Captulo 9

PRODUCCION DE PENICILINA

IntroduccinLos antibiticos son por definicin molculas con actividad antimicrobiana,

que incluyen una gran cantidad de compuestos pertenecientes a diferentes fami-lias qumicas. Son metabolitos secundarios, producidos en la mayora de los casosdespus de la fase de crecimiento. Los primeros procesos para la produccin depenicilina, que fue el primer antibitico conocido, implicaban el crecimiento dePenicillium notatum sobre la superficie de un medio lquido (Czapek-Dox-gluco-sa). El perodo de incubacin era usualmente de 6-12 das y posteriormente la pe-nicilina se extraa con solventes previa separacin del micelio.

La historia de las innovaciones en la produccin de penicilina comenz en1945 con el descubrimiento de una nueva especie, P. chrysogenum, la cual permi-ti incrementar los rendimientos del producto y trabajar en cultivo sumergidoempleando lactosa como fuente de carbono y energa, y agua de macerado de ma-z (corn-steep liquor) como fuente de nitrgeno. De esta poca es tambin el ha-llazgo de que precursores tales como el fenilacetato incrementan los rendimien-tos del antibitico, producindose en este caso predominantemente penicilina Gen lugar de una mezcla de distintos tipos.

En la Figura 23 se muestra un esquema de la biosntesis de penicilina. Lasdistintas penicilinas son producidas a partir de P. chrysogeizuin por adicin deuna apropiada cadena carboxlica en cantidad adecuada en el medio de cultivo,pero solamente tienen valor teraputico la penicilina G y la V. Ambas tienen unespectro y actividad similar, pero la penicilina V es ms estable a pH cido, loque permite su administracin por va oral.

La produccin de penicilina como otros procesos biotecnolgicos est domina-da por su aspecto competitivo entre los grandes laboratorios productores, que re-alizan permanentes esfuerzos de mejoramiento en cada rea del proceso: cepa,fermentacin y separacin. El proceso a grandes rasgos implica el cultivo de P.chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta una escala de 500.000 1,separacin del micelio por filtracin y extraccin del antibitico del caldo, segui-da por la cristalizacin o precipitacin cida del mismo.

Cepas, medios de mantenimiento e inculosNormalmente la cepa de produccin es mantenida como esporos, liofilizados

o en nitrgeno lquido. Otra alternativa es mantener el desarrollo vegetativo enN2 lquido o congelado a -70 C.

Antes de comenzar un proceso a partir de un cultivo, el operador debe reali-zar una exhaustiva evaluacin que asegure el mantenimiento de las caractersti-cas de la cepa, lo cual implica determinar el grado de esporulacin, la productivi-dad y caractersticas morfolgicas, lo que incluye ensayos en agitadores y en fer-mentadores de laboratorio.

Muchos son los factores que se asocian en la sntesis de antibiticos, tales co-mo esporulacin, velocidad de crecimiento y niveles de intermediarios, todos los

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cuales son regulados de una manera compleja por muchos genes. Esto puede. serel motivo por el cual las mutaciones con agentes fsicos (luz UV, rayos X) y qumi-cos, han tenido un gran xito en el mejoramiento de cepas. Entre 1950 y 1980 laconcentracin de penicilina obtenida fue incrementada desde 1000 U ml -1 a cercade 60.000 - U ml-1 (0.5 a 35 mg ml-1 ). Este mejoramiento fue posible no solamen-te por modificaciones en la cepa, sino tambin por la tecnologa del proceso, comola ingeniera de aireacin y sistema de mezclado en fermentadores, alimentacincontinua de glucosa, empleo de electrodos de pH para el control del mismo, y uti-lizacin del sistema continuo.

Las tcnicas genticas se han utilizado de dos formas para el mejoramientodel proceso. En primer lugar el empleo de mutantes bloqueados ha permitido elconocimiento de las rutas biosintticas y de apropiadas tnicas de seleccin. Ensegundo lugar, las tcnicas de fusin de protoplastos y procesos parasexuales fa=cilitaron la obtencin de recombinantes con rendimientos superiores a los de lascepas originales y con expresiones estables. Adems esto permiti la obtencin deorganismos productores de nuevos antibiticos.

El empleo de tcnicas de mejoramiento gentico posibilit entonces el au-mento de rendimientos y la obtencin de nuevas cepas que no producen pigmen-tos, lo cual ha sido de gran importancia en las etapas de extraccin y purifica-cin.

