Principios básicos de Bacteriología Veterinaria

María Elena Cicuta de Gallardo – Profesora Titular – Cátedra de Microbiología (FCV/UNNE )

Esta publicación pretende ser una guía de estudio de la Bacteriología Veterinaria, donde están esbozados algunos principios básicos que, debido a lo cambiante y dinámica de esta Ciencia, lo que hoy es válido mañana tendrá otra concepción. Es natural que ello ocurra porque está demostrando el avance del conocimiento en el tiempo que a veces es demasiado rápido para asimilarlo. Con las veloces formas de comunicación existentes es un desafío muy grande saber seleccionar contenidos esenciales por lo que fue mi meta sentar las bases de esta interesante rama de la Biología para una mejor comprensión.

INDICE

Página

Esbozo histórico 2 Morfología bacteriana 9 Metabolismo bacteriano 19 Ecología microbiana 25 Toxinas bacterianas 28 Acción de agentes físicos y químicos 31 División bacteriana 37 Genética bacteriana 41 Clasificación bacteriana 47 Biología molecular 52 Antibióticos 61

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Esbozo Histórico La Microbiología es la ciencia que estudia organismos demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. Si un objeto tiene un diámetro < o = 0,1 mm, el ojo humano no lo puede percibir en absoluto y aprecia muy poco detalle de uno de 1 mm. Por consiguiente, los organismos con un diámetro de 1 mm o < son microorganismos y caen dentro del amplio dominio de la Microbiología. Esta Ciencia se divide en: Protozoología: estudia los protozoarios

Ficología: estudia las algas Micología: estudia los hongos Bacteriología: estudia las bacterias Virología: estudia los virus

En la actualidad se deben agregar los nuevos agentes o priones, considerados ‘proteínas infecciosas’ responsables de las encefalitis espongiformes en el hombre y animales. La existencia exacta de este mundo microbiano fue desconocida por el hombre hasta la invención de los microscopios. Los primeros fueron simples, con una sola lente de distancia focal muy corta y, por consiguiente, capaz de una gran amplificación. Luego vinieron los compuestos con doble sistema de lentes (objetivo y ocular) que desplazó al simple. Sin embargo, casi todos los grandes avances fueron hechos con microscopios simples. El descubrimiento del mundo microbiano fue realizado por un comerciante holandés, Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) aficionado en pulir lentes. No asistió a la Universidad pero eso no fue inconveniente para la gran obra de su vida. Los microscopios de Leeuwenhoek se parecen poco a los actuales. Consistían en dos placas metálicas con una lente en el medio capaz de alcanzar los 300 aumentos (1/3 del microscopio óptico compuesto). Con ellos hizo magníficas descripciones de la estructura de semillas, embriones de plantas, espermatozoides, glóbulos rojos (completó la obra de circulación capilar de Harvey) y ‘animáculos’ que observó en la saliva, vinagre y agua. Fueron descriptos con tal precisión que aún hoy es posible identificar las especies. Hizo especial hincapié en la abundancia diciendo que “en una gota de saliva hay más animáculos que hombres en todo un reino”. Comunicó sus hallazgos a la Sociedad Real de Londres. Leeuwenhoek, sus microscopios y dibujos de los microorganismos observados. Fuente: Pelczar, Reid & Chan. Microbiología 4ª Ed. Mc Graw Hill, 1982.

Sin embargo, la exploración miocroscópica no progresó hasta un siglo después de la muerte de Leeuwenhoek. Su contemporáneo Robert Hook (1678), trabajando con microscopios compuestos no obtuvo imágenes claras ya que adolecían de graves defectos ópticos.

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Después que reveló el gran número de criaturas microscópicas presentes en la Naturaleza, los científicos comenzaron a preguntarse el origen de estas formas de vida. Existían dos corrientes: una, la abiogénesis o generación espontánea, apoyada desde la antigüedad por la autoridad de Aristóteles (384 – 322 AC), sostenía la generación de vida a partir de sustancias inertes. Es así que Sansón en el Antiguo Testamento aseguraba la creación de abejas a partir de la miel; en 1650 Van Helmont generaba ratones a partir de basura y granos en fermentación. Esta teoría se oponía a la biogénesis apoyada por Hipócrates en el año 400 AC, considerado el Padre de la Medicina que separó la medicina de la teología y mitología, sostenía que había ‘miasmas’ en el aire que producían el contagio. Clasificó las enfermedades en endémicas o propias de una región como la tuberculosis, cólera, chagas, y epidémicas, de aparición repentina, con un gran número de enfermos y luego desaparece (influenza o gripe humana y equina). Frascastorius (1484-1553) de Verona (Italia) creía en la presencia de ‘seminaria morbi que contagiaban por contacto directo, por fomites (objetos, animales o personas) o ‘ad distans’, por el aire. En 1665 el médico italiano Francesco Redi hizo una simple demostración que acabó temporalmente con el mito de la generación espontánea. Colocó un trozo de carne en una vasija de barro y la cubrió con una capa de gasa. Las moscas atraídas por el olor, depositaban sus huevos en la misma, mostrando que los gusanos o larvan no se generaban de la carne. El mismo Leeuwenhoek sostenía que los animáculos provenían de semillas o gérmenes que flotan en el aire. Un monje naturalista italiano, Lázaro Spallanzani (1729-1799) calentó infusiones de carne en vasijas cerradas herméticamente evitando la aparición de microorganismos. Needham no obtuvo los mismos resultados al no seguir las reglas estrictamente. A comienzos del Siglo XIX un cocinero francés François Appert aplicó esas prácticas para conservar alimentos perecederos en latas cerradas herméticamente y calentadas. Por ello recibió un premio de Napoleón, ya que solucionaba la alimentación de soldados en sus largas travesías. El proceso se conoce como ‘appertización’. A fines del Siglo XVIII tres grandes químicos de la época: Priestley, Cavendish y Lavoisier establecieron la base química de los gases. Uno de los primeros descubiertos fue el oxígeno que se pensó era esencial para la vida, por lo que se creyó que el cierre hermético impedía la proliferación de microorganismos al suprimirlo. Sin embargo, Cagniard-Latour y Schwann en 1837 y Schroeder y von Dusch en 1854, demostraron que ni el crecimiento ni la descomposición tienen lugar en infusiones calentadas en contacto con el aire si éste previamente se lo calentaba o pasaba a través de soluciones ácidas o alcalinas o a través de filtros de algodón, cuyo uso se extiende hasta el presente a través de los tapones de los tubos de ensayo.

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En el Siglo XIX se comenzó a estudiar la relación causal entre la aparición y desarrollo de microorganismos en infusiones y los cambios químicos o descomposición que se producía. El gran pionero fue un avezado químico francés: Luis Pasteur (1822-1895). Pero para la aceptación de este concepto primero tenía que desterrar la teoría de la generación espontánea. Irritado Pasteur por la experimentación defectuosa que llevó adelante esta teoría errónea, preparó matraces con cuellos de ‘cisne’ o en U. El aire entraba y salía libremente de ellos, pero era calentado en su trayecto, por lo que las infusiones que contenía no se contaminaban. Pasteur comunicó estos hallazgos en 1864 a la Universidad de la Sorbona diciendo con gran jactancia: …‘los he preservado de la única cosa que está por encima del poder del hombre, que es crear, los he preservado de los gérmenes que flotan en el aire, los he preservado de la vida… No se conoce hoy ningún caso en el que podáis afirmar que los seres microscópicos vienen al mundo sin gérmenes, sin padres semejantes a ellos… Quienen sostienen esto han sido juego de ilusiones, de experimentos defectuosos, viciados de errores que no han sido capaces de advertir ni han sabido evitar!’. Un físico inglés John Tyndall (1820-1893) contemporáneo de Pasteur y gran defensor de su obra, demostró con una cámara con aire desprovisto de partículas de polvo (ópticamente vacío) que las infusiones contenidas en tubos tampoco se contaminaban. Sin embargo, infusiones de pasto seco no se esterilizaban ni aún después de 5 horas de ebullición. Fue un botánico alemán, Ferdinand Kohn quien demostró que algunas bacterias producían elementos termorresistentes (esporos) visibles al microscopio. Cómo hacer para eliminar estos elementos? Tyndall ideó aplicar calor discontinuo (tindalización) es decir: hervía durante sólo 1 minuto pero 5 veces para eliminar todas las formas vegetativas termolábiles, esperaba 24 horas para que los esporos resistentes germinen a forma vegetativa de manera que con aplicación nuevamente de calor eran destruidas y así conseguía esterilizar dichas infusiones.

A- Esterilización del aire por calor de Cagniard-Latour y Schwann, B- Esterilización del aire por filtro de algodón de Schroeder y von Dusch C- Matraz en cuello de cisne de Pasteur, D- Cámara de Tyndall.

Fuente: Pelczar, Reid & Chan. Microbiología 4ª ed. Mc Graw Hill, 1982.

