PROTOCOLO COLIFORMES TOTALES Y FECALES
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7/24/2019 PROTOCOLO COLIFORMES TOTALES Y FECALES
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Calidad de Agua
Protocolo de Prctica: Determinacin de
Coliformes totales por el mtodo de tubos
mltiples
Catedrtico
PhD. Guadalupe Hernndez Eugenio
Presenta:
Barrales Fernndez Christell
Corts Soriano Isa
Lucas Jacobo Jetzahel
Torrez Lpez Osmar
Chapingo, Edo. Mex. A 18 de octubre de 2015
P o s t g r a d o e n I n g e n i e r a A g r c o l a y U s o
I n t e g r a l d e l A g u a
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IntroduccinEl agua es un recurso natural imprescindible para la sociedad y se utiliza en casi
todas las actividades que el hombre realiza. No obstante, en la actualidad existen
severos problemas de escasez y contaminacin del agua. As mismo, el agua puede
ser uno de los principales transmisores de enfermedades entricas si se llegara a
consumir en estado contaminado; entre los microorganismos indicadores del agua
potable, se pueden encontrar las bacterias del grupo coliforme, perteneciendo a este
grupo, gneros como: Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp y
Citrobacter spp; los cuales, generalmente se pueden encontrar en la capa superficial
del agua o en los sedimentos de fondo. El rpido aumento de la densidad
poblacional y el crecimiento industrial hace necesario e indispensable tratar las
aguas residuales para que, de esta manera puedan servir para los diferentes usos,considerndola como un recurso adicional (NOM-127-SSA1-1994, 1994, OMS,
1998).
Las aguas residuales, poseen una composicin altamente compleja, debido a la
incorporacin al agua de contaminantes como microorganismos, desechos
qumicos e industriales y de otros tipos. En consecuencia, se requiere una variedad
de procesos de tratamiento para separar los diversos contaminantes que con
seguridad se encontrarn (NOM-001-ECOL-1996, 1997, Valdezet al., 2003).
Los microorganismos indicadores contemplados por la Norma Oficial Mexicana
NOM-127-SSA1-1994, "Salud ambiental, agua para uso y consumo humano y
por la NOM-001-ECOL-1996 son dos: organismos coliformes totales y organismos
coliformes fecales.
Los microorganismos coliformes son un grupo de especies bacterianas que tienen
ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como
indicadores de contaminacin del agua y los alimentos. Los agentes patgenos
transmitidos por el agua constituyen un problema mundial que demanda un control
urgente mediante la implementacin de medidas de proteccin ambiental a fin de
evitar el incremento de las enfermedades relacionadas con la calidad del agua Los
microorganismos coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios
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o anaerobios facultativos, y fermentan la lactosa a 35 C con la produccin de cido
y gas. El grupo de los microorganismos coliformes es el ms ampliamente utilizado
en la microbiologa como indicador de prcticas higinicas inadecuadas (Edberget
al., 2000, Fenget al., 2002).
Los organismos coliformes son capaces de formar aerbicamente colonias en un
medio de cultivo lactosado selectivo y diferencial, con produccin de cido y
aldehdo dentro de un periodo de 24 h, en este grupo se incluyen bacterias como la
Escherichia, Klebsiella, Enterobacterm Serratiam Citrobacter, Salmonella y Shigella.
Tambin incluye organismos coliformes termotolerantes (coliformes fecales) los
cuales tiene las mismas propiedades Se utiliza la E. coli como indicador, para
identificar coliformes en alimentos y agua, como indicador de la presencia de este
coliforme (NOM-127-SSA1-1994, 1994,Fenget al., 2002)
La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas
selectivas o diferenciales (Edberget al., 2000).
ObjetivoCuantificar los coliformes totales en una muestra de agua residual, mediante el
mtodo de tubos mltiples.
Fundamento terico
Aguas residuales
Se consideran Aguas Residuales a los lquidos que han sido utilizados en las
actividades diarias de una ciudad (domsticas, comerciales, industriales y de
servicios) y que ahora estn contaminadas con sustancias fecales, orina,
procedentes de desechos orgnicos de origen antropognica, animales, adems de
residuos procedentes de la actividad industrial. Comnmente las aguas residuales
suelen clasificarse como (NOM-001-ECOL-1996, 1997, NOM-003-SEMARNAT-
1997, 1997, Valdezet al., 2003):
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Aguas Residuales Municipales. Residuos lquidos transportados por el
alcantarillado de una ciudad o poblacin y tratados en una planta de
tratamiento municipal.
