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Métodos de Estudio enMétodos de Estudio enBiología CelularBiología Celular

1. Introducción

• Métodos de estudio

2. Tipos de estudios

• Estudios “in vivo”

• Estudios “in vitro”

3. Técnicas de estudio

• De base preferentementemicroscópica

• De base preferentemente NOmicroscopica

Problema:Diabetes

¿Que hacer????

Tipos de estudio:Tipos de estudio:

-- Estudios Estudios ““in vivoin vivo””-- Estudios Estudios ““in in vitrovitro”” (aislamiento y (aislamiento y

crecimiento de células en cultivo)crecimiento de células en cultivo)

* Estudios sobre material fijado* Estudios sobre material fijado

Métodos Métodos ““en vivoen vivo””

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Métodos Métodos ““en vivoen vivo””

Transfección con la construcciónde selección

+ HigromicinaClonesClonesresistentes aresistentes aHigromicinaHigromicina

+ NeomicinaSelección de célulasSelección de célulasque expresen marcadores que expresen marcadores de fotorreceptoresde fotorreceptores

D3D3

Diferenciación In vitro

Soria et al (2000)Diabetes 49: 157-162

PromotorConstitutivo

Higror

NeoPromotor

Rodopsinar

Maduración

3

CÉLULAS D3 INDIFERENCIADAS CUERPOS EMBRIONARIOS DE 2 DÍAS EN DIFERENCIACIÓN ESPONTÁNEA

DIFERENCIACIÓN CON MEDIOS NEURONALES DE CUERPOS EMBRIONARIOS EXPANDIDOS EN MONOCAPA

Peripherin 1 (mouse)

E 9

.5

E 1

1.5

E 1

3.5

E 1

5.5

P3 P7

AD

ULT

E 1

8.5

P1

P5 P10

C-

E 1

0.5

E 1

6.5

E 1

2.5

E 1

4.5

Peripherin 1 (EB´s ES-D3/13)

Indi

f.

3 da

ys

5 da

ys

7 da

ys

9 da

ys

11 d

ays

13 d

ays

15 d

ays

17 d

ays

19 d

ays

21 d

ays

25 d

ays

30 d

ays

C

-

IRBP (mouse)

E 9

.5

E 1

1.5

E 1

3.5

E 1

5.5

P3

P7 AD

ULT

E 1

8.5

E 1

0.5

E 1

6.5

P1

P5

E 1

2.5

E 1

4.5

P10 C-

IRBP (EB’s ES-D3/13)

Indi

f.

3 da

ys

5 da

ys

7 da

ys

9 da

ys

11 d

ays

13 d

ays

15 d

ays

17 d

ays

19 d

ays

21 d

ays

25 d

ays

30 d

ays

C

-

4

EB’s D3

Monocapa (2 días)

ATRA/9-cis RA (5 días)

AMES (2 días)

Neurofilamento 200 (verde) ynúcleos celulares Hoechst(azul) en cuerpos embrionariosde 26 días

SeleccionadorSeleccionadorde célulasde células

activado poractivado porfluorescenciafluorescencia

Estudios Estudios ““en frescoen fresco””

• Estudios Vitales y Estudios Vitales y SupravitalesSupravitales

•• Cúltivo Cúltivo de células y órganosde células y órganos ExplantesExplantes

Cultivos PrimariosCultivos Primarios

Cultivos Secundarios Cultivos Secundarios

Tipos de estudio:Tipos de estudio:

-- Estudios Estudios ““in vivoin vivo””-- Estudios Estudios ““in in vitrovitro”” (aislamiento y (aislamiento y

crecimiento de células en cultivo)crecimiento de células en cultivo)-- Estudios sobre material fijadoEstudios sobre material fijado

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ORGANISMO

MATERIAL DE ESTUDIO

Fijado Cultivo “In Vivo”

Inclusión

Corte

Tinción

Montaje

OBSERVACIÓN

Congelación

Fijación

Fresco

Estudios sobre material fijadoEstudios sobre material fijado

1.1.FijaciónFijación2.2. InclusiónInclusión3.3.CorteCorte4.4.TinciónTinción

Estudios sobre material fijado: FIJACIONEstudios sobre material fijado: FIJACION

• Detener la dinámica funcional y los procesosenzimáticos para evitar los procesos de autolisis...