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Cambios químicos: Fermentación es el proceso de degradación de hidratos de carbono que da formación de alcoholes o ácidos orgánicos. Putrefacción: es el proceso degradativo de sustancias ricas en proteínas (carne, leche, huevos) que da como resultado productos de mal olor. Los químicos del siglo XIX sostenían que tanto la fermentación como la putrefacción eran procesos puramente químicos, no eran realizados por organismos vivos. Fue Pasteur, químico experimentado, quien demostró que los procesos fermentativos son resultado de la actividad microbiana. Las destilerías de Lille (Francia) que producían alcohol de la remolacha azucarera presentaron problemas con este proceso y lo llamaron a Pasteur. Él observó que los ‘fermentos buenos’ con forma de semilla de melón o zapallo (levaduras) que llevaban a cabo la fermentación alcohólica, habían sido reemplazados por bastones (lactobacilos) y cocos (estreptococos) ‘fermentos malos’que producían fermentación láctica con ácido láctico como producto final. Cómo destruir los fermentos malos sin dañar los caracteres organolépticos (color, sabor y aroma) del producto? Pasteur ideó calentar a 63ºC durante 30 minutos para destruir la flora indeseable y luego introducir nuevamente los fermentos buenos. A este calentamiento se lo conoce como pasteurización. En la actualidad se elevó la temperatura y se acortaron los tiempos de exposición al calor: 80ºC durante 15” hasta 140ºC durante 1” (ultra alta temperatura o UAT) que se aplica a los alimentos, principalmentederivados lácteos para no dañar su valor nutritivo. Descubrimiento de la vida anaerobia: Al examinar al microscopio líquidos de fermentación butírica Pasteur observó que organismos móviles perdían su motilidad en los bordes del cubreobjetos. También comprobó que corrientes de aire retrasaban la fermentación. Existía una microbiota (anaerobios) para la cual el oxígeno era letal, era ‘la vida sin aire’. Fue Pasteur quien demostró la relación causal de bacterias con enfermedad. Ideó cuatro métodos de inmunización (del Latín inmunis= libre de pagar im puestos). En 1796 un médico rural Edward Jenner (1749-1823) ideó la vacuna contra la terrible viruela observando que las ordeñadoras sufrían una enfermedad leve (nódulos benignos), a pesar de vivir en un ambiente con la enfermedad. 1º Método: Envejecimiento de cultivo: Para demostrar que había aislado el agente causal del cólera aviar (luego denominado Pasteurella multocida en su honor) lo inoculó a una serie de gallinas esperando que enfermen. Para su sorpresa las gallinas permanecían muy saludables. Al examinar qué había pasado descubrió que había tomado un cultivo de 8 semanas, que es considerado ‘viejo’ dado que las bacterias se reproducen cada 20’. Entonces tomó un cultivo nuevo virulento e inoculó al lote de gallinas anterior y a otro que no había recibido la 1ª dosis. Este último enfermó mientras que el primero se mantuvo protegido o inmune.

Vacuna contra el cólera aviar de Pasteur. Fuente: Pelczar, Reid & Chan. Microbiología 4ª ed. Mac Graw Hill, 1982.

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2º Método: Cultivo a temperatura disgónica: Si un cultivo lo sometemos a temperaturas no adecuadas (disgónicas), en general mayor a la óptima o eugónica, pierde virulencia pero no antigenicidad o inmunogenicidad. Es lo que ocurre con las aves con respecto al carbunco dado que su temperatura corporal de 42ºC no resulta favorable para Bacillus anthracis.

3º Método: Pasaje a otras especies: Algunas especies como el agente del mal rojo del cerdo (Erysipelothrix rhusiopathiae) pierden virulencia pero n o antigenicidad por pasaje a especies que no son las adecuadas para desarrollar Es lo que ocurre cuando se inocula a conejos y luego nuevamente al cerdo.

4º Método: Desecación: La rabia siempre fue una enfermedad mortal. Pasteur observaba que se la adquiría luego de la mordedura de algún animal rabioso. Inmediatamente asoció la saliva como transmisora del agente causal que ni siquiera lo podía observar al microscopio ya que se trataba de un virus, mucho más pequeño que una bacteria. Al comprobar síntomas nerviosos, inoculó saliva de un perro rabioso en un conejo y, luego de presentar la enfermedad, desecó su cerebro y médula espinal. Mezcló con glicerina e inyectó a un joven de 14 años, Joseph Meister, que había sido mordido por un lobo rabioso, consiguiendo salvar su vida. Por este logro y en su honor, todos los laboratorios que trabajan en rabia se denominan Instituto Pasteur, siendo el primero inaugurado en París en 1888.

Primer vacuna antirrábica de Pasteur.Fuente: Pelczar, Reid & Chan. Microbiología 4ª ed. Mc Graw Hill, 1982.

Antisepsia: Con la introducción de la anestesia comenzaron a realizarse todo tipo de

cirugías, pero paralelamente aparececían infecciones o sepsis posquirúrgicas graves que llevaban el paciente a la muerte. Fue Semmelweis en 1840, al observar cómo todos los pacientes de un pabellón se enfermaban de la misma manera que decía: ’hay algo en nuestras manos que contagia!’ En 1864 Joseph Lister idea operar en medio de vapores de fenol lo que detuvo bastante estas terribles infecciones adquiridas.

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Postulados de Koch: En 1863 Raye y Davaine asociaron bastones con carbunco. Un médico rural alemán, Robert Koch (1843-1910) discípulo de Henle, comprobó la presencia invariable de bacilos en la sangre de animales muertos por carbunco. En 1876 inoculó esta sangre infectada a ovejas para reproducir la enfermedad y luego de numerosas observaciones, incluso fue invitado al África, estableció sus postulados que permanecen vigentes hasta el presente: 1º) El microorganismo debe estar presente en todo caso de enfermedad. 2º) Se debe aislar en cultivo puro del animal enfermo. 3º) Se debe reproducir la enfermedad por inoculación en otro animal. 4º) Debe recuperarse el microorganismo de este animal. También estableció la especificidad biológica: sólo una clase de organismo produce determinada enfermedad. En 1882 logró aislar el bacilo de la tuberculosis por lo que se lo conoce como bacilo de Koch. Son numerosas las personas que escapan a esta síntesis y han contribuido al desarrollo de la Microbiología, arriesgando en muchos casos hasta su propia vida. Es en honor a ellos que se debe valorar su obra y rendirles un merecido tributo en reconocimiento a sus loables estudios que han permitido el avance de esta Ciencia. Aplicaciones de la Microbiología: Existen numerosas y útiles aplicaciones de esta Ciencia que se pueden dividir en: Microbiología del suelo o agrícola: Estudia la gran diversidad de microorganismos que mejoran la fertilidad del suelo convirtieno (fijando) el nitrógeno atmosférico en sales nitrogenadas que utilizan las plantas para la síntesis de proteínas (Azotobacter o Beijerinckia). Además transforman la sustancia orgánica (vegetales y animales muertos) en compuestos inorgánicos que sirven de nutrientes para las plantas. Participan muchas clases de microorganismos. Una ha de suelo fértil contiene 1.250 kg de bacterias, + cantidades similares de hongos, protozoarios y algas. A > cantidad de microorganismos > fertilidad. Microbiología de los alimentos: Son muchos los tipos de microorganismos que se emplean en la industria alimenticia para obtener los diferentes sabores y gustos. Se utilizan para elaborar pan, derivados cárneos (embutidos), lácteos (yogur, quesos, manteca) y numerosos productos.,

Los microorganismos que contaminan alimentos pueden ser saprófitos que causan alteraciones químicas de los caracteres organolépticos (color – sabor – aroma) o patógenos que originan infecciones, toxiinfecciones o intoxicaciones. Por eso es tan importante la manipulación higiénica de los mismos, mantenerlos a bajas temperaturas para frenar el desarrollo microbiano, deshidratarlos, alterar la presión osmótica ya sea con sal (salmuera) o azúcar (jaleas, mermeladas) o en ácidos orgánicos (láctico, cítrico, acético o vinagre).

En grandes tanques de fermentación, con medios de cultivo de bajo costo, se obtienen bebidas alcohólicas (vinos, cervezas), antibióticos, enzimas, vitaminas. Microbiología del agua: El agua es el medio ideal para la supervivencia de algunos microorganismos patógenos como los causantes de infecciones intestinales, disentería, cólera, leptospirosis y virus como el de la hepatitis y polio. El agua para que pueda ser bebida debe ser potable, es decir tratada para que sea segura y libre de indicadores de contaminación fecal, para lo cual se realizan controles químicos y bacteriológicos. Los microorganismos degradan la materia orgánica, con en ella a los gérmenes patógenos siendo inocuos para peces y otras formas de vida acuática. En general se recomienda el uso de detergentes biodegradables a nivel doméstico para no alterar la microbiota benéfica y facilitar el tratamiento de aguas residuales..