Aguas Residuales Industriales. Las Aguas Residuales provenientes de las
descargas de Industrias de Manufactura.
Otra forma de denominar a las Aguas Residuales es en base al contenido de
contaminantes que esta porta, as se conocen como (Valdezet al., 2003):
Aguas negras a las Aguas Residuales provenientes de inodoros, es decir,
aquellas que transportan excrementos humanos y orina, ricas en slidos
suspendidos, nitrgeno y coliformes fecales
Aguas grises a las Aguas Residuales provenientes de tinas, duchas,lavamanos y lavadoras, que aportan slidos suspendidos, fosfatos, grasas y
coliformes fecales, esto es, aguas residuales domsticas, excluyendo las de
los inodoros.
Aguas negras industriales a la mezcla de las aguas negras de una industria
en combinacin con las aguas residuales de sus descargas. Los
contaminantes provenientes de la descarga estn en funcin del proceso
industrial, y tienen la mayora de ellos efectos nocivos a la salud si no existe
un control de la descarga.
Coliformes
El trmino "coliformes" fue acuado para describir este grupo de bacterias entricas.
Coliformes no es una clasificacin taxonmica sino ms bien una definicin de
trabajo utilizado para describir un grupo de bacterias Gram-negativas, anaerbicas
facultativas con forma de varilla que fermenta la lactosa para producir cido y gas
dentro de 48 horas a 35 C. La mayora de los coliformes pueden encontrarse en
la flora normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados
especialmente en las heces, por ejemplo, Escherichia coli (Edberg et al., 2000, Feng
et al., 2002).
La Escherichia coli, es conocida originalmente como Bacterium coli comuna, fue
identificado en 1885 por el pediatra alemn, Theodor Escherich. Se encuentra
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ampliamente distribuida en el intestino de los seres humanos y animales de sangre
caliente y es el anaerobio facultativo predominante en el intestino y parte de la flora
intestinal esenciales que mantiene la fisiologa del husped sano. E. coli es un
miembro de la familia Enterobacteriaceae, que incluye muchos gneros, incluyendo
patgenos conocidos, tales como Salmonella, Shigella y Yersinia. Aunque la
mayora de las cepas de E. colino se consideran patgenos, pueden ser patgenos
oportunistas que causan infecciones en huspedes inmunocomprometidos.
Tambin hay cepas patgenas de E. coli que cuando se ingiere, causa
enfermedades gastrointestinales en los seres humanos sanos. Por esta razn, su
presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo ms
ampliamente utilizado en la microbiologa de alimentos como indicador de prcticas
higinicas inadecuadas (Edberget al., 2000, Fenget al., 2002).
Como los coliformes tambin pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre
coliformes totales y coliformes fecales. El grupo de coliformes fecales se compone
principalmente de E. coli, pero algunos otros entricos tales como Klebsiellatambin
puede fermentar la lactosa a estas temperaturas y, por tanto, ser considerado como
coliformes fecales. La inclusin de Klebsiella spp en la definicin de trabajo de
coliformes fecales disminuy la correlacin de este grupo con la contaminacin
fecal. Como resultado, la E. coliha resurgido como un indicador, en parte facilitadopor la introduccin de nuevos mtodos que pueden identificar rpidamente E. coli
(Fenget al., 2002).
Mtodos de determinacin
En 1892, Shardinger propuso el uso de E. colicomo indicador de contaminacin
fecal. Esto se basa en la premisa de que E. colies abundante en las heces humanas
y animales, y por lo general no se encuentran en otros lugares. Adems, dado que
puede ser fcilmente detectado por su capacidad para fermentar la glucosa, es elms sencillo de aislar de otros patgenos gastrointestinales conocidos. Por lo tanto,
la presencia de E. coli en los alimentos o el agua se acept como indicativo de
contaminacin fecal reciente y la posible presencia de agentes patgenos en stas
(Edberget al., 2000, Fenget al., 2002).
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En 1914, el Servicio de Salud Pblica de Estados Unidos adopt la enumeracin de
coliformes como un estndar ms conveniente de importancia sanitaria. Aunque
coliformes eran fciles de detectar, su asociacin con la contaminacin fecal era
cuestionable porque algunos coliformes se encuentran naturalmente en muestras
ambientales. Esto condujo a la introduccin de los coliformes fecales como indicador
de la contaminacin. Coliformes fecales, primero definido sobre la base de las obras
de Eijkman es un subconjunto de coliformes totales que crece y fermenta la lactosa
a temperatura de incubacin elevada, por lo tanto, se hace referencia tambin a los
coliformes termotolerantes (Fenget al., 2002).
