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PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE ENZIMA INVERTASA A PARTIR DE HONGOS

FILAMENTOSOS Y LEVADURAS.

PROTOCOL FOR THE OBTAINING OF ENZYME INVERTASA FROM FILAMENTOSUS

FUNGI AND YEASTS.

Autores: De Ávila-Luna, María. R1, González-Alcalá, Yulieth. A2 Director: Echeverri,

Gustavo. Co-director: Orozco-Ugarriza, Mauricio.

Artículo de revisión desarrollado en el marco del diplomado de investigación en salud X

cohorte para optar por el título de bacteriología.

RESUMEN

Objetivo: analizar las diferentes técnicas de obtención de la enzima invertasa a partir de

levaduras y hongos filamentosos, para proponer un protocolo que cumpla con los parámetros

necesarios para su consecución. Metodología: se realizó una búsqueda bibliográfica a partir

de los artículos de investigación publicados en los últimos 10 años en bases de datos como

Scielo, Science Direct, Springer y Google Académico. Resultados: se obtuvo un total de 185

artículos, se seleccionaron aquellos que fueran estudios experimentales, estudios que

comprendieran de los años 2009 al 2019, que trataran de la obtención de la enzima invertasa

a partir de levaduras y hongos filamentosos, dando un total de 10 artículos encontrados que

cumplen los criterios de selección para el desarrollo de la temática. Conclusión: esta revisión,

permitió conocer diferentes técnicas implementadas para la obtención de la enzima invertasa

a partir de hongos filamentosos y levaduras, estos microrganismos al estar tan distribuidos en

el medio ambiente son de fácil acceso y puede ayudar disminuir los costos de elaboración.

Esta revisión además permitió elaborar una guía de pasos modificables (protocolo) por el

investigador, debido a que es difícil establecer un protocolo homogéneo por la existencia de

gran variedad de métodos y lugares de aislamiento, cantidad del inóculo, cultivos de

1 Universidad de San Buenaventura seccional-Cartagena, facultad de ciencias de la salud, Bacteriología, grupo de investigación GIMA, Correo: marii-de-avila03@hotmail.com 2 Universidad de San Buenaventura seccional-Cartagena, facultad de ciencias de la salud, Bacteriología, grupo de investigación GIMA, Correo: yuligonzalezalcala@hotmail.com

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fermentación y técnica de extracción. En cuanto a la determinación de la actividad enzimática

por el contrario es muy similar en la mayoría de los artículos, lo que significa que es confiable

y contribuye a dar confiabilidad al proceso.

PALABRAS CLAVES: enzima, invertasa, obtención, biotecnología, levaduras, hongos

filamentosos, β- fructofuranosidasa, azúcar invertido. (DECS – CAB)

ABSTRACT

Objective: To analyze the different techniques to obtain the invertase enzyme from yeasts and

filamentous fungi, to propose a protocol that complies with the parameters necessary for its

achievement. Methodology: A bibliographic search was carried out based on the research

articles published in the last 10 years in databases such as Scielo, Science Direct, Springer

and Google Academico. Results: a total of 185 articles were obtained, those were selected

that were carried out experimental studies, studies that included the years 2009 to 2019, that

would be the obtaining of the inverted enzyme from the yeasts and filamentous fungi, giving a

total of 10 Articles found that meet the selection criteria for the development of the subject.

Conclusion: this review, which will be published in the implementation techniques for obtaining

the enzyme invertase from filamentous fungi and yeasts, these microorganisms are distributed

in the environment, are easily accessible and can help reduce the costs of the elaboration. This

is a guide of modifiable steps (protocol) by the researcher, because it is difficult to establish a

homogeneous protocol for the great variety of methods and places of isolation, the amount of

the inoculum, the fermentation cultures and the extraction technique. Regarding the

determination of enzymatic activity on the contrary it is very similar to most articles, which

means that it is reliable and give a confidence in the process.

KEYWORDS: enzyme, invertase, obtaining, biotechnology, yeast, β-fructofuranosidase, invert

sugar, filamentous fungi. (DECS – CAB)

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INTRODUCCIÓN

La biotecnología ha tenido gran auge en los últimos años en distintos aspectos, no solo en lo

tecnológico y económico sino también en la industria de los alimentos, específicamente en el

área de producción de endulzantes (jarabes concentrados de fructosa o glucosa). al momento

de la fabricación de bebidas y alimentos es muy habitual utilizar agentes endulzantes como la

sacarosa, la glucosa y la fructosa (1).

Existen procesos que facilitan la obtención de estos jarabes concentrados ampliamente

utilizados en la industria alimentaria y farmacéutica debido a su alta funcionalidad y

propiedades deseables (2), uno de estos procesos es a utilizando la enzimas como la invertasa

o β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26), también conocida como sacarasa, encargada de

catalizar la hidrolisis de la sacarosa específicamente los terminales no reductores β-

fructofuranosílicos de los fructofuranósidos, rompiendo el enlace β-fructofuranosil, es decir,

actúa sobre el extremo fructosa de la molécula de sacarosa (3).

