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Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de una proteína o molécula de interés
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Métodos de Baja
resolución
Precipitación con sales, precipitación con temperatura y pH
Métodos de Alta
Resolución
Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio iónico, afinidad
Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante, desnaturalizante
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Características Procedimiento
Solubilidad 1. Salting in2. Salting out
Carga iónica 1. Cromatografia de intercambio iónico
2. Electroforesis
Polaridad 1. Cromatografía de adsorción2. Cromatografía en papel3. Cromatografía fase inversa4. Cromatografía interacción
hidrófoba
Tamaño molecular 1. Dialisis y ultrafiltración2. Electroforesis en gel3. Cromatografía en filtración en
gel4. Ultracentrifugación
Especificidad de unión 1. Cromatografía de afinidad
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Sal más usada: Sulfato de Amonio
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MASA
TAMAÑO
Å
Å
kDa
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pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.pH solución< pI= proteína carga(+) por protonaciónpH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble
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Las proteínas son moléculas cargadas
• De
• Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos
• Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea
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CromatografíaEs un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes.
Volumen de columna
Muestra aplicada
Matriz
Tapónporoso
Eluyente
Eluyente Proteínas separadas
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Matriz de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina fase estacionaria o lecho de la columna.
Fase Móvil. Solución Tamponada que se hace pasar a través de la columnaLongitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.
Volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica.
Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.
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PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa
molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor
masa molecular
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APLICACIONES
Desalado de proteínas
Purificación de proteínas
Determinación del peso molecular de las proteínas
TIPOS DE MATRIZGRANULOS DE UN
MATERIAL ESPONJOSO E HIDRATADO
Dextranos con enlaces cruzados
Agarosa Poliacridamida
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En esta práctica se utilizará el gel dextrano.
FASE ESTACIONARIA
Tipo Peso molecularLímite de
fraccionamiento
Agua retenida(g/g gel sec)
Volumen de gel hidratado (ml/g
gel seco)
G10 Hasta 700 1.0 2
G15 Hasta 1500 1.5 3
G25 1000 - 5000 2.5 5
G50 1500 - 30 000 5.0 10
G75 3000-80 000 7.5 12-15
G100 4000 - 150000 10.0 15-20
G150 5000 – 400 000 15.0 20-30
G200 5000 – 800 000 20.0 30-40
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Cromatografía de intercambio iónico
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Intercambio aniónico
Fase estacionaria cargada positivamente
Intercambio catiónico
Fase estacionaria cargada negativamente
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GRADIENTE DE CONCENTRACIÓN
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Cromatografía de Afinidad
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Utiliza la alta especificidad entre las moléculas biológicas para separar componentes específicos de mezclas complejas.
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VENTAJAS:No hay restricción por volumen. EspecificidadPureza del producto final
DESVENTAJAS:Precio (alto) Condiciones de elución drásticasLigando específico no disponible o inadecuado
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Métodos espectrofotométricos
Ventajas de la técnica RápidaPrecisa Versátil Fácil de usar Eficiente en costo
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MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS
Método de Absorción No se pierden las muestras
Interfieren compuestos que absorben en el UV
MÉTODOS COLORIMÉTRICOS
Biuret Específico para proteínas, muestra pocas interferencias es barato
Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL
Lowry Tiene bastante sensibilidadde 0,1-1 mg/mL.
No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio
Bradford Muy sensible0,5 -1,4 mg/mL
Muestra interferencias con detergentes
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