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Microbiología del aire: Estudia los mecanismos para combatir la polución, por ejemplo, los óxidos corrosivos de azufre de algunos combustibles que contaminan la atmósfera son destruidos por Ferrobacillus ferrooxidans. Control de plagas: El control biológico de plagas cuida el medio ambiente ya que no deja residuos tóxicos en el mismo. Es así que Bacillus thuringiensis al esporular produce cristales de una proteína altamente tóxica para las orugas, la que ha sido industrializada por varios laboratorios (Agritol de Merck; Vectobac de Bayer). Biotecnología: Ha sido una revolución en los últimos años con el advenimiento del ADN recombinante para expandir el potencial de bacterias, virus y hongos como fábricas biológicas. Una de las aplicaciones más fascinantes y prometedoras ha sido la aplicación de la terapia génica, es decir la inserción de un gen faltante o sustitución de uno defectuoso en células humanas, de plantas y animales. Despierta especial interés su uso futuro en enfermedades genéticas como la hemofilia (incapacidad de coagular la sangre), diabetes (concentraciones elevadas de glucosa en sangre), drepanocitosis (hemoglobina anormal). En agricultura se han abierto campos sumamente útiles como el desarrollo de cepas bacterianas genéticamente modificadas para proteger las frutas de las heladas, otorgar a las plantas resistencia a insectos, sequías y enfermedades microbianas. La aplicación de técnicas de biología molecular permite realizar diagnósticos rápidos y precisos del agente patógeno, características de virulencia, sensibilidad antibiótica, origen y extensión del brote. Biorremediación: Es la decontaminación por medio de bacterias nativas del agua y del suelo, de derrames tóxicos, de aceites, como el desastre por petróleo del barco Exxon Valdez en 1989 en las playas de Alaska, que fue superado gracias a la acción de bacterias oxidantes de hidrocarburos a las que se las estimuló con nutrientes, para acelerar su efecto.

Fuente: http://www.battelle.org/environment/exxon-valdez.stm. Microbiología del espacio o Exobiología: Estudia los microorganismos del espacio exterior y transplante de tipos terrestres a otros planetas y vehículos espaciales.

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Guerra biológica o bacteriológica: Es el empleo deliberado de organismos vivos o sus toxinas para causar daño al hombre, animales y plantas. Bibliografía: Gest, H. The discovery of microorganisms revisited. ASM News 70 (6): 269-274 2004. Grimes, D.J. Koch’s postulates. Then and now. Microbe, ASM 1 (5): 223-228 2006. Pelczar, M.J.; Reid, R.D. & Chan, E.C.S. Microbiología, 4ª Ed. Mc Graw Hill, 826 pp. 1982. Stanier, R.Y.; Ingraham, J.L.; Wheelis, M.L. & Painter, P.R. Microbiología, 2ª Ed. Ed. Reverté S.A. 750 pp, 1996. Tortora, G.J., Funke, B.R. & Case, C.L. Introducción a la Microbiología, 9ª Ed. Ed. Méd. Panamericana, 959 pp. 2007. Morfología bacteriana Las bacterias son células procariotas (del griego pro=antes, karion= núcleo o nuez) o sea células con un nucleoide al que le falta la envoltura o membrana nuclear a diferencia de las células eucariotas (del griego eu=normal, karion= núcleo o nuez) que poseen un núcleo verdadero o completo, rodeado por una membrana. Se diferencian además, por no poseer organitos citoplásmicos como mitocondrias, retículo endoplásmico, ni corrientes intracitoplásmicas.

Esquema (a) y corte longitudinal (b) de una bacteria. Fuente: Tórtora et al., Ed. Méd. Panam., 2007

La morfología comprende el tamaño (de 0,2 a 20 μ), forma (cocos, bacilos o espirales), modo de agrupación (diplos, cadenas, tétradas, cubos o fardos, racimos) y estructura.

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División de cocos: (a) en un plano, (b) en dos planos, (c) en tres planos, (d) múltiples planos.

Fuente: Tórtora et al., Ed. Méd. Panam., 2007

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Disposición característica de bacilos. Fuente: Tórtora et al., Ed. Méd. Panam., 2007

Bacterias espiralares. Fuente: Tórtora et al., Ed. Méd. Panam., 2007

Envoltura bacteriana: Sirve para varias funciones: contiene sitios transportadores de nutrientes, sitios receptores de virus bacterianos o bacteriófagos y de bacteriocinas, interactúa con el ambiente y, por consiguiente, con el hospedador, contiene los antígenos (Ag) bacterianos de superficie (Ag K de la cápsula, Ag O somático, Ag H, flagelar). Las bacterias poseen una envoltura

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que consta de: cápsula, membrana externa (sólo en los Gram-), pared celular y membrana citoplásmica. La cápsula es una formación que protege a la bacteria de la fagocitosis y con ello las hace más virulentas al requerir menor número para producir infección. Son de diferente naturaleza: ácido hialurónico (Streptococcus equi, Pasteurella multocida), polisacáridos ácidos (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella spp.), polisacárida + proteína (Yersinia pestis, Bacillus megaterium), polipeptídica (de ácido D-glutámico: B. anthracis). La producción laxa de un polisacárido extracelular como glucocálix se denomina capa mucilaginosa que permite que las bacterias se adhieran sobre distintas superficies como epitelios (respiratorio, digestivo, conjuntiva) así como también a rocas en cursos de agua, raíces de plantas, sistemas de cañerías.

Membrana externa (ME): La poseen sólo los Gram (-). Está compuesta por un lipopolisacárido (LPS), proteína central o porina (que forman canales en la membrana y poseen efecto barrera) y fosfolípido similar al de la membrana citoplásmica. El LPS a su vez posee tres regiones: región I: compuesta por cadenas laterales de oligosacáridos que constituyen el antígeno O (del alemán Ohne Hauch = sin velo), región II: un polisacárido central formado cetodesoxioctanato (KDO) y heptonas región III: fosfoglucolípido o lípido A que es la fracción endotóxica, ya que cuando se libera por lisis celular provoca fiebre, hipotensión, leucopenia y shock endotóxico. Pared celular (PC): Es una estructura semirrígida formada por macromoléculas que le de la forma característica a cada tipo de bacteria. Está constituida por aminoazúcares o polisacáridos aminados (N-acetil-glucosamina = NAG y N-acetil-murámico = NAM) unidos por uniones β 1-4 glucosídicas (que la hace más estable, al igual que los anillos de piranosa) y tetrapéptidos formados por L, D y di aa (L y D-alanina, D-glutámico y meso-diaminopimélico = m-DAP). La secuencia alternada de L y D aa y m-DAP (heteroplímeros) le da mayor resistencia a la estructura, que si fueran homopolímeros. También se la conoce como peptidoglican, glucopéptido, mucopéptido o mureína. Esta estructura es única y propia de las bacterias, soporta altas presiones osmóticas internas de 1 a 3 atm en las Gram (-) y 5 a 10 atm en las Gram (+) que son más reforzadas ya que cuentan con 40 capas. Es el sitio blanco de enzimas: β 1-4 hexosaminidasas como lisozima y muramidasas que actúan en las uniones entre NAG y NAM, amidasas (entre la cadena PS y el tetrapéptido), endopeptidasas (en las uniones peptídicas) y de antibióticos como la penicilina que impide la reticulación transversal de la cadena, quedando restos de ella (esferoplastos). Sin la PC (protoplastos) las células no pueden soportar la intensa presión interna y explotan (lisis celular). Los Gram (+) tienen ácidos teicoicos (del griego teichos = techo) compuestos por un alcohol (glicerol o ribitol) y fosfato. Los Gram (-) constan de una o muy pocas capas de PC, que se dispone en el periplasma o espacio periplasmático muy rico en enzimas degradativas y proteínas de transporte. Las únicas bacterias que no poseen pared celular son los micoplasmas, por eso son muy pleomórficos y su subsistencia depende de la provisión de un medio isotónico con su medio interno. Membrana citoplásmica, citoplasmática o plasmática: Como la mayoría de las membranas biológicas es una bicapa lipídica en la que existen proteínas embebidas. Los fosfolípidos tienen sus extremos hidrofóbicos (ácidos grasos) hacia el interior y los hidrofílicos (fosfato y glicerol) hacia el exterior, expuestos a la fase acuosa. En presencia de agua los fosfolípidos forman una bicapa hermética, lo que permite la autorreparación de las soluciones de continuidad y los desgarros. La viscosidad es comparable con la del aceite y permite que las proteínas se desplacen con libertad para cumplir sus funciones sin que se altere la estructura de membrana. Pueden presentar diversas formas químicas debido a la variación en la composición de los ácidos grasos.

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La membrana plasmática de los eucariontes también contiene esteroles como el colesterol. Debido a la ausencia de esteroles en los procariontes, la membrana es más flexible, con excepción del único género que, al no poseer pared celular (Mycoplasma), posee esteroles a nivel de membrana.

La membrana cumple una importante función al tener permeabilidad selectiva de nutrientes que en su mayoría son transportados a través de ella. Las características hidrofóbicas le permiten funcionar como una barrera impidiendo el paso libre de compuestos polares. Algunas sustancias solubles en la fase lipídica como ácidos grasos, alcoholes y benceno, son capaces de atravesar la barrera libremente. Sin embargo las moléculas cargadas como los ácidos orgánicos, aminoácidos y sales orgánicas, que son hidrofílicas, no pueden atravesar la membrana por lo que deben ser transportadas en forma específica. Los mecanismos de transporte activo permiten a las células acumular solutos en contra de un gradiente de concentración.

