la glucosa y generar la represión por glucosa de la producción de

quitinasas (Gohel et al., 2006). De igual manera, Nguyen y colaboradores (1997) señalaron

que los genes que codifican enzimas como las quitinasas son generalmente inducidos por

sustratos poliméricos y por sus productos de degradación, y reprimidos por fuentes de

carbono fácilmente metabolizables tales como la glucosa. Otros autores han reportado este

mismo efecto de represión enzimática en la presencia de azúcares como glucosa, fructosa,

sucrosa, galactosa u otros, reiterando nuevamente la regulación de estas enzimas por un

sistema inductor–represor (Bruce et al., 1995; Sharaf, 2005).

Para cuantificar la cantidad de azúcares reductores y proteínas presentes en el extracto

enzimático tras el proceso de fermentación de cada una de las cepas (25 y control) en los

medios evaluados, se siguieron los métodos de Somogyi Nelson (Anexo 3) y de Bradford

(1976) (Anexo 4) respectivamente, modificados por Rodríguez (2001). Teniendo en cuenta

las interferencias que pueden sesgar los resultados del estudio, se decidió realizar una

cuantificación de azúcares reductores y proteínas en los medios quitina coloidal y quitina en

polvo, sin inocular, tratados bajo las mismas condiciones que los medios inoculados con los

aislamientos; la corrección se realizó restando a las cantidades medidas en la fermentación

con ambas cepas, en cada uno de los medios, los valores obtenidos en la determinación de

los medios sin inocular. En el medio quitina coloidal no se obtuvo una presencia detectable

de proteínas ni azúcares reductores, sin embrago en el medio con quitina en polvo fueron

detectados 1.4 mg mL-1 de proteínas y 0.077 mg mL-1 de azúcares reductores, esto puede

deberse a que posiblemente la quitina empleada puede contener restos protéicos en su

composición según lo estudiado por Peniche (2006), quien señaló que tras los procesos de

desproteinización para la obtención de quitina en polvo puede quedar del 1 al 7 % de

proteína residual.

57 

 

Figura 6.6. Evaluación de la actividad enzimática y específica de las cepas Control (C) y 25.

58 

 

Tras realizar la corrección en la medición, teniendo en cuenta la eliminación de la proteína

medida en el medio sin inocular, se obtuvo que en el medio quitina en polvo se observó una

mayor presencia de proteínas en relación al medio quitina coloidal, sin embargo, como se

mencionó anteriormente se observó mayor actividad enzimática, para los dos aislamientos,

en éste último tratamiento; resultados similares fueron obtenidos por Nawani y Kapadnis

(2005) en la evaluación con tres cepas de actinomicetos. Esto puede deberse a que en el

caso de la quitina coloidal para el tiempo de muestreo puede llegar a presentarse una rápida

producción y represión de quitinasas debido a la fácil accesibilidad que presenta este

sustrato con una mejor y más rápida generación de productos finales obteniéndose de esta

manera una posible moderación en la producción enzimática. El caso contrario puede ocurrir

con la quitina en polvo la cual al ser menos accesible para los microorganismos por su

estructura cristalina y fibrilar puede permitir la liberación inicial de unos bajos niveles de

oligómeros a partir de los cuales se puede generar un buen crecimiento y favorecer el

incremento en la producción de quitinasas y por ende en la degradación de la quitina; esto

puede estar seguido de un progreso en el crecimiento de los microorganismos

permaneciendo así hasta el momento en el que se alcanza una represión por producto final

o el sustrato escasea y se alcanza una fase estacionaria de crecimiento de los

microorganismos (Nawani y Kapadnis 2005).

Con el fin de determinar las condiciones que resultan óptimas para llevar a cabo un

procedimiento de evaluación de la actividad enzimática y la actividad enzimática específica

de quitinasas, se estudió la influencia que tienen las variables: temperatura y proporción

enzima sustrato sobre la evaluación de las actividades mencionadas. La máxima actividad

enzimática en la cepa Control (aproximadamente 0.0015 U) fue obtenida a 40ºC, en las

proporciones enzima-sustrato 1:2 y 1:4 cuando la muestra no fue precipitada y el

microorganismo se incubó en medio suplementado con quitina coloidal, las mismas

condiciones permitieron alcanzar el máximo de actividad enzimática específica para la

misma cepa (60.22 U/g de proteína para la proporción 1:2 y 59.98 U/g de proteína para la

proporción 1:4). En el caso de la cepa 25, la actividad enzimática más alta (0.00175 U) y la

máxima actividad enzimática específica (67.944 U/g proteína), fueron obtenidas cuando se

incubó en medio quitina coloidal, el extracto crudo no se precipitó con acetona, y el montaje

de ensayo de actividad se hizo con una proporción enzima-sustrato 1:1 y la reacción se llevó

a cabo a una temperatura de 50ºC. Los valores de actividad enzimática y actividad

enzimática específica obtenidos para la cepa 25 resultan ser mayores a los presentados con

la cepa control, pudiéndose así relacionar con los resultados obtenidos en la prueba en

59 

 

placa en donde la cepa 25 presentó un diámetro de halo mayor en relación a la cepa

Control. De acuerdo a los resultados obtenidos para los dos aislamientos, no se

evidenciaron diferencias representativas para la actividad enzimática entre las temperaturas

evaluadas (40° y 50ºC). El hecho de detectar actividad enzimática en ambas temperaturas

coincide con lo expuesto en la literatura que señala que las quitinasas son activas a

temperaturas en el rango de los 20° a los 50ºC (Swiontek et al., 2007). De igual manera,

Gomes y colaboradores (2000) mostraron una óptima temperatura entre 40° y 50°C para la

mayor actividad enzimática de quitinasas de Streptomyces sp.

El grado de hidrólisis final está determinado por las condiciones utilizadas en el ensayo de

actividad enzimática, siendo éstas, la concentración de sustrato, la relación enzima/sustrato,

el tiempo de incubación y las condiciones fisicoquímicas tales como el pH y la temperatura

(Benítez et al., 2008). Las proporciones evaluadas (1:1,1:2 y 1:4) no mostraron diferencias

significativas a nivel de actividad (Anexo 7), demostrando de ésta manera que la velocidad

de hidrólisis del sustrato no se alteró por la proporción enzima/sustrato evaluada (García,

2002). Por otro lado se empleó un pH de 6 para la reacción enzima/sustrato, esto es

comparable con lo presentado por Gupta y colaboradores (1995) quienes obtuvieron la

máxima actividad quitinolítica para la quitinasa producida por Streptomyces viridificans a pH

6. Por otro lado Hoster y colaboradores (2005) demostraron en su estudio una óptima

actividad quitinolítica empleando un rango de pH de 5 a 7 al evaluar un extracto de

quitinasas de la cepa MG3 de Streptomyces sp aislada del suelo de Gottingen. Resultados

similares fueron señalados por Boer y colaboradores (1998) quienes observaron una buena

actividad quitinolítica del extracto crudo de una cepa de Streptomyces sp. aislada del suelo

de Midsland, empleando un pH de 6.5 en la reacción enzima/sustrato. Así mismo,

numerosos estudios han mostrado que las quitinasas se caracterizan por presentar una alta

actividad quitinolítica en un rango de pH de 4.5 a 8. Las quitinasas de bacterias han

mostrado presentar una alta actividad a pH 8, en comparación a las secretadas por los

hongos que se ven favorecidas por un pH de 5, estas diferencias están dadas por el

ambiente en el que se desarrollan los microorganismos. Es posible que el pH empleado en

la reacción enzima/sustrato haya favorecido la actividad de las quitinasas debido a que al ser

secretadas por bacterias del suelo presentan preferencia por un pH cercano a la neutralidad

(Swiontek et al., 2007).

60 

 

Con el fin de determinar la influencia del grado de concentración de las proteínas sobre la

actividad enzimática y la actividad enzimática específica se evaluaron tres grados de

concentración de la enzima: 1x, 5x y 10x, bajo un tratamiento de precipitación del extracto

crudo con acetona para el caso de las dos últimas (Anexo 7). Teniendo en cuenta que tras la

evaluación de los agentes precipitantes acetona y sulfato de amonio (numeral 6.3.1.) no se

obtuvieron resultados válidos que permitieran realizar una selección de alguno de estos dos,

se decidió llevar a cabo el proceso de precipitación con acetona teniendo en cuenta la

necesidad de obtener extractos proteicos que conservaran buena actividad enzimática.

Estudios previos realizados por Noval y colaboradores (2004) demostraron que tras la

realización de una precipitación con sulfato de amonio (NH4)2SO4 se produjo una disminución

del 50 % de la actividad específica cuando se trabajo con enzimas β-1,3-glucanasas, en

relación con la obtenida cuando la precipitación fue realizada con acetona, indicando que

esta última resultó ser la más adecuada para conservar la actividad de las enzimas en

evaluación. De igual manera, al determinar la concentración de azúcares reductores en los

extractos obtenidos por ambos métodos de precipitación, encontraron que no se presentaron

diferencias significativas. A pesar que estas enzimas no corresponden a las evaluadas en

este estudio, el mismo efecto de la acetona sobre las quitinasas podría ocurrir.

Adicionalmente, Michail y colaboradores (2006) encontraron una buena recuperación de

proteínas cuando la muestra fue tratada con acetona en relación a cuando fue tratada con

sulfato de amonio. De igual manera, Popova y Pishtiyski (2001) en su estudio encontraron

que tras el tratamiento de una muestra con acetona al 60% se observó una actividad

enzimática de 84.88%, siendo esta superior a la alcanzada con otros agentes de

precipitación; así mismo la mayor actividad específica fue obtenida con la precipitación con

acetona a esta misma concentración. Siguiendo estos estudios y teniendo en cuenta que la

precipitación con acetona presenta la ventaja de disminuir el tiempo de experimentación al

no necesitar el paso de diálisis, pudiendo aumentar la posibilidad de obtener extractos

enzimáticos con mayor actividad, se decidió seleccionar éste agente precipitante para llevar

a cabo el ensayo (Guadarrama y Rivas, 1995).

Los resultados obtenidos para la actividad enzimática tras la precipitación en el medio quitina

coloidal muestran que las cepas en estudio no presentaron diferencias representativas entre

los tratamientos con precipitación y los que no incluían este proceso, sin embargo diversos

efectos de la precipitación sobre la actividad enzimática fueron observados (Anexo 7). Para

las cepas Control a 40 ºC y 25 a 50ºC se presentó una pérdida de la actividad enzimática en

las muestras que fueron tratadas con acetona. Por el contrario, la cepa Control a 50ºC,

61 

 

mostró un aumento en la actividad enzimática poco representativo cuando la muestra fue

precipitada, finalmente en la cepa 25 a 40ºC, no se presentó una tendencia clara de la

relación existente entre el grado de precipitación y la actividad enzimática (Figura 6.6). La

pérdida de actividad enzimática evidenciada, pudo deberse a que se haya generado una

denaturación de las proteínas ocasionada por la acetona, en donde pudo haber interferido

con las interacciones hidrofóbicas presentes en el interior de las proteínas generando la

desestabilización de la estructura proteica (Guadarrama y Rivas, 1995). A pesar que autores

como los mencionados anteriormente, señalan que la acetona resulta ser un buen agente de

precipitación, otros autores han expuesto resultados negativos tras la utilización de éste

agente. Anson y Mirsky (1931), señalaron que la acetona es en general un agente

denaturante efectivo. De igual manera United Nations Environment Programme (2005) han

mostrado pérdidas del 14 % de dicha actividad cuando las soluciones enzimáticas son

tratadas con acetona.

Con el fin de determinar la concentración de proteína presente en el extracto crudo de cada

una de las cepas evaluadas se realizó una cuantificación como se señala en la metodología.

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 6.7. La cepa control presentó una

tendencia acorde con el grado de concentración de proteínas, encontrándose valores

inferiores cuando la muestra fue concentrada 5 veces que cuando fue concentrada 10 veces.

En la cepa 25 igualmente se encontró una tendencia coherente con el grado de

precipitación, sin embargo ésta no fue proporcional a las veces de concentración. La

concentración de proteína obtenida en la cepa Control cuando se empleó medio con quitina

coloidal en el caso en el que no se llevó a cabo un proceso de precipitación, fue de 1.27

mg/mL, al concentrar la enzima cinco veces se habría esperado obtener una concentración

aproximadamente cinco veces mayor a la ya mencionada, sin embargo el aumento de la

concentración de proteína fue mínimo (1.31 mg/mL). El mismo caso se presentó cuando la

enzima fue concentrada diez veces en donde una ligera variación, poco representativa fue

obtenida (1.43 mg/mL). Un comportamiento similar fue observado en la cepa 25, para el

mismo medio de cultivo, resaltando que las concentraciones obtenidas fueron mayores para

ésta última, siendo éstas de 1.29, 1.78 y 2.58 mg/mL para los grados de concentración 1x,

5x y 10x, respectivamente. En el caso de la quitina en polvo para la cepa Control no se

evidenció una concentración de las proteínas tras el tratamiento de precipitación. Para la

muestra no precipitada con acetona, se obtuvo la mayor concentración de proteína, siendo

ésta de 4.63 mg/mL; tras concentrar la enzima cinco veces se observó un descenso no

esperado en la concentración de proteína de 1.36 mg/mL, obteniéndose así una

62 

 

concentración de 3.27 mg/mL. Para el grado de concentración 10x, se obtuvo un aumento

de 0.12 mg/mL en comparación al tratamiento que fue concentrado cinco veces, pero este

valor de concentración no superó el obtenido en el tratamiento sin precipitación. Por el

contario, para la cepa 25 si se obtuvo un efecto de precipitación en las muestras tratadas

con acetona, en la medida en que la concentración más baja fue obtenida para el

tratamiento no precipitado (6.1 mg/mL) pudiéndose así observar el efecto del agente

precipitante sobre las proteínas del extracto crudo, sin embargo no se presentó un

comportamiento proporcional al grado de concentración, obteniéndose así una mayor

concentración de proteínas (49.33 mg/mL) para la muestra concentrada cinco veces, que

para la que fue concentrada diez veces (24.37 mg/mL). Estos bajos resultados obtenidos en

las muestras precipitadas pudieron estar relacionados con la baja actividad enzimática

obtenida, en la medida en que el método no resultó favorable para alcanzar la concentración

esperada de proteína.