Otro aspecto importante en el mejoramiento de cepas se refiere a la morfolo-ga celular. En este sentido, si bien es conocido que la morfologa de un hongo en

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cultivo sumergido puede ser controlada por el nivel de inculo y por el medio, esposible influir sobre la misma por alteracin del genotipo. As se han selecciona-do cepas de P. chrysogeytum, que dan menor viscosidad en los caldos, incremen- tando la transferencia de oxgeno. Las tcnicas de recombinacin tienen una cier-ta ventaja sobre las de mutacin y seleccin, porque en este caso se deben estu-diar un menor nmero de mutantes.

Las etapas de desarrollo del inculo se llevan a cabo a 25 C en erlenmeyersy fermentadores agitados. Los medios empleados en estas etapas incluyen "cornsteep liquor" como fuente de nitrgeno, glucosa o sacarosa 2% (p/v), carbonato decalcio 0.5 - 1% (p/v) como "buffer" y sales inorgnicas. Cuando la fuente de carbo-no empleada en la escala de produccin es la lactosa, se la incluye a menudo enla etapa final con glucosa o sacarosa, de forma de inducir la B-galactosidasa ypermitir as una rpida iniciacin del proceso en el fermentador de produccin.

Requerimientos nutricionales y especficosAdems de glucosa y lactosa, Peiticillittm chrysogenum puede utilizar una

gran variedad de fuentes de carbono y energa. Alternativamente se han usadosacarosa, almidn, dextrinas, melaza, aceites vegetales y animales, etanol y gli-cerol.

Un medio de cultivo en sistema batch puede contener entre 30 y 40 g. 1-1 delactosa, en tanto que si se emplea un cultivo con alimentacin de fuente de carbo-no, se puede utilizar glucosa o melaza a una concentracin final de 100 g 1-1 .

La principal fuente nitrogenada empleada hasta la dcada del 70 fue "corn-steep liquor" debido a que aumentaba los rendimientos del antibitico probable-mente al suministrar compuestos como aminocidos, factores de crecimiento,precursores de la cadena lateral, adems de elementos trazas. Sin embargo, dadala variabilidad del producto entre distintas partidas, los problemas de suminis-tro, y tambin debido a la introduccin de precursores especficos de la cadena la-teral, las industrias buscaron reemplazarlo. Los productos alternativos son la ha-rina de semilla de algodn, extractos y peptonas, y la harina de soja. Sin embar-go en algunos casos estos productos son igualmente variables y tanto o ms ca-ros.

En 1976 se demostr la importancia de un suministro continuo de amonio(por alimentacin con (NH 4 )2SO 4 ), que permitiese mantener niveles del mismode aproximadamente 20 mM. Trabajando en cultivos alimentados y modificandola relacin nitrgeno/carbono en la alimentacin, se comprob que cuando el cul-tivo estaba limitado en nitrgeno cesaba la produccin de penicilina, la cual serestableca al ser la fuente de carbono la limitante. El requerimiento de grandescantidades de NH4 + podra reflejar su necesidad para la sntesis de glutamato, elcual es requerido para producir valina y cistena.

El azufre se incorpora como (NH4) 2 SO4 y con la fuente de nitrgeno orgnica(extractos, peptona). El fsforo en forma inorgnica se adiciona como sales de fos-fato y se aconseja mantener su concentracin entre 250 y 500 mg 1-1 con alimentacin continua. Adems se debe tener en cuenta que el "corn-steep liquor" esuna fuente importante de fsforo.

Si se desea obtener un determinado tipo de penicilina, se debe incluir inicial-mente, o bien por alimentacin en los medios, una cantidad relativamente gran-de de precursor. El requerimiento terico de fenilacetato sdico, es 0.47 g g-1 depenicilina G cida, y de fenoxiacetato de sodio, 0.50 g g-1 de penicilina V cida.

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Es aconsejable efectuar una alimentacin continua de estos componentes paraevitar la toxicidad de los mismos sobre la cepa y la hidroxilacin por accin delorganismo.

Parmetros de produccinLa cantidad de penicilina obtenida en un fermentador ( PV) es funcin de la

concentracin de clulas (X), de la velocidad especfica de produccin de penicili-na (q p ), del tiempo de fermentacin (t) y del volumen de medio de cultivo (V).

(1)

donde P = concentracin de penicilina al tiempo tf

Po = concentracin inicial de penicilina

velocidad especfica de produccin de penicilina(unidades mg-1 h-1 )

t

= tiempo de inoculacint f = tiempo de cosechaVo = volumen inicial

V = Volumen al tiempo t

Evidentemente el objetivo es alcanzar altos valores de X y de q p .Desde 1950 la velocidad de produccin de las cepas (q p X) se ha incrementa-

do 40 veces (desde 10 unidades ml-1 h-1 a 400 unidades ml-1 h-1 ).Entre los factores que afectan q p se tienen el pH, la temperatura, la airea-

cin y la velocidad especfica de crecimiento. El pH ptimo debe ser mantenidoalrededor de 6.5, lo cual permite adems minimizar la hidrlisis de penicilina acido peniciloico. Se debe tener en cuenta que el pH puede no ser constante debi-do a que el valor ptimo para crecimiento puede ser diferente del de formacin deproducto.