Pared celular de Gram (+) y (-). Fuente: Tórtora et al., Ed. Méd. Panam., 2007 Captación y transporte de nutrientes: La cápsula que rodea a varios microorganismos es una matriz débil que permite la difusión de todas las moléculas solubles pero no las partículas coloidales. La pared celular (PC) de los Gram (+) es permeable pero de matriz rígida que permite la difusión de nutrientes solubles. La membrana externa (ME) de los Gram (-) es una barrera para las grandes moléculas. Un tipo de proteína (porinas) forman canales de diámetro suficiente para permitir el paso de moléculas de hasta 800 a 900 D. Es decir que los nutrientes más pequeños como iones, mono y disacáridos, aa, di y tri-

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péptidos pueden difundir fácilmente a través de estos canales. Otras proteínas, presentes en menor número, actuarían como receptores para facilitar el ingreso de moléculas muy grandes para los poros como quelatos de hierro vitamina B12 y productos de degradación de ácidos nucleicos. En el espacio periplásmico situado entre la ME y PC de los Gram (-) existen tres tipos de proteínas:

Enzimas hidrolíticas que tienen como función hidrolizar nutrientes para atravesar la membrana celular (MC) como proteasas, ADN y ARN nucleasas, fosfatasas, fosfodiesterasas y lactamasas o penicilinasas que destruyen el anillo β-lactámico inactivando las penicilinas.

Proteínas fijadoras que ligan específicamente algunos azúcares, aa, sulfato para ayudar al ingreso o traslocación de dichas sustancias.

Proteínas quimiorreceptoras que permiten a los Gram (-) móviles detectar ciertos nutrientes en el medio para dirigirse hacia esas fuentes. Sistemas de transporte o traslocación de membrana: La mayoría de los microorganismos funcionan mejor cuando están rodeados de agua conteniendo iones y nutrientes disueltos; para usarlos deben atravesar la membrana celular (MC) por los siguientes caminos.

a) Difusión pasiva : Es el método más simple de incorporar solutos dentro o fuera de la célula. Permite el libre paso, no requiere energía ni proteína transportadora, pero es muy lento y depende de la concentración del soluto.

b) Difusión facilitada: Utiliza proteínas transportadoras o carriers denominadas permeasas

que se unen específicamente al soluto y facilita el pasaje o traslocación. Sin embargo esta forma es rara en bacterias, el glicerol es el único nutriente conocido que ingresa de esta manera en Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella, Shigella, Pseudomonas, Bacillus y Nocardia.

c) Transporte activo o traslocación de sustrato: Requiere proteína de transporte y energía para

ingresar el nutriente intacto en contra de un gradiente de concentración.

d) Traslocación de grupo: Necesita permeasa y mayor energía ya que ingresa el metabolito fosforilado.

Transporte de membrana. Fuente: Tórtora et al., Ed. Méd. Panam., 2007

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Citoplasma o citosol: Está compuesto en un 80% de agua y contiene proteínas (enzimas) hidratos de carbono, lípidos, iones y numerosos compuestos de bajo peso molecular. Aquí se llevan a cabo las funciones metabólicas,y, a diferencia de las eucariotas, no poseen organitos citoplásmicos como las mitocondrias y aparato de Golgi. Los ribosomas presentes en decenas de millares, le confiere aspecto granuloso, a diferencia de las eucariotas de 80S son de 70S, con dos subunidades de 30S y 50S. Es aquí donde actúan los antibióticos inhibidores de la síntesis proteica como los aminoglucósidos y eritromicina. Existen además inclusiones de reservas que no son constantes ni esenciales. Son derivados del metabolismo celular y aparecen en gran cantidad cuando la bacteria crece en medios ricos en nutrientes y desaparecen cuando es deprivada de los mismos. Son gránulos lipídicos (reserva de energía) como polihidroxibutarato (PHB o ácido β-polihidroxibutírico), gránulos de polifosfato, volutina, metacromáticos o de Babes-Ernst (reserva de ATP, en Corynebacterium diphteriae, Yersinia pestis, Mycobacterium tuberculosis, Spirillum volutans), gránulos polisacáridos con glucógeno o almidón de reserva. Los magnetosomas procariotas que permiten la orientación celular hacia los campos magnéticos terrestres, son organelas membranosas formadas por una proteían y lípido únicos en su composición, similares en tamaño y forma a aquéllos encontrados en el cerebro de abejas, palomas y salmones. Ellos son usados en estos animales para propósitos de navegación, de una manera similar como lo utilizan las bacterias. Los magnetosomas representan organelas procariotas que probablemente han sido transmitidos a eucariotas casi sin modificaciones apreciables.

Las cianobacterias crecen frecuentemente como largas cadenas de células que pueden ser

espirales, bacilares o canutillos y algunas de ellas se diferencian con varios tipos celulares llevando a cabo diferentes funciones fisiológicas en la colonia. Apéndices bacterianos: Algunas bacterias poseen flagelos que les sirven para la movilidad y pilli o fimbrias (sólo las Gram-) para la adherencia a superficies. Los flagelos están constituidos por una proteína flagelina (PM: 30.000-40.000D), similar a la miosina, antigénica (antígeno H = del alemán Hauch = velo), cuya función es huir de zonas desfavorables (reacción de terror) y aproximarse a las más propicias. El movimiento (taxis) ocurre en respuesta a estímulos químicos (quimiotaxis) o luminosos (fototaxis). Los flagelos no son determinantes de patogenicidad dado que existen bacterias sin flagelos (atricas) y por consiguiente inmóviles que son patógenas (Ej.: Brucella, Mycobacterium, Streptococcus, Bacillus anthracis). Constan de tres partes: el filamento axial, el gancho y el cuerpo basal que se fija a los distintos componentes celulares por medio de los anillos de inserción: anillo L (al LPS de la ME de los Gram-), anillo P (a la pared celular), anillo S (de supramembrana) y anillo M (de membrana citoplásmica). De acuerdo con su disposición en la bacteria se denominan: monopolar monotricas (en un extremo, un solo flagelo, ej.: Campylobacter, Vibrio cholerae), monopolar politrica o lofotrica (en un extremo, muchos flagelos, ej.: Pseudomonas), bipolar monotrica (en ambos extremos, un solo flagelo (Ej.: Leptospira, Treponema hyodysenteriae), bipolar politrica o anfitrica (en ambos extremos, muchos flagelos, ej.: Spirillum, Borrelia) y peritrica (en todo el perímetro, ej.: Proteus, Listeria).

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Flagelo bacteriano. Fuente: Brock Biología de los microorganismos, 8ªed. Prentice Hall , 2000.

Diversas bacterias forman estructuras multicelulares con marcadas divisiones de trabajo en tipos celulares diferenciados divergentes. Por ejemplo, colonias de Proteus forman capas de células en “terrazas” sobre el agar, difundiéndose del sitio de inoculación. Estas estructuras se forman cuando células con pocos flagelos (swimmers) se cubren de miles de ellos (swarmers) migrando sobre superficies secas, función que no pueden realizar las primeras.

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Leyenda: Terrazas de P. mirabilis difundiendo sobre la placa de agar. Una colonia originada de una gota que contiene menos de 104 bacterias puede cubrir un diámetro de 9 cm en 12 a 16 horas de incubación a 32°C. Fuente: www.asm.org/microbe Los pilli o fimbrias, propios de los Gram (-), son apéndices más cortos, rectos y menos numerosos que los flagelos, están constituidos por una proteína pilina (PM: 17.000D) tienen función de adhesinas a los tejidos por lo que se denominan factor de colonización ya que de otra manera serían arrastrados por los cilios respiratorios o los movimientos peristálticos intestinales. Corynebacterium renale es uno de los pocos (Gram+) que poseen pilli para adherirse al tracto urinario que infectan.

Flagelos y fimbrias en Salmonella typhi. Fuente: Brock Biología de los microorganismos, 8ªed. Prentice Hall , 2000. Esporulación o esporogénesis: Sólo las bacterias dotadas genéticamente de la capacidad de formar esporas como los géneros Bacillus y Clostridium realizan este proceso que les insume en término medio mucho mayor tiempo (6 horas) que el de la división celular (20 minutos). Se debe a que es un modo de conservación y supervivencia ya que el control negativo que ejercen lso inhibidores de este mecanismo se activan en condiciones desfavorables para la bacteria como falta de nutrientes o medios inhóspitos. Se lleva a cabo en varios estadíos, la resistencia aparece en distintas etapas de su formación:

- 0 la bacteria se halla al final del crecimiento exponencial, existen dos cromosomas en el plano ecuatorial de la bacteria que migran a cada polo, arrastrados por sus respectivos mesosomas,

- 1 se segregan exoenzimas (proteasas) y antibióticos polipeptídicos como polimixina (Bacillus polimyxa), tirotricina (B. brevis), bacylisin (B. subtilis),

- 2 formación del tabique, por invaginación de la membrana celular, - 3 formación de la preespora o protoplasto de la espora, con invaginación de la pared celular

que es esporo específica dado que el glucopéptido posee pocas uniones entrelazadas para favorecer la contracción y pérdida de agua,

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- 4 formación de la corteza con depósito de sales de calcio en forma de dipicolinato de Ca, en este momento el esporo adquiere resistencia térmica y a la desecación,

- 5 formación de la cubierta, capa rica en cisteína, similar a la quitina de insectos, en este momento adquiere resistencia a las radiaciones y agentes químicos (desinfectantes),

- 6 formación del exosporio, lipoproteica, que es la capa más externa que rodea a la endospora,

- 7 liberación por enzimas líticas sintetizadas o activadas después de la maduración. En estas condiciones pueden vivir cientos y miles de años hasta que, llegado el momento propicio, se desencadena la germinación. Ésta consta de tres fases: - activación, que es reversible, se produce por estímulos externos como agitación, que lesiona

el exosporio, - germinación propiamente dicha, ya es irreversible, con la entrada de agua se reanudan los

procesos metabólicos de la célula, y - crecimiento emerge la célula vegetativa.