CEPA CONTROL

Grado de concentración

Quitina coloidal Quitina en polvo Concentración de proteína (mg/ml) SD Concentración de

proteína (mg/ml) SD

1x 1,27 0,14 4,63 1,47 5x 1,31 0,01 3,27 0,91

10x 1,43 0,13 3,56 3,52

 

 

 

 

63 

 

CEPA 25

Grado de concentración

Quitina coloidal Quitina en polvo

Concentración de proteína (mg/ml) SD Concentración de

proteína (mg/ml) SD

1x 1,29 0,13 6,1 N.D. 5x 1,78 0,2 49,33 10,3

10x 2,58 0,43 24,37 14

 

Tabla 6.7. Concentración de proteína extracto crudo, Cepa 25 y Cepa Control. N.D. No determinado.

Por otro lado, la actividad enzimática específica fue determinada (Anexo 7). Los resultados

muestran que la cepa Control a 40ºC no presentó una tendencia acorde con el grado de

concentración de proteínas, encontrándose valores inferiores cuando la muestra fue

concentrada 5 veces en comparación a los obtenidos cuando fue concentrada 10 veces. En

la cepa 25 por el contrario, si se encontró una tendencia coherente con el grado de

precipitación, sin embargo ésta no fue proporcional a las veces de concentración (Figura

6.6). Cuando la reacción enzima/sustrato se llevó acabo a 50ºC la variación obtenida para la

cepa Control no fue apreciable en los tres grados de concentración evaluados. En la cepa 25

por el contrario si se encontró una tendencia coherente en cuanto a la precipitación

realizada, pero ésta no fue proporcional a las veces de concentración (Figura 6.6). Los

resultados confirman nuevamente que la precipitación no resultó ser favorable en el estudio.

En la Figura 6.6 se observa el comportamiento de las barras de error, en donde se observa

el solapamiento de éstas, confirmando que no existe una variabilidad representativa entre

los grados de concentración evaluados, adicionalmente se puede evidenciar que se

64 

 

presentaron diferencias apreciables entre algunas de las réplicas de cada tratamiento para

las cepas evaluadas.

6.4. ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO

Diversas fuentes han señalado a Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. como patógenos asociados

con daños radiculares y aéreos de plantas en diferentes cultivos como pimiento (Ezziyyani et

al., 2004), pepino (Singh et al., 1999) y algodón (Yuan y Crawford, 1995), entre otros,

generando un serio problema en la agricultura al ocasionar grandes pérdidas en cultivos de

gran importancia económica (Zakalyukina y Zenova, 2007). Frente a esta problemática, las

bacterias quitinolíticas cobran importancia por producir un efecto antifúngico sobre el

crecimiento de hongos fitopatógenos, por la acción combinada de quitinasas y otras enzimas

líticas como por ejemplo glucanasas y proteasas (De Boer et al., 1998). Los actinomicetos

son conocidos como fuente de metabolitos secundarios, antibióticos y enzimas líticas, razón

por la cual han sido estudiados como agentes potenciales de control biológico contra hongos

fitopatógenos como Fusarium sp. (Getha et al., 2005). En base a esto se decidió evaluar el

efecto inhibitorio que ejercen cepas quitinolíticas de actinomicetos sobre el crecimiento de

agentes fitopatógenos como Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. por medio de un enfrentamiento

dual entre actinomiceto/hongo. Para su efecto se seleccionaron 14 aislamientos incluyendo

la cepa Control, sin embargo no se evaluaron las mismas cepas para cada uno de los

hongos. El porcentaje de inhibición del crecimiento radial (PICR) generado por cada una de

las cepas evaluadas con sus respectivas réplicas sobre cada agente fitopatógenos se

muestra en el Anexo 8.

El ensayo de antagonismo in vitro mostró que el 100% de los aislamientos evaluados

presentaron antagonismo en mayor o menor grado frente a los hongos fitopatógenos

Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. en placas de PDA tras 8 días de incubación, para las

condiciones evaluadas. Este valor resulta ser alto en comparación con los resultados

obtenidos por Iznaga y colaboradores (2003), quienes encontraron que de 563 actinomicetos

aislados de suelos cubanos, 286 mostraron producir componentes con actividad antifúngica,

y Valois (1996) quien reportó una inhibición de Phytophthora sp. por el 72% de las cepas de

actinomicetos estudiadas. Duque y Quintana (2008) trabajaron previamente con las cepas

10, 16, 24 y 26 incluidas en este estudio, en donde evaluaron el efecto antagónico de estos

microorganismos sobre Fusarium oxysporum, empleando al igual que en la presente

65 

 

evaluación la técnica de enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo

fitopatógeno, utilizando agar avena e incubando los cultivos a 28 ºC por 5 días. El porcentaje

de inhibición micelial lo determinaron por medio de la comparación de los resultados de

crecimiento radial con los controles del hongo sembrados por punción en el mismo agar bajo

las mismas condiciones de incubación, sin embargo estos autores encontraron un porcentaje

de inhibición micelial de cero. Como se observa, aunque los antagonistas y la técnica

empleada fueron los mismos, es importante tener en cuenta que las condiciones y las cepas

de los agentes fitopatógenos trabajados difirieron; pudo haber ocurrido que el medio

empleado en el presente estudio hubiese favorecido la producción de metabolitos. Whipps

(1987) encontró que el medio de crecimiento empleado genera efectos significativos en la

morfología y en el desarrollo de los patógenos, así mismo en la producción de antibióticos

volátiles y no volátiles producidos por los agentes antagonistas y en las respuestas de los

agentes patógenos a estos antibióticos. De igual manera estudió que el medio afecta la

competencia y las interacciones miceliales entre los patógenos y los antagonistas. Ezziyyani

y colaboradores (2004) también demostraron que el grado de inhibición puede variar por

factores como la temperatura, el pH y el medio de cultivo empleado, demostrando que el

medio PDA intensifica la inhibición. También se ha encontrado que el modo de acción de los

antagonistas varía de acuerdo al tipo de fitopatógeno enfrentado; De Boer y colaboradores

(1998) en su estudio demostraron que el 12% de las bacterias quitinolíticas antagonistas

generaron inhibición de Fusarium oxysporum, mientras que el 56% inhibió el crecimiento

micelial de Fusarium culmorum. Por su lado Gomes y colaboradores (2000), en su ensayo

de inhibición de crecimiento micelial de agentes fitopatógenos por cepas de actinomicetos,

encontraron la inhibición total del crecimiento de Fusarium solani, Fusarium graminearum y

Fusarium oxysporum, mientras que para Fusarium sp. no se observó inhibición alguna.

Se realizó un análisis de varianza con el fin de evaluar el modelo en general para cada uno

de los fitopatógenos evaluados. En el caso de Rhizoctonia sp. se presentó un p-valor

<0.0001 indicando que el modelo es estadísticamente significativo. Adicionalmente, para la

variable cepa se obtuvo un p – valor <0.0001 mostrando que hay variabilidad entre las cepas

evaluadas. Por otro lado se encontró que las réplicas no presentaron entre sí diferencias

significativas arrojando un p – valor de 0.2232 confirmando que actuaron como tales en el

estudio (Anexo 9).

La tabla 6.8 muestra la comparación de las medias de los porcentajes de inhibición entre las

cepas, a través de un agrupamiento de Duncan en donde se observa la formación de cuatro

grupos; el mayor porcentaje promedio de inhibición se presentó en las cepas 11, 7 y 4

66 

 

(Figura 6.7), presentando valores de 84.44; 74.07 y 68.89% respectivamente; por el contrario

las cepas 24, 18, 26 y 2 (Figura 6.8.) mostraron los PICR más bajos con resultados de 35.56;

30.00; 25.56 y 20.00 respectivamente. La figura 6.9 muestra el crecimiento de Rhizoctonia

sp. sin mostrar influencia de ningún agente antagónico.

Cepa Media Agrupamiento 11 84,440 A 7 74,074 A B 4 68,889 A B

22 67,778 B 0 67,407 B

12 64,444 B C 16 58,889 B C D 10 48,889 C D E 1 44,433 D E F

25 43,703 D E F 24 35,556 E F G18 30,000 F G26 25,556 G2 20,000 G

Tabla 6.8. Agrupamiento de Duncan de los promedios de los porcentajes de inhibición de crecimiento radial, para Rhizoctonia sp. enfrentado a los aislamientos de actinomicetos.

Figura 6.7. Técnica de enfrentamiento dual frente a Rhizoctonia sp. para cepas de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición.

 

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A

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67 

jos

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de

9).

os,

Las

ara

12

68 

 

y 11 (Figura 6.10) con los siguientes valores: 86.67; 84.17; 82.50; 80.83 y 80.00%

respectivamente y los más bajos para la cepa 18 (Figura 6.11) con un porcentaje de 35.83.

La figura 6.12 muestra el crecimiento libre de Fusarium sp.

Cepa Media Agrupamiento

7 86,667 A

8 84,167 A B

16 82,500 A B

12 80,833 A B

11 80,000 A B

5 78,333 B

25 66,667 C

0 64,167 C D

22 57,500 D

4 56,667 D

2 48,333 E

24 45,833 E

26 41,667 E F

18 35,833 F Tabla 6.9. Agrupamiento de Duncan de los promedios de los porcentajes de inhibición de crecimiento radial, para Fusarium sp. enfrentado a los aislamientos de actinomicetos.

Figura 6.10. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas de actinomicetos con los más altos porcentajes de inhibición micelial.

69 

 

Figura 6.11. Técnica de enfrentamiento dual frente a Fusarium sp. para cepas de actinomicetos con el más bajo porcentaje de inhibición.

Figura 6.12. Crecimiento libre de Fusarium sp. en medio YGC.

De las 13 cepas evaluadas en el enfrentamiento dual contra los hongos fitopatógenos, el

30.77% presentaron inhibiciones miceliales contra Rhizoctonia sp. superiores a las

evidenciadas con la cepa Control, y el 53.85% superaron esta última en el enfrentamiento

contra Fusarium sp. (Figura 6.13).

Figura 6.13. Técnica de enfrentamiento dual actinomiceto/hongo para la cepa control, A. 67.41% de inhibición micelial de Rhizoctonia sp. B. 64.17% de inhibición micelial de Fusarium sp.

Se determinó la correlación entre las variables porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp.,

porcentaje de inhibición para Fusarium sp. y el área bajo la curva para la producción de

70 

 

quitinasas evaluadas en el numeral 6.2.2.3. Los valores obtenidos se muestran en la Tabla

6.10.

Correlación de Pearson PICR Rhizoctonia

sp. PICR

Fusarium sp. ABC Producción de

Quitinasas PICR Rhizoctonia sp. 1 1

PICR Fusarium sp. 0,76946435 1 ABC Producción de Quitinasas -0,26455377 -0,50516172 1

Tabla 6.10. Correlación Pearson para porcentaje de inhibición de crecimiento radial para Rhizoctonia sp. y Fusarium

sp. y área bajo la curva de producción de quitinasas en ensayo en placa.

Los resultados muestran que la correlación más baja se presentó entre las variables área

bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp.,

ya que el valor fue cercano a cero, adicionalmente se observa que la correlación presenta un

valor negativo lo que indica una relación inversamente proporcional entre las dos variables.

Por su parte una correlación media fue establecida para las variables porcentaje de

inhibición para Fusarium sp. y el área bajo la curva para la producción de quitinasas, de igual

manera en este caso la correlación indicó una relación inversamente proporcional. La

correlación más alta se encontró entre las variables PICR para Rhizoctonia sp. y PICR para

Fusarium sp., indicando una relación directamente proporcional. Los resultados muestran

que no existe una correlación significativa entre la producción de quitinasas evaluadas en la

prueba semicuantitativa y la inhibición de crecimiento radial generada sobre los agentes

fitopatógenos Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. Es probable que la inhibición del crecimiento

de los fitopatógenos esté dada por acción de otros compuestos antifúngicos y no

propiamente por enzimas hidrolíticas de tipo quitinasas (Prapagdee et al., 2008). Es

importante mencionar que en el momento en el que se inoculó el agente fitopatógeno, el

microorganismo antagonista ya se encontraba esporulado al llevar 11 días de incubación

previa, esto con el fin de seguir lo reportado por Duque y Quintana (2008) quienes

recomiendan dar una ventaja al antagonista para la colonización del medio, con el fin de

esperar la generación y difusión de metabolitos con actividad antifúngica en el medio

(amensalismo). De igual manera, De Boer y colaboradores (1998) mostraron que se

presentaba una mejor inhibición del agente fitopatógeno cuanto éste se inoculó una semana

después de que el microorganismo antagonista había sido sembrado. El hecho de haber

observado la esporulación de los microorganismos, permite intuir que éstos se encontraban

en la fase estacionaria de su crecimiento. Augustine y colaboradores (2005) encontraron que

la producción de antibióticos usualmente ocurre en la fase estacionaria pudiéndose así

71 

 

suponer que la inhibición de los agentes fitopatógenos pudo estar relacionada con éstos

metabolitos secundarios, sumado al hecho de que la producción de antibióticos forma parte

de la transición de las células vegetativas a propágulos en actinomicetos como

Streptomyces sp. (Duque y Quintana, 2008).