Como resultado de la reacción, se obtiene una mezcla de glucosa más fructosa, generando lo

que se llama azúcar invertido, comúnmente usado en la industria alimenticia por su alto poder

edulcorante (4). Por otra parte, además de tener una alta capacidad hidrolítica en medios con

altas concentraciones de sacarosa puede intervenir en la síntesis de fructooligosacáridos

(FOS) (5), estos por su bajo poder calórico son benéficos para el ser humano, ayudando a

prevenir enfermedades cardiacas, cáncer de colon, diabetes, entre otras(6).

La invertasa se caracteriza por tener una masa molecular en el rango de 47–430 kDa, valor de

Km de 0.063 a 470 mM, Kcat de 5.68 a 7.4 × 106 s-1 y vida media de 2.42–78.8 min a (65°C)

funciona óptimamente entre temperaturas de 30-75°C y pH de 2.9–6.2. (7), además puede ser

obtenida partir de animales vertebrados e invertebrados, vegetales, frutas, plantas

especialmente la caña de azúcar (Saccharum spp.) (8, 9).

Por otro lado, estudios realizados revelan que se puede hallar en bacterias, algas verdes y

hongos. Demostrando que Aspegillus niger, Candida utilis, Penicilium sp., Torulaspora

delbrueckii y cerevisiae son los mayores productores de invertasa y en menor proporción

Aspergillus sp., Aspergillus clavatus, Candida versatili, Pichia guilliermondii, Aureobasidium

pullulans, Pichia Pastoris (10), siendo Saccharomyces cerevisiae una de las levaduras más

4

utilizada industrialmente por su alta capacidad de fermentación de sacarosa (11), y asimismo

se considera como una cepa hiper-productora de invertasa donde se han identificado 2 tipos

de invertasa: (una forma glicosilada encontrada en el espacio extracelular y una forma no

glicosilada ubicada en el espacio intracelular), siendo la forma glicosilada las más

predominante (12).

En la actualidad, en la industria alimentaria se utilizan distintos tipos de compuestos químicos

y biológicos que ayudan a disminuir o mantener el tiempo y los costos de producción y la

inocuidad del producto. Es por esta razón que se utilizan enzimas como la invertasa, ya que

son proteínas caracterizadas por su especificidad que actúan como catalizadores de las

reacciones químicas, de síntesis y degradación de compuestos para realizar estos procesos

(13).

En Colombia, este tipo de enzimas poco se fabrican, quizás por falta de motivación, inversión

e infraestructura. Por esta razón el desarrollo de esta importante área en dicho país se

encuentra limitada, conllevando a la importación lo que beneficia a países industrializados

(Japón, Estados Unidos, Canadá y México). Pero aun así existen diferentes grupos de

investigación dedicados al estudio de la aplicabilidad de microorganismos y sus enzimas. Entre

ellos el grupo de biotecnología ambiental e industrial de la universidad Javeriana, el grupo

BIOALLI de la Universidad de Antioquia, etc. Sin embargo, el valor tan importante que tienen

sus trabajos para la biotecnología aun esta por ser explorado (14, 15).

Por lo tanto, es importante analizar las diferentes investigaciones que se han realizado al

respecto para estudiar los protocolos o técnicas de obtención de la enzima, con el fin de

mostrar aquellas técnicas de fácil implementación a partir de hongos filamentosos y levaduras.

Esta revisión se basó en la búsqueda de estudios que tuvieran como objetivo la obtención de

la enzima invertasa a partir de levaduras y hongos filamentosos utilizando diferentes técnicas

o protocolos, que permitieran establecer una guía de pasos modificables por el investigador

según sus necesidades, usando estos microorganismos, por ser considerados los mayores

productores de la enzima (16, 17).

Según lo anteriormente planteado surgió la necesidad de realizar una revisión bibliográfica con

el fin de observar nuevas técnicas de producción y obtención de la enzima invertasa,

5

promoviendo el desarrollo biotecnológico, microbiológico e industrial de un producto de menor

costo a escala de laboratorio. Debido a que para la producción industrial de azúcar invertido

se están implementando técnicas basadas en la aplicación de altas temperaturas lo que

produce un gasto energético y a su vez un mal uso de los combustibles fósiles, es importante

implementar técnicas que disminuyan el impacto ambiental que generan este tipo de prácticas.

Por lo tanto, el objetivo de esta revisión es “analizar las diferentes técnicas de obtención

de la enzima invertasa a partir de levaduras y hongos filamentosos, para proponer un

protocolo que cumpla con los parámetros necesarios para su consecución”.

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METODOLOGÍA

Estrategia de búsqueda bibliográfica

Para la búsqueda de artículos relacionados con el tema de interés “PROTOCOLO PARA LA

OBTENCIÓN DE ENZIMA INVERTASA A PARTIR DE HONGOS FILAMENTOSOS Y

LEVADURAS” Se usaron las bases de datos Google Académico, Springer, Scielo y

ScienceDirect, utilizando las palabras clave enzyme, invertase, obtaining, biotechnology,

yeast, β-fructofuranosidase, invert sugar, filamentous fungi disponibles en DeCS y CAB.