Esporulación bacteriana. Fuente: Tortora et al., Ed. Méd. Panam., 2007

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Bibliografía: Beveridge, T.J. Visualizing bacterial cell wall and biofilms. Microbe, ASM, 1 (6): 279-294 2006. Rothfield, L.; Taghbalout, A. & Vats, P. Bacteriall cells have cytoeskeletons, too. ASM News, 71 (2): 582 – 586 2005.

Section of resting spore of Bacillus megaterium. (Electron micrograph by C. F. Robinow) Fuente: http://www.accessscience.com/content.aspx?id=068100 Metabolismo bacteriano o Bioenergética

La energía química o potencial de las sustancias alimenticias (carbohidratos, proteínas y lípidos) se encuentran en las uniones covalentes de los átomos de una molécula. Durante la hidrólisis de una unión química (péptido-éster) se liberan 3 kcal/mol, de un enlace de ATP 8 kcal/mol. El metabolismo involucra todas las acciones químicas realizadas por la célula que se dividen en dos categorías:

a) Catabolismo: son las rutas generadoras, degradativas o productoras de energía por procesos oxidativos que producen calor (Reacciones exergónicas)

b) Anabolismo: son las rutas consumidoras de energía o biosintéticas por procesos reductores (Reacciones endergónicas).

Las rutas anabólicas comienzan con los productos intermediarios del catabolismo para sintetizar aminoácidos (aa), ácidos grasos, azúcares, purinas y pirimidinas. Estas moléculas básicas son polimerizadas en compuestos estreucturales como proteínas, lípidos, polisacáridos y ácidos nucleicos.

Todos los seres vivientes, incluidas las bacterias, tienen vías metabólicas similares con un objetivo final común: suministrar ATP.

Fuente de energía Fuente de carbono Microorganismos Luz solar Reducen CO2 y Fotosintéticos o fototrofos acuáticos compuestos orgánicos Cianobacterias Oxidan moléculas Reducen CO2 y Autótrofos o quimiolitotrofos . inorgánicas (Fe, NH3, compuestos orgánicos Llevan a cabo ciclos del N, C, S. NO2, S, H) Compuestos orgánicos Compuestos orgánicos Heterótrofos quimiosintéticos

u organotrofos . Patógenos Bacterias fotosintéticas o fototrofas, cianobacterias, algas verdeazuladas (AVA): Son anerobias estrictas pigmentadas por una porfirina magnésica similar a la clorofila que se denomina bacterioclorofila y está contenida en membranas (cromatóforos o tilacoides similares a

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los cloroplastos vegetales). Son acuáticos de agua dulce o salada, transforman la energía lumínica en química para sintetizar sus cadenas carbonadas. Existen: Tiobacterias purpúreas: Thiorhodaceae, Thiospirillum, Chromatium o Sulfobacterias que reducen CO2 a expensas de SH2. Bacterias purpúreas no sulfúreas: Athiorhodaceae, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas que reducen CO2 a expensas de compuestos orgánicos que actúan como dadores de H2. Tiobacterias verdes: Chlorobacteriaceae, Chlorobium, Chloropseudomonas que reducen CO2 a expensas de SH2. Bacterias autótrofas o quimiolitotrofas: Obtienen su energía por oxidación de sustancias inorgánicas específicas para cada organismo. Nitrosomonas: oxidan NH3 a nitritos. Nitrobacter: oxidan nitritos (NO2) a nitratos (NO3) Thiobacillus thiooxidans: oxida S inorgánico a sulfato. Tiene gran tolerancia a la acidez y sobrevive a pH tan bajos como 0,6 o a concentraciones de 5% de ácido sulfúrico. Tiene un sistema especial de permeasas que lo defiende del ambiente tóxico y lo capacita para vivir en un medio sin competidores. Bacterias hidrogenófilas o Hidrogenomonas: oxidan H2 al igual que Methanobacterium: CO2 + 4 H2 = CH4 (metano=gas de los pantanos) + 2 H2O Ferrobacterium ferrooxidans, Gallionella ferruginea: oxidan sales ferrosas a hidróxido férrico. Las membranas de las bacterias fotosintéticas incluyen cromatóforos diferenciados para la función de fotosíntesis. Los componentes proteicos y lipídicos de los mismos son diferentes de aquéllos de la membrana celular. De una manera similar, las sulfobacterias contienen membranas proteináceas que rodean los gránulos de azufre en el citoplasma, protegiendo la célula de este elemento, mientras que en las Archaea membranas rodeadas de vacuolas de gas sirven como organelas de flotación, al igual que cepas de Cytophaga, Flavobacterium y Bacteroides. La autotrofia como modo de vida microbiana, extraído de Pace, N.R. (1999) Microbial Ecology & Diversity. ASM News 65 (5): 328-333. La autotrofia, fijación de CO2, es la esencia de la productividad primaria. Winogradsky, a través de sus estudios de los organismos oxidantes del sulfuro y Beijerinck, con sus fijadores de N2, identificaron el concepto de autotrofia. Sin embargo nuestro conocimiento es aún muy limitado debido a que estos microorganismos difícilmente crecen In Vitro para su estudio en el laboratorio. Los metabolismos del hierro, hidrógeno y azufre no se conocen muy bien y probablemente contribuyan significativamente a la producción primaria en la corteza terrestre y, tal vez, en algún otro lugar del sistema solar. La autotrofia basada en la fotosíntesis llegó con las bacterias; se cree que los cloroplastos son derivados de una cianobacteria. Heterótrofos quimiosintéticos u organotrofos: Son incapaces de utilizar CO2, como única fuente de C. Requiere moléculas orgánicas (glucosa ) como donadora de e- para obtener energía (~). Incluye a toas las ptógenas del hombre y animales. Han evolucionado con pérdida de enzimas necesarias para sintetizar compuestos celulares que se han vuelto esenciales (parasitismo). Requieren factores de desarrollo. Obtienen su ~ de la glucosa (C6H12O6) mediante tres mecanismos: Fermentación: 2 C3H6O3 + 56 kcal (2 ATP/ mol de glucosa) Respiración aerobia (+ 12 O2) = 6 CO2 + 6 H2O + 686 kcal (36 ATP/ mol de glucosa) Respiración anaerobia (+ 12 NO3)= 12 NO2K + 6 CO2 + 6 H2O + 429 kcal (20 ATP/mol de glucosa)

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La fermentación es el mecanismo menos eficiente en producir ~ ya que la molécula de glucosa no se degrada completamente. En cambio en la respiración la glucosa se degrada completamente, siendo el O2 el aceptor final de e-. En la respiración anaerobia el aceptor final es un compuesto inorgánico diferente del O2, el NO3 en el caso de los anerobios facultativos y SO4 y fumarato en los anaerobios estrictos. El piruvato o ácido pirúvico es el metabolito intermediario de diferentes vías fermentativas: En la fermentación alcohólica llevada a cabo por levaduras (Sacharomyces cerevisae) y bacterias, (Sarcina, Erwinia) se obtiene etanol + CO2. En la fermentación homoláctica (Lactobacillus y Streptococcus) se produce ácido láctico y en la heteroláctica (Leuconostoc) se le suman ácido acético, fórmico, etanol y CO2. En la fermentación ácida mixta de las enterobacterias se obtienen diversos ácidos orgánicos, y 2-3butanediol es característico de Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Bacillus. En la fermentación butírica propia de los anerobios Bacteroides, Fusobacterium y Clostridium se produce ácido butírico, acético, etanol, acetona, isopropanol, H2 y CO2. En la fermentación propiónica de Propionibacterium, Corynebacterium diphteriae, Veillonella y Neisseria, se produce ácido propiónico, acético, succínico y CO2. Todos los nutrientes son degradados a grupos acetilos: los hidratos de carbono por glucólisis (vía Embden-Meyerhoff-Parnas, EMP, de las enterobacterias; pentosa-fosfato, PF, de Lactobacillus, Brucella y Acetobacter o Entner-Doudoroff, ED, de Pseudomonas y Alcaligenes) donde el piruvato es oxidado a acetilo en lugar de ser reducido a ácido; las proteínas por acción de proteasas se degradan a aminoácidos (aa) y por desaminación a acetilo; los lípidos por acción de lipasas dan ácidos grasos y por oxidación acetilos, éstos son transferidos a la coenzima A, que actúa como aceptor transitorio de grupos químicos, dando acetil-CoA. De esta forma ingresa al ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos donde es oxidada originando 8 H+ que son transportados a nivel de membrana (cadena respiratoria) produciendo un gradiente o cascada de protones, cuya ~ genera ATP, mecanismo conocido como fosforilación oxidativa.

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Esquema general de la respiración aerobia. Fuente: De Robertis & De Robertis. Biología Celular y Molecular, Ed. El Ateneo 1981. Fisiología del crecimiento bacteriano: El crecimiento bacteriano depende del suministro de una adecuada fuente de nutrientes que varía con las diferentes especies.Vale la pena recordar que sólo se ha logrado el desarrollo en medios artificiales del 1% de las especies conocidas. Algunas son capaces de crecer en una gran variedad de medios, otras, las parásitas estrictas, son muy exigentes en sus requerimientos. Las unidades químicas estructurales son similares en todos los seres vivos y sus rutas metabólicas también. Las sustancias nutritivas de los medios de cultivo artificiales, si bien no reproducen exactamente el habitat natural, tienen que ser las materias primas para sintetizar unidades químicas estructurales del protoplasma bacteriano. También se le debe dar energía (~) suficiente para polimerizar, mantener equilibrio de membrana, motilidad, dividirse, esporular y otros procesos celulares que requieran ~.