Todos los actinomicetos evaluados que mostraron presentar inhibición micelial de los

agentes fitopatógenos exceptuando las cepas 11 y 1 presentaron actividad quitinolítica para

el ensayo en placa. De acuerdo al análisis de correlación realizado entre el área bajo la

curva calculado para las quitinasas en la prueba semicuantitativa y el PICR para los agentes

fitopatógenos evaluados, se observa que en general las cepas que presentaron una mayor

actividad quitinolítica en placa mostraron la menor inhibición micelial de los hongos Fusarium

sp. y Rhizoctonia sp. De Boer y colaboradores (1998) señalaron que a pesar de evidenciar la

producción de enzimas del tipo quitinasas, en algunos casos el hongo a controlar no resulta

ser afectado, indicando de esta manera que la producción de estas enzimas no genera

siempre a un efecto antifúngico. Por otro lado, el caso contrario fue observado; cepas como

la 11, 7 y 16 que presentaron halos de hidrólisis de quitina con diámetro inferiores en

comparación a las otras cepas evaluadas, mostraron un alto porcentaje de inhibición en la

prueba del enfrentamiento dual, observándose de ésta manera un comportamiento inverso al

esperado. En aquellos casos en los que la inhibición del crecimiento micelial no estuvo

relacionada con la producción de quitinasas, pudieron haberse presentado mecanismos

alternos, tales como la producción de antibióticos y productos tóxicos para los hongos, los

cuales se difunden en el medio generando una pigmentación del mismo (Valois 1996), tal

como se observa en la figura 6.14. En los resultados obtenidos se observó que el

crecimiento hifal, en muchos de los casos, fue reducido lejos de donde se encontraba el

actinomiceto crecido, este efecto pudo ser evidenciado de manera más notoria en la

inhibición del crecimiento radial de Rhizoctonia sp. con las cepas 11, 4 y 7, y en las cepas

11, 12, 16 y 8 en el enfrentamiento contra Fusarium sp. De Boer y colaboradores (1998)

encontraron la producción de componentes antifúngicos como antibióticos por parte de

bacterias, los cuales se difunden en el medio y generan este efecto. Otra posibilidad pudo

haber sido la competencia por hierro a través de la producción de sideróforos y la

competencia por colonización de espacio y nutrientes principalmente (Gomes et al., 2000;

Whipps, 2001); sin embargo, no es muy probable que una competencia por nutrientes se

haya presentado, ya que coincidiendo con lo que reportan De Boer y colaboradores (1998) el

hongo pudo haber obtenido todos sus requerimientos nutricionales a partir del disco de agar

en donde se encontraba previamente sembrado. Resultados similares fueron obtenidos por

72 

 

estos últimos autores mencionados, quienes en su ensayo con bacterias quitinolíticas y su

efecto antagónico sobre Phoma exigua por medio de la técnica de la doble capa de agar,

demostraron que el efecto inhibitorio no siempre estaba acompañado por la actividad de las

quitinasas, encontrando cepas que produjeron estas enzimas sin generar un efecto negativo

sobre la formación del micelio fúngico. Por otro lado, Saito y colaboradores (1998) en su

estudio con Streptomyces lividans mostraron que la presencia de glucosa puede generar la

inhibición de la producción de quitinasas. De igual manera Tweddell y colaboradores (1994),

en la evaluación con Stachybotrys elegans, evidenciaron una producción de quitinasas

significativamente baja cuando el medio fue suplementado con glucosa, sucrosa y N-

acetilglucosamina, en ausencia de quitina; esto pudo haber afectado el presente estudio, ya

que al haber empleado un medio de cultivo con alto contenido de glucosa como el PDA se

pudo haber generado la represión de la producción de estas enzimas. Resulta importante

señalar que el medio empleado no presentaba ningún sustrato inductor para la producción

de quitinasas excepto el micelio fúngico, el cual no necesariamente promueve la secreción

de estas enzimas por parte del antagonista. De Boer y colaboradores (1998) evaluaron si la

producción de quitinasas se veía inducida por la presencia del agente fitopatógeno Phoma

exigua el cual es altamente sensible al ataque de éstas enzimas, encontrando que ninguna

de las bacterias evaluadas fue capaz de lisar la hifa madura del hongo en agar agua.

 

Figura 6.14. Difusión de metabolitos secundarios en agar PDA, cepa 4.  

Para poder determinar si existe una correlación entre la producción de quitinasas y el efecto

antagónico, sería conveniente proporcionar las condiciones necesarias para que el

actinomiceto secretara las quitinasas y posteriormente éstas generaran un efecto inhibitorio

sobre el crecimiento de los hongos fitopatógenos. Para esto podría emplearse la técnica de

la doble capa de agar, utilizando una capa de base de medio mínimo suplementado con

73 

 

quitina coloidal, de manera tal que las quitinasas se vieran inducidas, y que al adicionar la

segunda capa éstas se difundieran en el medio de cultivo, ésta segunda capa podría ser de

agar PDA ya que éste mostró ser un medio óptimo para el crecimiento de los hongos

fitopatógenos evaluados. De esta manera, posterior a la inoculación se podría realizar un

seguimiento del crecimiento radial empleando como control la misma técnica pero

reemplazando el medio base por uno con otra fuente de carbono como por ejemplo glucosa.

Otra posibilidad, sería emplear extracto enzimático obtenido de una inducción previa con

quitina coloidal tal como lo reportan Prapagdee y colaboradores (2008), difundiéndolo sobre

un medio favorable para el desarrollo del agente fitopatógeno e inoculando posteriormente

un disco de agar con el hongo previamente crecido y observar de ésta manera la inhibición

del crecimiento radial de éste. El hecho de emplear un extracto enzimático que se encuentra

libre de células limitaría los mecanismos de antagonismo basados en producción de

metabolitos secundarios. Por otro lado, con el fin de obtener resultados más certeros se

podría realizar la purificación total o parcial de las enzimas quitinolíticas, para así poder

determinar si realmente la inhibición del crecimiento de los agentes fitopatógenos es

generada por la acción de estas enzimas hidrolíticas, tal como lo han realizado diversos

autores (Gupta et al., 1995; Mukherjee y Sen, 2006).

Las cepas de actinomicetos evaluados mostraron inhibir a los dos hongos fitopatógenos

evaluados, indicando que el mecanismo de acción de estos microorganismos puede

corresponder a actividades antifúngicas de amplio espectro y no específicas para un solo

tipo de microorganismo. Sin embargo, los PICR de Fusarium sp. resultaron ser mayores en

relación a los PICR obtenidos cundo se enfrentó el actinomiceto con Rhizoctonia sp. La

mayor susceptibilidad de Fusarium sp. pudo deberse a su lento crecimiento, lo que permite

que haya una mayor acumulación de metabolitos secundarios generados por la cepa

bacteriana en el medio de cultivo de enfrentamiento. De igual manera podría suponerse

nuevamente que el mecanismo de acción de los antagonistas fue mediado por la acción de

antibióticos, ya que se ha reportado que la producción de estos metabolitos secundarios

puede variar entre especies e incluso entre cepas bacterianas (De Boer et al., 1998).

Es importante tener presente que no puede excluirse que las quitinasas hayan contribuido a

la actividad antifúngica evidenciada en este estudio en aquellas cepas en las que por medio

de la prueba semicuantitativa se observó la producción de estas enzimas. Es posible que se

haya generado una sinergismo durante la interacción en el proceso de inhibición de los

74 

 

crecimientos miceliales de los hongos fitopatógenos entre las enzimas del tipo quitinasas y

los metabolitos antifúngicos, y/o entre diversas enzimas hidrolíticas tales como proteasas y/o

β-1,3-glucanasas (De Boer et al., 1998), teniendo en cuenta que la correlación entre los

porcentajes de inhibición de crecimiento radial y los valores de área bajo la curva para

producción de quitinasas no fue significativa. De igual manera, Valois (1996) postuló una

posibilidad con respecto a este mecanismo de sinergia, en donde sugiere que posiblemente

los metabolitos antifúngicos podrían evitar el crecimiento de Phytophtora sp. perjudicando su

mecanismo de defensa, mientras las enzimas hidrolíticas, por degradación de la pared

celular podrían contribuir a la lisis celular del patógeno y adicionalmente proveer nutrientes

adicionales a la población antagonista. Por el tipo de investigación desarrollada, dichas

sustancias no fueron identificadas por lo que no se llegó a dilucidar la razón por la que

dichos resultados fueron obtenidos.

75 

 

7. CONCLUSIONES

• El 83% (19 de 23) de los aislamientos de los actinomicetos evaluados mostraron

halo de hidrólisis en el medio quitina coloidal durante el screening inicial.

• La quitina coloidal al 1% resultó ser la concentración más baja que permitió la mejor

visualización de la hidrólisis enzimática en la prueba semicuantitativa en placa.

• El 53% de las cepas evaluadas en la prueba semicuantitativa presentaron

actividades quitinolíticas superiores a las obtenidas con la cepa control, por lo que

pueden ser tenidas en cuenta para estudios posteriores.

• Las cepas 22 y 24 mostraron la mayor hidrólisis de la quitina coloidal en el ensayo

semicuantitativo en placa, con promedios de diámetros de halos de hidrólisis de 8.13

y 7.50 mm respectivamente, presumiendo la posibilidad de ser cepas con alta

actividad quitinolítica.

• Factores como la temperatura y la proporción enzima/sustrato en la prueba

cuantitativa de actividad quitinolítica no mostraron un efecto notorio sobre la

actividad enzimática y actividad enzimática específica evaluadas para la cepa 25 y

control, de igual manera la precipitación con acetona de los extractos enzimáticos de

cada una de las cepas evaluadas mostró no concentrar las proteínas en la medida

esperada.

• En el medio mínimo líquido suplementado con quitina coloidal se obtuvieron

mayores valores de actividad enzimática y actividad enzimática específica en

comparación al medio mínimo líquido suplementado con quitina en polvo, por esta

razón resulta ser apropiado para la evaluación de la actividad quitinolítica en cepas

de actinomicetos a las condiciones evaluadas en este estudio.

76 

 

• El ensayo de antagonismo in vitro permitió evidenciar la capacidad de las cepas

evaluadas para inhibir el crecimiento de Rhizoctonia sp y Fusarium sp con

promedios de porcentajes de inhibición desde 20 hasta 84.4% y desde 35.83 hasta

86.67%, respectivamente.

• La cepa 11 presentó el máximo porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR)

contra Rhizoctonia sp siendo éste de 84,44%, por su lado el PICR más alto (86,67%)

en el antagonismo contra Fusarium sp fue obtenido con la cepa 7.

• Las cepas en general presentaron una actividad antifúngica no específica por

especie de patógenos ya que la correlación de la inhibición entre los dos agentes

fitopatógenos fue representativa. Sin embargo, no se encontraron valores

significativos de correlación entre la actividad quitinolítica y la actividad antagónica

de los actinomicetos evaluados.

77 

 

8. RECOMENDACIONES

• Evaluar el efecto de diversas fuentes de nitrógeno orgánicas como la Peptona, la

caseína hidrolizada y el extracto de levadura e inorgánicas como el nitrato de

amonio o el sulfato de amonio, con el fin de determinar si pueden generar un efecto

de estimulación en la inducción de quitinasas.

• Repetir el ensayo de concentración de proteínas por el método de precipitación

empleando sulfato de amonio y acetona, y si es el caso evaluar otros posibles

agentes precipitantes, tales como ácido tricloroacético (TCA), cloroformo, metanol,

etanol o propanol, determinando de esta manera el agente precipitante que permite

la más alta recuperación de proteínas y la mayor conservación de la actividad

enzimática.

• Teniendo en cuenta que las muestras empleadas para realizar un análisis de

proteínas resultan ser un factor determinante, sería importante incluir un paso de

diálisis tras el proceso de precipitación de proteínas con sulfato de amonio, con el fin

de eliminar restos de esta sal del precipitado, de manera tal que al llevar a cabo la

reacción enzima sustrato se evite la presencia de interferencias como las señaladas

en este estudio en los valores de las mediciones y, en caso tal, en los procesos de

purificación subsiguientes.

• Realizar la purificación de las quitinasas por medio de técnicas cromatográficas,

llevando a cabo un seguimiento de su estado de pureza por medio de una

electroforesis y teniendo en cuenta la conservación de su actividad a lo largo de las

etapas, con el fin de poder observar el efecto directo de estas sobre el crecimiento

fúngico de manera tal que se logre dilucidar el grado de participación de estas

enzimas en los resultados obtenidos en este estudio tras el ensayo de antagonismo

in vitro.

• Repetir el ensayo de la estandarización de las variables físico/químicas para la

evaluación de la actividad enzimática, considerando las temperaturas citadas en

este estudio e incluyendo la evaluación a 37ºC con diferentes tiempos de incubación

(30, 60 y 120 minutos). Adicionalmente emplear valores de pH en una rango de 5 a

78 

 

7, lo cual ha sido reportado por otros autores para determinar la influencia que

presentan éstos en la actividad enzimática.

• Realizar una curva de actividad de quitinolítca (cuantitativa) en función del tiempo (0

a 15 días) para las cepas utilizadas en la estadarización del ensayo de actividad

cuantitativa, para establecer los días óptimos de muestreo para la evaluación de las

cepas en estudio.

79 

 

9. BIBLIOGRAFÍA

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101 

 

10. ANEXOS

Anexo1. Aislamiento e identificación microscópica y macroscópica de cepas de

actinomicetos.

 

 

 

 

Para la toma de muestras de suelo, se realizó la georeferenciación por GPS (Global

Positioning System) de los diferentes puntos de muestreo en la rizósfera de trébol blanco

localizado en la Sabana de Bogotá - Zona Cundíboyacense. A partir de las muestras de

suelo recolectadas en los distintos puntos de muestreo demarcados por el sistema de

georeferenciación; se hicieron siembras en agar avena aislando en su totalidad 30 cepas

(Duque y Quintana, 2008).

 

CEPA

1

2

4

CARACTMACRO

Colonia seca,producción difusibles, revnaranja claro, claro.

Colonia seca,pigmentos dvioleta, anversesporulación b

Colonia secreverso ca

pigmentos dianverso co

militar, a metiempo de inc

café c

TERISTICAS OSCOPICAS

, pulverulenta, de pigment

verso de coloanverso color ca

, pulverulenta, ifusibles, rever

so color inicial cablanca.

ca pulverulenta, afé oscuro, sin fusibles al medio

olor inicial verde edida que pasa ecubación se torncon blanco

.

 

CARACTEMICROS

sin tos nia afé

Micelio ramificadofragmentacadenas dsencillos, espirales.