• Hacer “estática” la estructura del organismo

• Preservar los componentes tisulares

• Modificar la reactividad de los tejidos frente adiferentes agentes

• Facilitar la difusión a través de las membranas (o lafijación) de determinados compuestos

Objetivos:Objetivos: •• Por deshidratación: Alcohol, acetona..Por deshidratación: Alcohol, acetona..

•• Por fijación de sales: Cloruro de mercurio,Por fijación de sales: Cloruro de mercurio,dicromato dicromato potásico, acetato de potásico, acetato de uranilouranilo, ácido, ácidopícrico,...pícrico,...

•• Por cambios del estado coloidal: Acido acético,Por cambios del estado coloidal: Acido acético,ácido crómico,..ácido crómico,..

•• Por Por reticularizaciónreticularización: Formol, : Formol, paraformaldehidoparaformaldehido,,glutaraldehidoglutaraldehido, Osmio..., Osmio...

•• MezclasMezclas

Mecanismos de actuación de los fijadores:Mecanismos de actuación de los fijadores:

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Estudios sobre material fijadoEstudios sobre material fijadoTécnicas de estudio:Técnicas de estudio:

1. De base preferentemente microscópica2. De base preferentemente no

micróscopica• Separación y cultivo celular• Fraccionamiento de componentes celulares• Estudio de las condiciones químicas

intracelulares• Técnicas de DNA recombinante

Microscopio ÓpticoMicroscopio Óptico Microscopio ÓpticoMicroscopio Óptico

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InmunocitoquímicaInmunocitoquímica

8

Microscopio de FluorescenciaMicroscopio de Fluorescencia

Anticuerpos frenteAnticuerpos frentea Colágeno IVa Colágeno IV

Electrodo Electrodo IntracorticalIntracortical

Procesamiento ExternoProcesamiento Externo

Acute Experiments: HistologyAcute Experiments: Histology

9

Acute ExperimentsAcute Experiments: : Early Early responseresponse

**

GFAPGFAPNEUNNEUN

Chronic ExperimentsChronic Experiments Proliferation of reactive astrocytes (GFAP stain)

**

**

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Microscopio ÓpticoMicroscopio Óptico Microscopio ÓpticoMicroscopio Óptico

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Ampliando los límites de detecciónAmpliando los límites de detección

Contraste de fasesContraste de fasesinterferencial interferencial ++Análisis de imagenAnálisis de imagen

AutoradiografíaAutoradiografía::Incorporación de Incorporación de ProlinaProlinatritiada tritiada a nivel de laa nivel de lamembrana basalmembrana basal

Microscopio Microscopio ConfocalConfocal

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Microscopio deMicroscopio defluorescenciafluorescencia

MicroscopioMicroscopioConfocalConfocal

ReconstrucciónReconstruccióntridimensional atridimensional apartir de imágenespartir de imágenesde de microscopíamicroscopíaConfocalConfocal

ReconstrucciónReconstruccióntridimensionaltridimensionala partir dea partir deseccionesseccionesseriadasseriadas

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Microscopio Electrónico TransmisiónMicroscopio Electrónico Transmisión MicroscopíaMicroscopía Electrónica: Sombreado Electrónica: Sombreado

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MicroscopíaMicroscopía Electrónica: Sombreado Electrónica: SombreadoMicroscopíaMicroscopía Electrónica: Electrónica: CriofracturaCriofractura

MicroscopíaMicroscopíaElectrónica:Electrónica:CriofracturaCriofractura

MicroscopíaMicroscopía Electrónica: Electrónica: CriofracturaCriofractura

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CriotécnicasCriotécnicas

TinciónTinciónnegativanegativa

Reconstrucción tridimensional aReconstrucción tridimensional apartir de imágenes de Microscopiapartir de imágenes de MicroscopiaElectrónicaElectrónica

Autoradiografía Autoradiografía al Microscopioal MicroscopioElectrónicoElectrónico

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Microscopia de BarridoMicroscopia de Barrido