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Requerimientos inorgánicos: Agua: Es el vehículo por el cual los materiales esenciales penetran en la célula y salen los de desecho. Forma parte del 80% del peso celular. Sales inorgánicas: Cumplen tres funciones principales:

1) Mantienen estado coloidal del citoplasma o citosol y presión osmótica. 2) Mantienen equilibrio ácido-básico 3) Forman parte de enzimas o actúan como activadores de reacciones enzimáticas.

Los vestigios o impurezas de los medios de cultivo suelen satisfacer la necesidad inorgánica celular. S: forma parte de los aa cisterna y metionina y de la vitamina tiamina (B1). Puede ser

suministrado en forma de sulfato (inorgánico) o en forma orgánica (aa y/o vitamina). Fe: esencial para funciones de varias enzimas como catalasa, peroxidasa, citocromo. De su

concentración depende la producción de toxina diftérica. P: para almacenamiento y transporte de ~. N: provisto como sales de NH3, aa y nucleótidos. Co: bacterias producen cianocobalamina o vitamina B12. Ca: compuesto de pared celular y esporos bacterianos en forma de dipicolinato de Ca. K y Mg: para el normnal funcionamiento de ribosomas. Mb: para fijación de N y reducción de nitratos. Zn y Mn: para funcionamiento de ciertas enzimas.

Requerimiento de factores de desarrollo: Muchas bacterias heterotrofas u organotrofas no crecen aunque se les suministre una adecuada fuente de C, N y sales minerales. Necesitan, además, factores de desarrollo que son esenciales (vitaminas, aa, purinas u otras sustancias). La mayoría de los mismos son vitaminas del grupo By funcionan como grupos prostéticos o coenzimas de cadenas enzimáticas vitales. Tiamina (B1): Coenzima de carboxilasa y otras enzimas importantes en la decarboxilación de α ceto-ácidos. Riboflavina (B2): parte activa del transportador de e- FAD.

Piridoxal (B6): para reacciones de síntesis y degradación de aa. Ácido nicotínico y su amida NAD: intervienen en deshidrogenación, degradación anaeróbica de hidratos de carbono. Ácido pantoténico: componente de la coenzima A, interviene en reacciones de acetilación. Biotina: fija CO2 en aspartato y, por consiguiente, participa en síntesis de ácidos grasos, desaminación de aa y decarboxilación de ácido acético. Ácido para-amino-benzoico (PABA): componente vitamínico del ácido fólico (ácido pteroil-glutámico) o coenzima F. Cianocobalamina (B12): interviene en la síntesis de bases púricas y pirimídicas, y los aa serina y metionina.

Requerimientos físicos: O2, CO2, temperatura, humedad, pH y potencial de óxido-reducción (Eh). De acuerdo con su requerimiento en las bacterias se clasifican en:

Aerobias obligadas: requieren O2 como aceptor final de e-. Ej.: Mycobacterium, Bacillus, Pseudomonas. Microaerófilas: crecen mejor en medios con baja tensión de O2 y un 10% de CO2. En medios semisólidos es característico el crecimiento a 1 cm de la superficie. Ej.: Haemophilus, Brucella abortus, Campylobacter, Leptospira.

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Anaerobias facultativas: desarrollan en condiciones aerobias como anaerobias. Enturbian todo el medio de cultivo líquido. Ej.: Staphylococcus, Streptococcus, Enterobacterias. Anaerobias obligadas: sólo desarrollan en medios con bajo potencial redox (Eh) o donde el O2 ha sido eliminado por diferentes métodos: - Agregando compuestos reductores (con radicales SH2) como tioglicolato de Na, cisteína, ácido ascórbico, extracto de carne o hígado. - Reemplazando el aire con una bomba de vacío e inyectando gases inertes como N, He, mezcla de N + CO2

- Utilizando sobres generadores de H2 que se combinan con O2 y forman H2O en jarras anaeróbicas (Gas-Pak).

Crecimiento de (a) aerobias obligadas, (b) anaerobias estrictas, (c) anaerobias facultativas y (d) microaerófilas. Fuente: Brock Biología de los microorganismos, 8ªed. Prentice Hall , 2000. Requerimiento de CO2

Las bacterias no desarrollan cuando se priva por completo de CO2 (asimilación heterotrófica de CO2). Sirve para:

- Mantener ácidos dicarboxílicos para síntesis de ácidos tricarboxílicos del ciclo de Krebs. - Síntesis de ácidos grasos, purinas.

Requerimiento de temperatura: Cada especie bacteriana posee un rango de temperatura dentro del cual desarrolla. Existe un límite de máxima y mínima y una temperatura óptima intermedia en la que el crecimiento es más rápido. Para todas las patógenas y algunas saprófitas el rango es entre 25 y 40ºC, con una óptima de 37ºC. Son las mesófilas. Algunas tienen rangos amplios como Pseudomonas (entre 5 y 43ºC) y otras muy estrecho (30-39ºC) como Streptococcus y Neisseria. Ningún mesófilo crece por debajo de 5ºC ni por encima de 45ºC. Psicrófilas: Crecen mejor a temperaturas inferiores a 20ºC. Entre 0 y -7ºC si el medio no se congela o posee crioprotector. Causan alteraciones en alimentos refrigerados o congelados: Pseudomonas, Achromobacter, mohos (Cladosporium). Psicrotrofas: Es una categoría donde se ubicó a las patógenas que desarrollan en frío, entre 10 y 25ºC como Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica y Clostridium botulinum E.

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Termófilas: Desarrollan entre 55 y 80ºC. Clostridium perfringens, Bacillus stearothermophilus, Brocothrix thermophacta. Hipertermófilos o termófilas extremas: Se reproducen por encima de los 80ºC, viven en aguas termales generalmente asociadas con la actividad volcánica (el azufre suele ser importante en su actividad metabólica) y en las fumarolas hidrotermales de las profundidades marinas. Pertenecen a las Archeaebacteria (Thermococcus, Thermoplasma, Pyrolobus, Pyrococcus). De hecho la ADN polimerasa utilizada en PCR, que soporta 95ºC sin desnaturalizarse, se extrajo de Thermus aquaticus, de allí su denominación Taq polimerasa. Requerimiento de pH: La mayoría de los patógenos crecen bien a pH ligeramente alcalino 7,2 – 7,4. Algunas son acidófilas, desarrollan a bien a pH 6 o inferior como lactobacilos y levaduras y las basófilas como Vibrio cholerae necesita pH 9 para desarrollar. Soluciones ácidas de SO4H2 al 5% o alcalinas de NaOH al 4% son letales con excepción del género Mycobacterium (agente de la tuberculosis) que las soportan 15 minutos sirviendo de esta manera para decontaminar la muestra. Requerimiento de potencial redox (Eh): El potencial redox es la fuerza electromotriz que producen las reacciones químicas de oxidación y reducción. Se mide con electrodos de metal (platino) de un voltímetro, la diferencia de potencial nos da la fuerza impulsora de la reacción. Los sistemas redox no se equilibran entre sí a diferencia de los ácidos y bases cuyo estado de disociación tiende a alcanzar un equilibrio detectado fácilmente con un potenciómetro que mide la diferencia de potencial en forma estática. El potencial redox de los medios aerobios es de +0,2-0,4 voltios (V) mientras que los anaerobios son incapaces de desarrollar si el Eh es > -0,2 V. El O2 considerado tóxico para estos organismos no es inhibidor si el Eh es bajo. La aireación tiende a producir potenciales más positivos. Regulación metabólica:

La actividad de las cadenas enzimáticas se regula por medio de un control genético que es lento y un control catalítico que es rápido. En el primero, la presencia del sustrato (Ej.: lactosa) induce o desencadena el mecanismo de síntesis de las enzimas que lo degradarán. Por otro lado, la acumulación de un producto final (Ej.: triptofano) inhibe la síntesis de las enzimas que se necesitan para su elaboración (represión). En el segundo tipo de control, la presencia de un precursor (Ej.: glucosa-6-P) activa a la última enzima de la cadena (glucógeno-sintetasa) y con ello se pone en funcionamiento toda la cadena que la degrada. En cambio la acumulación de un producto final como citidin-tri-P inhibe por retroalimentación o feed-back a la primer enzima (aspartato-transcarbamilasa) de la cadena y con ello entra en reposo evitando gasto inútil de energía..

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Regulación enzimática por control genético (inducción y represión) y catalítico (activación por precursor y retroinhibición). Fuente: De Robertis & De Robertis. Biología Celular y Molecular, Ed. El Ateneo 1981.