La búsqueda en Google Académico se realizó con la combinación de los siguientes

descriptores y operadores booleanos:

Search (((“Yeast and invertase”) OR (“Invertase extraction ”) OR (“Extraction or yeast”) OR (“β-

fructofuranosidasa”) OR (“β-fructofuranosidasa and yeast”) OR (“biotechnology invertase”) OR

(“Invertase”) OR (“β-fructofuranosidasa extraction”) OR (“Biotecnology yeast or invertase”) OR

(“Biotecnology and extraction”) OR (“filamentous fungi and invertase”) OR (“filamentous fungi

and extraction”) OR (“filamentous fungi and β-fructofuranosidasa”) OR (“filamentous fungi and

Obtaining and extraction ) OR (“Yeast biotecnology”) OR (“Obtaining and extraction or yeast”))))

AND (((“Obtaining and extraction or invertase”) OR (“Obtaining and extraction or β-

fructofuranosidasa”) OR (“Obtaining invertase”) OR (“Obtaining yeast”) OR (“Obtaining β-

fructofuranosidasa”) OR (“ Obtaining and extraction, enzyme”) OR (“Enzyme invertase”) OR

(“β-fructofuranosidasa enzyme”) OR (“Enzyme biotecnology”) OR (“Enzyme biotecnology

extractions”) OR (“Enzyme invertase extractions”) OR (“NOT invertase producing bacteria”) OR

(“NOT invertase producing plants ”) OR (“NOT invertase producing fruits”) OR (“NOT invertase

chemically produced”)))

La búsqueda en las bases de datos Springer, Scielo y Science Direct se realizó con las

palabras clave tomadas deL DeSH y CABI <<Invertase>>, << levadura and invertase >>,

<<NOT bacterias >>, << invertase obtaining >>, <<β-fructofuranosidasa >>, y combinándolas

con los operadores booleanos <<AND>> <<OR>> <<NOT>>.

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Como criterios de búsqueda avanzada y filtro de selección se restringió la búsqueda a

investigaciones publicadas en los últimos 10 años (2009-2019); la búsqueda bibliográfica se

realizó en un periodo de tiempo que comprende del 2 al 20 de marzo de 2019.

Como criterio de selección de artículos se definió:

Criterios de inclusión: estudios experimentales, ensayos de laboratorio, estudios que

incluyan levaduras y hongos filamentosos, estudios realizados en un periodo de 2009-

2019.

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RESULTADOS

Los criterios de búsqueda en las bases de datos Scielo, Science Direct, Springer, Google

Académico se desarrollaron mediante una búsqueda avanzada con las palabras clave y las

combinaciones de operadores booleanos descritos anteriormente en la metodología. Los

artículos pasaron por diferentes filtros como periodos de año entre 2009-2019, se tuvo en

cuenta que fueran estudios experimentales, que trataran de la obtención de la enzima invertasa

a partir de levaduras y hongos filamentosos, dando un total de 10 artículos encontrados que

cumplen los criterios de selección para el desarrollo de la temática.

La distribución de artículos según las bases de datos usadas fue el siguiente:

Gráfico 1. Resultado de la búsqueda de artículos

9

De acuerdo a los criterios previamente señalados, se seleccionaron finalmente 10 artículos.

En la tabla 1 se puede observar la distribución de los artículos según su descriptor y base de

datos utilizada, para los análisis posteriores los 10 artículos seleccionados fueron ordenados

según el título, año, revista, autores, precisiones metodológicas y resultados de cada uno de

ellos para facilitar el análisis comparativo, los artículos utilizados se basaron en la relación con

el objeto de estudio, donde se describen los métodos utilizados para la extracción y obtención

de invertasa y los materiales y equipos utilizados en las técnicas, y se excluyeron aquellos que

incluían otros microorganismos o fuentes de obtención diferentes a hongos y levaduras.

Tabla 1. Artículos analizados en el estudio.

Estudio

(Autor, Año,

Revista [Ref.])

Tipo de estudio

Metodología

Microorganismo

Resultados

Ferreira MV, Rossler AF, Toralles RP, Ruiz WA, Rombaldi CV, 2018

Scielo.

Experimental

Elección y descripción del Microorganismo y el cultivo utilizado.

Determinación azúcares reductores.

Actividad de la invertasa

Efecto de la concentración de bicarbonato de sodio y velocidad de agitación en la extracción de la invertasa.

Purificación del extracto bruto por precipitación

Saccharomyces cerevisiae.

El NaHCO3 es un agente de autolisis efectivo y su utilización es una buena alternativa en la extracción de invertasa, principalmente si es combinado con la velocidad adecuada de agitación en el shaker y liofilización de la levadura.

Rubio C, Latina C, Navarro A, 2014.

Google Academico

Experimental

Aislamiento directo.

Identificación.

Producción de invertasa.

Preparación del extracto enzimático.

Actividad invertásica.

Actividad transferasa.

Aspergillus niger IB56

Según los microorganismos aislados del jarabe de fructosa obtuvieron una cepa que fue identificada como Aspergillus niger IB56, capaz de producir invertasa a las 48 h de incubación, que posee alta actividad transfructosilante (5,6 U/ml). Se determinó que la máxima producción de

10

Influencia de factores físicos y químicos sobre la producción de FOS.

Cromatografía de alta presión (HPLC).

Reproducibilidad de los resultados.