Actinomi

sin rso afé,

Micelio vefragmentaaéreo frpresentandcadenas dsencillos e

Actinomic

o,

el a

Micelio vefragmentaaéreo fracadenas conidios o

Actinomi

ERISTICAS COPICAS

IDM

vegetativo o no do, aéreo, de conidios

formando

ceto 100x

egetativo no do, micelio ragmentado do de conidios en espiral.

ceto 100x.

egetativo no do, micelio agmentado, largas de valados.

ceto 100x

DENTIFICACIONMICROSCÓPICA

Streptomyces

Streptomyces

N.I

N A

IDENTIFICARDR

Streptom

Saccharopo

Thermob

1

ACION RA

IDENN B

myces

olyspora

bifida

102 

NTIFICACIOIOQUIMICA

N.R

N.R

N.R

 

CEPA

5

6

7

CARACTMACRO

Colonia secreverso naranjcremoso, coloque a medidtiempo se tornpigmento.

Colonia seca pigmento difusanverso colonbordes blancque pasa el blanca (puntoreverso verde

Colonia seca pigmento difusAnverso colopálido y se medida que paa geosmina.

TERISTICAS OSCOPICAS

ca pulverulenja, anverso al ini

or inicial rojo fucda que pasa

na blanco a gris

pulverulenta, sible en el mednia color plateadcos que a med

tiempo se toros blancos) cmilitar.

pulverulenta, sible en el med

onia color rosatorna blanco

asa el tiempo. O

CARACTEMICROS

nta, cio

csia el

sin

Conidios dobles, filamentosramificado

Actinomi

sin dio, do, ida rna con

Micelio vefragmentade conidiaaéreo tortu

Actinomi

sin dio. ado

a Olor

Micelio vefragmentalarga de cespirales.

Actinomi

ERISTICAS COPICAS

IDM

sencillos y pocos

s no os.

ceto 100x

egetativo no do, cadena as, micelio uoso.

ceto 100x

getativo sin r, cadena

conidios sin

ceto 100x

DENTIFICACIONMICROSCÓPICA

N.I

Streptomyces

N.I

N A

IDENTIFICARDR

Streptom

Streptom

Thermomon

1

ACION RA

IDENN B

myces

myces

nospora

103 

NTIFICACIOIOQUIMICA

N.R

N.R

N.R

 

CEPA

8

9

10

CARACTMACRO

Colonia secarosado tenupigmentación, difusible en el

Colonia secanverso grispigmento difuscolonia pequeñ

Colonia seca,pigmento difusreverso verdeblanco gris qutiempo se torexudados de c

TERISTICAS OSCOPICAS

a, anverso coue, reverso

sin pigmenmedio.

ca pulverulens plateado sible en el medña.

, pulverulenta, sible en el mede, anverso coue con el paso rna café, presencolor verde.

CARACTEMICROS

olor sin nto

Micelio fragmentatortuoso, espirales. conidias. género: Streptomy

Actinomi

nta, sin

dio,

Cantidad conidias. fragmentatortuoso y

Actinomi

sin dio, olor del nta

Micelio fragmentatortuoso de ePocas con

Actinomi

ERISTICAS COPICAS

IDM

no do,

y con Pocas

Posible

yces sp.

ceto 100x

alta de Micelio no do, en espiral.

ceto 100x

no do,

formación entramadas. nidias.

ceto 100x

DENTIFICACIONMICROSCÓPICA

N.I

Streptomyces

N.I

N A

IDENTIFICARDR

Thermob

Streptom

Streptom

1

ACION RA

IDENN B

bifida

myces Str

myces N

104 

NTIFICACIOIOQUIMICA

N.R

reptomyces

Nocardia

 

CEPA

11

12

14

CARACTMACRO

Colonia seca pigmento difussin pigmentaanverso colooscuro, bordecrema con punel micelio.

Colonia seca,con bordespigmentación e

Colonia seca pigmento difusreverso cafécolonias grisepuntos negros

TERISTICAS OSCOPICAS

pulverulenta, sible en el medción en rever

or inicial marres de blanco ntos blancos sob

anverso grisác blancos. Sen reverso.

pulverulenta, sible en el med

é claro, anveres borde blan sobre la colonia

CARACTEMICROS

sin dio, so, rón

a bre

Micelio vefragmentaaéreo frcon tortuoso.

Actinomi

ceo Sin

Filamentosmicelio fragmentaconidias.

Actinomic

sin dio, rso co;

a.

Micelio fragmentatortuoso eForma Pocas con

Actinomi

ERISTICAS COPICAS

IDM

egetativo no do, micelio ragmentado

espirales,

ceto 100x

s largos, no

do, pocas

ceto. 100x

no do, en espiral. entramada.

nidias.

ceto 100x

DENTIFICACIONMICROSCÓPICA

Streptomyces

N.I

N.I

N A

IDENTIFICARDR

Streptom

Streptom

Streptom

1

ACION RA

IDENN B

myces

myces

myces Str

105 

NTIFICACIOIOQUIMICA

N.R

N.R

reptomyces

 

CEPA

16

18

19

CARACTMACRO

Colonia secanverso café,en reverso, difusible en el

Colonia seca pigmento en recolor gris plattiempo de incblanco.

Colonia seca pigmento difureverso nacolonias sobrea grises con micelio.

TERISTICAS OSCOPICAS

ca pulverulen sin pigmentac

sin pigmenmedio.

pulverulenta, everso, anverso teado y pasado cubación se tor

pulverulenta, usible al medaranja, anveresalientes blanc "agujeros" sob

CARACTEMICROS

nta, ión nto

Micelio nofragmentatortuoso, fode entramconidias. Pgénero: Streptomy

Actinomic

sin de el rna

Micelio vefragmentaaéreo fraSe observsueltos coco bacila

Actinomi

sin dio, rso cas bre

Micelio ramificadofragmentaaéreo cadenas den espiral.

Actinomi

ERISTICAS COPICAS

IDM

do, no ormación ada. Pocas Posible

yces sp.

ceto. 100x

getativo sin r. Micelio agmentado.

van conidios en forma ar.

ceto 100x

vegetativo o, no do. Micelio

formando de conidios .

ceto 100x

DENTIFICACIONMICROSCÓPICA

N.I

Streptomyces

Streptomyces

N A

IDENTIFICARDR

Streptom

Streptom

Streptom

1

ACION RA

IDENN B

myces N

myces

myces

106 

NTIFICACIOIOQUIMICA

Nocardia

N.R

N.R

 

CEPA

21

22

23

CARACTMACRO

Colonia pequesin color en eblancos en (esporulación)

Colonias peqanverso las cde gris a blanen reverso, ni

Colonia peblanco, con grises. Revernaranja.

TERISTICAS OSCOPICAS

eña, anverso cael reverso. Punt

la superfi.

ueñas, secas, colonias se tornncas, sin pigmendifusible al medi

queña, anverpuntos negros

rso con pigmen

CARACTEMICROS

afé, tos cie

Micelio fragmentavegetativofragmentaconidios een espiral.

Actinomi

en nan nto o.

Micelio vefragmentaaéreo fren conidiobacilar.

Actinomi

rso s y nto

Micelio vefragmentaaéreo fren conidiococo bacila

Actinomi

ERISTICAS COPICAS

IDM

aéreo do, micelio

o con ción, pocos

en cadena o .

ceto 100x

getativo sin r, micelio ragmentado os de forma

ceto 100x

getativo sin r, micelio ragmentado os de forma ar.

ceto 100x

DENTIFICACIONMICROSCÓPICA

Streptomyces

Streptomyces

Streptomyces

N A

IDENTIFICARDR

Streptom

Thermob

Streptom

1

ACION RA

IDENN B

myces Str

bifida

myces

107 

NTIFICACIOIOQUIMICA

reptomyces

N.R

N.R

 

CEPA

24

25

26

CARACTMACRO

Colonia secanverso gris, en reverso, difusible en el

Colonia seca, pigmento anmedio, anvertornándose cocon borde blan

Colonia ppulverulenta, difusible en el color gris a mo

TERISTICAS OSCOPICAS

ca, pulverulensin pigmentac

sin pigmenmedio.

pulverulenta, dunaranjado en rso inicio blanon el tiempo a gnco.

equeña, sesin pigmen

medio, anverso orado.

CARACTEMICROS

nta, ión nto

Filamentosramificadoconidios s

Actinomi

ura, el

nco gris

Micelio filamentosfragmentatortuoso, cadenas d

Actinom

ca, nto de

Filamentostortuosos, fragmentaespiral.

Actinomic

ERISTICAS COPICAS

IDM

s os, pocos imples.

ceto 100x

aéreo, s dos,

con de conidios.

iceto 100x

s,

dos, sin

ceto. 100x

DENTIFICACIONMICROSCÓPICA

N.I

N.I

N.I

N A

IDENTIFICARDR

Thermob

Saccharopo

Streptom

1

ACION RA

IDENN B

bifida Str

olyspora

myces Str

108 

NTIFICACIOIOQUIMICA

reptomyces

N.R

reptomyces

109 

 

CEPA CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS

CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS

IDENTIFICACION MICROSCÓPICA

IDENTIFICACION ARDRA

IDENTIFICACION BIOQUIMICA

27

Colonia puntiforme, seca, pulverulenta, anverso color verde, halo delgado color verde claro sin pigmento.

Micelio aéreo no fragmentado; micelio vegetativo no fragmentado No tortuoso, sin espiral.

Actinomiceto 100x

N.I

Streptomyces

Streptomyces

30

Colonia grande, seca, pulverulenta, anverso blanco inicialmente tornándose con el tiempo de color gris. Reverso con pigmento verde militar.

Micelio aéreo tortuoso, cadenas de conidios, con espirales.

Actinomiceto. 100x

N.I

Streptomyces

Streptomyces

110 

 

Anexo 2. Medios de cultivo. 

• AGAR AVENA (30 g/L)

COMPONENTES g/L

Avena comercial en polvo 30.0 Sacarosa 5.0 Agar-Agar 15

Preparación del medio:

Agregar los componentes al agua destilada, calentar a fuego durante 5 minutos, ajustar el

pH a 6.8. Autoclavar (15 lb y 121 ºC). Servir en cajas de Petri estériles.

Nota: Cuando se utilice nistatina (1%) se debe agregar antes de la esterilización del medio

de cultivo.

• AGAR QUITINA COLOIDAL (1% p/v)

COMPONENTES Cantidad/LSolución Stock K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v)

10ml

Solución Stock MgSO4.7H2O 1.5% (p/v)

10mL

Solución Stock (CaCl2 0.5%, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v)

10mL

NH4Cl2 1g Quitina coloidal 1% (p/v) Agar-agar purificado (Merck) 15g

Preparación del medio:

Mezclar los componentes y llevar a volumen con agua destilada, calentar al fuego durante 5

minutos para disolver las sales, ajustar el pH a 6.8. Autoclavar (15 lb y 121 ºC). Servir en

cajas de Petri estériles.

• MEDIO MÍNIMO SUPLEMENTADO CON GLUCOSA (1% p/v)

111 

 

COMPONENTES Cantidad/LSolución Stock K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v)

10ml

Solución Stock MgSO4.7H2O 1.5% (p/v)

10ml

Solución Stock (CaCl2 0.5%, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v)

10mL

NH4Cl2 1g Glucosa 10 g Agar-agar purificado (Merck) 15.0g

Preparación del medio:

Mezclar los componentes y llevar a volumen con agua destilada, calentar al fuego durante 5

minutos para disolver las sales, ajustar el pH a 6.8. Autoclavar (15 lb y 121 ºC). Servir en

cajas de Petri estériles.

• AGAR AGUA

COMPONENTES g/LAgar-agar purificado (Merck) 15.0

Preparación del medio:

Adicionar el agar al agua destilada, calentar durante 5 minutos. Autoclavar (15 lb y 121 ºC).

• AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

COMPONENTES g/LAgar PDA 39.0

Preparación del medio:

Preparar según instrucciones de la casa comercial.

• AGAR YGC

COMPONENTES g/LAgar YGC 38.1

Preparación del medio:

Preparar según instrucciones de la casa comercial.

• MEDIO LÍQUIDO AVENA (30g/L)

112 

 

COMPONENTES g/LAvena comercial en hojuelas 30.0 Sacarosa 5.0

Preparación del medio:

Agregar los componentes al agua destilada, ajustar el pH a 6.8. Autoclavar (15 lb y 121 ºC.

MEDIO LÍQUIDO QUITINA COLOIDAL (0.5% p/v)

COMPONENTES Cantidad/LSolución Stock K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v)

10ml

Solución Stock MgSO4.7H2O 1.5% (p/v)

10mL

Solución Stock (CaCl2 0.5%, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v)

10mL

NH4Cl2 1g Quitina coloidal 0.5% (p/v)

Preparación del medio:

Agregar los componentes al agua destilada, ajustar el pH a 6.8. Servir en erlenmeyer.

Autoclavar (15 lb y 121 ºC).

• MEDIO LÍQUIDO QUITINA EN POLVO (1.5% p/v)

COMPONENTES Cantidad/LSolución Stock K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v)

10ml

Solución Stock MgSO4.7H2O 1.5% (p/v)

10mL

Solución Stock (CaCl2 0.5%, FeCl3 0,06%, NaCl 0,5% p/v)

10mL

NH4Cl2 1g Quitina en polvo 15 g/L

Preparación del medio:

Agregar los componentes al agua destilada, Ajustar el pH a 6.8. Servir en erlenmeyer.

Autoclavar (15 lb y 121 ºC).

113 

 

Anexo 3. Curva Patrón para la cuantificación de azúcares reductores en términos de N-

acetilglucosamina.

Preparación de Reactivos:

* Somogyi I g/L

Carbonato de Sodio anhidro (Na2CO3): 24g Sal de Rochelle: 12g Bicarbonato se Sodio (NaHCO3): 16g Sulfato de Sodio (Na2SO4): 144g Agua destilada: Aforar a 1000 mL

Depositar en un beaker de 1000 mL 500 mL de agua destilada y disolver en agitación

constante cada uno de los componentes hasta obtener una mezcla homogénea. Completar

con agua destilada hasta un volumen de 1000 mL. En caso de precipitarse calentar antes de

usar.

