PROCEDIMIENTO OPERATIVO

ELISA COMPETITIVO

1.Preparar Pocillos (sensibilizados con Ac específicos anti T4) y

numerarlos 1 para Blanco + 5 para Patrones + 1S.Control +1 Muestra =

8 POCILLOS

Los anticuerpos fijados servirán para que se unan los antígenos T4 a ellos

2. Pipetear 10 uL de cada Patrón, S. Control y muestras en los tubos correspondientes ( Ag no

marcados)

3. Añadir 200 uL de conjugado de enzima (Ag + peroxidasa

de rábano) excepto para el pocillo blanco ¿por qué?  Para ensayar:

diferentes concentraciones de antígeno cantidad fija de antígeno marcado

4. Cubrir el microteeter con hoja adhesiva y mezclar

delicadamente

5. Incubar los pocillos durante 80 minutos a 37º+-2ºC.

Los Ag marcados – competirán – Ag no marcados para unirse a los anticuerpos fijados a los pocillos

 

6. Quitar la hoja adhesiva

7. Lavar los tubos 4 veces con 350 uL de Solución limpiadora diluida y volcar

Así conseguimos la eliminación de exceso de antígeno (no unidos a Ac)

 

8. Pipetear 200 uL de solución sustrato-cromogen  (Igual cantidad que Ag conjugado)

Dicha reacción no se da en el blanco porque no contiene conjugado enzimático 

Sustrato reacciona con el enzima que marca al antígeno dando una reacción coloreada

9. Incubar durante 15 minutos a 37ºC+-2, evitar la

exposición directa a la luz (cubrir con papel de aluminio)

10. Pipetear 100 uL de Reactivo Bloqueante en todos los pocillos.

 

9.Leer la absorbancia con un espectofotómetro a 450 nm

12.Hacer gráfica para hallar resultados (transparencia)eje X las concentraciones en eje Y las absorbancias

Calibrar el espectofotómetro

con el blanco

Después se leen las absorbancias de menor a mayor concentración de las muestras

12.Cálculo de resultados Una vez realizada la recta:

extrapolar el valor de la concentración de muestra y control a la curva

a partir de las absorbancias que si las conocemos. 

NOTA: Antes de proceder al cálculo de resultado:asegurarse de que la concentración del suero control está incluida en el

valor descrito en la Hoja de Control de Calidad.