Microscopia DICMicroscopia DICde alta resoluciónde alta resolución

M. E. TransmisiónM. E. Transmisión

Proliferation of microglia and macrophages

GSI-B4GSI-B4

CD 68CD 68

150150

100100

5050

0055 1010 1515

cpscps AA

33

22

11

00

44

55 1010 1515

BB

MicroanalysisMicroanalysis

22

11

0055 1010 1515

CC

EnergyEnergy ( (KeVKeV))

Técnicas de estudio:Técnicas de estudio:

1. De base preferentemente microscópica2. De base preferentemente no

micróscopica• Separación y cultivo celular• Fraccionamiento de componentes celulares• Estudio de las condiciones químicas

intracelulares• Técnicas de DNA recombinante

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Fraccionamiento de las células yFraccionamiento de las células yanálisis de sus moléculas.análisis de sus moléculas.

De De DuveDuve, Premio , Premio Nobel Nobel 19741974

Fraccionamiento de las células yFraccionamiento de las células yanálisis de sus moléculas.análisis de sus moléculas.

•• Homogeneización y Homogeneización y ultracentrifugaciónultracentrifugacióndiferencial.diferencial.

•• Sistemas de células libres. Sistemas de células libres.

•• Técnicas de cromatografía (intercambioTécnicas de cromatografía (intercambioiónico, filtración en iónico, filtración en gelgel, afinidad,...), afinidad,...)

•• Técnicas de electroforesis (SDS-PAGE,Técnicas de electroforesis (SDS-PAGE,Western BlottingWestern Blotting, ...), ...)

•• Cristalografía de Rayos X Cristalografía de Rayos X

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•• Espectroscopia de RMN Espectroscopia de RMN Registro IntracelularRegistro Intracelular

Ganglion cell spike trainsGanglion cell spike trains are are the result of extensivethe result of extensivesignal processingsignal processing in in the retinal networkthe retinal network

Green

Red

Blue

-3.5

-1.5

-0.5

0

0

0

G24G24

105° /285°

15°/195°

135° /315°

Ratecode? Timecode?

Variability

Ambiguity

local versus distributedrepresentation

Individual ganglion cells are unreliable stimulus encoders due toIndividual ganglion cells are unreliable stimulus encoders due toresponse variability and ambiguityresponse variability and ambiguity

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Registro enRegistro en““parcheparche”” de demembranamembrana

Registro enRegistro en““parcheparche”” de membrana de membrana

La proteína luminiscente La proteína luminiscente aecuorinaaecuorinaemite luz en presencia de emite luz en presencia de CaCa++ libre++ libre

VisualizaciónVisualizaciónintracelular de laintracelular de laconcentración deconcentración deCaCa++ utilizando++ utilizandoun indicadorun indicadorfluorescentefluorescente

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Métodos para introducir en una célula una Métodos para introducir en una célula una substanciasubstanciapara la cual la membrana es impermeablepara la cual la membrana es impermeable Visualización de Visualización de microtubulos microtubulos con moléculascon moléculas

de de tubulina tubulina marcadasmarcadas

Tecnología de DNA Tecnología de DNA recombinanterecombinante

•• Secuenciación de Secuenciación de aminoacidosaminoacidos..

•• Clonación y separación DNA. Clonación y separación DNA.

•• Técnicas de hibridación.Técnicas de hibridación.

•• Técnicas de PCR.Técnicas de PCR.

Métodos de Estudio enMétodos de Estudio enBiología CelularBiología Celular

1.1. Observación de la estructura de lasObservación de la estructura de lascélulas con el microscopio.células con el microscopio.

2.2. Aislamiento y crecimiento de células enAislamiento y crecimiento de células encultivo.cultivo.

3.3. Fraccionamiento de las células y análisisFraccionamiento de las células y análisisde sus moléculas.de sus moléculas.

4.4. Fisiología celular.Fisiología celular.

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ORGANISMO

MATERIAL DE ESTUDIO

Fijado Cultivo “In Vivo”

Inclusión

Corte

Tinción

Montaje

OBSERVACIÓN

Congelación

Fijación

Fresco