FOS fue 105 g/l, respecto a la concentración de sacarosa inicial (300 g/l), en las siguientes condiciones de ensayo: pH, 5,0; Temperatura 20 ºC y en un tiempo de reacción de 60 min.

Alekseeva OV, Sabirzyanova TA, Selyah IO, 2014.

Springer.

Experimental

Cepas de microorganismos y condiciones de cultivo.

Preparación de pared celular de la levadura C. utilis y tratamiento de la pared celular con tripsina.

Aislamiento de proteínas, unido no covalentemente a polisacáridos, de la pared celular.

Electroforesis

Preparación de invertasa homogénea a partir de la pared celular de C. utilis y su secuenciación parcial.

Determinación de la actividad de la invertasa.

Microscopía electrónica de células de levadura.

Candida utilis

En este estudio, encontraron solo el alto peso molecular de la invertasa glicosilada, y el bajo peso molecular de la no glicosilada (62 kDa) en la pared celular bajo las condiciones experimentales podría ser explicado por dos razones: ya sea la tripsina dividida en proteína, o esta forma no fue retenida en la pared celular en el curso de exportación al medio de cultivo.

Shankar T, Thangamathi P, Rama R, Sivakumar T, 2013.

Google académico.

Experimental

Efecto del pH, temperatura, tiempo, fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno orgánico, fuentes de nitrógeno inorgánico, de las diferentes concentraciones del nivel de inóculo, niveles de sacarosa, iones

Saccharomyces cerevisiae

La producción de invertasa y las interacciones de sustrato de sacarosa de cepa de levadura en la palma de vino fue evidente a través de este estudio. Este estudio nos da una pista, de la riqueza microbiana de la invertasa producida por levadura y que puede ser

11

metálicos, surfactantes, buffers, aminoácidos, de los residuos agrícolas en la producción de invertasa.

Medios de Producción invertasa en estado sólido fermentación (SSF).

Medios de producción invertasa sumergidos fermentación (SmF)

aprovechada para procesos biotecnológicos.

Ghasemi Y,

Mohkam M,

Ghasemian Abdollah,

Rasoul-Amini S, 2014.

Springer.

Experimental

Aislamiento y cribado de microorganismos.

Identificación de microorganismos.

Preparación de medios de cultivos.

Técnica de fermentación.

Ensayo de actividad de invertasa.

Procedimiento de optimización.

Identificación de componentes y nutrientes importantes.

Optimización de componentes cribados.

Pichia sp.

Las condiciones para la producción de invertasa por Pichia sp. revelaron un incremento en la producción de invertasa de nuevas levaduras aisladas.

La estrategia utilizada aquí demuestra la ventaja en comparación con los métodos tradicionales y permite después de 2 diseños experimentales y 27 experimentos optimizados establecer que la mejor condición de fermentación fue: 40 g / l de sacarosa, 5 g / l de extracto de levadura, 4 g / l de peptona, que dio lugar a una actividad enzimática de 38,71 U / ml.

Aslam A, Haq I, Sikander A, 2013.

Google académico

Experimental

Elección del microorganismo.

Resistencia a la 2-desoxi-D-glucosa.

Preparación de inóculo.

Producción de invertasa en fermentador agitado.

Aislamiento de invertasa extracelular.

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae fue seleccionado porque contenían ambos tipos de invertasas. Fue previamente mutagenizado químicamente por metilsulfonato de etilo (EMS). para la producción de invertasa

12

Aislamiento de invertasa intracelular.

Purificación de invertasa.

Precipitación con sulfato de amonio.

Cromatografía de intercambio anicónico.

Filtración en gel.

Diálisis.

Electroforesis.

Marcador proteico.

Contenido de carbohidratos.

Caracterización de invertasas purificadas.

extracelular como principal enzima secretora. Como resultado se obtuvo que, la purificación de la invertasa extracelular con recuperación de 38% se logró. El peso molecular (110 kD) de invertasa glicosilada que tiene 48% de contenido de carbohidratos e intracelular no glicosilada (55 kD).

Lazar Z, Rossignol T, Verbeke J, Crutz-Le Coq A, Nicaud J, Robak M, 2013.

Springer.

Experimental

Construcción de plásmidos.

Cepas Y. lipolytica utilizadas en este estudio.

Condiciones de los medios y la cultura.

Crecimiento en placas de microtitulación.

Estudio de biorreactor.

Métodos analíticos

Determinación de biomasa e invertasa intracelular.

Extracción medición de azúcares y ácidos.

Actividad de invertasa

Yarrowia lipolytica

El nuevo cassette de expresión invertasa desarrollado en esta investigación, permite una fuerte secreción de invertasa en el medio y en consecuencia, una rápida escisión de sacarosa en glucosa y fructosa independiente de cualquier condición de inducción y posteriormente no está sujeto a inhibición por el medio.

Abre el camino para una utilización racional de Y. lipolytica en fermentación industrial.

Paiva A, Teixeira M, Terenzi H, João J, Souza L, 2009.

Scielo.

Experimental

Microorganismo y condición de cultivo.

Influencia de varios compuestos sobre las invertasas.

Producción en SbmF y SSF.

Influencia del salvado de trigo humedecido con diferentes soluciones.

Extracción de enzimas extracelulares e intracelulares.