Los pocos estudios realizados con respecto a la temperatura indican que elvalor ptimo para crecimiento es de aproximadamente 30 C, en tanto que el p-timo de produccin oscila entre 20 y 25 C. Para un proceso "betch" la temperatura puede variar entre 23 y 28 C, en tanto que para el "batch" alimentado esa va-riacin est entre 25 y 27 C.

La aireacin presenta un problema especial en esta fermentacin, debido aque al incrementarse la biomasa, y por consiguiente la demanda de 0 2 , aumentatambin la viscosidad del medio, lo cual crea una resistencia importante para latransferencia de oxgeno. Por lo tanto puede ocurrir que por encima de un ciertovalor de X el suministro de oxgeno pueda ser insuficiente para mantener un q pmximo por un determinado tiempo. Para superar estos problemas se puede in-crementar la potencia de agitacin, el caudal de aire, la presin dentro del reac-tor, cambiar las condiciones de cultivo o incluso trabajar con cepas modificadas

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que no aumenten la viscosidad. Todo esto indica la necesidad de un adecuadomanejo del proceso y del diseo del reactor.

En un cultivo "batch" la velocidad especfica de produccin de penicilina al-canza valores altos al final del crecimiento exponencial, cayendo posteriormentecomo se muestra en la Figura 24.

Si la produccin se opera en sistema "batch" alimentado el objetivo es obte-ner tanta biomasa como sea posible (trmino X de la ecuacin 1) la cual deberaproducir penicilina a una alta velocidad especfica (qp en ecuacin 1) por el mayortiempo posible. Se ha observado que el mximo valor de q p es de aproximada-mente 15 unidades por mg-1 h-1 , el cual se alcanza al comienzo de la fermenta-cin y luego declina. Por otra parte los productores obtienen alrededor de 60.000unidades ml -1 en 200 h de proceso, lo que significa una productividad media de300 unidades ml-1 h -1 . Por lo tanto si la mxima biomasa alcanzada es de 50 mgml -1 para un qp de 15 unidades mg-1 h-1 , la mxima productividad debera serde 750 unidades ml-1 h-1 , lo que indica que el promedio obtenido es menos de lamitad del mximo. Lo expuesto indica la importancia de mantener un q p elevado.En este sentido se ha determinado cmo influye sobre este valor, la velocidad es-pecfica de crecimiento.

El valor de u para la fase de produccin, tiene un lmite superior, el cual si essuperado, la biomasa requiere un exceso de oxgeno que lleva a una disminucinde qp , si existe una limitacin del mismo en el reactor. El lmite inferior de u pa-ra la produccin vara con la cepa utilizada.

En sistemas de cultivo con alimentacin con glucosa, el valor de qp vara li-nealmente con u hasta una velocidad de alimentacin de glucosa cuyo valor osci-la alrededor de 0,33 m moles de glucosa (g biomasa)-1 h-1 , el cual corresponde aun u

de 0,015 h-1 . A mayores valores de velocidad de alimentacin u se incre-menta linealmente pero qp permanece constante (Figura 25). El valor mnimo deu debajo del cual q p desciende linealmente con u se denomina u crtico (uc ). No seconocen con precisin las causas de esta disminucin.

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El problema por lo tanto es determi-nar qu factores de la biomasa o del en-torno limitan el valor de q

p para tratarde superarlos. Si el oxgeno es el limi-tante del crecimiento, se demuestra unarelacin lineal entre el valor de u y lavelocidad especfica de consumo de ox-geno (qo2). De lo anteriormente expues-to se deduce que durante la fase de pro-duccin o crecimiento lento en un siste-ma de produccin industrial "batch" ali-mentado (la glucosa es el sustrato limi-tante) se debern mantener valores ade-cuados de u y q02 para lograr un qpapropiado.

Para la mayora de las fermentacio-nes industriales el u de produccin esmenor de 0.01 h-1 . Se debe cuidar en esta fase no tener un exceso de glucosa de-bido a que el mismo puede ocasionar una inhibicin de la actividad o de la snte-sis de enzimas involucradas en la biosntesis de penicilina. A pesar de que la li-mitacin de hexosa disponible es esencial para el xito del proceso, el valor de upuede ser controlado por otros nutrientes, habindose demostrado que la eleccindel nutriente limitante (oxgeno, fsforo, sulfato, amonio, magnesio) tiene unefecto marcado sobre el metabolismo energtico.