La inhibición enzimática puede ser reversible (competitiva o no competitiva) o irreversible. Inhibición reversible competitiva (IRC): Ocurre cuando sustratos de molécula similar compiten con el sitio activo de la enzima. Ej.: sulfamidas compiten con el factor de crecimiento ácido para amino benzoico (PABA). Inhibición reversible no competitiva (IRnoC): En este caso sustrato e inhibidor no están relacionados estructuralmente. Ej.: enzimas que necesitan iones metálicos para activarse son inhibidas por agentes que se unen a esos iones como el quelante etilen-diamino-tetra-acético (EDTA) que se une reversiblemente a Mg++ y otros cationes divalentes. Inhibición irreversible: Ocurre cuando se desnaturaliza la proteína ya sea por calor o agentes químicos o bien se producen enlaces covalentes en el sitio activo con modificación del grupo funcional. Bibliografía: Carter,G.R.; Chengappa, M.M. & Roberts, A.N. Essentials of Veterinary Microbiology, 5th ed. Williams & Wilkins, 1995. De Robertis, E.D.P. y De Robertis, E.M.F. Biología Celular y Molecular, 10ª ed., Ed. El Ateneo, 613 pp, 1981. Ecología microbiana

La ecología estudia a los organismos en sus ambientes naturales, es decir todo lo que rodea a un organismo. Los microorganismos forman comunidades y éstas los ecosistemas. Las células individuales se agrupan formando → poblaciones Las poblaciones relacionadas metabólicamente forman → comunidades

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Las comunidades microbianas interactúan con los macroorganismos y definen el → ecosistema. Los habitats de los microorganismos son muy diversos, el crecimiento en la naturaleza

depende de los nutrientes o recursos disponibles y las condiciones de crecimiento (temperatura, pH, agua, luz, O2). Estos elementos definen el nicho ecológico, donde cada microorganismo crece mejor. Todos los seres superiores están colonizados por una microbiota normal que nos protege de ciertas enfermedades al impedir el crecimiento de microorganismos perjudiciales. Esta población no es un accidente sino que refleja la adpatación evolutiva. En el intestino del hombre y animales por ejemplo son la fuente de vitaminas del grupo B. La resistencia natural a enfermedades es proporcionada por la piel, mucosas, cilios, acidez estomacal y algunas sustancias químicas como el interferón. Escherichia coli es un habitante normal del intestino grueso de los vertebrados y su presencia es beneficiosa porque ayuda a producir vitaminas y degrada alimentos. La relación entre organismos se puede clasificar de la siguiente manera: Mutualismo o simbiosis: Ambos organismos se benefician: los rumiantes con bacterias del rumen que producen celulasa para hidrolizar celulosa en almidón y otros polisacáridos (PS) a moléculas de bajo peso molecular como ácidos orgánicos (acético, propiónico, butírico que son absorbidos por la corriente sanguínea y oxidados para producir ATP para los requerimientos del animal), H2 y CO2. Las metanógenas usan el H2 producido en grandes cantidades como fuente de ~ y CO2 como aceptor de electrones, resultando en CH4 que es excretado por medio de los eructos. Parasitismo: Un organismo se beneficia a expensas del otro. Comensalismo: Es un estado parasitario en el cual un organismo vive dentro o sobre el hospedador sin causarle enfermedad. El organismo se beneficia de esta relación y el otro no se perjudica. El término patógeno oportunista o potencial es usado para hacer notar que un organismo comensal bajo determinadas circunstancias como disminución de la resistencia del hospedador o aumento de la virulencia de aquél, puede causar enfermedad. Por ejemplo Staphylococcus aureus puede causar mastitis como resultado de daño en la ubre y Pasteurella haemolytica (sola o en combinación con otras bacterias y virus) origina neumonía en bovinos fatigados y debilitados por un largo viaje y frío (fiebre del transporte). Existen más de 200 especies de bacterias y hongos saprófitos que pueden causar infecciones oportunistas como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp. entre las 1as y Penicillium, Aspergillus y Candida entre los 2dos.

Varios patógenos bacterianos forman comunidades complejas que causan infecciones crónicas y resisten los tratamientos estandar, son los biofilmes que son microcolonias de células bacterianas adheridas por polisacáridos excretados por las propias células. El exopolisacárido glococálix protege a Pseudomonas aeruginosa de la fagocitosis ya que los macrófagos y neutrófilos los encuentran pero no los pueden engolfar o fagocitar.

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Biofilme de P. aeruginosa. Fuente: ASM MicroteLibrary.org Los biofilmes atrapan nutrientes e impiden el desprendimiento de las células, un ejemplo

clásico es la placa dental. Tienen importancia médica pues las bacterias escapan al ataque del sistema inmunitario y de los antibióticos. Pueden crecer así sobre las prótesis e implantes. Para la industria también representa un problema: corrosión de objetos sumergidos en el agua, plataformas submarinas, barcos, etc.

En ambientes naturales, los biofilmes sirven como importante factor de sobrevivencia permitiendo a los microorganismos adaptarse colectivamente a las condiciones cambiantes en lugar de hacerlo en forma aislada que serán más vulnerables.

Propiedades básicas de los biofilmes Comunidad de varios tipos de microorganismos que cooperan entre sí. Los microorganismos están dispuestos como microcolonias. Las microcolonias están rodeadas por una matriz que las protegen. Entre las microcolonias hay diferentes ambientes. Los microorganismos tienen un sistema de comunicación primitivo. Los microorganismos en un biofilm son resistentes a los antibióticos, a los

antimicrobianos y a la respuesta o mecanismos de defensa del huésped, incluida la fagocitosis.

Los biofilmes se adhieren a superficies animadas como válvulas cardíacas, huesos o tejidos, o a objetos inanimados como válvulas artificiales, implantes, prótesis o catéteres. Uno de los mejores ejemplos de biofilme son las placas dentales, que consisten en unacommunidad de microorganismos que inicialmente se adhieren a la superficie dental. Si permanecen sin que sean disturbados, sus productos pueden penetrar el esmalte, causandocavidades, y eventualmente progresar hasta el tejido blando causando periodontitis La mayoría de las especies microbianas presentan un antagonismo que surge de alteraciones en el medio físico (modificaciones del pH por la producción de ácido a partirde la fermentación) o elaboración y excreción de productos específicos como losantibióticos y bacteriocinas, que inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Estos factores son importantes en la ecología del agua y el suelo. El sinergismo puede describirse como un esfuerzo cooperativo de dos o más especies microbianas que produce un resultado que no podría obtenerse individualmente,

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este fenómeno de colaboración para transformar elementos, se presenta con frecuencia enla naturaleza y se conoce con el nombre de sintrofía: comiendo juntos, como por ej.:bacterias nitrosificantes y nitrificantes que oxidan el NH3 a NO3-. Bibliografía:

Clutterbuck, A.L.; Woods, E.J.; Knottenbelt, D.C.; Clegg, P.D.; Cochrane, C.A. &Percival, S.L. Biofilms and their relevance to veterniary medicine. Vet. Microbiology, 121(1-2):1-17 2007.

Konopka, A. Microbial ecology. Searching for principles. Microbe, ASM 1 (4): 175-179 2006.

Leid, J.G. Bacterial biofilms resist key host defenses. Microbe, ASM, Features, Feb.2009.

Madigan, M.T.; Martinko, J.M. & Parker, J. Brock Biología de los microorganismos, 8ªed. Prentice Hall , 1064 pp, 2000.

Ward, D.M. A macrobiological perspective on microbial species. Microbe, ASM 1 (6): 269-278 2006.

Toxinas bacterianas La distinción entre bacterias patógenas y no patógenas a veces no es muy fácil de realizar. En algunos pocos casos encontramos la explicación de una enfermedad atribuible a un solo producto. En la mayoría de los casos, la producción de enfermedad es más compleja y resulta de la interacción entre múltiples componentes bacterianos (intra o extracelulares) con los mecanismos de defensa del hospedador. Los factores de virulencia o patogenicidad de las bacterias son muchos y variados. Entre los extracelulares están las exotoxinas que pueden incluir exoenzimas, que contribuyen la génesis de una enfermedad, no explicando en su totalidad, el proceso de infección; citotoxinas que son efectivas contra poblaciones celulares individuales, en oposición a las exotoxinas clásicas que afectan todos los tejidos o sistemas y las enterotoxinas. Las endotoxinas son propias de los Gram(-), forman parte de su estructura en la porción lipopolisacárida (LPS) de la membrana externa, es el fosfoglucolípido (lípidoA) que se libera sólo cuando la bacteria es destruida y cumplen un importante rol en la patogénesis de la infección. Las enfermedades causadas por toxinas bacterianas pueden agruparse en cuatro mecanismos fisiológicos: citolíticos como las toxinas de S. aureus y C. perfringens que forman poros o digieren membranas, respectivamente; citotóxicos como la toxina diftérica que inhibe la síntesis de proteínas; enterotóxicos como la toxina colérica y de E. coli que estimulan la secreción y motilidad intestinal provocando diarreas y neurotóxicos como la toxina botulínica que inhibe la liberación de acetilcolina o la tetánica que desdobla la acetilcolinesterasa. En el cuadro siguiente se describen algunas características de las endo y exotoxinas ENDOTOXINA EXOTOXINA ________________________________________________________________ Bacterias productores Gram (-): Enterobacterias, Gram (+): Bacillus, Brucella sp, Haemophilus Clostridium, Staphylococcus Composición química Fosfoglucolípido (lípidoA) Proteínas de alto peso LPS de membrana externa molecular