Ensayo enzimático

Cuantificación de proteínas

Análisis estadístico

Aspergillus caespitosus

Se obtuvieron altos niveles de invertasas cuando A. caespitosus se cultivó en SbmF (medio Khanna) y SSF utilizando residuos agroindustriales como fuente de carbono, Sin embargo, la producción de invertasa extracelular en SSF fue de 2.73 veces superior en comparación con el SbmF, con salvado de trigo.

13

Veana F, Martínez-Hernández J.L, Aguilar C.N., Rodríguez-Herrera R, Michelena G, 2011.

Scielo.

Experimental

Microorganismo y condiciones de propagación.

Preparación de subproductos.

Fermentación en estado sólido

Caracterización enzimática del extracto.

análisis estadístico.

Aspergillus niger GH1

Los resultados obtenidos en este estudio son consistentes con Informes anteriores, el hecho de que la actividad invertasa producida bajo SmF es inferior a la producida en SSF, se obtuvo invertasa usando A. niger Aa20 en SSF. Otros autores emplearon sacarosa (25 g / L) y diferentes concentraciones de glucosa. La actividad máxima de 212 U / L se obtuvo en glucosa 100 g / L. y en medio solo con el inductor, se detectaron 140 U / L. En términos de productividad, en el presente estudio se aumentó 30 veces la productividad que otros autores que utilizan diferentes cepas A. niger

De Souza A, Esteves P, De Castro B, Archette C, Nascif É, Ribeiro F, Stringhetaa P, Mota A, 2019.

Science direct

Experimental

Reactor de ultrasonido

Caracterización de la enzima: determinación de la actividad invertasa, pH óptimo y temperatura.

Efecto de la ecografía sobre la reacción enzimática.

Determinación de los parámetros cinéticos de la invertasa.

Parámetros del modelo de Michaelis-Menten

Efecto del ultrasonido sobre el sustrato.

Efecto de la ecografía sobre la actividad de la invertasa.

Diseño experimental, regresiones

Sacharomyces cerevisiae

Este trabajo fue el primero en evaluar el efecto del ultrasonido en la reacción de invertasa, así como un pre-tratamiento en el sustrato y enzima. Por lo tanto, según los autores de puede afirmar que los efectos positivos del ultrasonido están relacionados con la turbulencia y la transferencia de masa durante la reacción. El ultrasonido potencia la hidrólisis enzimática de la sacarosa. lo que demuestra que este proceso mejora la hidrólisis enzimática de la invertasa, resultado que puede ser interesante a nivel industrial.

14

Figura 1. Flujograma para obtención de la enzima invertasa según la evidencia

experimental publicada.

Un protocolo de obtención permite ajustar, ordenar, estandarizar y tener un control exhaustivo

de los procesos que se quieran llevar a cabo. En la figura 1 se observa los pasos

fundamentales para realizar una obtención enzimática.

CARACTERIZACION ENZIMATICA

OBTENCION DE EXTRACTO CRUDO

APLICAR TECNICAS DE EXTRACCIÓN (AGITACIÓN, FERMENTACION EN ESTADO SOLIDO O LIQUIDO, ETC.)

INÓCULACION EN EL MEDIO DE FERMENTACIÓN

CONTEO DE CÉLULAS PARA EL INÓCULO

IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO

CULTIVO DEL MICROORGANISMO EN MEDIO APROPIADO PARA SU CRECIMIENTO

AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO

matemáticas y análisis estadístico.

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Aislamiento

Los hongos filamentosos y levaduras son los que según la revisión de artículos tienen la mayor

capacidad de producir invertasa en presencia de sacarosa, estos pueden ser aislados en

ambientes con altas concentraciones de azúcar, suelo fértil, plantas, frutas, etc. Para su

correcto aislamiento es necesario utilizar medios que favorezcan el crecimiento de estos, como

son los medios de cultivo selectivos o enriquecidos para recuperar los microorganismos en

gran porcentaje, por otro lado, es importante qué los materiales estén previamente

esterilizados para evitar contaminación(18). Otra fuente para conseguir estos microorganismos

es por medio de la compra o donación de cepas ATCC y por exposición de los hongos

filamentosos y levaduras a compuestos químicos (17).

Cultivo

Existen distintos tipos de medios de cultivos que cumples con las condiciones necesarias para

el crecimiento de estos, entre los medios de cultivo más utilizados se encuentran:

Medio MY40 (Osmophilic Agar): es un medio de cultivo utilizado para la búsqueda de

microorganismos osmofilicos, es decir, microorganismo con capacidad de desarrollarse

en medios con alta presión osmótica (altas concentraciones de azucares), (10).

Placa de Agar de Dextrosa de Papa (PDA): Es un medio de cultivo altamente nutritivo,

favorece el crecimiento de hongos y levaduras, permite la esporulación y la producción

de Algunos puede ser suplementado con antibióticos o ácidos para inhibir el crecimiento

bacteriano (12), (19).

Medio YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Agar): Es un medio de cultivo que

contiene extracto de levadura al 1%, glucosa al 0,8% y bactopéptona al 2%, los

hidrolizados del extracto permiten un crecimiento más rápido, de modo que durante el

crecimiento exponencial o fase logarítmica, las células se dividen cada 90 minutos (20).

