Universidad de La SerenaFacultad de CienciasDepartamento de Biología

Laboratorio Bioquímica GeneralIngeniería en Alimentos

Alumna: Natalia Vargas GuzmánProfesora: Carla Maturana Valdivia

I Semestre 2013

Las proteínas son macromoléculas, formadas por la unión desustancias más simples llamadas aminoácidos.Las proteínas determinan la forma y la estructura de lascélulas y dirigen casi todos los procesos vitales. Las funcionesde las proteínas son las siguientes:

Estructural – enzimática – hormonal – reguladora – transporte – reserva – contráctil

La organización de una proteína viene definida por cuatro niveles estructurales:

• Estructura primaria• Estructura secundaria• Estructura terciaria• Estructura cuaternaria

Especificidad y variabilidad

Amortiguadoras de pH

Solubilidad

Comportamiento eléctrico

Estabilidad

Funciones biológicas

Objetivo: Evaluar la capacidad amortiguadora de las proteínas.

Método: Titulación con acido en presencia de indicador que vira entre limites donde se supone que existe propiedad amortiguadora

Materiales:• Vaso precipitado

• 5 tubos de ensayo

• Bureta

• Pipeta

• Embudo

• Papel filtro

• Baño termorregulador a 100°C

Reactivos:• Agua destilada

• Suero sanguíneo

• Albumina

• Rojo de metilo (indicador de pH)

• HCl 0,01 N (acido fuerte: neutraliza mas rápido la reacción).

Procedimientos:1. Hacer lo siguiente en los tubos de ensayo:

• Tubo 1: Agregar 1mL de suero

• Tubo 2: Agregar 1mL de albumina

• Tubo 3: Agregar 1mL de suero + 5mL de H2O

• Tubo 4: Agregar 1mL de albumina + 5mL de H2O

• Tubo 5: Agregar 2mL de H2O

2. Al tubo 3 y 4 llevar a ebullición por 2 minutos, luego filtrar con papel (este proceso es para desproteinizar).

3. Ya con los 5 tubos listos, agregar a cada uno 3 gotas de rojo de metilo

4. Titular con HCl 0,01 N, hasta ver un cambio en la coloración

5. Anotar el gasto de HCl en cada muestra

Resultados y observacionesLo primero que calcularemos serán los Miliequivalentes en cada

muestra con la siguiente formula.

Meq = [N]xV

• Tubo 1: Meq = 0,01N x 5 mL Meq = 0,05

• Tubo 2: Meq = 0,01N x 0,7 mL Meq = 0,007

• Tubo 3: Meq = 0,01N x 2,6 mL Meq = 0,026

• Tubo 4: Meq = 0,01N x 0,5 mL Meq = 0,005

• Tubo 5: Meq = 0,01N x 0,2 mL Meq = 0,002

TuboMuestra Gasto de HCl (mL)

Miliequivalentes

1Suero sanguíneo 5

0,05

2Albumina 0,7

0,007

3Suero desproteinizado 2,6

0,026

4

Albumina desproteinizada 0,5

0,005

5Control 0,2

0,002

Tabla: Valores obtenidos del gasto y los Miliequivalentes de HCl

Conclusiones

Respecto al gasto realizado con HCl al titular se deduce que mientras más estabilizada y estructurada esta la proteína, mayor cantidad de volumen se requiere para lograr variar el pH de la solución.

En la titulación, mientras más rápido cambie de color la muestra, menos poder de amortiguación tiene.En la tabla podemos observar que en el tubo 1, la cantidad utilizada de Miliequivalentes de HCl es mucho mayor en el suero sanguíneo (0,05 Meq), esto indica que las proteínas en solución actúan como un buen amortiguador de pH. En el caso del suero desproteinizado se obtuvo un gasto menor de Miliequivalentes de HCl debido a que ya no esta el poder tamponaste de las proteínas. La muestra que gasto menos Miliequivalentes de HCl para titularse fue el tubo 5 que contiene la muestra control (H2o) lo cual refleja la ausencia de poder amortiguador.

Poder de amortiguación mayor: Suero sanguíneoPoder de amortiguación menor: Agua

Objetivo: Determinar punto isoeléctrico de la caseína

La caseína representa el 80% de las proteínas existentes en la leche y el

2,7% en composición de la leche liquida, la caseína precipita del liquido cuando este cambia a un pH determinado. En este estado se dice que la proteína se encuentra en su punto isoeléctrico.

Método: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína

Materiales:

• 9 tubos de ensayo

• Pipeta

Procedimientos:

• 1. Enumerar 9 tubos de ensayo

• 2. Al tubo 1 añadir 3,2 mL de CH3COOH 1N y 6,8 mL de H2O destilada

• 3. A los 8 tubos restantes añadir 5 mL de H2O

• 4. Desde el tubo 1 obtener 5 mL, agregarlo al tubo 2, continuar con este procedimiento hasta el tubo 9

• 5. Agregar 1 mL de solución de caseína a todos los tubos

• 6. Esperar 30 minutos y registrar la presencia o no de precipitado

Reactivos:• Agua destilada• CH3-COOH 1N (ácido)• CH3-COONa 0,1 N (Sal)• Caseína

Resultados y observacionesCalcular concentración:

C1 x V1 = C2 x V2

• Concentración del tubo 1: (CH3COOH)

1N x 3,2 mL = C2 x 10 mL

C2 = 0,32 N

(Como hacemos dilución seriada el tubo siguiente será la mitad de la concentración del anterior).