Los lmites permisibles de coliformes para una muestra de agua, se deben ajustar
a lo establecido por las normas, las cuales establecen que organismos coliformes
totales, el lmite permisible es de 2 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) por
cada 100 mL; mientras que de organismos coliformes fecales debe de ser cero
(NOM-127-SSA1-1994, 1994).
El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la
fabricacin de los alimentos.
La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque supresencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.
Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas del equipo.
La calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes reas del
procesamiento de alimentos.
Dentro de los mtodos ms comunes para la cuantificacin de coliformes destacan
el nmero ms probable (NMP) y por unidades formadoras de colonias; sin
embargo, este ltimo se realiza a partir del NMP (Marielarenaet al., 1995, Guzmnet al., 2004).
La determinacin del NMP de bacterias coliformes en una muestra se hace a partir
de la tcnica de tubos mltiples, en la cual volmenes decrecientes de la muestra
(diluciones decimales consecutivas) son inoculadas en un medio de cultivo
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adecuado. La combinacin de los resultados positivos y negativos es usada en la
determinacin del NMP (NOM-127-SSA1-1994, 1994,Guzmnet al., 2004).
El mtodo consta de tres etapas: prueba presuntiva, prueba confirmativa y prueba
complementaria. La prueba presuntiva consiste en colocar volmenes determinadosde muestra en una serie de tubos conteniendo caldo lauril triptosa y son inoculados
a 350.5C duran 24-48 horas. En esta prueba presuntiva la actividad metablica
de las bacterias es estimulada vigorosamente y ocurre una seleccin inicial de
organismos que fermentan la lactosa con produccin de gas. La formacin de gas
de 350.5C dentro de las 24 a 48 horas, constituye una prueba presuntiva no debe
usarse rutinariamente sin confirmacin para anlisis de agua y aguas residuales
(NOM-127-SSA1-1994, 1994).
De acuerdo al objetivo del estudio, en algunos casos se puede usar la prueba
presuntiva sin confirmacin, o en los casos en que exmenes anteriores indican que
los resultados de la prueba presuntiva son comparables a la prueba confirmativa
(NOM-127-SSA1-1994, 1994).
La prueba confirmativa consiste en transferir todos los tubos positivos de la prueba
presuntiva a tubos conteniendo caldo lactosado verde brillante bilis 2% y son
incubados durante 24-48 horas a 350.5C. Esta prueba reduce la posibilidad deresultados falsos gas-positivos que pueden ocurrir por las actividades metablicas
de los organismos formadores de esporas o por la produccin sinergstica de gas
debido a que algunas cepas bacterianas no pueden, individualmente, producirlo a
partir de la fermentacin de la lactosa. El caldo lactosado verde brillante bilis
contiene agentes selectivos e inhibidores que suprimen el desarrollo de todos los
organismos no coliformes. La produccin de gas a 35C despus de las 24-48 horas
constituye una prueba confirmativa positiva (NOM-127-SSA1-1994, 1994,Fenget
al., 2002, Herreraet al., 2005).
La prueba complementaria consiste en transferir por inoculacin en estras, las
bacterias a partir de los tubos de caldo lactosado verde brillante bilis positivos, a
placas de Agar Endo o Agar Eosina Azul de Metileno (EAM), luego son incubadas
a 350.5C durante 242 horas. Se consideran positivas las colonias tpicas que
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son nucleadas con o sin brillo metlico y las colonias a tpicas que son opacas,
anucleadas, mucoides y de color rosado. Colonias tpicas y atpicas son transferidas
a tubos con caldo lauril triptosa y tubos con agar inclinado. Ser prueba
complementaria positiva cuando haya produccin de gas a partir de la fermentacin
de la lactosa y por el examen microscpico, sea demostrada la presencia de bacilos
Gram-negativos no esporulados, en las bacterias desarrolladas en el agar inclinado
(NOM-127-SSA1-1994, 1994, NOM-001-ECOL-1996, 1997,Edberget al., 2000).
Esta prueba se aplica en el examen de muestras de agua, si los resultados son
aplicados en el control de la calidad del agua potable. Tambin se recomienda
cuando existe alguna duda sobre la validez de la prueba confirmativa.