Medio YNB (YEAST NITROGEN BASE): Este medio contiene las vitaminas esenciales

y sales inorgánicas necesarias para cultivar levadura, excepto aminoácidos y nitrógeno,

utiliza como fuente de carbono los carbohidratos (glucosa o sacarosa) (21).

Agar Extracto de Malta: Es particularmente adecuado para levaduras y hongos ya que

contienen una alta concentración de maltosa y otros sacáridos como fuentes de energía,

16

este tipo de medio es ideal para recuperar al 100% los conidios si se desea realizar

suspensión conidial para el inoculo (22)

Medio Czapek Dox (CD): es benéfico para el cultivo de hongos saprófitos, bacterias

del suelo y otros microorganismos a partir de diversos materiales (23).

Según la necesidad del investigador, decidirá qué cantidad de inoculo y que medio utilizará o

por el contrario suplementará los antes mencionados con otras fuentes de carbono como

trehalosa, maltosa, galactosa, manosa, fructosa, etc. Otras fuentes de nitrógeno como extracto

de levadura, glicina, peptona, gelatina, urea y caseína, diferentes concentraciones de inóculo,

como 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 y 3.5% para establecer su capacidad para estimular la producción

de invertasa en el medio de fermentación (24).

Identificación

Para la correcta identificación de hongos y levaduras, basada en la literatura es posible aplicar

distintas estrategias de identificación una de estas es el sistema API 20C AUX, con un 95% de

exactitud y perfil numérico 2040032 (25), La identificación para hongos filamentosos se debe

realizar en base a características macromorfológicas, micromorfológicas, fisiológicas y tipos

de reproducción (10), el análisis de la secuencia del gen que evaluará las caracterizaciones

morfológicas, fisiológicas y bioquímicas del aislado productor de invertasa (26); para la

identificación de Cándida, utilizar CANDIFAST test kit (20).

Inóculo

Para determinar la cantidad de inoculo que se desea utilizar es necesario tener en cuenta el

tipo de técnica a aplicar, para hacerlo se puede realizar un conteo de células en cámara de

Neubauer (27, 28), mediante suspensión conidial de esporas, para levaduras puede usarse la

técnica espectrofotométrica a 600 nm para leer turbidez y poder estandarizar dicho inóculo

(24), por otro lado, se pueden evaluar diferentes concentraciones del nivel del inóculo según

la cantidad de invertasa que se desee obtener (29).

Obtención de invertasa

Según la literatura se puede obtener la enzima invertasa utilizando diferentes métodos como,

cultivo en batch (12), mediante precipitación con sulfato de amonio (17), biorreactores (30),

17

fermentación sumergida o de estado sólido (31), usando bicarbonato de sodio como método

de extracción (32), manejando biocatalizadores solubles e inmovilizados , extracción acuosa

de dos fases (33), etc.

Cuando se trabaja con microorganismos liofilizados se deberá suspender 1 g de preparado

liofilizado de levadura u hongo en 200 ml de tampón de extracción (tampón acetato 0,1 M, pH

5,0, en NaCl 0,5 M), es necesario agitar la mezcla durante 15 min mediante sonicación de la

suspensión u homogeneización de la misma, centrifugar y tomar el sobrenadante como

extracto enzimático. El extracto enzimático, cuando no se esté utilizando, se guardará en frío

en frascos estériles (34).

Es importante mantener en agitación constante para estimular la hidrolisis de la sacarosa por

parte de los hongos según la técnica a aplicar y tener en cuenta el tipo de sustrato a utilizar

(34), la temperatura y el pH 2.9 a 6.2 (35), el periodo de incubación puede variar de 24, 48 a

72 horas y se deben realizar los ensayos y pruebas por triplicado para reducir el margen de

error (36, 37).

Medios de fermentación para la obtención de invertasa

Cultivo en batch: es un sistema cerrado de fermentación discontinua, a este proceso

se le añade al inicio un inóculo proveniente de un medio de cultivo donde creció el

microorganismo previamente (agar PDA), el medio de cultivo puede contener glucosa,

(NH4)2SO4, KH2PO4 MgSO4.7H2O, FeSO4 y peptona, luego se debe poner en

agitación a 150 rpm a 30°C durante 24 horas. A lo largo de todo el proceso de

fermentación se debe añadir oxígeno en forma de aire, un agente antiespumante y

controlar el pH (12).

Medio Czapek Dox: Es un medio que favorece el crecimiento de hongos y bacterias de

suelo no fastidiosas. Para trabajar con este medio es necesario preparar el inóculo en

una solución fisiológica del microorganismo aislado, tomando aproximadamente 104

conidios/ml o 104 células/ml, luego tomar el inoculo y añadirlo en medio de Czapek Dox,

18

constituido por NaNO3, K2HPO4, MgSO4 7H20, KCL y sacarosa, a pH 4.5, a una

temperatura de 30°C y en agitación de 250 rpm durante 48 horas (10).