• Concentración de acetato de sodio:

0,1N x 1 mL = C2 x 6 mL

C2 = 0,017

• Calcular factor de dilución:

Fd = Vfinal/Vinicial

• Volumen inicial: 5 mL

• Volumen final: 6 mL Fd = 6/5

Fd = 1,2

Con la ecuación de Henderson-Hasselbach:

Calcularemos el pH, teniendo en cuenta que el acido acético tiene un pKa de 4,7

Tubo [CH3COOH] [CH3COONa] [CH3COOHxFd] pH ¿Precipita?

1 0,32 N 0,017 N 0,27 3,4

2 0,16 N 0,017 N 0,13 3,8

3 0,08 N 0,017 N 0,07 4,0

4 0,04 N 0,017 N 0,03 4,4

5 0,02 N 0,017 N 0,016 4,7 Si

6 0,01 N 0,017 N 0,00833 5,0

7 0,005 N 0,017 N 0,00417 5,3

8 0,0025 N 0,017 N 0,00208 5,6

9 0,00125 N 0,017 N 0,00104 5,9

El tubo 4 con un pH de 4,7 precipita, esto quiere decir que tiene el PUNTO ISOELECTRICO de la caseína (se encuentra en su punto de menos solubilidad).

Tabla: precipitación de caseína en su punto isoeléctrico

Conclusiones• Las proteínas poseen un punto isoeléctrico en el que no tienen

una carga neta, al no tener carga aumentan las repulsiones electrostáticas y por lo tanto la proteína precipita.

• Según el experimento realizado la caseína debe tener un punto isoeléctrico cercano al pH 4,7. Al investigar el punto isoeléctrico teórico encontré que el pI exacto de la caseína es de 4,75 lo que nos permite confirmar lo realizado en laboratorio.

Objetivo: Evaluar la solubilidad de proteínas frente a diferentes tipos de soluciones iónicas.

Método: Precipitación y redisolución de la proteína con acido y base.

La mayoría de las proteínas pueden precipitarse en las soluciones acuosas por la adición de ciertos ácidos, tales como el tricloroacético y el perclórico, los cuales forman con la proteína sales insolubles en ácido. Estos reactivos se emplean para “aclarar” los fluidos biológicos o extractos celulares de proteínas antes de realizar los análisis para determinar la existencia de moléculas de bajo peso molecular, tales como la glucosa y los aminoácidos. Otros precipitantes análogos de las proteínas son los ácidos túngstico, ortotúngstico y metafosfórico. Las proteínas también pueden ser precipitadas por cationes, tales como Zn+2 y el Pb+2. Las proteínas se pueden precipitar de las soluciones mediante un agente precipitante de carga opuesta a la de las proteínas; esto requiere que el pH de la solución debe ser controlado de tal modo que la proteína quede en el lado ácido o básico de su punto isoeléctrico.

Materiales:• 8 tubos de ensayo• Gotario• Pipeta

Reactivos:• HCl 0,01N• NaOH 0,1N• Albumina • Acetato de plomo 10%• Sulfato de Zinc 10%• Tungstato de sodio 10%• Ferrocianuro de potasio 1,0%

Procedimientos:

PRECIPITACION EN ACIDO:• 1- Enumerar 4 tubos de ensayo• 2- Añadir a cada uno 1mL de HCl 0,01 N + 1mL de albumina• 3- Añadir:

Tubo 1: 1 mL de Acetato de plomo 10%Tubo 2: 1 mL de Sulfato de Zinc 10%Tubo 3: 1 mL de Tungstato de Sodio 10%Tubo 4: 1 mL de Ferrocianuro de Potasio1,0%

• 4- Observar la presencia de precipitado y anotar

PRECIPITACION EN BASE:• 1- Enumerar 4 tubos de ensayo• 2- Añadir a cada uno 1mL de NaOH 0,01 N + 1mL de albumina• 3- Añadir:

Tubo 1: 1 mL de Acetato de plomo 10%Tubo 2: 1 mL de Sulfato de Zinc 10%Tubo 3: 1 mL de Tungstato de Sodio 10%Tubo 4: 1 mL de Ferrocianuro de Potasio1,0%

• 4- Observar la presencia de precipitado y anotar

Resultados y observaciones

Solucion TuboAcetato de

plomo

Sulfato de

Zinc

Tungstato de

sodio

Ferrocianuro

de potasio

HCl

1 -

2 -

3 +

4 +

NaOH

5 +

6 +

7 -

8 -•El HCl precipita con Tungstato de sodio y Ferrocianuro de potasio (aniones)•El NaOH precipita con Acetato de plomo y Sulfato de zinc (cationes)

Podemos concluir que las proteínas con acido precipitan con los aniones y las proteínas con base precipitan con los cationes.

Tabla: presencia de precipitados

Conclusiones

• El zinc forma un precipitado en medio básico.• El sodio forma un precipitado en medio ácido.• El potasio forma un precipitado en medio ácido.• El plomo forma un precipitado en medio básico.• Las proteínas se pueden precipitar mediante un agente

precipitante de carga opuesta a la de las proteínas; esto se requiere que el pH de la solución debe ser controlado de tal modo que la proteína quede en el lado ácido o básico de su punto isoeléctrico.

Las proteínas pueden precipitar con la adición de cationes (Zinc y Plomo) en medio básico, y con aniones (Sodio y Potasio) en medio acido.