La relacin entre q p y u podra indicar la necesidad de prolongar un estadofisiolgico particular de las clulas. Se ha comprobado por estudios en cultivocontinuo que existe una correlacin entre la velocidad especfica de crecimiento yla morfologa celular, la cual corresponde a un estado fisiolgico determinado.Para un valor de p mayor de 0,023 h -1 se observa solamente crecimiento vegeta-tivo, en tanto que debajo de 0,014 h-1 comienza a tener lugar la formacin de co-nidias.

Debido a que bajas velocidades de crecimiento son de gran importancia enmuchos procesos fermentativos, es una necesidad dilucidar para esos casos quefunciones celulares tienen lugar. Luego, se podra estabilizar la funcin deseada,como produccin de penicilina, por perodos prolongados de tiempo. Un valor m-nimo de u podra indicar tambin la necesidad de reemplazar clulas viejas o al-teradas, las cuales han perdido irreversiblemente su capacidad de sntesis de pe-nicilina.

La duracin de la fermentacin de penicilina puede estar limitada por la ca-pacidad de transferencia de oxgeno del reactor. Como ya se indic, en algn mo-mento la concentracin celular puede exceder el suministro de oxgeno necesariopara mantener un valor alto de qp y la sntesis disminuye.

En algunos procesos la presencia de txicos, inhibidores o factores no conoci-dos pueden causar una disminucin en el valor de qp, sobre todo al final de la fa-se de produccin.

Tecnologa del procesoLa tecnologa de produccin de penicilina presenta a nivel comercial aspectos

particulares que son mantenidos en reserva por los productores, a pesar de queexiste abundante bibliografa en el tema. Un esquema del proceso se observa enla Figura 26.

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La produccin de penicilina G o V es llevada a cabo por fermentacin en me-dios lquidos, empleando reactores cuyo volumen oscila entre 40,000 y 500,000 1.Este proceso es aerbico y en general se emplea una relacin de 0,5 - 1,0 volmenes de aire (volumen de lquido)-1 min 1 . En una fermentacin de penicilina tpi-ca, la mayora de la masa celular es obtenida durante las primeras 40 horas defermentacin, a partir de un inculo de 10% (v/v) de un cultivo vegetativo de 20 g1 -1 . Luego el crecimiento contina a un valor mnimo de p, el cual se debe regularsi se quiere mantener un qp elevado.

Durante la fermentacin se debe controlar si el suministro de oxgeno es elrequerido para mantener el valor deseado de qp. Otro parmetro importante es latemperatura, y en este caso el diseo y operacin del reactor es importante por elcalor generado por el crecimiento y la agitacin.

Los agitadores utilizados son en general de tipo turbina. La potencia introdu-cida al cultivo es del orden de 1 - 4 W 1 -1 . Durante el proceso se controla la tem-peratura, caudal de aire, velocidad de agitacin, pH y velocidad de agregado denutrientes. La duracin de la etapa de produccin en el caso de operarse un siste-ma "batch" alimentado es del orden de las 200 h.

Actualmente la extraccin con solventes es la base para la separacin y puri-ficacin de la penicilina. El primer paso consiste en separar el micelio del mediode cultivo empleando un filtro rotatorio a vaco tipo cilndrico. El filtrado rico enpenicilina es luego enfriado en un intercambiador de calor a 0 - 4 C con el objetode disminuir la degradacin enzimtica y qumica durante las etapas de extrac-cin posteriores.

Las penicilinas G y V son cidos fuertes (pKa entre 2.5 - 3.1). Las formas ci-das son solubles en muchos solventes orgnicos y se pueden extraer con un altorendimiento en acetato de amilo o de butilo a pH 2.5 - 3.0. La extraccin se puederealizar en operaciones continuas, a contracorriente en extractores centrfugosen etapas mltiples, a temperaturas de 0 - 3 C. Otra posibilidad es el empleo demezcladores estticos o decantadores, los cuales tienen en menor costo de inver-sin.

Se debe tener en cuenta que tanto la penicilina G como la V se degradan enmedio cido con una cintica de primer orden a una velocidad proporcional a latemperatura y recproca con respecto al pH. Esto hace que la vida media en con-diciones de eficiente extraccin en medio cido sea muy reducida. Sin embargocomo la forma V en tales condiciones es ms estable que la G, si el objetivo es ob-tener 6-amino penicilnico (6-APA) la produccin de penicilina V es ms aconse-jable.

