PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO

PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA

ENFERMEDAD DE CHAGAS

Bioq. Natalia PeraltaParasitología y MicologíaFacultad de Química, Bioquímica y Farmacia.Universidad Nacional de San Luis

- Herramientas convencionales aplicadas según la etapa (métodos parasitológicos e inmunológicos). - Reactivos disponibles en el medio.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

La Enfermedad de Chagas es una de las endemias más importantes en nuestro país, siendo uno de los problemas de Salud Pública de mayor distribución en América Latina.

Para su correcto diagnóstico se deben evaluar los datos clínicos, de laboratorio y epidemiológicos.

El laboratorio juega un rol fundamental y muchas veces determinante en el diagnóstico de la infección.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

La enfermedad de Chagas presenta tres etapas clínicas:

a) agudab) indeterminada c) crónica

Debemos tener en cuenta el período ventana que se produce cuando T.cruzi ingresa al organismo, cumple sus primeros ciclos de desarrollo en el hospedador, que abarca entre 7 a 15 días, período después del cual recién se pueden detectar parásitos circulantes y posteriormente anticuerpos contra el parásito.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Por esto es fundamental conocer tres aspectos:

Cuándo realizar un análisis Qué análisis realizar Cuales son los objetivos del análisis

Para evitar la realización de estudios parasitológicos

y/o serológicos en un momento inadecuado, con

la consecuencia de posibles falsos resultados

negativos.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Luego del período de Ventana se presentan parasitemias, las que van disminuyendo a medida que transcurre el tiempo, hasta hacerse mínimas o aleatorias.

ETAPA AGUDA

El diagnóstico de laboratorio debe centrarse en la búsqueda del parásito.

MÉTODOS PARASITOLÓGICOS

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

ETAPAS INDETERMINADA y CRÓNICA

El diagnóstico se realiza mediante la demostración de anticuerpos específicos anti

Trypanosoma cruzi.

MÉTODOS SEROLÓGICOS

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

En nuestro país, el diagnóstico serológico debe efectuarse por dos

reacciones en paralelo, y en caso de discordancia, se debe recurrir a una tercera prueba a

fin de definir el resultado.

ETAPA AGUDA

MÉTODOS

PARASITOLÓGICOS

TOMA DE MUESTRA

MOMENTO DEL CONTAGIO

Deben realizarse al menos DOS pruebas serológicas para Chagas, a los fines de

conocer si el paciente tiene ya una infección previa.

Si la misma es negativa la segunda muestra debe ser obtenida respetando el periodo de ventana desde el inicio de la

posible infección.

ETAPA AGUDA

En esta etapa deben realizarse fundamentalmente los

MÉTODOS PARASITOLÓGICOS, los cuales pueden ser realizados por distintos procedimientos analíticos, dependiendo de la disponibilidad de recurso humano capacitado

y equipamiento en cada laboratorio. La DETECCIÓN DEL PARÁSITO, como en toda enfermedad infecciosa, es el único parámetro

de CERTEZA DIAGNÓSTICA.

MÉTODOS PARASITOLÓGICOS

GOTA FRESCAGOTA GRUESA

TÉCNICA DE CONCENTRACIÓN DE STROUT

MICROSTROUT / MICROMÉTODOHEMOCULTIVO

XENODIAGNÓSTICO

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMETODOS PARASITOLÓGICOS-GOTA FRESCA

Aumentar irrigación

Sensibilidad 50%

10x / 40x

gota de citrato al 2%)

Trypanosoma cruzi

45 minutos

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMÉTODOS PARASITÓLOGICOS-GOTA GRUESA

Sensibilidad 50%

Colocar 1 a 3 gotas Desfibrinar

1-2min

Dejar secar

Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos.Lavar y secar

objetivo de 100x aceite

Trypanosoma cruzi

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMÉTODOS PARASITOLÓGICOS-STROUT

Sensibilidad 95%

5-10 mL

Tº amb

Retracción del coágulo

600 rpm 2 min.

2500 rpm 10 min.

Suero

Sedimento

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

Sobrenadante

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMÉTODOS PARASITOLÓGICOS-MICROMÉTODO /MICROHEMATOCRITO

Sensibilidad 90 a 95%

45 segundos a 5000 rpm

6 a 9 microhematocrito heparinizado

Cerrar extremo con plastilina Cortar

BIOSEGURIDAD

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

La técnica de MICROHEMATOCRITO NO ES RECOMENDABLE

Puede brindar falsos resultados negativos:

Si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados.

Que el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar la presencia del parásito en la interfase, entre la capa de glóbulos blancos y el suero.

Si el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una adecuada adherencia y dificulta la observación.

Por razones de Bioseguridad del operador:

Ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMÉTODOS PARASITOLÓGICOS-NUEVO MICROMÉTODO

Sensibilidad 90 a 95%

1 min a 3000 rpm

1 gota de heparina +

0,5 ml de sangre venosa

Tubo Eppendorf(1,5 ml de capacidad)

Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

Mezclar por inversión

Tomar una gota de la interfase

(capa de glóbulos blancos)

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMÉTODOS PARASITOLÓGICOS-HEMOCULTIVO

Consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.

Existen técnicas estandarizadas con sangre heparinizada, recolectada en condiciones de estricta asepsia, en medio monofásico (Infusión Cerebro Corazón) y bifásico (pico de flauta de

agar sangre).Se incuba a 28ºC y se realizan observaciones microscópicas y

subcultivos periódicos, desde los 7 y hasta un máximo de 60 días.

