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Procesividad de la RNA polimerasa
Guillermo Domínguez Huertas
Biología molecular avanzada
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Elongación transcripcional
Enzimacompletamente
procesiva.
Recibe diferentesseñales que modulan
un amplio rango develocidad.
La Km ap varíaampliamente
según el moldeDificultad para elaislamiento de
intermediarios.
Existen sitios del moldeconcretos de pausa de
elongación.
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La RNA polimerasa está organizada en canales
Timón(rudder)
Fauces (jaws)
Canal de salidadel RNA
Centro catalítico
Canal secundario
Dominio solapa(flap domain)
Canal primariocorriente arriba
Canal primariocorriente abajo
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• Modelo más apropiado para estudiosfisico-químicos de la transcripción.
• Enzima monomérica.
• Capaz de llevar a cabo un ciclotranscripción completo en ausencia defactores proteicos adicionales.
• Alta tasa de síntesis de RNA y deespecificidad por el promotor.
• Los análisis estructurales de difracción derayos X revelan una mayor similitud conlas DNA polimerasas.
(Cheetham, 1999)
RNA polimerasa del fago T7
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PausaParada transitoria del complejo de elongación.
Produce la pérdida transitoria de capacidad catalítica.
Estado competente Estado de pausa
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Retroceso (backtracking)La debilidad del heterodúplex fuerza el retroceso del
complejo de elongación
Pausa
Estado competente
Retroceso
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Bloqueo (arrest)
Parada permanente del complejo de elongación transcripcional.Necesita la acción de factores Gre para volver a elongar.
EndonucleasaBloqueo
Gre
NTP PPiGre
Gre
Estado competente Elongación
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Las pausas son intermediarios de isomerización del centrocatalítico
NusG
NusAGre
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¿Qué sentido biológico tienen las pausas?
(i) Señales reguladoras intrínsecas: sincronizan la RNAP con launión de factores de elongación (a la RNAP y al RNAnaciente).
(ii) Sincroniza la traducción y la transcripción bacterianas. Losoperones rrn se transcriben mucho más rápido.
(iii) Facilita que el RNA adopte una correcta estructurasecundaria.
(iv) Requisito previo del bloqueo y la terminación.
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Factores de elongación
Cada factor de elongación actúa sobre la RNAP mediante canales
GreA, GreB, PPi
Mdf
NusA
NusA
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NusA
• Conservado entre eubacterias y arqueas.
• Estimula ciertos tipos de pausa (ej: operones his y trp) y la terminaciónintrínseca.
• En asociación con otros factores Nus, y con las proteínas N y Q del fago λ,estimula la antiterminación. La función antiterminadora de NusA juega unpapel clave en la expresión de los operones rrn.
• Terminación: (a) KH y S1 interaccionan con el canal de salida del RNA,facilitando la aparición de una horquilla de terminación. (b) ...o biendirectamente con el dominio “solapa”, induciendo la pausaalostéricamente.
• Antiterminación: basándose en la proximidad del CTD al RNA de salida,el complejo podría secuestrar el brazo 5’ de la horquilla de pausa.
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NusA
NTD S1 KH1 KH2
Homologíaestructural con laregión 2 de σ. Unióna la RNAP (hélice αarrollada de β’).
Dominios globulares deinteracción con el RNA deS1/KH
• NusA de E.coli tiene dos dominiosadicionales en el C-terminal, AR1 yAR2, encargados de prevenir launión al RNA fuera de la RNAP.
(estructura de NusA de M.tuberculosis)
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Los factores sigma y nusA compiten por el sitio de unión a laRNAP
σ
promotor
RNAP σ
terminadorNusA
nut
nut RNAPNusA
RNAP
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GreA y GreB
• Todas las RNAP oligoméricas conservan actividad endonucleasaintrínseca. Los factores GreA y GreB estimulan esta función para salir delestado de bloqueo. En eucariotas, la proteína correspondiente es TFIIS.
• Según algunos autores, participa en la fidelidad transcripcional(proofreading), y facilita la transición del complejo de iniciación al deelongación.
• Los mutantes defectivos tanto de Gre como de TFIIS apenas tienenafectado su crecimiento: es probable una redundancia de factoresimplicados en esta función o que éste actúe sólo bajo ciertas condicionesde estrés.
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GreA y GreB
GreA de E. coli
•Familia Gre: ~160 aas, muy conservadaen dos dominios.
