PROCESOS DE SEPARACINCintica y isoterma de adsorcin de C-ficocianina deSpirulina platensisen resinas de intercambio inicoL. SalaI;FS FigueiraI;GP CerveiraI;CC MoraesII,*;SJ KalilI,*YoUniversidade Federal do Rio Grande, Escuela de Qumica e Alimentos, PO 474, 96201-900, Rio Grande - RS, Brasil.Telfono: +55 (53) 32338754, Fax: +55 (53) 32338645, E-mail:dqmsjk@furg.brIIUnipampa, Ingeniera de Alimentos, PO 07, 96412-420, Bag - RS, Brasil.E-mail:engcarolinemoraes@yahoo.com.br

RESUMENC-ficocianina es un colorante azul natural extrado deSpirulina platensis,que tiene muchas aplicaciones en las industrias alimentarias y farmacuticas.En este trabajo se investig el efecto del pH y la temperatura sobre la adsorcin de C-ficocianina en dos diferentes resinas de intercambio inico (DEAE Streamline Streamline y Q XL) para la cromatografa de adsorcin en lecho expandido.Adems, se evaluaron la cintica y la isoterma de adsorcin.Se alcanz el equilibrio de la matriz Q XL despus de 60 minutos, mientras que para DEAE slo se alcanza despus de 140 min.C-ficocianina mostr el coeficiente de particin ms alta a pH 7,5 para ambas resinas a 25 C.La isoterma de adsorcin de C-ficocianina fue muy bien representado por el Langmuir, Freundlich y modelos de Langmuir-Freundlich, donde los valores estimados paraQmyKdobtenidos por la isoterma de Langmuir fueron, respectivamente, 33,92 mg.mL-1y 0.123 mg. ml-1para DEAE, y 28,12 mg.mL-1y 0.082 mg.mL-1para la matriz Q XL.A cooperatividad negativa se observ para la unin cuando se utiliz la matriz Q XL C-ficocianina, mientras que la cooperatividad era puramente independiente usando la matriz de DEAE.Palabras clave:adsorcin;C-ficocianina;Isoterma de Freundlich;Los parmetros cinticos;Isoterma de Langmuir.