* Somogyi II g/200 mL

Sulfato cúprico pentahidratado (CuSO4.5 H20): 4g Sulfato de Sodio (Na2SO4): 36g Agua destilada: Aforar a 200 mL

Depositar en un beaker de 500 mL 100 mL de agua destilada y disolver en agitación

constante cada uno de los componentes hasta obtener una mezcla homogénea. Completar

con agua destilada hasta un volumen de 200 mL.

* Nelson g/500 mL

Ácido Sulfúrico (H2SO4): 21.2 mL Arsenato de Sodio heptahidratado(Na2HAsO4. 7H2O): 3.02g Amonio Molibdato ((NH4)6Mo7O24.4H2O): 25.2g Agua destilada: 478.8 mL

Depositar en un beaker de 1000 mL 453.6 mL de agua destilada y disolver en agitación

constante el molibdato de amonio, posteriormente adicionar lentamente el ácido sulfúrico

hasta obtener una mezcla homogénea. Por otro lado disolver el arsenato de sodio

heptahidratado en 25.2 mL de agua destilada. Mezclar las dos soluciones e incubar por 48

horas a 37ºC. Almacenar en recipiente ámbar.

Datos curva patrón:

114 

 

Cantidad N - Acetilglucosamina

(µg)

Concentración N - Acetilglucosamina

(µg/µl)

Promedio Absorbancias 595

nm Desviación estándar

0 0 0,000 20 0,08 0,028 0,005 25 0,1 0,162 0,040 30 0,12 0,222 0,044 35 0,14 0,273 0,043 40 0,16 0,440 0,023 45 0,18 0,497 0,010 50 0,2 0,567 0,024 55 0,22 0,654 0,033 60 0,24 0,766 0,009 70 0,28 0,984 0,055 80 0,32 1,159 0,027 90 0,36 1,306 0,026

Cuantificación de azúcares reductores por Somogyi–Nelson modificado por Rodríguez (2001).

1. Mezcla de reacción a utilizar:

X muestra: 50 µL Sustrato (quitina coloidal): 200 µL

Somogyi I: 200 µL Somogyi II: 50 µL

2. Calentar 30 minutos hasta ebullición.

3. Enfriar a temperatura ambiente.

4. Adicionar 250 µL del reactivo de Nelson.

5. Adicionar 700 µL de agua destilada.

6. Leer a una longitud de onda de 595 nm después de 24 horas.

Curva Patrón N-Acetilglucosamina

y = 4,5887x - 0,3295R2 = 0,9963

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4

Concentracion N- Acetilglucosamina µg/µl

Abs

orba

ncia

595

nm

115 

 

Anexo 4. Curva Patrón para la cuantificación de proteínas, empleando Suero albúmina de

bovino (BSA) como proteína standard.

Preparación de Reactivos:

*Bradford g/L

Azul de Coomasie Brillante G: 0.1g Ácido ortofosfórico concentrado 85% (H3PO4): 100 mL Etanol 95% (CH3-CH2-OH): 50 mL Agua destilada: 850 mL

Depositar en un beaker de 1000 mL el azul de Coomassie brillante G y disolver en 100 mL

de ácido ortofosfórico concentrado 85% y 50 mL de etanol al 95%, dejar en agitación durante

48 horas a temperatura ambiente. Completar con agua destilada hasta un volumen de 1000

mL. Dejar precipitar toda la noche a 4ºC y posteriormente centrifugar a 4 ºC a 11000 x g.

Datos Curva Patrón:

Cantidad proteína

(µg)

Logaritmo cantidad

proteína (µg)

Promedio Absorbancias

595 nm

Logaritmo promedio

absorbancias Desviación

estándar 0 0,000 0,000 1 0,000 0,123 -0,911 0,004 2 0,301 0,187 -0,727 0,023 4 0,602 0,363 -0,440 0,028 6 0,778 0,439 -0,358 0,014

10 1,000 0,593 -0,227 0,038 12 1,079 0,628 -0,202 0,007 16 1,204 0,791 -0,102 0,010 20 1,301 0,920 -0,036 0,024 24 1,380 1,048 0,020 0,021 28 1,447 1,138 0,056 0,001

116 

 

Cuantificación de proteínas por el método de Bradford (1976), modificado por Rodríguez (2001).

1. Mezcla de reacción a utilizar:

X muestra: 20 µL NaOH 1.5M: 50 µL

Reactivo de Bradford: 1000 µL

2. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente.

3. Leer a una longitud de onda de 595 nm.

Curva patrón determinación de proteína

y = 0,6647x - 0,8971R2 = 0,9941

-1,000

-0,800

-0,600

-0,400

-0,200

0,000

0,200

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000

Cantidad BSA (log µg)

log

Abs

595

nm

117 

 

Anexo 5. Valores de medición en milímetros del diámetro de halos de hidrólisis en agar

quitina coloidal al 1%.

Nº Cepa

Medición en mm (10 días) Día 3 Día 5 Día 7 Día 9

R1 R2 R3 PROMEDIO R1 R2 R3 PROMEDIO R1 R2 R3 PROMEDIO R1 R2 R3 PROMEDIO1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 0,00 2,00 1,75 2,25 2,00 4,00 6,50 5,00 5,17 6,00 7,00 5,00 6,00 4 4,00 2,00 2,00 2,67 4,00 2,75 2,25 3,00 4,00 2,75 3,25 3,33 4,00 2,75 3,25 3,33 5 3,00 2,50 3,75 3,08 4,00 2,75 4,25 3,67 2,75 4,75 N.D 3,75 4,25 2,75 4,75 3,92 7 2,00 2,00 1,00 1,67 3,00 3,25 1,88 2,71 3,22 4,50 2,00 3,24 3,25 4,60 3,25 3,70 8 1,00 1,00 1,00 1,00 1,25 1,50 1,38 1,38 1,75 1,75 2,25 1,92 2,50 1,88 1,88 2,08

10 1,00 1,00 1,00 1,00 1,50 1,00 0,88 1,13 1,50 1,50 1,30 1,43 2,50 2,60 2,50 2,53 11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,50 0,50 0,50 0,50 12 0,00 0,00 0,00 0,00 1,75 2,25 3,00 2,33 2,50 2,50 3,00 2,67 2,50 2,50 3,00 2,67 14 2,80 3,25 2,75 2,93 4,33 5,00 5,10 4,81 6,25 6,25 8,75 7,08 6,25 9,50 9,50 8,42 16 1,00 1,00 N.D 1,00 1,00 1,00 N.D 1,00 1,25 1,00 N.D 1,13 2,25 2,00 N.D 2,13 18 1,00 0,88 0,88 0,92 1,25 1,00 1,00 1,08 2,00 1,75 1,50 1,75 2,60 2,00 3,00 2,53 19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 21 0,00 0,00 0,00 0,00 2,50 3,00 2,25 2,58 3,50 4,00 2,50 3,33 4,00 4,25 2,50 3,58 22 5,00 3,75 4,25 4,33 6,60 6,00 4,25 5,62 9,25 8,00 8,75 8,67 11,00 13,50 9,75 11,42 24 4,75 6,25 4,25 5,08 8,60 7,00 7,75 7,78 9,00 8,50 8,00 8,50 10,00 12,00 11,50 11,17 25 3,00 2,50 3,00 2,83 4,00 2,50 3,00 3,17 4,00 3,00 3,00 3,33 6,00 5,00 4,00 5,00 26 3,75 2,50 2,00 2,75 7,00 5,50 4,25 5,58 7,50 6,00 5,00 6,17 9,00 9,50 7,00 8,50 27 0,00 0,00 0,00 0,00 3,25 3,00 2,00 2,75 4,00 3,25 3,75 3,67 4,50 3,50 4,25 4,08 C 0,00 0,00 0,00 0,00 1,75 3,25 2,50 2,50 3,25 4,00 2,75 3,33 3,75 5,25 4,75 4,58

N.D. No determinado.

118 

 

Anexo 6. Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica. Análisis de varianaza (ANOVA).

• Anova para el área total del halo de hidrólisis a través de los días de medición

• Anova para el área total del halo de hidrólisis durante el total de días de medición (Área bajo la curva)

119 

 

• Anova para la comparación de las cepas en el día 3 de medición

• Anova para la comparación de las cepas en el día 5 de medición

120 

 

• Anova para la comparación de las cepas en el día 7 de medición

• Anova para la comparación de las cepas en el día 9 de medición

121 

 

Anexo 7. Estandarización de prueba para la evaluación cuantitativa de la Actividad

Quitinolítica.

*Actividad enzimática y actividad enzimática específica de cepa Control:

Cepa Control a 40 °C

Grado de concentración Proporción

Quitina coloidal Quitina en polvo U (µmol

/min) SD U/g

proteína SD U (µmol

/min) SD U/g

proteína SD

1X

1:1 0,00148 5,8E-05 58,28778 2,288436 0,00047 0,00066 5,05841 7,116591:2 0,00153 6,3E-05 60,22891 2,464603 0,00043 0,00048 4,66647 5,230281:4 0,0015 6,7E-05 58,98875 2,653758 0,00005 4,6E-05 0,54 0,49872

5X

1:1 0,00069 0,00069 26,14998 26,26322 0 5,5E-05 0 0,846511:2 0,00116 0,00052 44,31513 19,83871 9E-06 7,3E-05 0,13634 1,117971:4 0,00131 4,7E-05 50,16719 1,786939 0 3,6E-05 0 0,54849

10X

1:1 0,00128 8E-06 44,84637 0,295197 0 0,00012 0 1,7137 1:2 0,00134 1,5E-05 46,85764 0,528932 0 5,9E-05 0 0,828031:4 0,00133 4,9E-05 46,57031 1,709245 0 6,8E-05 0 0,96024

Cepa Control a 50 °C

Grado de concentración Proporción

Quitina coloidal Quitina en polvo

U (µmol /min) SD

U/g proteína SD

U (µmol /min) SD

U/g proteína SD

1X

1:1 0,001289 0,000049 50,73895 1,94879 0 5,9E-05 0 0,636839 1:2 0,001246 0,000059 49,06203 2,324857 0 0,00012 0 1,241167 1:4 0,001386 0,000282 54,567287 11,114668 0 2,5E-05 0 0,274018

5X

1:1 0,001378 0,000013 52,587467 0,499345 0 2,6E-05 0 0,400635 1:2 0,001389 0,000033 53,005658 1,269996 0 0,00003 0 0,455467 1:4 0,001358 0,000015 51,829497 0,569761 0 2,8E-05 0 0,424162

10X

1:1 0,001398 0,00003 48,868897 1,057863 0 3,9E-05 0 0,549899 1:2 0,001372 0,000002 47,95904 0,067723 0 3,4E-05 0 0,481274 1:4 0,001391 0,000055 48,629461 1,938101 0 0,00011 0 1,491007

122 

 

*Actividad enzimática y Actividad enzimática específica de cepa 25:

Cepa 25 a 40 °C

Grado de concentración Proporción

Quitina coloidal Quitina en polvo U (µmol

/min) SD U/g

proteína SD U (µmol

/min) SD U/g

proteína SD

1X

01:01 0,001639 0,000013 63,53905 0,489854 0,000082 0,000241 0,673677 1,97607401:02 0,00164 0,000005 63,57954 0,212763 0,000244 0,00014 2,00396 1,14895401:04 0,001654 0,000018 64,100122 0,689102 0 0,000095 0 0,781338

5X

01:01 0,001504 0,00016 42,241361 4,503964 0,000548 0,000178 0,555423 0,18063501:02 0,00152 0,000078 42,708894 2,18477 0,000423 0,000128 0,428961 0,13013501:04 0,001515 0,000073 42,568366 2,044772 0,000056 0,000091 0,05693 0,092491

10X

01:01 0,001739 0,000336 33,708512 6,510632 0,000503 0,000367 1,032689 0,75252401:02 0,001588 0,000144 30,775606 2,798276 0,000223 0,000107 0,458052 0,21963101:04 0,001483 0,000082 28,731862 1,588985 0,000076 0,000085 0,155982 0,174783

Cepa 25 a 50 °C

Grado de concentración Proporción

Quitina coloidal Quitina en polvo U (µmol

/min) SD U/g

proteína SD U (µmol

/min) SD U/g

proteína SD

1X

01:01 0,001759 0,000241 67,944869 9,304028 0,000014 0,000058 0,11793 0,47907401:02 0,001667 0,000126 64,425918 4,868612 0,000147 0,000258 1,20631 2,1151 01:04 0,001538 0,000126 59,425303 4,874431 0,000068 0,00005 0,561136 0,413065

5X

01:01 0,001364 0,00001 38,404697 0,289192 0,000294 0,000225 0,298461 0,22826601:02 0,00139 0,000024 39,137317 0,66925 0,000129 0,000093 0,130498 0,09384201:04 0,001452 0,000163 40,872469 4,577848 0,000249 0,00026 0,251958 0,263835

10X

01:01 0,001447 0,000114 28,019688 2,198065 0,000766 0,000186 1,570899 0,38190301:02 0,001385 0,000027 26,820928 0,529203 0,000287 0,000259 0,589878 0,53044501:04 0,001374 0,000023 26,614063 0,44773 0,000663 0,001347 1,360419 2,764267

123 

 

Anexo 8. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial (PICR). Enfrentamiento en cultivo dual actinomiceto.hongo fitopatógeno.