•El dominio N-terminal (Gre-NTD)consistente en un dímero de hélices aarrolladas. Aporta la estimulación de laactividad endonucleasa y la unión alRNA, tal y como indica la distribución decargas superficial.
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GreA y GreB
El domino C-terminal (Gre-CTD) globular se une la RNAP por la proximidaddel canal secundario.
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GreA y GreB
TFIIS interaccionando con la RNAP II
[Kettenberger H et al. Cell 114, 347-357(2003)]
El canal secundario es el únicodesocupado en el CET,proporcionando un paso directohacia el centro catalítico para losfactores reguladores.
Gre-NTD se introduce en el canalsecundario de la RNAP, colocandodos residuos ácidos invariantes muycerca del centro catalítico.
Ensayos de huella detalladossugieren que Gre afectaalostéricamente a varias regiones,estabilizando la conformaciónretrasada y así facilitando elmecanismo de hidrólisis.
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GreA y GreB
Conaway RC et al. Cell. 2003 Aug 8;114(3):272-4.
El modo de acción de TFIIS es completamenteanálogo. Los residuos ácidos invariantes se localizanen el extremo del lazo de zinc del C-terminal.
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Mfd(TRCF: factor acoplador de la transcripción y la reparación)
Homología conUvrB Unión al DNA ATPasa TRG
Homología conRecG
Hidroliza ATP y se transloca. Su velocidad de translocación lleva a pensar
que sólo interacciona con RNAP bloqueadas.
La hidrólisis de un ATP produce un cambio conformacional crítico que lleva a
establecer nuevos contactos con el DNA. Si esto se produce unido a la
RNAP, impulsa su avance.
Ante un “obstáculo” importante, Mfd aborta la transcripción.
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Modelos de transcripción
Huellas observadas en DNA y RNA de CET parados:ruptura con el modelo monótono de transcripción. La RNAP avanza
comprimiéndose y relajándose como si fuese una “oruga”.
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Modelos de transcripción
• El modelo de transcripción “de gusano” (inchworm model; Chamberlin,1995) fue replantado a finales de los años 1990, ya que estaba basadoúnicamente en CET parados. Hoy se sabe que la distancia entre el centrocatalítico y el frente de la RNAP es constante.
• Modelo de “abrazadera deslizante” (sliding clamp model; Reeder & Hawley,1996): es rígida y puede “deslizarse” hacia atrás debido a la debilidad delheterodúplex. El deslizamiento hacia delante y atrás podría esplicar la reduccióndel número de pb digeridas. ¿Replisoma? ¿Flexibilidad?
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Técnicas de estudio de la procesividad de la RNApolimerasa
• Ensayos de huella dactilar.
• Difracción de rayos X.
• Ensayos de entrecruzamiento ácido nucleico-proteína.
• Transcripción en fase sólida (paseo de la RNA polimerasa).
• Análisis de moléculas individuales mediante la trampa óptica.
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Pulso de luz UV
Nucleasas
Bromurocianógeno.MAPEAR.
ProteínaÁcido nucleico
Experimento de entrecruzamiento (crosslinking assays)
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Técnica del paseo de la RNAP
RNAP
PoliHis
mRNADNA
Sustrato de agarosa con Ni2+
conjugado
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Técnica del paseo de la RNAP
Vamos añadiendo grupos de NTP alternando con lavados hasta llegar a laposición deseada...
ATCGAGAGGG10ACACGGCGAA20TAGCCAT27GCC30AAT
AUC GAGAGGGACACGGCGAA20
AUC GAGAGGGACACGGCGAA20UAG
AUC GAGAGGGACACGGCGAA20UAG CCAU27
(ATP, GTP, CTP)
(ATP, GTP, UTP)
(ATP, CTP, UTP)
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Técnica del paseo de la RNAPSi la posición deseada está lejos del promotor, lo mejor es añadir una proteína
“obstáculo” (roadblock) y dejar elongar con los cuatro NTP...
...AATCG111TAGTTGACTAGAATGAATTCGCGT135CAEcoQ111
AUC AGAGGGA10CACGGCGAA20TAGCCAT.....
ATCGAGAGGG10A.................ATGAATTCGCGT135CAEcoQ111
(ATP, CTP, GTP, TTP)
(ATP, GTP, TTP)
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Trampa óptica: análisis de motores biomolecularesindividuales
F=K·L0/Δx
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Los protagonistas...
Evgeny A. Nudler Robert C. Landick
Sergei Borukhov Carlos Bustamante
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