El método del hemocultivo es de elección por su menor agresividad

para los pacientes, fundamentalmente en la población neonatal, mayor

precocidad de resultados y menor requerimiento en infraestructura.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDAMÉTODOS PARASITOLÓGICOS-XENODIAGNÓSTICO

Consiste en amplificar el nº de parásitos utilizando al vector. Se utilizan ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto

estadio.

Se realiza con la aplicación de 4 cajas con 20 ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20 días de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una banda elástica. Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20 minutos.

Luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60 días. El material se obtiene por compresión de la zona abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un portaobjetos, y se lo diluye con solución fisiológica estéril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con objetivo de 40x , recorriendo aproximadamente 300 campos en guarda griega.

ventajas desventajas

Strout, Microstrout

Resultado precoz Certeza diagnóstica Sencillez operativa Bajo costo

Sensibilidad operador dependiente

Hemocultivo Elevada sensibilidad Certeza diagnóstica Facilidad en la obtención de la muestraBajo costo

Requiere experiencia del operador Contaminaciones

Xenodiagnóstico Gold standard Método cruento Reacciones alérgicas Infraestructura compleja

Enfermedad de Chagas Diagnóstico

parasitológico

En resumen, los métodos parasitológicos clásicos: EXAMEN EN FRESCO, STROUT O MICROSTROUT y

HEMOCULTIVO empleados secuencialmente, permiten detectar el parásito, y consecuentemente efectuar

el diagnóstico de certeza, prácticamente en el 95% de los casos

durante el período agudo.

ETAPA INDETERMINADA Y

CRÓNICA

MÉTODOS SEROLÓGICOS

El concepto básico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parásito y, por lo tanto, sus resultados

nunca proporcionan certeza diagnóstica y deben medirse en

términos de probabilidad.

Para que las probabilidades de éxito en el diagnóstico serológico se acerquen

a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente

El MÉTODO A EMPLEAR, EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA e INTERPRETAR ADECUADAMENTE LOS

RESULTADOS.

MÉTODOS SEROLÓGICOS

- HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI)

- ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent

Assay)

- INMUNOFLUORESCENCIA(IF)

Los métodos actualmente validados son:

Se basa en la propiedad que tienen las proteínas de adsorberse sobre la superficie de glóbulos rojos de carnero o de ave modificada químicamente y actuar como soporte del antígeno.

Si en el suero del paciente existen anticuerpos contra los antígenos del parásito, los glóbulos rojos se aglutinan.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICAMÉTODOS SEROLÓGICOS - HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA

Consiste en placas de poliestireno con antígenos solubles del Trypanosoma cruzi pegados. Sobre cada uno de los reservorios de la placa se coloca suero de pacientes que, si tienen anticuerpos se unen a los antígenos del Tripanosoma.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICAMÉTODOS SEROLÓGICOS - ELISA

Luego se agrega un reactivo constituído por anticuerpo anti inmunoglobulinas humanas marcado con una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y posteriormente, se agrega un sustrato de la enzima que, si en la fase sólida se encuentra el doble complejo antígeno- anticuerpo del paciente- anticuerpo marcado, desarrolla un color cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpos del paciente y a la afinidad de los mismos.

Tiene un fundamento similar al método de ELISA, con algunas diferencias importantes. La primera es que el antígeno es particulado (el parásito entero fijado con formaldehído o glutaraldehído). La segunda diferencia radica en que el segundo anticuerpo está marcado con una sustancia fluorescente, ususalmente isotiocianato de fluoresceína y, por último, la lectura se realiza en un microscopio equipado con luz UV.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICAMÉTODOS SEROLÓGICOS - INMUNOFLUORESCENCIA

Los parámetros para determinar la confiabilidad de un método son:

- Sensibilidad (S)

- Especificidad (E)

- Valor predictivo (VP)

S: capacidad de un método de dar resultado (+) en presencia de infección.

E: capacidad de un método de dar resultado (-) en ausencia de infección.

VP: probabilidad que un individuo con resultado (+) esté realmente

infectado (VP+) o de que un individuo con resultado (-) sea realmente no

infectado (VP-).

Las dos primeras son intrínsecas del método, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infección. Así, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es más alto que en una zona no endémica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor).

Como ningún método tiene 100% de E, las pautas para diagnóstico de la infección chagásica (Manual para la atención del

paciente infectado con Trypanosoma cruzi. Ministerio de Salud de la Nación. 2005)

determinan que, para que un individuo sea considerado chagásico, deben dar positivos

al menos dos métodos serológicos diferentes:

ELISA + HAI ELISA + IF HAI + IF

Actualmente, la reacción más sensible es ELISA que, por otra

parte, si se cuenta con un espectrofotómetro de lectura

vertical (lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad.

Permite procesar elevado número de muestras.

La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulación del nivel

de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y también es adecuada para procesamiento de

elevado número de muestras.

Respecto a la IF, sin dudas se trata de una buena metodología, pero

requiere experiencia del operador y depende de la subjetividad del

mismo. Por otra parte, el equipamiento requerido no está al alcance de

pequeños laboratorios y no es una técnica adecuada para procesar elevado número de muestras.

EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS

DOS PRUEBAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD

DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA

DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL.