PROVA PRÀCTICA 1

OLIMPÍADA DE BIOLOGIA DE CATALUNYA

Febrer 2019

COGNOM I NOM_______________________________

LABORATORI __________________________________

LLOC EN EL LABORATORI_________________________

EFECTE DELS ANTIBACTERIANS SOBRE ELS BACTERIS

1. Introducció.

Els agents antibacterians són compostos naturals, semisintètics o sintètics

que maten o inhibeixen el creixement dels bacteris. Els que els maten

s’anomenen bactericides, i dins d’aquest grup alguns són bacteriolítics, ja

que el seu efecte no només provoca la mort del bacteri sinó també la seva

lisi. En canvi, els que aturen el creixement del bacteri però no el maten

s’anomenen bacteriostàtics, sent la seva acció reversible, ja que quan el

compost no està present el bacteri pot tornar a creixer.

Per determinar a quin d’aquest tres tipus pertany un determinat

antibacterià, es pot estudiar la cinètica de creixement al llarg del temps d’un

cultiu líquid del bacteri en qüestió, un cop s’ha afegit el compost

antibacterià en estudi. Existeixen diferents paràmetres que mesuren en

creixement d’una població bacteriana en un medi de cultiu líquid, però els

mètodes més adients per esbrinar a quin dels tres tipus d’antibacterians

pertany un compost en estudi és determinar la concentració d’unitats

formadores de colònies (anomenat també concentració de viables) i

mesurar la densitat òptica del cultiu al llarg del temps.

Atès que les poblacions bacterianes en un cultiu líquid de laboratori poden

estar a elevades concentracions, per determinar la concentració d’unitats

formadores de colònies (cèl·lules viables) caldrà diluir molt les mostres del

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

cultiu, agafades en diferents temps d’incubació, en un solvent estèril (com

ara una solució salina). Seguidament, caldrà sembrar un petit volum

(típicament 0,1 mL) de cada tub de dilució en la superfície del medi sòlid

adient per tal d’obtenir un nombre estadísticament significatiu de colònies

per placa (entre 30 i 300). Es considera que cada colònia prové d’una cèl·lula

inicial que hi havia en el cultiu líquid. Per això, a las cèl·lules inicials se les

coneix com a unitats formadores de colònies. Per augmentar la precisió dels

resultats, es poden realitzar duplicats o triplicats de cada dilució.

En la Figura 1, es mostra un esquema del que s’ha explicat sobre com

procedir experimentalment per determinar la concentració d’unitats

formadores de colònies (UFC/mL) en un cultiu líquid.

Figura 1. Esquema del procés de generació de les dilucions seriades des de la mostra del cultiu bacterià i la sembra

de plaques pel recompte de cèl·lules viables.

Una vegada s’incuben les plaques a la temperatura i temps adient, es

procedeix a comptar les colònies que han crescut a cada placa i només es

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

consideraran pel posterior càlcul aquelles que siguin estadísticament

significatives; és a dir les que continguin de 30 a 300 colònies.

Seguidament, es calcula la concentració de viables (UFC/mL) en cada un

dels temps, tenint en compte les dilucions fetes.

Per altra banda, el creixement bacterià també pot mesurar-se mitjançant la

densitat òptica. Això es basa en què a mesura que un bacteri donat creix

en un medi líquid, aquest, que inicialment era transparent, es va enterbolint

i les cèl·lules bacterianes absorbeixen i dispersen la llum incident. Com més

alta és la concentració de bacteris major és la terbolesa. Per això, una

mesura indirecta per determinar la concentració bacteriana (o la biomassa

d’un cultiu) és determinar la densitat òptica del cultiu mitjançant un

espectrofotòmetre. Per fer-ho, cal prendre mostres d’un petit volum del

cultiu en els temps desitjats i col·locar-la en una cubeta transparent, i

mesurar l’absorció de la llum a una determinada longitud d’ona (λ) en

relació al medi de cultiu sense bacteris. La densitat òptica (OD) és

directament proporcional a la biomassa del cultiu. Cal remarcar que

aquesta és una mesura indirecta ja que no ens diu la concentració

bacteriana ni distingeix entre bacteris vius i morts, però sí permet

determinar en temps real la cinètica de creixement d’un bacteri en un cultiu

líquid al llarg del temps. També cal assenyalar que l’absorció de la llum per

part de les cèl·lules senceres sempre és superior a l’absorció de restes

cel·lulars.

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

2. Objectiu.

L’objectiu d’aquesta activitat és determinar a quina tipologia pertanyen tres

antibacterians (A, B i C) en estudi: bactericida, bacteriolític o bacteriostàtic.

3. Experiment.

Per poder determinar la tipologia de tres compostos antimicrobians s’ha

seguit el procediment que es detalla a la Figura 2.

Figura 2. Esquema de l’experiment dissenyat per esbrinar a quina tipologia d’antibacterians pertanyen els

compostos A, B i C.

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

En ella s’observa que es parteix d’un cultiu en medi líquid en el qual s’ha

inoculat un bacteri contra el qual tenen activitat els compostos

antibacterians A, B i C. Després de la inoculació, el cultiu s’incuba a 37oC

durant 90 min per permetre que el bacteri comenci a créixer

exponencialment. En arribar a aquest temps, se separa el cultiu en quatre

parts iguales. A tres dels alíquotes s’addiciona el compost A, B o C a la

concentració adient i en el quart el solvent usat per dissoldre els compostos

en estudi. Aquest quart flascó és el control de creixement del bacteri sense

cap tractament antibacterià.

Cal prendre mostres en els temps 0, 90, 150 i 180 min d’incubació per

determinar a aquest temps la concentració d’unitats formadores de

colònies (viables) i la densitat òptica.

En aquest exercici, l’estudiant realitzarà només l’estudi experimental al

temps 0 min i se li subministrarà els resultats de tota l’experimentació

posteriorment perquè pugui resoldre el problema.

Per realitzar l’experiment cal treballar en condicions estèrils, les quals

s’aconsegueixen treballant al davant de la flama d’un bec Bunsen. El

professorat donarà les instruccions oportunes per a una bona pràctica.

3.1. Material i equipament:

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

- Cultiu bacterià.

- 2 Cubetes de plàstic per espectrofotòmetre.

- Nansa de Digralsky estèril d’un sol us

- 5 Plaques de medi de cultiu.

- Puntes estèrils per micropipetes.

- Solució salina estèril.

- 1 Tub estèril eppendorf amb 200 µL de formaldehid (10%) i 800 µL

medi de cultiu líquid.

- 1 Tub estèril eppendorf amb 200 µL de formaldehid (10%).

- 5 Tubs estèrils eppendorf d’un sol ús.

- Agitador de tubs.

- Espectrofotòmetre per mesurar la densitat òptica a una longitud

d’ona de 550 nm (ODλ550 nm).

- Micropipetes (P1000 i P200).

3.2. Presa de mostres.

Agafa l’ampolla de cultiu retolada amb el número del teu lloc en el

laboratori i porta-la al teu lloc. En condicions estèrils procedeix a agafar les

següents mostres:

1. Pren 800 µL del cultiu bacterià amb una micropipeta i diposita’ls en

el tub estèril eppendorf que conté 200 µL de formaldehid. El

formaldehid fixa les cèl·lules sense lisar-les i per tant podràs guardar

el tub a temperatura ambient i llegir la ODλ550 nm del cultiu quan hagis

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

fet tota l’experimentació per determinar la concentració d’unitats

formadores de colònies (viables) del cultiu.

2. Pren 1000 µL del teu cultiu en un tub estèril. Aquest serà el tub de la

mostra del cultiu a temps 0 min per determinar la concentració de

viables.

3. Torna el cultiu bacterià a l’incubador.

3.3. Determinació de la concentració de unitats formadores de colònia

(viables) d’un cultiu bacterià

En primer lloc cal prepara un banc de dilucions com el que s’indica a la

Figura 1.

1. Retola 5 tubs estèrils amb 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 i 10-5 i amb el número

del lloc que ocupes en el laboratori.

2. Diposita a cada tub 0,9 mL de solució salina estèril.

3. Transfereix en el tub 10-1 un volum de 0,1 mL des del tub de la mostra

del cultiu que has agafat a temps 0.

4. Descarta la punta de la pipeta al recipient indicat

5. Agita el tub

6. Transfereix 0,1 mL del tub 10-1 al tub 10-2.

7. Descarta la punta de la pipeta al recipient indicat

8. Agita el tub

9. Continua repetint el mateix procediment per a la resta de tubs fins a

completar el banc de dilucions

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

En segon lloc cal sembrar en plaques de medi sòlid des de cada un dels

tubs del banc de dilucions i incubar-ho a 37oC durant 24 h (Figura 1). Per

això cal fer el següent:

1. Retola 5 plaques de medi sòlid LB amb 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 i 10-5 i amb

el número del lloc que ocupes en el laboratori.

2. Pren amb una micropipeta 0,1 mL de cada un dels tubs del banc de

dilucions i diposita’ls curosament en la superfície de la placa de medi

de cultiu corresponent. Pots usar la mateixa punta de micropipeta si

comences a fer la transferència ordenadament des del tub més diluït

fins el més concentrat.

3. Usa la nansa de Digralsky estèril d’un sòl us per escampar suaument

el volum de la dilució per sobre de la placa de Petri. Pots usar la

mateixa nansa per a sembrar totes les plaques, només cal que

comencis primer per la placa amb la dilució més alta (placa 10-6), i la

última la que prové de sembrar de la dilució més baixa (10-1).

4. Un cop sembrades lliura les plaques i el banc de dilucions al

professorat.

3.4. Determinació de la ODλ550 nm d’un cultiu bacterià

Per mesurar la densitat òptica del cultiu bacterià, cal fer el següent:

1. Agafa el tub amb el medi de cultiu estèril i formaldehid i el que conté

la mostra que has agafat a temps 0 per determinar la ODλ550 nm. Agafa

també les dues cubetes i ves on es troba l’espectrofotòmetre.

2. Omple una cubeta amb 1 mL de medi de cultiu estèril.

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

3. Neteja la superfície de la cubeta amb un paper.

4. Introdueix la cubeta dins de l’espectrofotòmetre assegurant que els

costats transparents de la cubeta estiguin en la mateixa orientació

que el feix de llum.

5. Pitja el botó de zero/blanc de l’aparell, fins que aparegui el valor

0.000.

6. Treu la cubeta i deixa-la en el recipient que hi ha al costat de

l’espectrofotòmetre per a aquesta finalitat.

7. Diposita la mostra del cultiu bacterià que has agafat en la segona

cubeta.

8. Neteja la superfície de la cubeta amb un paper.

9. Introdueix la cubeta dins de l’espectrofotòmetre assegurant que els

costats transparents de la cubeta estiguin en la mateixa orientació

que el feix de llum.

10. Anota en el full de preguntes el valor que apareix a la pantalla,

aquesta serà la ODλ550 nm del cultiu a temps 0.

11. Treu la cubeta i deixa-la en el recipient que hi ha al costat de

l’espectrofotòmetre per a aquesta finalitat.

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

4. Resultats

Seguidament trobaràs els resultats per els diferents temps estudiats.

Unitats formadores de colònies (UFC/mL)

Temps

d'incubació (min)

Control

(sense

tractament)

Tractament

Compost A Compost B Compost C

0 3,7 x 107 3,7 x 107 3,7 x 107 3,7 x 107

90 1,7 x 108 1,7 x 108 1,7 x 108 1,7 x 108

150 3,5 x 108 7,2 x 105 1,6 x 108 9,8 x 105

180 1,0 x 109 2,9 x 105 1,5 x 108 1,5 x 105

Densitat òptica (DO550 nm)

Temps

d'incubació (min)

Control

(sense tractament)

Tractament

Compost A Compost B Compost C

0 0,08 0,08 0,08 0,08

90 0,25 0,25 0,25 0,25

150 0,65 0,07 0,27 0,27

180 0,95 0,05 0,26 0,24

COGNOM I NOM_________________________________

LABORATORI ___________________________________

LLOC EN EL LABORATORI__________________________

PREGUNTES I QÜESTIONS DE LA PROVA PRÀCTICA 1

1. Quin ha estat el valor de la DO550 nm del teu cultiu que has obtingut

experimentalment a temps 0? __________________

2. Les plaques que has sembrat s’han d’incubar a la temperatura adient

durant 24 h per observar el creixement de les colònies. Imagina que ja ha

passat aquest temps, les colònies han crescut i has obtingut els següents

resultats:

2.1. Quins resultats seran vàlids per poder calcular la concentració de

viables?___________________________

Dilució acumulada

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Nº colònies per placa Incomptables 3846 298 33 4

2.2. Tenint en compte aquestes dades, quina és la concentració (UFC/mL)

del cultiu en el moment que es vas prendre la mostra?

Espai per calcular

Resultat: La concentració de viables és: ____________________UFC/mL

3. Representa gràficament les dades de densitat òptica i de viables que es

donen en l’apartat de Resultats en funció del temps d’incubació en els

gràfics semi logarítmics següents.

A cada gràfic, indica les unitats del eixos d’ordenades i abscisses

corresponents.

DO550 nm versus temps UFC versus temps

4. Tenint en compte els resultats obtinguts, indica a quina tipologia

(bacteriostàtic, bactericida o bacteriolític) pertanyen els compostos en

estudi, tot assenyalant el per què.

El compost A és un ________________________, ja que______________

___________________________________________________________

El compost B és un ________________________, ja que______________

___________________________________________________________

El compost C és un ________________________, ja que______________

___________________________________________________________