PROVA PRÀCTICA 1 OLIMPÍADA DE BIOLOGIA DE CATALUNYA · ara una solució salina). Seguidament,...
Transcript of PROVA PRÀCTICA 1 OLIMPÍADA DE BIOLOGIA DE CATALUNYA · ara una solució salina). Seguidament,...
PROVA PRÀCTICA 1
OLIMPÍADA DE BIOLOGIA DE CATALUNYA
Febrer 2019
COGNOM I NOM_______________________________
LABORATORI __________________________________
LLOC EN EL LABORATORI_________________________
EFECTE DELS ANTIBACTERIANS SOBRE ELS BACTERIS
1. Introducció.
Els agents antibacterians són compostos naturals, semisintètics o sintètics
que maten o inhibeixen el creixement dels bacteris. Els que els maten
s’anomenen bactericides, i dins d’aquest grup alguns són bacteriolítics, ja
que el seu efecte no només provoca la mort del bacteri sinó també la seva
lisi. En canvi, els que aturen el creixement del bacteri però no el maten
s’anomenen bacteriostàtics, sent la seva acció reversible, ja que quan el
compost no està present el bacteri pot tornar a creixer.
Per determinar a quin d’aquest tres tipus pertany un determinat
antibacterià, es pot estudiar la cinètica de creixement al llarg del temps d’un
cultiu líquid del bacteri en qüestió, un cop s’ha afegit el compost
antibacterià en estudi. Existeixen diferents paràmetres que mesuren en
creixement d’una població bacteriana en un medi de cultiu líquid, però els
mètodes més adients per esbrinar a quin dels tres tipus d’antibacterians
pertany un compost en estudi és determinar la concentració d’unitats
formadores de colònies (anomenat també concentració de viables) i
mesurar la densitat òptica del cultiu al llarg del temps.
Atès que les poblacions bacterianes en un cultiu líquid de laboratori poden
estar a elevades concentracions, per determinar la concentració d’unitats
formadores de colònies (cèl·lules viables) caldrà diluir molt les mostres del
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
cultiu, agafades en diferents temps d’incubació, en un solvent estèril (com
ara una solució salina). Seguidament, caldrà sembrar un petit volum
(típicament 0,1 mL) de cada tub de dilució en la superfície del medi sòlid
adient per tal d’obtenir un nombre estadísticament significatiu de colònies
per placa (entre 30 i 300). Es considera que cada colònia prové d’una cèl·lula
inicial que hi havia en el cultiu líquid. Per això, a las cèl·lules inicials se les
coneix com a unitats formadores de colònies. Per augmentar la precisió dels
resultats, es poden realitzar duplicats o triplicats de cada dilució.
En la Figura 1, es mostra un esquema del que s’ha explicat sobre com
procedir experimentalment per determinar la concentració d’unitats
formadores de colònies (UFC/mL) en un cultiu líquid.
Figura 1. Esquema del procés de generació de les dilucions seriades des de la mostra del cultiu bacterià i la sembra
de plaques pel recompte de cèl·lules viables.
Una vegada s’incuben les plaques a la temperatura i temps adient, es
procedeix a comptar les colònies que han crescut a cada placa i només es
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
consideraran pel posterior càlcul aquelles que siguin estadísticament
significatives; és a dir les que continguin de 30 a 300 colònies.
Seguidament, es calcula la concentració de viables (UFC/mL) en cada un
dels temps, tenint en compte les dilucions fetes.
Per altra banda, el creixement bacterià també pot mesurar-se mitjançant la
densitat òptica. Això es basa en què a mesura que un bacteri donat creix
en un medi líquid, aquest, que inicialment era transparent, es va enterbolint
i les cèl·lules bacterianes absorbeixen i dispersen la llum incident. Com més
alta és la concentració de bacteris major és la terbolesa. Per això, una
mesura indirecta per determinar la concentració bacteriana (o la biomassa
d’un cultiu) és determinar la densitat òptica del cultiu mitjançant un
espectrofotòmetre. Per fer-ho, cal prendre mostres d’un petit volum del
cultiu en els temps desitjats i col·locar-la en una cubeta transparent, i
mesurar l’absorció de la llum a una determinada longitud d’ona (λ) en
relació al medi de cultiu sense bacteris. La densitat òptica (OD) és
directament proporcional a la biomassa del cultiu. Cal remarcar que
aquesta és una mesura indirecta ja que no ens diu la concentració
bacteriana ni distingeix entre bacteris vius i morts, però sí permet
determinar en temps real la cinètica de creixement d’un bacteri en un cultiu
líquid al llarg del temps. També cal assenyalar que l’absorció de la llum per
part de les cèl·lules senceres sempre és superior a l’absorció de restes
cel·lulars.