La extraccin de penicilina se puede realizar en una o ms etapas sucesivas,con una acidificacin del caldo filtrado con H2SO 4 o H 3 PO 4 al 10% P/V y con elagregado de un agente surfactante (0,003 - 0,1% P/P, en el solvente), realizndo-se la extraccin y concentracin en extractores centrfugos. Dependiendo de lasespecificaciones de uso final, el solvente conteniendo penicilina se puede tratarcon carbn para separar pigmentos y otras impurezas. Esta etapa actualmenteno se realiza debido a las bajas impurezas de los caldos y a los altos rendimientosobtenidos.

La cristalizacin se puede realizar desde la fase acuosa si se desea, siendo losvalores crticos las concentraciones de sodio o potasio, la temperatura, la concen-tracin de penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalizacin a partir de unsolvente se requiere tambin un exceso de Na + o K+ , siendo los cristales recupe-rados en un filtro rotatorio a vaco. Estos cristales son lavados y presecados con

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un solvente voltil que tambin separa impurezas coloreadas. El secado definiti-vo se puede realizar con aire caliente, vaco o calor radiante.

La penicilina cristalina G o V as obtenida puede ser empleada como tal o co-mo intermediario que es convertido a 6-APA para obtener nuevas penicilinas se-misintticas, cuidando en todos los casos que los productos debern tener un gra-do farmacutico. El cido 6-APA puede ser obtenido por va enzimtica (penicilinacilasa) o qumica; sin embargo todas estas etapas escapan al alcance de estamonografa, por lo tanto se remite al lector interesado a la bibliografa.

Economa del procesoSe atribuye un 80% del costo de produccin de penicilina al proceso de fer-

mentacin y un 20% a las etapas posteriores de extraccin y purificacin. A suvez en el proceso fermentativo, un elevado porcentaje en los costos correspondeal medio de cultivo, en el cual la glucosa es el componente de mayor valor. El m-ximo rendimiento mencionado en esta fermentacin es aproximadamente 0.1 gde penicilina por gramo de azcar. El balance de materia para glucosa es el si-guiente:

glucosa

=

consumo para

consumo para energa

consumo paraconsumida

biomasa

+

de mantenimiento

+

penicilina

Podemos entonces escribir la siguiente ecuacin:

donde Y'p/s es el rendimiento en producto que se obtendra cuando no hay creci-miento ni mantenimiento, y los dems trminos tienen el significado ya mencio-nado. Se ha estimado que de la cantidad total de glucosa consumida, el 20% seutiliza en la formacin d biomasa, el 10% para la produccin de penicilina, y elresto, o sea el 70% para mantenimiento.

El valor de Y'p/s se puede estimar tericamente mediante el conocimiento dela ruta biosinttica que conduce al producto. En el caso de la penicilina el valormximo terico posible ha sido calculado en 1.1 g de penicilina g-1 de glucosa

Tomando en cuenta el elevado consumo de glucosa para mantenimiento esevidente que deben realizarse todava estudios fisiolgicos con el objeto de redu-cir ese porcentaje.

En 1980 la produccin mundial de penicilina alcanz las 17,000 toneladascon un valor estimativo de 380 millones de dlares. Estos dos valores son mayo-res que los de cualquier otro antibitico y no son fijos sino que la produccin tieneuna significativa velocidad de crecimiento anual. Esto se debe a su baja toxicidady la posibilidad de modificar qumicamente la molcula, lo cual incrementa suutilidad.

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A pesar de los avances logrados, muchos problemas fundamentales sobre elcontrol de la fermentacin de penicilina permanecen todava sin resolver. Las fu-turas mejoras en la produccin deberan considerar:

El aumento de qp max y la biomasa (X), la disminucin de uc, la inhibicin dela hidrlisis de la penicilina, la disminucin de la viscosidad de los caldos y delporcentaje de carbono destinado a mantenimiento, la obtencin de cepas con fe-notipos y productividad estables, y finalmente el mejoramiento de los sistemasde operacin como el batch alimentado y el continuo.

Lecturas recomendadas:1.

Comprehensive Biotechnology. The practice of Biotechnology: Current Commodity Pro-ducts, Vol. 3. Ed. Harvey W, Blanch; Stephen Drew, Daniel C. Wang. Pergamon Press,1985.

2.

Microbial Growth. Benchmark Papers in Microbiology. Ed, P.S.S. Dawxon. Dowden,Hutchinson-Ross, Inc. Pennsylvania, 1974.

3.

Microbial Technology. Microbial Processes. Second Edition/Volume I. Ed. H.J. Peppler and D. Perlman. Academic Press, N. Y., 1979.

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