Fermentación de Estado Sólido (SSF): favorece el crecimiento de microorganismos

sobre medios húmedos en ausencia de agua libre, en el cual se adiciona el inóculo y un

sustrato al medio de producción, el medio de producción contiene sacarosa, extracto de

levadura, cloruro de amonio, cloruro de calcio, polietilenglicol, metionina, tampón citrato

a pH 6 e incubar durante 48 horas. Al finalizar agregar agua destilada al sustrato

fermentado y poner en agitación durante 1 hora. Luego centrifugar a 10.000 rpm durante

5 minutos (24, 38).

Fermentación Sumergida (SmF): este tipo de fermentación se realiza en Erlenmeyer

que contienen el inóculo, sustrato y medio de producción que está constituido por

sacarosa, extracto de levadura, cloruro de amonio, cloruro de calcio, polietilenglicol,

metionina, tampón de citrato a pH-6 e incubar durante 48 horas(24).

Luego del proceso de fermentación se procede a extraer la fracción de enzima de

interés, que puede ser extracelular o intracelular:

1. Invertasa extracelular: para la obtención de este tipo de invertasa es necesario

tomar el sobrenadante del cultivo, separando las células por medio de

centrifugación, luego se lleva a precipitación con sulfato de amonios y el

precipitado proteico resultante, se purifica a través de cromatografía de

intercambio iónico (17, 39).

2. Invertasa intracelular: tomar las células producto de aislamiento, lavar una vez

con tampón de acetato o en su defecto lavar dos veces con agua destilada, filtrar

utilizando una membrana de poros y dejar secar (17, 21).

19

Preparación del extracto enzimático

Al tener lista el tipo de invertasa de interés (extracelular o intracelular), las levaduras se

deberán separar por centrifugación a 4500 rpm y los hongos filamentosos se deben separar

por filtración. El extracto crudo producto de la centrifugación y filtración se conservará a 4°C

para posteriormente determinar la actividad enzimática (10).

Caracterización enzimática

Se debe realizar a través del método de cuantificación de azucares reductores (DNS). Esta

técnica es aplicable a todos los procedimientos de sistemas de cultivos de medios líquidos y

sólidos cuya molécula de sustrato sean azucares reductores como glucosa, xilosa, entre otros.

La coloración final desarrollada es estable durante 4 horas, sensible y adaptable durante la

manipulación de un gran número de muestras a la vez (40).

Para medir la actividad de la enzima agregar 0.2 ml del extracto enzimático a 0,8 ml de solución

de sacarosa, luego colocar en ebullición durante 5min. Posteriormente agregar 1ml de reactivo

3,5-dinitrisalicilico para detener la reacción y poner en ebullición durante 5 minutos. Después

enfriar en agua helada y leer absorbancia a 540nm utilizando un espectrofotómetro. Todas las

determinaciones analíticas se deben realizar por triplicado y los resultados producto de la

actividad deben calcularse por medio de una curva de calibración de glucosa estándar (9, 41).

El método DNS es el más acorde y con mejores resultados para la cuantificación de azucares

reductores. Por lo que ha tenido diversos ajustes para ser utilizado en distintas materias primas

debido a su alta sensibilidad (42, 43).

20

DISCUSIÓN

Teniendo en cuenta la metodología planteada por los artículos seleccionados para la

elaboración del protocolo de obtención de enzima invertasa, se evidenció que es posible

establecer un protocolo de fácil consecución, económico y que puede ser modificable según

las necesidades del autor, por lo tanto, es de gran importancia continuar con este tipo de

investigaciones para seguir realizando aportes que beneficien a la industria enzimática

colombiana e impulse a aumentar la producción de esta.

Según investigaciones realizadas por Ferreira MV, et al (2018), permiten afirmar que es

posible obtener enzima invertasa utilizando compuestos económicos y de fácil acceso como lo

es el bicarbonato de sodio (NaHCO3), junto con una adecuada velocidad de agitación en

presencia del microorganismo (hongo o levadura) permite obtener invertasa en forma libre.

Cabe resaltar que durante la aplicación de esta técnica en la investigación se utilizaron medios

de cultivos como él PDA y reactivo DNS, que según la evidencia científica son los más

adecuados para este tipo de indagaciones. por otro lado, Según resultados de la investigación

de Lazar Z, et al (2013), permite afirmar que el método de elección para realizar una correcta

medición de azucares reductores y de actividad de la invertasa es el método DNS por lo que

se decidió incluir en el protocolo descrito en esta investigación ya que aportan excelentes

resultados durante su ejecución (12, 44).

Datos revelados por Rubio C, et al (2014), muestran que un microorganismo como Aspergillus

niger es capaz de producir invertasa a las 48 horas incubación, pero esto es relativo ya que

dependerá de la velocidad de reacción, de las condiciones y los requerimientos dados para

que el microorganismo actúe, la temperatura y el pH, juegan un papel muy importante durante

la obtención de la invertasa por lo que deben ser controlados (10, 35).