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
2. Objectiu.
L’objectiu d’aquesta activitat és determinar a quina tipologia pertanyen tres
antibacterians (A, B i C) en estudi: bactericida, bacteriolític o bacteriostàtic.
3. Experiment.
Per poder determinar la tipologia de tres compostos antimicrobians s’ha
seguit el procediment que es detalla a la Figura 2.
Figura 2. Esquema de l’experiment dissenyat per esbrinar a quina tipologia d’antibacterians pertanyen els
compostos A, B i C.
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
En ella s’observa que es parteix d’un cultiu en medi líquid en el qual s’ha
inoculat un bacteri contra el qual tenen activitat els compostos
antibacterians A, B i C. Després de la inoculació, el cultiu s’incuba a 37oC
durant 90 min per permetre que el bacteri comenci a créixer
exponencialment. En arribar a aquest temps, se separa el cultiu en quatre
parts iguales. A tres dels alíquotes s’addiciona el compost A, B o C a la
concentració adient i en el quart el solvent usat per dissoldre els compostos
en estudi. Aquest quart flascó és el control de creixement del bacteri sense
cap tractament antibacterià.
Cal prendre mostres en els temps 0, 90, 150 i 180 min d’incubació per
determinar a aquest temps la concentració d’unitats formadores de
colònies (viables) i la densitat òptica.
En aquest exercici, l’estudiant realitzarà només l’estudi experimental al
temps 0 min i se li subministrarà els resultats de tota l’experimentació
posteriorment perquè pugui resoldre el problema.
Per realitzar l’experiment cal treballar en condicions estèrils, les quals
s’aconsegueixen treballant al davant de la flama d’un bec Bunsen. El
professorat donarà les instruccions oportunes per a una bona pràctica.
3.1. Material i equipament:
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
- Cultiu bacterià.
- 2 Cubetes de plàstic per espectrofotòmetre.
- Nansa de Digralsky estèril d’un sol us
- 5 Plaques de medi de cultiu.
- Puntes estèrils per micropipetes.
- Solució salina estèril.
- 1 Tub estèril eppendorf amb 200 µL de formaldehid (10%) i 800 µL
medi de cultiu líquid.
- 1 Tub estèril eppendorf amb 200 µL de formaldehid (10%).
- 5 Tubs estèrils eppendorf d’un sol ús.
- Agitador de tubs.
- Espectrofotòmetre per mesurar la densitat òptica a una longitud
d’ona de 550 nm (ODλ550 nm).
- Micropipetes (P1000 i P200).
3.2. Presa de mostres.
Agafa l’ampolla de cultiu retolada amb el número del teu lloc en el
laboratori i porta-la al teu lloc. En condicions estèrils procedeix a agafar les
següents mostres:
1. Pren 800 µL del cultiu bacterià amb una micropipeta i diposita’ls en
el tub estèril eppendorf que conté 200 µL de formaldehid. El
formaldehid fixa les cèl·lules sense lisar-les i per tant podràs guardar
el tub a temperatura ambient i llegir la ODλ550 nm del cultiu quan hagis
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
fet tota l’experimentació per determinar la concentració d’unitats
formadores de colònies (viables) del cultiu.
2. Pren 1000 µL del teu cultiu en un tub estèril. Aquest serà el tub de la
mostra del cultiu a temps 0 min per determinar la concentració de
viables.
3. Torna el cultiu bacterià a l’incubador.
3.3. Determinació de la concentració de unitats formadores de colònia
(viables) d’un cultiu bacterià
En primer lloc cal prepara un banc de dilucions com el que s’indica a la
Figura 1.
1. Retola 5 tubs estèrils amb 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 i 10-5 i amb el número
del lloc que ocupes en el laboratori.
2. Diposita a cada tub 0,9 mL de solució salina estèril.
3. Transfereix en el tub 10-1 un volum de 0,1 mL des del tub de la mostra
del cultiu que has agafat a temps 0.
4. Descarta la punta de la pipeta al recipient indicat
5. Agita el tub
6. Transfereix 0,1 mL del tub 10-1 al tub 10-2.
7. Descarta la punta de la pipeta al recipient indicat
8. Agita el tub
9. Continua repetint el mateix procediment per a la resta de tubs fins a
completar el banc de dilucions
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
En segon lloc cal sembrar en plaques de medi sòlid des de cada un dels
tubs del banc de dilucions i incubar-ho a 37oC durant 24 h (Figura 1). Per
això cal fer el següent:
1. Retola 5 plaques de medi sòlid LB amb 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 i 10-5 i amb
el número del lloc que ocupes en el laboratori.