PICR: (Crecimiento libre - Crecimiento influenciado) X 100

Crecimiento libre

Evaluación de Antagonismo contra Rhizoctonia sp. en agar PDA

Cepa Réplica % de Inhibición

crecimiento radial 1 1 37,778 1 2 53,333 1 3 42,222 2 1 10,000 2 2 33,333 2 3 16,667 4 1 66,667 4 2 71,111 4 3 68,889 7 1 77,778 7 2 80,000 7 3 64,444

10 1 44,444 10 2 55,556 10 3 46,667 11 1 91,111 11 2 80,000 11 3 82,222 12 1 75,556 12 2 64,444 12 3 53,333 16 1 50,000 16 2 73,333 16 3 53,333 18 1 26,667 18 2 23,333 18 3 40,000 22 1 56,667 22 2 70,000 22 3 76,667 24 1 17,778 24 2 40,000 24 3 48,889 25 1 44,444 25 2 44,444 25 3 42,222 26 1 26,667 26 2 23,333 26 3 26,667 C 1 62,222 C 2 60,000 C 3 80,000

Evaluación de Antagonismo contra Fusarium sp. en agar PDA

Cepa Réplica % de Inhibición

crecimiento radial 2 1 50,000 2 2 50,000 2 3 45,000 4 1 57,500 4 2 57,500 4 3 55,000 5 1 82,500 5 2 75,000 5 3 77,500 7 1 85,000 7 2 87,500 7 3 87,500 8 1 80,000 8 2 85,000 8 3 87,500

11 1 80,000 11 2 80,000 11 3 80,000 12 1 82,500 12 2 82,500 12 3 77,500 16 1 80,000 16 2 82,500 16 3 85,000 18 1 32,500 18 2 37,500 18 3 37,500 22 1 60,000 22 2 52,500 22 3 60,000 24 1 37,500 24 2 50,000 24 3 50,000 25 1 62,500 25 2 67,500 25 3 70,000 26 1 45,000 26 2 30,000 26 3 50,000 C 1 60,000 C 2 65,000 C 3 67,500

124 

 

Anexo 9. Porcentaje de inhibición de crecimiento radia. Análisis de varianza (ANOVA)

• Anova para el ajuste del modelo general para Rhizoctonia sp.

• Anova para el ajuste del modelo general para Fusarium sp.

125 

 

Determinación de la actividad quitinolitica de cepas nativas de actinomicetos y su efecto antagónico sobre microorganismos fitopatógenos 

 

Farfán‐Ayala, D. M., Franco‐Correa, M., Gutiérrez‐Triviño, C., Rodríguez‐Bocanegra, M.X. 

 

 

RESUMEN: El papel ecológico de los actinomicetos en la rizosfera como microorganismos antagonistas ha generado gran interés en los últimos años. En el presente estudio se evaluó la producción de enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas por parte de cepas nativas de actinomicetos y su posible efecto antagónico sobre microorganismos fitopatógenos, Rhizoctonia sp. y Fusarium sp. Se realizó un screening con 23 cepas de actinomicetos para determinar cuales presentaban actividad quitinolítica, se empleó medio mínimo suplementado con quitina coloidal 1% pH 6.8; 19 de las 23 cepas de actinomicetos evaluadas mostraron zona de hidrólisis después de 5 días de incubación a 25ºC. Por otro lado, para determinar la concentración más baja de quitina que permitía una mejor visualización de la hidrólisis enzimática, las cepas 4, 12 y 26 seleccionadas aleatoriamente fueron sembradas en medio mínimo suplementado con quitina coloidal al 0.5, 1 y 2%, la concentración de 1% fue la seleccionada para continuar con el ensayo en placa. Para evaluar la actividad quitinolítica de las 19 cepas, se realizó una prueba semicuantitativa en placa; por la técnica de pozos en medio mínimo quitina coloidal al 1%, inoculando 5 µL de una suspensión celular (107 cel·mL-1); tras un periodo de incubación de 9 días a 25ºC, las cepas 24 y 22 presentaron los promedios de diámetros de halos de hidrólisis más significativos 8,13 y 7,50 mm respectivamente, en comparación a las demás cepas en estudio; por el contario las cepas 11, 19 y 1 presentaron los promedios de diámetros de halo de hidrólisis más bajos o no evidenciables. Finalmente se evaluó el efecto antagónico de 13 cepas de actinomicetos sobre Rhizoctonia sp y Fusarium sp, para ello se realizó un enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo fitopatógeno. Las cepas 11, 7 y 4 presentaron los porcentajes de inhibición de crecimiento radial más altos para Rhizoctonia sp. con valores de 84.44, 74.07 y 68.89% respectivamente; para el caso de Fusarium sp, las cepas 7, 8, 16,12 y 11 generaron la mayor inhibición sobre su crecimiento radial, en donde los PICR obtenidos fueron 86,67, 84,17, 82, 50, 80,83 y 80% respectivamente. Tras el análisis de correlación, no se evidencio una variación representativa entre el área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Fusarium sp., indicando que posiblemente en el efecto antagónico generado también estuvieron involucrados otros mecanismos adicionales a la acción de las quitinasas.

Palabras claves: actinomicetos, quitinasas, quitina coloidal, antagonismo, fitopatógenos, Rhizoctonia sp., Fusarium sp.

ABSTRACT: Actinomycetes ecological roll, at rhizosphere, as antagonistic microorganisms has developed a huge interest in the last years. This study evaluated the production of hydrolytic enzymes, chitinases, by native actinomycetes strains and their possible antagonist effect against phytopathogens (Rhizoctonia sp. and Fusarium sp.). The first step was a screening of the actinomycetal strain, in order to determine chitinolytic activity. The strains were inoculated by streaking in a minimal medium supplemented with 1% colloidal chitin (pH 6.8); 19 of 23 evaluated strains showed a hydrolysis area after 5 incubation days at 25ºC. In order to determine the lower chitin concentration which allow the better enzymatic hydrolysis observation, strains 4, 12 and 26, randomly selected, were inoculated in minimal media supplemented with 0.5, 1 y 2% colloidal chitin, concentration of 1% was selected for plate enzymatic assay. A semi quantitative plate assay was performed to test the chitinolytic activity of the 19 selected strains; to develop this 4 wells were done on a 1% colloidal chitin minimal medium plate and then inoculated with 5 µL of a cells suspension (107 cell·mL-1). The plates were incubated at 25 ºC for 9 days. Strains 24 and 22 showed the most significant hydrolysis halos (8.13 and 7.50 mm, respectively); contrarily strains 11, 19 and 1 did not show or showed the smaller hydrolysis halos. Finally, the antagonist effect of 13 actinomycetal strains towards Rhizoctonia sp and Fusarium sp. was evaluated by dual cultures actinomycete/fungal phytopathogen. The highest radial growth inhibition percentages for Rhizoctonia sp., 84.44, 74.07 and 68.89% corresponded to strains 11, 7 and 4, respectively. In the case of Fusarium sp, strains 7, 8, 16, 12 and 11 showed the maximum inhibition percentages, 86.67, 84.17, 82.50, 80.83 and 80% respectively. A correlation test between the area under the curve values, obtained for semi quantitative chitinolytic activity, and radial growth inhibition percentages were performed in order to identify the correlation between this two variables. The results showed a correlation value of -0.264 between chitinolytic activity and Rhizoctonia sp.

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inhibition, and -0.505 between chitinolytic activity and Fusarium sp. inhibition, suggesting that the antagonist effect involves additional mechanism rather than chitinases activity.

Key words: actinomycetes, chitinases, colloidal chitin, antagonisms, phytopathogens, Rhizoctonia sp., Fusarium sp.

INTRODUCCION

La quitina es un homopolímero formado por residuos de N-acetil-D-Glucosamina con enlaces β-1,4. Se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza como un componente estructural de hongos (22% - 44%), insectos y crustáceos (25% - 58%) y protozoos (Hoster et al; 2005, Mukherjee y Sen, 2006; Bhattacharya et al., 2007). La quitina es hidrolizada por un complejo quitinasa que comprende tres enzimas: exoquitinasa, endoquitinasa y β-N-acetilglucosaminidasa. La primera hidroliza el extremo no reductor de la cadena de quitina; la segunda cliva los enlaces internos β- 1,4 glicosídicos de N-acetilglucosamina y la última hidroliza unidades secuenciales de N-acetilglucosamina en el extremo no reductor del sustrato. El clivaje enzimático que realizan las quitinasas se lleva a cabo aleatoriamente en la naturaleza en toda la estructura del polímero, esto genera la liberación de compuestos solubles de bajo peso molecular de N-acetilglucosamina como quitotetraosa, quitotriosa, quitobiosa y pequeños oligosacáridos los cuales resultan ser los más predominantes y pueden ser utilizados como sustrato por la β-N-acetilglucosaminidasa (Sastoque, 2006; Bhattacharya et al., 2007). Las quitinasas son glicosil hidrolasas y se encuentran presentes en una gran variedad de organismos tales como bacterias, hongos, insectos, plantas y animales (Hoster et al., 2005). Las bacterias producen quitinasas principalmente para degradar quitina y usarla como fuente de energía. Adicionalmente, algunas quitinasas de bacterias quitinolíticas son agentes potenciales para el control biológico de enfermedades de plantas causadas por

diversos hongos fitopatógenos, pues hidrolizan la quitina presente en la pared celular del hongo (De la Cruz et al., 1992).

Los actinomicetos son bacilos Gram positivos que se caracterizan por formar filamentos ramificados (Ezziyyani et al., 2004). Su pared celular está compuesta por peptidoglucano presentan resistencia a los antifúngicos y la disposición de su material genético es típicamente procariótica (Salazar et al., 1997), aunque se caracterizan por presentar un alto contenido de guanina y citosina en su ADN, siendo éste superior al 55%. Estas bacterias son aerobias y anaerobias, pudiéndose

encontrar en animales o en el hombre; son heterótrofas, por lo cual pueden utilizar fuentes de carbono simples, complejas y compuestos moleculares orgánicos tales como ácidos, azúcares, polisacáridos, lípidos, proteínas e hidrocarburos alifáticos. Utilizan como fuentes de nitrógeno amonio, nitratos, aminoácidos, peptonas y un gran número de proteínas (Leveau y Bouix, 2000).

Los actinomicetos se consideran los organismos dominantes involucrados en la descomposición de quitina en el suelo (Ames, 1989), de igual manera, han sido mencionados como agentes antagonistas prometedores para el biocontrol debido a la reacción de hidrólisis sobre el micelio de los hongos en suelos ácidos y hojarascas que catalizan estas enzimas (Gomes et al., 2001).

Teniendo en cuenta esto, el papel de las quitinasas de los actinomicetos en la actividad fúngica podría ser estudiada, ya que estos microorganismos pueden contribuir a su planta hospedera con alguna protección natural contra infecciones, participando en técnicas de control biológico llegando a ser una aproximación importante para facilitar la agricultura sostenible (Wang et al., 2002; Taechowisan et al., 2003).

Esta investigación busca determinar la capacidad de cepas nativas de actinomicetos para producir enzimas hidrolíticas del tipo quitinasas. Adicionalmente pretende evaluar el efecto antagónico de estos microorganismos sobre algunos hongos fitopatógenos, de tal manera que en un futuro pueda ser establecida la relación existente entre las enzimas producidas y el antagonismo generado por aquellas cepas en las cuales así sea evidenciado.

METODOLOGÍA

RECONSTITUCIÓN DE CEPAS DE ACTINOMICETOS

Se realizó la reconstitución de 23 aislamientos de actinomicetos, tomados del banco de cepas del laboratorio UNIDIA de la Pontificia Universidad Javeriana y de la cepa de Streptomyces sp. proporcionada por el Laboratorio de Biotecnología, estudiada como cepa

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quitinolítica por Sastoque (2006), la cual fue empleada como cepa Control.

Se tomaron 40mL de medio avena líquido ((Avena en hojuelas 3% y azúcar 20% (p/v)), y se inocularon con 100 µL de cada uno de los aislamientos crioconservados. Cada medio inoculado se incubó en agitación a 120 rpm durante 5 días a 20ºC. A continuación se sembraron placas de agar avena suplementado con nistatina 0.1% (v/v) y se incubaron a 25ºC durante 10 días, obteniéndose así el banco de trabajo constituido por 24 aislamientos, el cual se mantuvo viable por pases sucesivos en agar avena.

EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD QUITINOLÍTICA

Preparación de quitina coloidal

La quitina coloidal fue preparada siguiendo el protocolo de Skujins y colaboradores (1965) modificado por Rodríguez (2001) con una variación en el volumen a utilizar de H3PO4. Para su efecto se tomaron 10 g de quitina comercial (SIGMA) y se disolvieron en 150 mL de H3PO4 concentrado (85%), la mezcla fue dejada en agitación durante 48 h a 4ºC. La solución resultante fue filtrada empleando fibra de vidrio, posteriormente se adicionó etanol acuoso al 50% alcanzando un volumen final de 300 ml. A continuación la mezcla se colocó en agitación hasta que se observó una solución homogénea y de aspecto coloidal. Se realizaron 15 lavados con agua destilada mediante centrifugación a 4500 x g a una temperatura de 10ºC con el fin de alcanzar un pH cercano a la neutralidad, la concentración final de la quitina coloidal fue estimada de acuerdo al volumen final obtenido. La quitina coloidal empleada para el ensayo de actividad enzimática fue dializada contra agua destilada durante 48 h.

Evaluación de producción de quitinasas en placa

Selección de cepas quitinolíticas

Se realizó un screening a partir del banco de trabajo con el fin de seleccionar las cepas de actinomicetos que presentaban actividad quitinolítica. Las cepas de actinomicetos fueron sembradas por método de estría en medio mínimo, preparado a partir de soluciones stock de K2HPO4 y KH2PO4 3% (p/v), MgSO4.7H2O 1.5 % (p/v), CaCl2, FeCl3 y NaCl a una concentración de 0.5%, 0.06% y 0.5% (p/v) respectivamente, utilizando NH4Cl. 0.1% como fuente de nitrógeno (Hoster et al., 2005; Franco, 2008). El medio fue suplementado con quitina coloidal al 1% (p/v) como única fuente de carbono. Para determinar la viabilidad de las cepas, se empleó medio mínimo suplementado con glucosa 1% (p/v) como única fuente de carbono, el pH de los medios de cultivo fue

ajustado a 6.8. Después de 5 días de incubación a 25ºC las cepas que presentaron zonas de hidrólisis en el medio con quitina coloidal 1% (p/v), fueron consideradas como posibles cepas productoras de quitinasas; se seleccionaron 19 cepas del banco para continuar con el estudio.

Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad quitinolítica

La concentración óptima de quitina coloidal para el estudio se determinó empleando las cepas 4, 12, 26 (seleccionadas al azar) y Control, previamente seleccionadas como cepas quitinolíticas en la evaluación en placa; éstas fueron sembradas en medio mínimo con 3 concentraciones de quitina coloidal: 0,5, 1 y 2% (p/v) (Taechowisan et al., 2003) para determinar la concentración más baja que permitía una mejor visualización de la hidrólisis enzimática; dichas concentraciones fueron evaluadas por triplicado para cada una de las cepas ya mencionadas.

Determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica

A partir de cada una de las cepas de actinomicetos seleccionadas para el estudio se realizó un recuento de conidios en Cámara de Neubauer hasta obtener un inóculo de 107 cél.mL-1. A cada caja de petri estéril se le adicionaron 30 mL de medio mínimo con quitina coloidal 1% (p/v) pH 6.8, para formar una capa de espesor grueso, posteriormente se realizaron cuatro pozos con capacidad de 30 µL a una distancia equidistante, a continuación se agregaron 20 µl de agar agua con el fin de conformar una capa sellante, y sobre esta capa se adicionaron 5 µL del inóculo. Este procedimiento se realizó en los cuatro pozos formados. Los volúmenes empleados se seleccionaron de acuerdo a la estandarización realizada. El montaje fue llevado a cabo por triplicado para cada una de las cepas evaluadas. Las placas de petri se llevaron a incubar a una temperatura de 25ºC por un período de 9 días, y se realizaron mediciones del diámetro de los halos de hidrólisis que se iban formando en el medio los días 3, 5, 7 y 9.

ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO

Para determinar la capacidad antagonista de los diferentes aislamientos de actinomicetos se realizó un enfrentamiento en cultivo dual, actinomiceto/hongo fitopatógeno siguiendo una combinación de los protocolos de Crawford y colaboradores (1993) y Gravel y colaboradores (2005). Los patógenos evaluados se seleccionaron por ser hongos asociados a

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enfermedades del suelo presentes en trébol blanco: Rhizoctonia sp. y Fusarium sp., proporcionados por el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Nacional de Colombia y el Laboratorio de Micología de la Pontificia Universidad Javeriana respectivamente.

Se realizó una siembra masiva ocupando un espacio de 3 cm de distancia a partir de uno de los extremos de la caja de cada una de las cepas evaluadas en agar PDA pH 6.8 por triplicado, posteriormente éstas fueron puestas en incubación a 25ºC durante 10 días, hasta observar la esporulación de las colonias. A continuación se inóculo un disco de agar YGC de 0.5 cm donde previamente se encontraba crecido el hongo a evaluar (Rhizoctonia sp. y Fusarium sp.) a una distancia de 3 cm del extremo opuesto a la siembra del actinomiceto. Por otro lado se evaluó la viabilidad del hongo fitopatógeno sin interactuar con otro microorganismo, el cual fue inoculado por técnica de disco de agar en el centro de una caja de petri con agar PDA; después de 8 días de incubación se realizó la medición del crecimiento libre e influenciado del fitopatógeno con el fin de determinar el porcentaje de inhibición de crecimiento radial del fitopatógeno (PICR) generado por el actinomiceto, el cual fue calculado mediante la siguiente fórmula:

PICR: (Crecimiento libre - Crecimiento influenciado) X

100 Crecimiento libre

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados obtenidos en la evaluación de actividad qutinolítica y en el ensayo de la actividad antifúngica in vitro fueron sometidos a un análisis de varianza de clasificación simple (ANOVA), siendo las medias con diferencias significativas comparadas según la prueba de rangos múltiples de Duncan para P≤0.05, con el fin de determinar si las variables en estudio cepa, días y réplicas y cepa y réplicas, respectivamente, presentaban variabilidad en el modelo. Adicionalmente se realizó un análisis del comportamiento del diámetro de los halos de cada una de las cepas evaluadas según el área bajo la curva para observar así la tendencia general a través del tiempo, para ello se empleó la fórmula reportada por Istifadah y colaboradores (2006), en donde Y correspondia al diámetro del halo y t al día de medición.

Por otro lado se realizó una correlación de Pearson entre los valores de área bajo la curva obtenidos en la determinación semicuantitativa de la actividad quitinolítica y los porcentajes de inhibición de

crecimiento radial (PICR), para identificar la relación líneal existente entre estas dos variables cuantitativas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

RECONSTITUCIÓN DE LAS CEPAS DE ACTINOMICETOS

Para la realización del estudio se seleccionaron 23 aislamientos de actinomicetos del banco de cepas del grupo UNIDIA de la Pontificia Universidad Javeriana. Los viales con las cepas de actinomicetos conservadas en glicerol, se reconstituyeron para contrarrestar el estrés generado por la congelación que afecta la actividad metabólica del microorganismo, garantizando la estabilización y recuperación total de los procesos moleculares (Sánchez y Corrales, 2005). Se empleó medio avena líquido, que posiblemente favoreció el intercambio molecular iónico y la recuperación de la actividad metabólica de la membrana celular rápidamente (Sánchez y Corrales, 2005).

Evaluación de la producción de quitinasas en placa

Selección de las cepas quitinolíticas

De los 23 aislamientos de actinomicetos evaluados, 19 fueron capaces de utilizar la quitina coloidal como única fuente de carbono, mostrando crecimiento y presentando una zona de hidrólisis alrededor de la colonia, indicando actividad quitinolítica (Kamil et al., 2007; Swiontek et al., 2007). En contraste, las cepas identificadas como 6, 9, 23 y 30 presentaron crecimiento pero no halo de hidrólisis, por lo cual no fueron consideradas como cepas quitinolíticas y en consecuencia fueron eliminadas del estudio; probablemente trazas de azúcar del medio avena les permitió alcanzar un crecimiento muy leve sobre este medio de cultivo, teniendo en cuenta que los actinomicetos son nutricionalmente versátiles, siendo capaces de crecer en un medio con limitación de nutrientes (El-Nakeeb y Lechevalier, 1962; Thangapandian et al., 2007).

Determinación de la concentración de quitina para la evaluación de la actividad quitinolítica

Se realizó un montaje tomando 3 cepas aleatoriamente (Cepas 4, 12 y 26), previamente seleccionadas como quitinolíticas en la evaluación en placa. Dichas cepas fueron sembradas en medio mínimo utilizando tres concentraciones de quitina coloidal reportadas en la

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literatura 0.5% (Shanmugaiah et al., 2008), 1% (Kamil et al., 2007) y 2% (Ogawa et al., 2002; Salazar et al., 2006;). A la concentración de 0.5%, las zonas de hidrólisis que rodeaban las colonias de las bacterias eran difíciles de visualizar, a las concentraciones 1 y 2% se evidenció un aumento en la hidrólisis, generándose un aumento en la claridad del medio, por tal motivo se decidió emplear la concentración de 1% (siendo la menor concentración de las dos que se visualizaron) para la realización de la prueba semicuantitativa, teniendo en cuenta factores económicos y el prolongado tiempo que toma la preparación de este sustrato. La razón por la que las zonas de hidrólisis no fueron visualizadas al emplear una concentración de 0.5%, puede deberse al hecho que la inducción de la producción de quitinasas se ve estimulada por el incremento de la concentración de la quitina coloidal (Sharaf, 2005). Adicionalmente el emplear una concentración más alta de quitina coloidal posiblemente genera una opacidad visual del medio, lo que puede facilitar la observación de los halos de hidrólisis.

Evaluación semicuantitativa de la actividad quitinolítica

La actividad quitinolítica fue detectada semicuantitativamente para cada una de las cepas en medio quitina coloidal al 1%, siguiendo la metodología de siembra en pozo. La cepa control de Streptomyces sp, previamente había mostrado producir quitinasas según estudios realizados por Sastoque (2006), motivo por el cual fue usada como cepa control para el estudio. El tamaño de las colonias y los halos fue medido. Las cepas 24 y 22 mostraron tener un buen potencial quitinolítico evidente por su crecimiento e hidrólisis de quitina en placa, presentando un halo de hidrólisis de 8.133 y 7.508 mm respectivamente, indicando una mejor difusión de las enzimas quitinolíticas (Ahmadi et al., 2008). Por el contrario las cepas 1 y 19 no generaron halo de hidrólisis y en la cepa 11 el diámetro de hidrólisis alcanzado (0.125 mm) después de los 9 días de evaluación fue muy pequeño en comparación a las demás cepas en estudio. Estos resultados pueden ser explicados como consecuencia de la concentración de inóculo empleada, ya que ésta pudo no haber sido suficiente para lograr observar un efecto hidrolítico en el medio de cultivo, teniendo en cuenta los estudios de Patidar y colaboradores (2005) quienes observaron un incremento lineal en la producción de quitinasas cuando la concentración del inóculo aumentaba. Por otro lado es posible que se haya presentado una pérdida de actividad por parte de estas cepas debido a una unión inespecífica del centro activo de la enzima (quitinasas) con el sustrato (quitina) (Álvarez y Del-Barrio, 2008). De igual manera puede que estas cepas hayan perdido su actividad quitinolítica, teniendo en cuenta lo encontrado previamente en donde se ha señalado que subcultivos continuos pueden tener efectos negativos en la

producción de metabolitos secundarios por parte de los microorganismos (Taddei et al., 1999).

Se realizó un ANOVA analizando el área bajo la curva (teniendo en cuenta los cuatro tiempos de evaluación), en donde la variable de interés fue el área del halo de hidrólisis generado alrededor de las colonias crecidas en medio quitina coloidal al 1%. Los resultados mostraron que el modelo general es estadísticamente significativo y permite identificar la variabilidad que existe en la variable de interés. De igual manera la variable cepa mostró explicar el comportamiento del crecimiento del área del halo, y la variable réplica se comportó como tal.

La comparación entre los promedios de áreas de halo de hidrólisis por cepas y por días fue realizado por medio de la prueba del rango múltiple de Duncan para áreas bajo la curva, los resultados demuestran que existen diferencias estadísticamente significativas entre éstos, de manera tal que permitieron conformar seis grupos de acuerdo a la similitud de los valores de sus medias con variaciones desde aproximadamente 49 hasta 0.5, en donde el primer grupo estuvo conformado por las cepas 22 y 24 con valores de 48.817 y 44.317 respectivamente, por el contrario en el último grupo se presentaron valores de 0.5, 0 y 0 para las cepas 11, 19 y 1 respectivamente.

Por otro lado, con el fin de comparar la medición (mm) de los halos formados a través de los días de evaluación por cada una de las cepas, se tomaron los datos iniciales sin calcular el área total de crecimiento del halo durante los 9 días de medición, calculando el promedio de los datos de diámetro de los halos obtenidos en los cuatro tiempos de medición. De acuerdo al análisis de varianza realizado, el modelo mostró ser adecuado, de igual manera las variables cepa y día incluidas en el modelo resultaron ser válidas pues presentaron un p- valor de <0.0001. Este resultado coincide con lo esperado, teniendo en cuenta que la medición del diámetro del halo es diferente en los tiempos de evaluación. Por su parte, la variable réplica presentó nuevamente un p - valor superior a 0.05 (0.2333), lo que confirmó que las réplicas no presentaron diferencias significativas entre ellas. Se obtuvieron nuevamente resultados significativos entre los resultados que conllevaron a la formación de 6 grupos, en donde se observa que las cepas 24 y 22 permanecieron en una posición superior en relación a las demás cepas, como consecuencia de haber presentado los mayores diámetros de halo (8.1333 y 7.5083). Los resultados muestran que el ordenamiento de las cepas y los grupos conformados según el agrupamiento de Duncan en función de los promedios de los diámetros de los halos, en los cuatro tiempos de medición es el mismo que el obtenido con los datos para el área bajo la curva, siendo así buenas aproximaciones para observar el comportamiento general de los aislamientos en el transcurso del tiempo de evaluación.

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Para evaluar las diferencias del comportamiento de las mediciones de los halos del total de las cepas por día, se realizó un agrupamiento de Duncan que mostró presentar diferencias significativas entre cada uno de los días de medición. Según los resultados obtenidos, el tamaño del halo aumentó en función del tiempo, conformándose así 4 grupos, en donde se evidenció que la mayor variación se presentó entre los días 3 y 5. Esto coincide con lo señalado por Gadelhak y colaboradores (2005) y Tsay y colaboradores (2006), quienes reportaron un periodo de 5 días para la producción de quitinasas en placa para Streptomyces sp y actinomicetos en general respectivamente.

Con el fin de realizar la comparación de las cepas dentro de cada uno de los días de medición, se decidió realizar un nuevo agrupamiento, para cada día de medición se ajustó un modelo de análisis de varianza. Los p -valor obtenidos para el modelo fueron <0.0001 para todos los días de evaluación, indicándonos que el modelo es bueno y expresa variabilidad. El mismo resultado fue obtenido para la variable cepa por lo que nuevamente se infiere que valores de medición estadísticamente significativos fueron obtenidos dependiendo de cada una de las cepas. En el caso de la variable réplica los valores obtenidos fueron: 0.1844; 0.1384; 0.5460 y 0.3359, para los días 3, 5, 7 y 9 respectivamente. Como se observa, se encontraron valores por encima de 0,05, explicando una vez más que experimentalmente la variable réplica se comporta adecuadamente. De esto se obtuvo la formación de distintos grupos dependiendo del día de medición. En el día 3 se obtuvieron 4 grupos, en el día 5 se formaron 5 grupos y en los días 7 y 9 se observó la conformación de 6 grupos.

La máxima medición alcanzada se observó al día 9 (11.4 mm), diversos autores señalan que un tamaño de halo significativo debe encontrarse por encima de los 5 mm (Taechowisan et al., 2003; Shanmugaiah et al., 2008), por lo tanto, bajo esta condición, solo las cepas 2, 14, 22, 24, 25 y 26 superarían lo que la literatura presenta. Sin embargo, para efectos del estudio, todas las cepas que presentaron hidrólisis enzimática fueron seleccionadas para la prueba de antagonismo, teniendo en cuenta que los datos preliminares no siempre coinciden con la información obtenida en un screening secundario, que por lo general consiste en pruebas cuantitativas de la enzima secretada por las cepas en medio líquido, a lo largo de diferentes tiempos de incubación (Gómez et al., 2004). Es importante resaltar que de las 19 cepas en evaluación, aproximadamente el 53% presentaron actividad quitinolítica en placa superiores a las obtenidas en la cepa control, para las condiciones de evaluación.