Alekseeva OV, et al (2014), demostraron en su investigación que la forma glicosilada de

invertasa exportada al medio de cultivo, se retiene en la pared celular, mientras que la otra,

la forma no glicosilada, no se detectó en la pared celular, siendo un hallazgo muy relevante

ya abre paso a otro tipo de investigaciones que según posteriores investigaciones y

basándose en la literatura la forma glicosilada es la más predominante en investigaciones de

uso de la invertasa (20, 39)

21

Shankar T, et al (2013), mediante un estudio experimental describen el efecto de diferentes

condiciones, soluciones y compuestos frente a la producción de invertasa lo que hace un gran

aporte al uso de la invertasa porque le ofrece múltiples alternativas al investigador para

establecer un protocolo que logra evidenciar el comportamiento de invertasa al reaccionar

frente a pH, temperatura, tiempo, fuentes de carbono, sacarosa , aminoácidos, residuos

orgánicos entre otros compuestos que permiten que el investigador utilice diferentes métodos

para mejorar la producción de invertasa (24).

Los investigadores Ghasemi Y, et al (2014), utilizaron en su investigación un microorganismo

poco usado para la producción de invertasa Pichia sp, Obteniendo buenos resultados al

trabajar con este tipo de ya que es su mayoría se trabaja con la levadura Saccharomyces, lo

que indica que tanto las levaduras como los hongos filamentosos en su mayoría son excelentes

productores de enzima invertasa lo que ofrece al investigador distintas estrategias para la

producción de invertasa (26).

Para un mejor resultado Aslam A, et al (2013), utilizaron sulfato de amonio para realizar la

precipitación en el extracto crudo y así tomar el sobrenadante, lo que parece un método poco

convencional, pero con el que al igual que con otros métodos, se logra obtener excelentes

resultados, aunque en este estudio se utilizó cromatografía de intercambio iónico y filtración

en gel, es más aconsejable solo utilizar el método de precipitación de la técnica utilizada en

esta investigación ya que la cromatografía y la filtración en gel pueden resultar costosos y lo

que se buscan son alternativas económicas para la extracción de la enzima (17).

El aporte realizado por Paiva A, et al (2009), es de gran importancia porque muestra al lector

como mediante residuos agroindustriales como única fuente de carbono en microbiología de

alimentos se pueden obtener grandes beneficios como lo es la producción de enzima invertasa

fermentación sumergida o en estado sólido lo que ofrece diferentes alternativas como fuente

de carbono para obtenerla (29), Veana F, et al (2011), durante su investigación también

utilizaron residuos agroindustriales, en este caso utilizaron melaza y bagazo de caña de azúcar

junto a Aspergillus niger para la producción de invertasa obtenida mediante hidrólisis ácida la

cual favoreció la disponibilidad de azúcares fermentables. Además, se utilizó una baja

concentración de sustrato, lo que puede redujo los costos de producción, por lo tanto, este tipo

22

de estudios representan un método alternativo para la producción de invertasa utilizando

hongos xerófilos aislado de sustratos de bajo costo (melaza y bagazo de caña de azúcar) (28).

De Souza A, et al (2019), aplicaron una estrategia muy diferente a todas las demás planteadas

en la investigaciones citadas anteriormente ya que midieron el efecto del ultrasonido o

ecografía sobre la reacción enzimática para la producción de invertasa, determinando que el

ultrasonido aplica como una alternativa para acelerar la inversión de sacarosa por la invertasa,

Por lo tanto, la tecnología de ultrasonido surge como una alternativa interesante para mejorar

el rendimiento de la invertasa, acelerando la reacción enzimática.

Es de gran importancia tener en cuenta cada una de las apreciaciones dadas en el protocolo

para una correcta obtención de la enzima, todo puede estar sujeto a cambio según las

necesidades del investigador.

23

CONCLUSIONES

Al realizar la revisión de artículos se logró llegar a las siguientes conclusiones:

La búsqueda bibliográfica permitió conocer diferentes técnicas implementadas para la

obtención de la enzima invertasa a partir de hongos filamentosos y levaduras. además

que al estar estos microrganismos tan distribuidos en el medio ambiente son de fácil

acceso, lo que facilita el proceso y puede ayudar disminuir los costos de obtención.

Para la realización del aislamiento, cultivo e identificación es necesario tener en cuenta

el tipo de hongo o levadura para establecer la técnica que requiere utilizar, en el

protocolo no se encuentran establecidas las mediciones necesarias para la producción

de la enzima ya que esto dependerá de la cantidad que el investigador decida obtener,

por otro lado, la técnica de identificación varía según el tipo de microorganismo escogido

para producir la enzima.

Teniendo en cuenta la literatura consultada existen diferentes técnicas para establecer

la cantidad de inóculo para la obtención de la enzima, tomando en cuenta 3 tipos de

técnicas diferentes para su preparación, puesto que se observó que se obtenían

excelentes resultados durante la aplicación de estas.

Es de resaltar que invertasa extracelular resulta fácil de obtener y se produce en mayor

cantidad lo que la convierte en una gran elección para la producción de la enzima.

En cuanto a la medición de azucares reductores y la actividad enzimática se logró inferir

que el método DNS es el indicado para la realización de estas pruebas según los diez

artículos utilizados para la construcción del protocolo, seis afirman que el método DNS

arroja mejores resultados y genera mayor confiabilidad.

Por último, es difícil unificar toda la información encontrada para establecer un protocolo

homogéneo, ya que hay mucha variedad en cuanto a métodos y lugares de aislamiento,

cantidad del inóculo, cultivos de fermentación y técnica de extracción, lo que permite al

investigador modificarlo a sus necesidades.

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