Equipo, materiales y reactivosREACTIVOS
Alcohol etlico 95%
Triptosa
Fosfato dipotsico K2HPO4
Fosfato monopotsico KH2PO4
Cloruro de sodio
Lauril sulfato de sodio
Agua destilada
Peptona
Lactosa
Bilis de buey deshidratada
Eosina
Azul de metileno
Verde brillante
Extracto de carne
Sulfato de magnesio (MgSO4.7H2O)
Cristal violeta
Oxalato de amonio
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Yoduro de potasio (KI)
Cristales de yodo
Safranina
Agar
Acetona
SOLUCIONES
Caldo Lauril Trptosa: pesar 20 g de triptosa, 5 g de lactosa, 2.75 g de fosfato
dipotsico K2HPO4, 2.75 g fosfato monopotsico KH2PO4, 5 g de NaCl, 0.1 g
de lauril sulfato de sodio, diluir en 1 litro de agua. Ajustar el pH a 6.80.1.
Esterilizar.
Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis 2%. Pesar 10 g de peptona, 10 g delactosa, 20 g de bilis de buey deshidratada, 0.0133 g de verde brillante. Se
diluyen en 1 litro de agua destilada y se ajusta el pH a 7.20.2. Esterilizar.
Agar Eosina Azul de Metileno (EAM). Pesar 10 g de peptona, 10 g de lactosa,
2 g de fosfato dipotsico K2HPO4, 0.4 g de agar, 0.065 g de azul metileno, 1
L de agua destilada. Se disuelve el medio en un poco de agua calentndolo
y agitndolo, se afora a 1 L y se esteriliza, se vaca en las cajas Petri (15 mL).
Agar nutritivo: Pesar 5 g de peptona, 3 g de extracto de carne, 15 g de agar.Se disuelve calentndolo y agitndolo frecuentemente hasta 1 L. vaciar en
volmenes de 6 a 7 mL en tubos de ensaye de 12x120 mm. Esterilizar a
121C durante 15 min. Sacar de la autoclave y colocar en posicin inclinada
hasta que el medio se solidifique.
Agua de dilucin: Para solucin Stock A. Pesar 34 g de fosfato monopotsico
KH2PO4 y disolver en 500 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.2 con
NaOH 1 N y completar el volumen a 1 L con agua destilada. Para solucin
Stock B. Pesar 50 g de sulfato de magnesio (MgSO4.7H2O) y disolver el 1 L
de agua. Para el agua de dilucin, agregar 1.25 mL de la solucin Stock A de
fosfato monopotsico y 5 mL de la solucin Stock B de sulfato de magnesio
a 1 L de agua destilada
Reactivos para la coloracin de Gram:
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o Solucin de cristal violeta: Disolver 2 g de cristal violeta en 20 mL de
alcohol etlico a 95% y filtrar en papel grueso o algodn. Disolver 0.2
g de oxalato de amonio en 20 mL de agua destilada. Mezclar estas
soluciones en partes iguales.
o Solucin de Lugol: Disolver 2 g de yoduro de potasio (KI) en 5 mL de
agua destilada. Agregar 1 g de cristales de yodo a la solucin de
yoduro de potasio y agitar hasta que el yodo se disuelva. Agregar 295
mL de agua destilada y agitar.
o Solucin de Safranina: disolver 2.5 g de safranina en 100 mL de
alcohol etlico 95%. Diluir 10 mL de solucin stock de Safranina en 90
mL de agua destilada.
o Alcohol acetona. Mezclar alcohol etlico 95% y acetona en partesiguales.
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero
Propipeta
Gradilla
Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)
Lentes de seguridad
Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodn
Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodn
Pipetas Pasteur estriles
Asa bacteriolgica
Portaobjetos
Microscopio ptico
Termmetro calibrado
Bao de agua a 44.5 0,1C.
Incubadora a 35 2,0Ca.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca
Autoclave
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Potencimetro
Cajas Petri
Tubos de 22x175 mm.
Tubos de 16x150 mm.
Tubos de ensaye
Gradilla para tubos de ensaye
Matraz Erlenmeyer 250 mL
Matraz Erlenmeyer 500 mL
Matraz Erlenmeyer 1 L.
Algodn
Papel aluminio
Lminas porta objeto
Papel filtro
Matraz quitazato
Bomba de vaco
Procedimiento
Prueba presuntiva de coliformes
Para la preparacin del medio de cultivo para la prueba presuntiva de muestras deagua, se preparan las diluciones del caldo lauril sulfato de sodio. Se agitan las
muestras y se transfieren en volmenes de acuerdo a la Cuadro 1, completando el
volumen con caldo de lauril de sodio, y se incuban a 355C, se examinan los tubos
a las 24 horas y se observa si hay formacin de gas, mediante el desplazamiento
del medio en la campana de Durhman, en caso contrario, incubar 24 h ms.