A pesar que, en los días definidos de medición se obtuvo la formación de diferente número de grupos, y que estos pertenecían a diversas cepas, los máximos y los mínimos a partir del día 5 siempre fueron conservados. Se encontraron cepas como las 2, 12, 21, 27 y control,

en las cuales no se evidenció la formación de un halo de hidrólisis al día 3 de medición, pero si al día 5 de medición; teniendo en cuenta que se trabajaron cepas diferentes, el metabolismo entre una y otra pudo haber variado generando la hidrólisis de la quitina en diferentes tiempos; estudios previos con actinomicetos han señalado diferentes tiempos de incubación para poder evidenciar el halo de hidrólisis, El Fiky y colaboradores (2003) estudiaron un tiempo de incubación de 3 días para que las zonas de hidrólisis fueran evidenciadas, por el contrario Ahmadi y colaboradores (2008) y Shamungaiah y colaboradores (2008) evidenciaron los halos de hidrólisis a los 10 y 5 días de incubación respectivamente. Como se mencionó anteriormente las variaciones más representativas en relación al tamaño del halo se presentaron entre los días 3 y 5 de medición, en algunas cepas ésta variación se hizo menos notoria a lo largo del tiempo de evaluación, esto pudo deberse a una disminución en la producción de quitinasas por efecto de la represión por catabolitos. Estudios previos realizados por Leisner y colaboradores (2008) demostraron que cuando adicionaron glucosa a placas con agar quitina se generó una reducción en el tamaño de las zonas de aclaramiento sugiriendo de esta manera que la actividad quitinasa está sujeta a la represión catabólica.

ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO

El ensayo de antagonismo in vitro mostró que el 100% de los aislamientos evaluados presentaron antagonismo en mayor o menor grado frente a los hongos fitopatógenos Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. en placas de PDA tras 8 días de incubación, para las condiciones evaluadas. Este valor resulta ser alto en comparación con los resultados obtenidos por Iznaga y colaboradores (2003), quienes encontraron que de 563 actinomicetos aislados de suelos cubanos, 286 mostraron producir componentes con actividad antifúngica, y Valois (1996) quien reportó una inhibición de Phytophthora sp. por el 72% de las cepas de actinomicetos estudiadas.

Duque y Quintana (2008) trabajaron previamente con las cepas 10, 16, 24 y 26 incluidas en este estudio, en donde evaluaron el efecto antagónico de estos microorganismos sobre Fusarium oxysporum, empleando al igual que en la presente evaluación la técnica de enfrentamiento en cultivo dual entre actinomiceto/hongo fitopatógeno, utilizando agar avena e incubando los cultivos a 28 ºC por 5 días, después de los cuales determinaron el porcentaje de inhibición micelial obteniendo un valor de cero; pudo haber ocurrido que el medio empleado en el presente estudio hubiese favorecido la producción de metabolitos. Whipps (1987) encontró que el medio de crecimiento empleado genera efectos significativos en la morfología y en el desarrollo de los patógenos, así mismo en la producción de antibióticos volátiles y no volátiles producidos por los

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agentes antagonistas y en las respuestas de los agentes patógenos a estos antibióticos. De igual manera estudió que el medio afecta la competencia y las interacciones miceliales entre los patógenos y los antagonistas. Ezziyyani y colaboradores (2004) también demostraron que el grado de inhibición puede variar por factores como la temperatura, el pH y el medio de cultivo empleado, demostrando que el medio PDA intensifica la inhibición. También se ha encontrado que el modo de acción de los antagonistas varía de acuerdo al tipo de fitopatógeno enfrentado; De Boer y colaboradores (1998) en su estudio demostraron que el 12% de las bacterias quitinolíticas antagonistas generaron inhibición de Fusarium oxysporum, mientras que el 56% inhibió el crecimiento micelial de Fusarium culmorum.

Se realizó un análisis de varianza con el fin de evaluar el modelo en general para cada uno de los fitopatógenos evaluados. En el caso de Rhizoctonia sp. se presentó un p-valor <0.0001 indicando que el modelo es estadísticamente significativo. Adicionalmente, para la variable cepa se obtuvo un p – valor <0.0001 mostrando que hay variabilidad entre las cepas evaluadas. Por otro lado se encontró que las réplicas no presentaron entre sí diferencias significativas arrojando un p – valor de 0.2232 confirmando que actuaron como tales en el estudio. Por otro lado se realizó un agrupamiento de Duncan en donde se observa la formación de cuatro grupos; el mayor porcentaje promedio de inhibición se presentó en las cepas 11, 7 y 4, presentando valores de 84.44; 74.07 y 68.89% respectivamente; por el contrario las cepas 24, 18, 26 y 2 mostraron los PICR más bajos con resultados de 35.56; 30.00; 25.56 y 20.00 respectivamente.

Al igual que en el modelo general de análisis de varianza de Rhizoctonia sp., el modelo establecido para Fusarium sp. mostró ser adecuado, pues presentó un p – valor inferior a 0.0001. De igual manera se observó que existen diferencias estadísticamente significativas entre los PICR de las cepas evaluadas y que la variable réplica al presentar un p – valor de 0.2982 no presentó diferencias significativas confirmando su validez en el estudio. Por otro lado, se realizó un agrupamiento de Duncan y se obtuvo la formación de 6 grupos, las comparaciones de media de porcentaje de inhibición entre las cepas evaluadas para Fusarium sp. mostraron que los datos más altos fueron obtenidos para las cepas 7, 8, 16, 12 y 11 con los siguientes valores: 86.67; 84.17; 82.50; 80.83 y 80.00% respectivamente y los más bajos para la cepa 18 con un porcentaje de 35.83. De las 13 cepas evaluadas en el enfrentamiento dual contra los hongos fitopatógenos, el 30.77% presentaron inhibiciones miceliales contra Rhizoctonia sp. superiores a las evidenciadas con la cepa Control, y el 53.85% superaron esta última en el enfrentamiento contra Fusarium sp.

Se determinó la correlación entre las variables porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp., porcentaje

de inhibición para Fusarium sp. y el área bajo la curva para la producción de quitinasas evaluadas. Los resultados muestran que la correlación más baja se presentó entre las variables área bajo la curva para producción de quitinasas y porcentaje de inhibición para Rhizoctonia sp., ya que el valor fue cercano a cero, adicionalmente se observa que la correlación presenta un valor negativo lo que indica una relación inversamente proporcional entre las dos variables. Por su parte una correlación media fue establecida para las variables porcentaje de inhibición para Fusarium sp. y el área bajo la curva para la producción de quitinasas, de igual manera en este caso la correlación indicó una relación inversamente proporcional. La correlación más alta se encontró entre las variables PICR para Rhizoctonia sp. y PICR para Fusarium sp., indicando una relación directamente proporcional. Los resultados muestran que no existe una correlación significativa entre la producción de quitinasas evaluadas en la prueba semicuantitativa y la inhibición de crecimiento radial generada sobre los agentes fitopatógenos Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. Es probable que la inhibición del crecimiento de los fitopatógenos esté dada por acción de otros compuestos antifúngicos y no propiamente por enzimas hidrolíticas de tipo quitinasas (Prapagdee et al., 2008). Es importante mencionar que en el momento en el que se inoculó el agente fitopatógeno, el microorganismo antagonista ya se encontraba esporulado al llevar 11 días de incubación previa, esto con el fin de seguir lo reportado por Duque y Quintana (2008) quienes recomiendan dar una ventaja al antagonista para la colonización del medio, con el fin de esperar la generación y difusión de metabolitos con actividad antifúngica en el medio (amensalismo). Augustine y colaboradores (2005) encontraron que la producción de antibióticos usualmente ocurre en la fase estacionaria pudiéndose así suponer que la inhibición de los agentes fitopatógenos pudo estar relacionada con éstos metabolitos secundarios, sumado al hecho de que la producción de antibióticos forma parte de la transición de las células vegetativas a propágulos en actinomicetos como Streptomyces sp. (Duque y Quintana, 2008). Todos los actinomicetos evaluados que mostraron presentar inhibición micelial de los agentes fitopatógenos exceptuando las cepas 11 y 1 presentaron actividad quitinolítica para el ensayo en placa. De acuerdo al análisis de correlación realizado entre el área bajo la curva calculado para las quitinasas en la prueba semicuantitativa y el PICR para los agentes fitopatógenos evaluados, se observa que en general las cepas que presentaron una mayor actividad quitinolítica en placa mostraron la menor inhibición micelial de los hongos Fusarium sp. y Rhizoctonia sp. De Boer y colaboradores (1998) señalaron que a pesar de evidenciar la producción de enzimas del tipo quitinasas, en algunos casos el hongo a controlar no resulta ser afectado, indicando de esta manera que la producción de estas enzimas no genera siempre a un efecto antifúngico. Por otro lado, el caso contrario fue

132 

 

observado; cepas como la 11, 7 y 16 que presentaron halos de hidrólisis de quitina con diámetro inferiores en comparación a las otras cepas evaluadas, mostraron un alto porcentaje de inhibición en la prueba del enfrentamiento dual, observándose de ésta manera un comportamiento inverso al esperado. En aquellos casos en los que la inhibición del crecimiento micelial no estuvo relacionada con la producción de quitinasas, pudieron haberse presentado mecanismos alternos, tales como la producción de antibióticos y productos tóxicos para los hongos, los cuales se difunden en el medio generando una pigmentación del mismo (Valois 1996).

Para poder determinar si existe una correlación entre la producción de quitinasas y el efecto antagónico, sería conveniente proporcionar las condiciones necesarias para que el actinomiceto secretara las quitinasas y posteriormente éstas generaran un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de los hongos fitopatógenos. Para esto podría emplearse la técnica de la doble capa de agar, utilizando una capa de base de medio mínimo suplementado con quitina coloidal, de manera tal que las quitinasas se vieran inducidas, y que al adicionar la segunda capa éstas se difundieran en el medio de cultivo, ésta segunda capa podría ser de agar PDA ya que éste mostró ser un medio óptimo para el crecimiento de los hongos fitopatógenos evaluados. De esta manera, posterior a la inoculación se podría realizar un seguimiento del crecimiento radial empleando como control la misma técnica pero reemplazando el medio base por uno con otra fuente de carbono como por ejemplo glucosa. Otra posibilidad, sería emplear extracto enzimático obtenido de una inducción previa con quitina coloidal tal como lo reportan Prapagdee y colaboradores (2008), difundiéndolo sobre un medio favorable para el desarrollo del agente fitopatógeno e inoculando posteriormente un disco de agar con el hongo previamente crecido y observar de ésta manera la inhibición del crecimiento radial de éste.

Es importante tener presente que no puede excluirse que las quitinasas hayan contribuido a la actividad antifúngica evidenciada en este estudio en aquellas cepas en las que por medio de la prueba semicuantitativa se observó la producción de estas enzimas. Es posible que se haya generado una sinergismo durante la interacción en el proceso de inhibición de los crecimientos miceliales de los hongos fitopatógenos entre las enzimas del tipo quitinasas y los metabolitos antifúngicos, y/o entre diversas enzimas hidrolíticas tales como proteasas y/o β-1,3-glucanasas (De Boer et al., 1998), teniendo en cuenta que la correlación entre los porcentajes de inhibición de crecimiento radial y los valores de área bajo la curva para producción de quitinasas no fue significativa. De igual manera, Valois (1996) postuló una posibilidad con respecto a este mecanismo de sinergia, en donde sugiere que posiblemente los metabolitos antifúngicos podrían evitar el crecimiento de Phytophtora sp. perjudicando su mecanismo de defensa, mientras las

enzimas hidrolíticas, por degradación de la pared celular podrían contribuir a la lisis celular del patógeno y adicionalmente proveer nutrientes adicionales a la población antagonista. Por el tipo de investigación desarrollada, dichas sustancias no fueron identificadas por lo que no se llegó a dilucidar la razón por la que dichos resultados fueron obtenidos.

CONCLUSIONES

• El 83% (19 de 23) de los aislamientos de los

actinomicetos evaluados mostraron halo de

hidrólisis en el medio quitina coloidal durante

el screening inicial.

• La quitina coloidal al 1% resultó ser la

concentración más baja que permitió la mejor

visualización de la hidrólisis enzimática en la

prueba semicuantitativa en placa.

• El 53% de las cepas evaluadas en la prueba

semicuantitativa presentaron actividades

quitinolíticas superiores a las obtenidas con la

cepa control, por lo que pueden ser tenidas en

cuenta para estudios posteriores.

• Las cepas 22 y 24 mostraron la mayor

hidrólisis de la quitina coloidal en el ensayo

semicuantitativo en placa, con promedios de

diámetros de halos de hidrólisis de 8.13 y 7.50

mm respectivamente, presumiendo la

posibilidad de ser cepas con alta actividad

quitinolítica.

• El ensayo de antagonismo in vitro permitió

evidenciar la capacidad de las cepas

evaluadas para inhibir el crecimiento de

Rhizoctonia sp y Fusarium sp con promedios

de porcentajes de inhibición desde 20 hasta

84.4% y desde 35.83 hasta 86.67%,

respectivamente.

• La cepa 11 presentó el máximo porcentaje de

inhibición de crecimiento radial (PICR) contra

Rhizoctonia sp siendo éste de 84,44%, por su

lado el PICR más alto (86,67%) en el

antagonismo contra Fusarium sp fue obtenido

con la cepa 7.

• Las cepas en general presentaron una

actividad antifúngica no específica por especie

133 

 

de patógenos ya que la correlación de la

inhibición entre los dos agentes fitopatógenos

fue representativa. Sin embargo, no se

encontraron valores significativos de

correlación entre la actividad quitinolítica y la

actividad antagónica de los actinomicetos

evaluados.

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