INTRODUCCINLos ficobiliprotenas son pigmentos fotosintticos presentes en cianobacterias, responsables de alrededor del 50% de la luz captada por estos microorganismos (Santiago-Santoset al.,2004).Una de las ficobiliprotenas ms interesantes para la comida (Yoshidaet al.,1996) y cosmtico (Cohen, 1986) industrias es C-ficocianina, su aplicabilidad se basa en el hecho de que se puede utilizar como un colorante azul natural en estos sectores como un sustituto de colorantes sintticos, que son generalmente txicos o de otra manera insegura (Moraeset al,2011b;.. Minkovaet al,2003; Arad y Yaron, 1992).De las diversas fuentes existentes de este tinte natural, la cianobacteriaSpirulina platensismerece una atencin especial, ya que C-ficocianina puede constituir hasta el 20% de la fraccin proteica (Vonshak, 1997).C-ficocianina est formado por dosysubunidades de protenas diferentes de 17.000 y 19.500 Da, respectivamente, con un cromforo bilin unido a la subunidad(a84) y dos a la subunidad(b84, B155) (Turneret al.,1997).Patelet al.(2005) encontraron que la masa molecular de esta biomolcula extrado deSpirulinasp.era 112 kDa.Adems de su potencial para su uso en alimentos y cosmticos, los estudios han demostrado que el C-ficocianina tiene antioxidante (Bhat y Madyasatha, 2001), anti-inflamatorio y propiedades antitumorales (Reddyet al.,2003), as como actuar como una estimulador del sistema inmune, aumentando el nmero total de leucocitos, cuya funcin principal es mantener la salud de los rganos del cuerpo y proteger contra el cncer y lceras (Madhyasthaet al.,2006).Adems, esta protena se ha informado de inducir la apoptosis en algunas clulas de carcinoma (Royet al.,2007) y las clulas mieloides crnicas humanas de leucemia (Subhashini, 2004).La propiedad fitoteraputicos presentado por este producto requiere un alto nivel de pureza, logrado a travs de diversas tcnicas de purificacin, que presentan un costo elevado.Uno de los procesos aplicados en la purificacin de protenas se basa en tcnicas cromatogrficas tales como cromatografa de intercambio inico de lecho expandido (EBIEC).La adsorcin en lechos expandidos permite a las protenas pueden recuperar directamente a partir de preparaciones de clulas disgregadas, sin la necesidad de la eliminacin previa de los slidos en suspensin, que normalmente resultar en la obstruccin de los lechos de relleno.La aplicacin de esta tcnica reduce en gran medida la complejidad de procesamiento aguas abajo mediante la eliminacin de ciertas etapas de centrifugacin, dilisis, precipitacin, sistema acuoso de dos fases y filtracin en gel, resultando en la reduccin de costes y la simplificacin del proceso de purificacin y recuperacin del bioproducto (Chase, 1994 ).Sin embargo, hay algunos factores que son crticos para el xito del producto, incluyendo la eleccin correcta de adsorbente, junto con un diseo cuidadoso del aparato en el que se realiza la separacin.El EBIEC hace uso de adsorbentes tales como resinas de intercambio de iones, que adsorben protenas como resultado de interacciones inicas entre grupos cargados en la superficie de la protena y los grupos inicos con cargas opuestas en el intercambiador de iones (Chase, 1994).El pH es capaz de promover cambios en la fuerza inica mientras que la temperatura afecta a la estructura espacial de la protena, por lo que estos son parmetros importantes en el estudio de la cintica de adsorcin de un compuesto interesante.En un estudio de adsorcin, es esencial para determinar el modelo que describe la isoterma de adsorcin en cuestin (Dottoet al.,2013).Las isotermas de adsorcin son curvas que describen la adsorcin de un soluto por los slidos a una temperatura constante.Una isoterma de adsorcin se muestra la cantidad de soluto adsorbido por la superficie adsorbente como una funcin de la concentracin de equilibrio del soluto.Las isotermas encontrado ms comnmente para la adsorcin de bioproductos son los Freundlich, Langmuir, modelos lineales Langmuir-Freundlich y.La tcnica utilizada para crear los datos de adsorcin es, en principio, muy simple, ya que una cantidad conocida de soluto se aade a un sistema que contiene una cantidad conocida de adsorbente.Se supone que la diferencia entre la cantidad aadida y que permanece en solucin se adsorbi sobre la superficie adsorbente (Alleoniet al.,1998).La seleccin de las condiciones de adsorcin C-ficocianina es un paso importante para la purificacin adicional usando tcnicas EBIEC, ya que los aumentos en la adsorcin del compuesto por el intercambiador de iones de plomo a reducciones en los costes del proceso debido a la disminucin de las prdidas y el uso de volmenes reducidos de la producto de destino y resina.Hay una falta de estudios relacionados con el comportamiento de C-ficocianina durante su adsorcin sobre resinas de intercambio inico en un lecho expandido.Silveiraet al.(2008) estudiaron los efectos del pH y la temperatura sobre el coeficiente de particin, y determin la isoterma de adsorcin en las mejores condiciones evaluadas para la adsorcin de C-ficocianina sobre la resina de intercambio inico Q-Sepharose FF, una resina ampliamente utilizado y de gran xito aplica en lechos fijos.La adsorcin en una resina de lecho expandido de Streamline DEAE fue estudiado por Bermejoet al.(2006), Ramoset al.(2010), Ramoset al.(2011) y Bermejo y Ramos (2012), la obtencin de las isotermas de adsorcin para el crudo C-ficocianina y / o un extracto purificado para obtener el parmetroQm.En estos estudios el comportamiento cintico no se evalu y el pH y la temperatura no se optimizaron para una mejor adsorcin.De acuerdo con los aspectos mencionados anteriormente, y teniendo en cuenta la importancia de un anlisis de los datos de equilibrio en el desarrollo de las ecuaciones que se pueden utilizar para el diseo de modelos de adsorcin y la eleccin de la mejor adsorbente, el objetivo de este estudio fue investigar la efectos de los parmetros de proceso - temperatura y pH - en la adsorcin de C-ficocianina en las resinas de intercambio inico Streamline Q XL y DEAE Streamline para lechos expandidos, as como la verificacin de las condiciones de equilibrio tpicos para la adsorcin de C-ficocianina Onto intercambio inico resinas.MATERIAL Y MTODOSPreparacin del extracto crudo y CuantificacinLaSpirulina platensiscianobacteria fue cultivado y mantenido en exteriores fotobiorreactores en condiciones no controladas en el sur de Brasil.Durante estos cultivos, el agua fue suplementado con 20% medio sinttico Zarrouk (Costaet al.,2000).Al final del cultivo, la biomasa se recuper por filtracin, y despus se sec, congelado y se moli a un dimetro de partcula de entre 0,106 y 0,125 mm (Moraeset al.,2010).La extraccin de C-ficocianina de la biomasa se llev a cabo de acuerdo con Moraeset al.(2010), que usa agua como disolvente extractor a una velocidad de 0,16 g: 1 ml (biomasa en polvo: extractor disolvente).La concentracin de C-ficocianina(C - FC,la ecuacin (1)) se calcul como se describe por Bennett y Bogorad (1973) con pocas modificaciones en las densidades pticas.

AdsorbentesSe estudiaron dos adsorbentes adecuados para su uso en lechos expandidos para la adsorcin de C-ficocianina.Estos adsorbentes consistan en una matriz macroporosa de agarosa con un ncleo de cuarzo.Uno de los adsorbentes, Streamline DEAE (GE Healthcare) es un intercambiador aninico dbil, siendo el grupo funcional -O-CH2CH2-N+(C2H5) 2H.El otro adsorbente, Streamline Q XL (GE Healthcare) es un intercambiador aninico fuerte, con un amonio cuaternario como grupo funcional.El rango de pH de trabajo de ambos intercambiadores es entre 2 y 13 (Amersham Biosciences, 2002).Estas resinas pueden promover diferentes grados (2-3 veces) de expansin del lecho.Efecto del pH sobre el coeficiente de particinLas pruebas se llevaron a cabo en un reactor de mezcla termosttica a 25 C, con agitacin mecnica durante 200 min como se muestra enla Figura 1.

En este sistema, se aadi 30 ml de extracto C-ficocianina con una concentracin de C-ficocianina inicial fijo a 3 ml de resina de intercambio inico (Streamline Q XL o Streamline DEAE) pre-equilibrada en tampn fosfato 0,025 M de sodio en el pH de la estudio.El pH del extracto C-ficocianina se ajust a los siguientes valores de pH (5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 y 7,5), de acuerdo con el rango donde el C-ficocianina se considera estable (Silvaet al.,2009).Un espacio en blanco se prepar para cada prueba, en la que se aadi el C-ficocianina en el pH bajo estudio para el sistema sin la resina de intercambio de iones.Se tomaron muestras a intervalos predeterminados de tiempo (0, 2, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 140, 180 y 200 min), el clculo de la concentracin de C-ficocianina segn la ecuacin (1).Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado.Basado en las concentraciones iniciales y finales de C-ficocianina libre (no adsorbido) en la fase lquida(C *),la concentracin de equilibrio de C-ficocianina adsorbido sobre la fase slida(q *)se puede calcular, obteniendo as la particin coeficiente(f),que indica la fraccin de protena adsorbida en el equilibrio.El coeficiente de particin se calcula de acuerdo con Harsha y Furusaki (1994) (Ecuacin (2)):

Efecto de la temperatura sobre el coeficiente de particinDespus de establecido el tiempo de equilibrio y el mejor pH de adsorcin C-ficocianina (fijada en 7,5), se estudi el efecto de la temperatura sobre los coeficientes de particin (5, 15 y 25 C) en los reactores de mezcla con agitacin orbital (200 rpm).En este sistema, se aadi 30 ml de extracto C-ficocianina con una concentracin de C-ficocianina inicial fijo a 3 ml de resina de intercambio inico (Streamline Q XL o Streamline DEAE) pre-equilibrada en tampn fosfato 0,025 M de sodio a pH 7,5.Un espacio en blanco se prepar para cada prueba, en la que se aadi el C-ficocianina a la temperatura bajo estudio para el sistema sin la resina de intercambio de iones.Se tomaron muestras a 0 y 200 min.Se calcularon las concentraciones de C-ficocianina y los coeficientes de particin como se muestra en las ecuaciones (1) y (2), respectivamente.Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.Isotermas de adsorcinLos experimentos utilizados para determinar la isoterma de adsorcin en equilibrio se llevaron a cabo en un sistema discontinuo con agitacin orbital que contiene resina pre-equilibrada de intercambio inico (Streamline Q XL o Streamline DEAE) y el extracto C-ficocianina con diferentes concentraciones iniciales a pH 7,5 y 25 C y se incub a 200 rpm durante 200 min.Despus de este periodo se recogieron las muestras para determinar la concentracin C-ficocianina.Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.Las isotermas de adsorcin se pueden describir en muchas formas matemticas, algunos de los cuales se basan en un modelo fsico simplificado de adsorcin y desorcin, mientras que otros son puramente emprica y destinado a correlacionar los datos experimentales.Varios ecuaciones de isotermas, tales como los modelos de Langmuir, Freundlich y Langmuir-Freundlich, se han utilizado para describir las caractersticas de equilibrio de adsorcin.Si la adsorcin de C-ficocianina sigue el modelo de Langmuir, el proceso de adsorcin se puede expresar como:

dondeQmrepresenta la capacidad mxima de unin de la resina (mg.mL-1)yKdes la constante de equilibrio Langmuir (mg.mL-1),que es la disociacin efectiva constante que representa la relacin entre la desorcin y adsorcin.El modelo propuesto se basa en una superficie ideal y predice que la superficie de adsorcin es energticamente ideales (Barbozaet al.,2002).Por otro lado, si la adsorcin de C-ficocianina sigue el modelo de Freundlich, la isoterma puede ser descrito como sigue:

dondeKfynson las constantes fsicas de Freundlich relacionados con la capacidad de adsorcin y la intensidad de adsorcin del adsorbente, respectivamente.Modelo de Langmuir-Freundlich (Ec. 5), propuesto por Sips (1948), es una forma combinada de modelos de Langmuir y Freundlich y tiene tres parmetros:Qmes la capacidad mxima de adsorcin de la monocapa;KdLFes la constante de disociacin aparente;ynLFes el coeficiente de Langmuir-Freundlich que indica la presencia o ausencia de cooperatividad.

El Freundlich, Langmuir y los modelos de Langmuir-Freundlich aplican utilizando un mtodo de regresin no lineal se utiliza para ajustar los datos experimentales de equilibrio, y el coeficiente de determinacin(R)utilizados para analizar el ajuste de cada modelo.Los parmetros de los modelos se estimaron mediante el mtodo de regresin no lineal de las expresiones modelo.RESULTADOS Y DISCUSINEfectos del pH en el Coeficiente de ParticinEl coeficiente de particin se correlaciona la cantidad de compuesto de destino que migra de una fase a otra.En el presente caso, el coeficiente de particin correlaciona la cantidad de C-ficocianina presente en la fase slida, o se adsorbe sobre la resina, con la cantidad de la misma bioproducto libre en la solucin en el equilibrio.La Figura 2muestra la variacin en la concentracin de C-ficocianina en la fase lquida a los diferentes valores de pH durante el perodo de tiempo estudiado.Se puede observar que se alcanz el equilibrio despus de 60 minutos para todos los valores de pH estudiados usando la resina Streamline Q XL (Figura 2b), mientras que con la resina DEAE Streamline (Figura 2a), el equilibrio se alcanza solamente despus de 140 minutos.Los ensayos llevados a cabo sin la adicin de cualquier resina mostraron que no haba desnaturalizacin C-ficocianina durante el perodo de tiempo estudi en cualquiera de los valores de pH de trabajo.El tiempo necesario para alcanzar el equilibrio para la adsorcin de C-ficocianina en la resina DEAE Streamline en los diferentes valores de pH fue muy similar a la encontrada por Silveiraet al.(2008), cuando se alcanz el equilibrio despus de 150 min para la adsorcin de C-ficocianina en la resina de flujo rpido Q Sepharose utilizado para el lecho fijo.La Figura 3muestra el comportamiento del coeficiente de reparto con la variacin en el pH para la adsorcin de C-ficocianina en las resinas DEAE Streamline Streamline y Q XL.Los valores del coeficiente de particin ms bajos se obtuvieron en el valor ms bajo de pH estudiado, es decir, a pH 5. La estructura de C-ficocianina incluye una parte de la protena, y por lo tanto la carga neta de la biomolcula superficie pueden variar de acuerdo con el valor del pH circundante.Cuando por encima de su pI (punto isoelctrico) la biomolcula se carga negativamente.Por otra parte, cuando el pH est por debajo de su pI la biomolcula se carga positivamente.El punto de C-ficocianina isoelctrico es de alrededor de 4.6 a 5.2 (Santiago-Santoset al,2004;.. Abaldeet al,1998), y por lo tanto el extracto utilizado en este estudio fue cargado negativamente y los adsorbentes eran aninico.Por lo tanto, cuando C-ficocianina se puso en contacto con el adsorbente, el enlace buffer-adsorbente formado era ms dbil que el enlace C-ficocianina-adsorbente, lo que resulta en un proceso de adsorcin.Cuanto mayor sea el valor de pH, mayor es la carga negativa neta en la biomolcula, resultando en altos coeficientes de particin, como se muestra enla Figura 3.