2. Pren amb una micropipeta 0,1 mL de cada un dels tubs del banc de
dilucions i diposita’ls curosament en la superfície de la placa de medi
de cultiu corresponent. Pots usar la mateixa punta de micropipeta si
comences a fer la transferència ordenadament des del tub més diluït
fins el més concentrat.
3. Usa la nansa de Digralsky estèril d’un sòl us per escampar suaument
el volum de la dilució per sobre de la placa de Petri. Pots usar la
mateixa nansa per a sembrar totes les plaques, només cal que
comencis primer per la placa amb la dilució més alta (placa 10-6), i la
última la que prové de sembrar de la dilució més baixa (10-1).
4. Un cop sembrades lliura les plaques i el banc de dilucions al
professorat.
3.4. Determinació de la ODλ550 nm d’un cultiu bacterià
Per mesurar la densitat òptica del cultiu bacterià, cal fer el següent:
1. Agafa el tub amb el medi de cultiu estèril i formaldehid i el que conté
la mostra que has agafat a temps 0 per determinar la ODλ550 nm. Agafa
també les dues cubetes i ves on es troba l’espectrofotòmetre.
2. Omple una cubeta amb 1 mL de medi de cultiu estèril.
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
3. Neteja la superfície de la cubeta amb un paper.
4. Introdueix la cubeta dins de l’espectrofotòmetre assegurant que els
costats transparents de la cubeta estiguin en la mateixa orientació
que el feix de llum.
5. Pitja el botó de zero/blanc de l’aparell, fins que aparegui el valor
0.000.
6. Treu la cubeta i deixa-la en el recipient que hi ha al costat de
l’espectrofotòmetre per a aquesta finalitat.
7. Diposita la mostra del cultiu bacterià que has agafat en la segona
cubeta.
8. Neteja la superfície de la cubeta amb un paper.
9. Introdueix la cubeta dins de l’espectrofotòmetre assegurant que els
costats transparents de la cubeta estiguin en la mateixa orientació
que el feix de llum.
10. Anota en el full de preguntes el valor que apareix a la pantalla,
aquesta serà la ODλ550 nm del cultiu a temps 0.
11. Treu la cubeta i deixa-la en el recipient que hi ha al costat de
l’espectrofotòmetre per a aquesta finalitat.
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
4. Resultats
Seguidament trobaràs els resultats per els diferents temps estudiats.
Unitats formadores de colònies (UFC/mL)
Temps
d'incubació (min)
Control
(sense
tractament)
Tractament
Compost A Compost B Compost C
0 3,7 x 107 3,7 x 107 3,7 x 107 3,7 x 107
90 1,7 x 108 1,7 x 108 1,7 x 108 1,7 x 108
150 3,5 x 108 7,2 x 105 1,6 x 108 9,8 x 105
180 1,0 x 109 2,9 x 105 1,5 x 108 1,5 x 105
Densitat òptica (DO550 nm)
Temps
d'incubació (min)
Control
(sense tractament)
Tractament
Compost A Compost B Compost C
0 0,08 0,08 0,08 0,08
90 0,25 0,25 0,25 0,25
150 0,65 0,07 0,27 0,27
180 0,95 0,05 0,26 0,24
COGNOM I NOM_________________________________
LABORATORI ___________________________________
LLOC EN EL LABORATORI__________________________
PREGUNTES I QÜESTIONS DE LA PROVA PRÀCTICA 1
1. Quin ha estat el valor de la DO550 nm del teu cultiu que has obtingut
experimentalment a temps 0? __________________
2. Les plaques que has sembrat s’han d’incubar a la temperatura adient
durant 24 h per observar el creixement de les colònies. Imagina que ja ha
passat aquest temps, les colònies han crescut i has obtingut els següents
resultats:
2.1. Quins resultats seran vàlids per poder calcular la concentració de
viables?___________________________
Dilució acumulada
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Nº colònies per placa Incomptables 3846 298 33 4
2.2. Tenint en compte aquestes dades, quina és la concentració (UFC/mL)
del cultiu en el moment que es vas prendre la mostra?
Espai per calcular
Resultat: La concentració de viables és: ____________________UFC/mL
3. Representa gràficament les dades de densitat òptica i de viables que es
donen en l’apartat de Resultats en funció del temps d’incubació en els
gràfics semi logarítmics següents.
A cada gràfic, indica les unitats del eixos d’ordenades i abscisses
corresponents.
DO550 nm versus temps UFC versus temps
4. Tenint en compte els resultats obtinguts, indica a quina tipologia
(bacteriostàtic, bactericida o bacteriolític) pertanyen els compostos en
estudi, tot assenyalant el per què.
El compost A és un ________________________, ja que______________
___________________________________________________________
El compost B és un ________________________, ja que______________
___________________________________________________________
El compost C és un ________________________, ja que______________
___________________________________________________________