Despus de incubar se registran como positivos aquellos tubos en donde se observe
turbidez (crecimiento) y produccin de gas.
Cuadro 1. Diluciones necesarias para el anlisis presuntivo de coliformes
Inculo(mL)
Cantidad demedio portubo (mL)
Volumen demedio msinculo (mL)
Caldo lauriltriptosarequerido (g/L)
Concentracin
1 10 11 35.6 1x10 10 20 71.2 2x
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10 20 30 53.4 1.5x20 10 30 106.8 3x100 50 150 106.8 3x100 35 135 124.6 3.5x100 20 120 142.4 4x
Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva, a tubos que contienen caldo de bilis verde brillante (brilla), con campana
de Durhman. Agitar suavemente para homogenizar la mezcla, y se incuban a
352C durante 24 a 48 horas (Figura 1).
Se registran como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
(crecimiento) y produccin de gas despus del periodo de incubacin, mediante lairradiacin de luz UV.
Figura 1. Dilucin de la muestra para anlisis de coliformes totales y fecales
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Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales
Se transfieren de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo de la prueba presuntiva a tubos
con caldo EC, se agitan suavemente y se incuban a 44.50.1C en incubadora o a
bao de agua con circulacin durante 24 a 48 horas. Se registran como positivos
todos los tubos en donde se haya observado crecimiento y produccin de gas
(fluorescencia) despus de un periodo de incubacin; mediante la irradiacin de los
tubos con una fuente de luz UV.
Prueba complementaria para coliformes totales
Para el control de calidad para coliformes totales, se inoculan tubos de caldo EC
una cepa de E. colicomo control positivo y una de Enterobacter aerogenescomo
control negativo e incubar junto con las muestras.
a) Prueba confirmativa para Echerichia coli: se toma una asada de cada uno de
los tubos positivos de EC y se siembra por estra cruzada en agar azul de
metileno para su aislamiento. Se incuban las placas invertidas a 35C por 18
a 24 horas. Se seleccionan las placas con las morfologas microscpicas de
E. colide cada una de las colonias formadas y se incuban a 35C por 18-24
horas, se hace un frotis y se tien por Gram para observar al microscopio la
presencia de bacilos o cocobacilos Gram-negativos.
Preparacin de la coloracin de Gram
Se limpia bien una lmina de vidrio, para librarla de cualquier traza de pelcula
oleosa. Se coloca una gota de agua destilada sobre la lmina. Con un asa de
inoculacin colectar una pequea cantidad del crecimiento bacteriano en la
superficie del agar inclinado y suspenderla en la gota de agua, con la punta del asa
de inoculacin esparcir sobre la lmina de manera que forme una pelcula bien
delgada. Fijar la suspensin pasando la lmina tres veces sobre la llama, cubrir la
suspensin fijada, con solucin de cristal violeta, durante un minuto. Remover el
exceso de cristal violeta de la lmina, lavndola brevemente con agua corriente;
cubrir con solucin Lugol durante un minuto, decolorar utilizando una solucin de
alcohol-acetona (1:1).
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Clculos
Para prueba presuntiva:
Se debern revisar los tubos a las 24 y 48 horas y ver en la tabla No. 1 y Si el total
de tubos son negativos: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA
DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada. Todos aquellos
tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarn convenientemente
y se proceder a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA. Los resultados se
expresan de la siguiente manera, para el caso de coliformes totales, expresar como:
+
=
Para prueba confirmativa:
A partir del nmero de tubos que dan reacciones positivas en los medios de
aislamiento y confirmativo, calcular por referencia a las tablas estadsticas (Cuadro
2, Cuadro 3) el nmero ms probable de organismos coliformes, organismos
coliformes termotolerantes y E. colipresuntiva en 100 cm3de la muestra. Cuando
se emplean de dilucin para hacerlo equivalente. En caso de no encontrar en los
cuadros la combinacin de tubos adecuada, emplear para los clculos la siguiente
ecuacin:
100 3=
. 100
3 3
Cuadro 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20
mL de muestra de agua o hielo.
No. De tubospositivos
NMP/100 mL
95% de lmite de confianza
(aproximado)Inferior Superior
0
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5 >8.0 4.0 Infinito
Cuadro 3. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10
mL de muestra de agua o hielo.
No. De tubospositivos
NMP/100 mL
95% de lmite de confianza(aproximado)
Inferior Superior
0 23.0 13.5 Infinito
BibliografaEdberg, S., Rice, E., Karlin, R. and Allen, M. (2000). "Escherichia coli: the best
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