La variacin de los coeficientes de particin en la resina Streamline DEAE fue modesto en comparacin con el que en la resina Streamline Q XL, mostrando que el pH tena slo una ligera influencia sobre la adsorcin sobre esta resina.En el estudio llevado a cabo por Silveiraet al.(2008), tambin se midi la influencia del pH sobre el coeficiente de reparto a un pH de 8,0 y 9,0 y, aunque el coeficiente de particin fue ligeramente mayor a pH 8,0 que a pH 7,5, los autores informaron que C-ficocianina no era muy estable a un pH de 8.0.Es de inters limitado para llevar a cabo estudios de adsorcin donde hay una prdida de actividad biolgica de la protena.Silvaet al.(2009) reportaron que la concentracin de C-ficocianina disminuy a 70% de su valor inicial a pH 8,0 a temperatura ambiente y, por esta razn, los valores de pH por encima de 7,5 no fueron incluidos en el presente estudio.Los mayores coeficientes de reparto se obtuvieron a pH 7,5 para ambas resinas y por lo tanto este pH fue elegido para seguir trabajando.Efecto de la temperatura sobre el coeficiente de particinLos coeficientes de particin que se encuentran en el intervalo de temperatura evaluados se muestran en laTabla 1.

La adsorcin ms bajo C-ficocianina se produjo a la temperatura ms baja (5 C) para ambas resinas, mientras que las adsorciones C-ficocianina en 15 y 25 C para ambas resinas eran iguales.Por lo tanto, la temperatura de 25 C fue elegida para los siguientes experimentos con dos adsorbentes, ya que la eleccin de esta temperatura reducira los costes de refrigeracin durante la purificacin en una escala mayor en una columna de lecho expandido.Adems, segn Saradaet al.(1999) y Silvaet al.(2009), C-ficocianina es estable a esta temperatura y pH.Isoterma de adsorcinUn anlisis de los datos de equilibrio es importante para desarrollar una ecuacin que puede ser utilizado para propsitos de diseo.En este estudio, tres modelos de adsorcin no lineales clsicos, Langmuir, Freundlich y Langmuir- Freundlich, fueron empleados para describir la adsorcin de equilibrio C-ficocianina.El modelo de Langmuir se refiere a la sorcin monocapa sobre superficies que contienen un nmero finito de sitios idnticos, lo que significa que los sitios de unin de los adsorbentes son idnticos, y la protena molcula diana slo se une a los sitios de unin (Rozieet al.,1991).Otros supuestos tambin se hacen para el modelo de Langmuir, es decir, reaccin reversible y no hay interaccin entre las especies adsorbidas (Nieet al.,2007).Por esta razn el modelo de Langmuir presume de adsorcin homognea.La ecuacin de Freundlich es una relacin emprica, mediante el cual se supone que la energa de adsorcin de una protena cuando la unin a un sitio sobre un adsorbente depende de si o no los sitios adyacentes ya estn ocupadas.La isoterma de Langmuir-Freundlich es un simple generalizacin de las dos isotermas (Sips, 1948).Por analoga con la protena - mltiples interacciones de ligando, se ha sugerido que este isoterma sirve para modelar cooperatividad de adsorcin.Como la ecuacin tiene tres trminos de ajuste, es mucho mejor para la aproximacin de adsorcin de una naturaleza heterognea y explicar cooperatividad de adsorcin.Para que no interactan, sitios puramente independientes, el valor den= 1LF.CuandonLF>1, se sugiere cooperatividad positiva, mientras que cuando 0