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Estabilidad Estables. No pierden toxicidad Inestables. Pierden toxicidad

a 60ºC, ni por agentes químicos a 60ºC o por agentes químicos Ubicación Intracelular, se libera por lisis Excretada por la bacteria Mecanismo de acción Inespecífico: fiebre, shock Altamente específicas,

síntomas típicos

Toxicidad Baja Muy alta, letales Antigenicidad No son antigénicas, ni estimulan Muy antigénicas. Estimulan

Antitoxinas pero sí anticuerpos formación de antitoxina neutralizante Pérdida de toxicidad No se transforman en toxoides por Se transforman en toxoides Agentes químicos (formol) conservando antigenicidad. Componentes intracelulares: Las bacterias Gram (-) difieren de otras bacterias y de células mamíferas en que tienen una membrana citoplasmática interna y otra externa que consiste en una bicapa lipídica y proteínas de membrana. Contiene un lipopolisacárido (LPS) que provee una barrera a los metales pesados, moléculas grandes (enzimas líticas, ADN) y a agentes disolventes de lípidos como las sales biliares. El LPS también posee cadenas laterales variables de carbohidratos u oligosacáridos que le dan la antigenicidad O. Éstas hacen más resistente al microorganismo a las defensas del hospedador, reduciendo por ejemplo la fijación de complemento que las destruiría. Varias de estas funciones también las presentan los Gram (+) a través de los ácidos lipoteicoicos. El LPS parece ser vital para las bacterias Gram (-); los genes de su biosíntesis, al igual que de los ácidos lipoteicoicos, evolucionaron mucho antes de la existencia de las defensas de las células mamíferas, son altamente conservados por más de un billón de años y su mutación es letal para la bacteriua. Es encontrado en una gran variedad de géneros y especies sugiriendo que es importante para las células procariotas. Las bacterias con largas cadenas de polisacárido (antígeno, Ag O) son, en general, más resistentes a la lisis mediada por complemento y a la fagocitosis. Algunos organismos Gram (-) no entéricos que tienen muy poco o casi nada Ag O, utilizan otras estructuras hidrocarbonadas con función similar. Por ejemplo las variaciones de fase de los antígenos de superficie es un paso común de algunas bacterias para evadir el sistema inmunológico. Ha sido bien documentado en LPS de Bordetella pertussis, Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis y N. gonorroeae. Aunque los patógenos entéricos requieren de grandes Ag O para la resistencia a los ácidos biliares, no hay datos convincentes que sugieran qué diferencias en los LPS contribuyen a la virulencia. Los patógenos intestinales usualmente poseen otros determinantes de patogenicidad como los pillis, fimbrias o adhesinas, motilidad, exotoxinas o enterotoxinas, factores de penetración, haciendo que el LPS parezca menos significatiuvo en el desarrollo de gastroenteritis y otras noxas causadas por este grupo de bacterias. Por el contrario, el LPS tanto de flora normal como de bacterias virulentas, puede ser una molécula altamente tóxica si se libera al torrente sanguíneo (endotoxina), produciendo fiebre o hipertermia, leucopenia, hipotensión, shock y muerte. Diferencias en la estructura del LPS se correlacionan con la habilidad para activar macrófagos, liberar mediadores (citokinas) y producir shock séptico. Los mediadores causan aumento en la permeabilidad vascular, disminución en la contractilidad cardíaca, vasodilatación,

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hipertensión pulmonar y coagulación intravascular diseminada (CID) que finalmente llevan a la muerte. Componentes extracelulares Toxina tetánica: Es una neurotoxina secretada por Clostridium tetani siguiendo una multiplicación en un ambiente anaeróbico dentro del tejido infectado. Es responsable del espasmo muscular localizado o generalizado en el tétanos (parálisis espástica) y puede actuar en diferentes áreas del sistema nervioso vía los nervios periféricos, placas motoras, columna vertebral, cerebro o sistema simpático. El sitio blanco es la placa mioneural donde bloquea a la acetilcolinesterasa dando como resultado la diseminación incontrolada de impulsos nerviosos e hiperreflexia de los músculos esqueléticos. La acción de la toxina es presináptica mientras que la estricnina, de efecto similar, es postsináptica. La toxina no produce cambios histológicos evidentes ni daño al sistema nervioso. Toxina botulínica: Elaborada por C. botulinum, es usualmente ingerida preformada y penetra en la circulación siguiendo la absorción a través del intestino delgado y su drenaje linfático. Sólo el sistema nervioso periférico es afectado, no esl central. La acción de la toxina, similar al curare, consiste en bloquear la liberación presináptica del neurotransmisor acetilcolina en la placa mioneural. Este bloqueo se manifiesta en una parálisis flácida. Mientras que la toxina tetánica es hgomogénea, la botulínica producida por cada uno de los siete serotipos (A, B, C, D, E, F y G) es antigénicamente diferente. Esto significa que aunque actúen de igvual manera, no hay protección crizada entre ellas. La composición de una vacuna debe, por consiguiente, reunir los serotipos predominantes de una región. Otras exotoxinas

Los diferentes tipos de Clostridium perfringens (A, B, C, D, E y F) producen diversos productos tóxicos que desarrollan roles específicos en los diferentes cuadros. De las 12 toxinas, 4 son consideradas letales mayores: La toxina α (alfa) es una lecitinasa o fosfolipasa producida en gran cantidad por las cepas del tipo A. Causa hidrólisis de fosfolípidos de membrana, incluidos los eritrocitos, siendo la característica más remarcable de esta toxina la masiva hemólisis intravascular. Esta toxina se hace sistémica siguiendo la absorción desde el intestino y, a medida que causa hemólisis generalizada, afecta la pared de los capilares llenando de fluido las cavidades. La toxina β (beta) producida por C. perfringens tipo B y C, está asociada con enteropatogéneis (disentería del cordero y enteritis hemorrágica de ovinos y caprinos como así también en terneros y lechones). Es producida en grandes cantidades siguiendo un crecimiento exuberante en el contenido intestinal. Es necrotizante e induce a la inflamación de la mucosa intestinal acompañada de hemorragia, ulceración y pérdida de la mucosa. La toxina ε (épsilon) aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal, actuando sobre el endotelio vascular, favoreciendo su diseminación por el torrente sanguíneo junto con la toxina resultando un a toxemia β con ambos efectos combinados. El mecanismo por el cual la toxemia contribuye a la muerte del animal no es conocido aunque están implicados falla del corazón e hipotensión. La toxina ε se puede unir a receptores de una variedad de tejidos, especialmente aquéllos del cerebro, riñones e hígado y su efecto es mediado por el sistema de la adenilciclasa. El edema resultante se puede observar en corazón, cerebro y pulmones. La toxina ι (iota) es producida por C. perfringens tipo E. Aunque el organismo esté asociado con enterotoxemia en corderos y terneros, no es un patógeno significativo. Al igual que la toxina ε, aumenta la permeabilidad capilar que interfiere con la absorción intestinal. La exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa tiene una actividad similara la de la toxina diftérica, ambas son potentes inhibidoras de la síntesis proteica ribosomal de células eucariotas. Inactivan la enzima denominada factor de elongación 2. Aunque se conoce este mecanismo, no se sabe cómo contribuye a la letalidad de las infecciones por Pseudomonas.

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La exotoxina de Bacillus anthracis es un complejo formado por tres componentes: factor letal, factor edema y antígeno protector (antifagocítico) que tienen su máximo efecto cuando actúan juntos. Staphylococcus aureus produce un rango de productos extracelulares, pero al menos dos de ellos pueden ser clasificados como exotoxinas: la toxina α y la leucocidina. Ambas tienen actividad antifagocítica y la primera puede llegar a ser letal en cantidad suficiente. Su actividad antifagocítica difiere: mientras que la toxina α induce a disrupción lisosomal dentro de los neutrófilos, la leucocidina lleva a una extrusión de los gránulos lisosomales. La primera interactúa con los lípidos, especialmente de las membranas celulares y se puede ligar, por ejemplo, al endotelio vascular de los músculos produciendo contracciones, espasmos, isquemia y anoxia. Enterotoxinas Las enterotoxinas de Vibrio cholerae y Escherichia coli han sido extensamente caracterizadas. La primera es una proteína que estimula la secreción a través de la adeniciclasa en la mucosa intestinal. Posee cinco receptores celulares que se fijan a la membrana citoplásmica del entericito llevándolo a una activa secreción con grandes pérdidas de agua y electrolitos. El paciente colérico puede llegar a morir por deshidratación grave. E. coli produce dos clases de enterotoxinas: una termolábil y otra termorresistente. La primera es idéntica en su mecanismo de acción a la colérica; la segunda estimula otra enzima: la guanilato ciclasa, pero ambas se traducen en el mismo efecto: aumento de la permeabilidad intestinal con pérdia de agua y electrolitos, disminución de la absorción, aumento de la motilidad intestinal, todo lo cual lleva al cuadro de diarrea que puede ser fatal, sobretodo en animales jóvenes. También se han reconocido enterotoxinas con efectos similares en otras enterobacterias como Salmonella y Klebsiella, en Aeromonas, Campylobacter jejuni, Serpulina hyodysenteriae y Bacteroides fragilis. C. perfringens tipo A también produce una enterotoxina responsable de intoxicación alimentaria en el hombre. Primariamente afecta al íleum donde altera el transporte de fluidos, iones y glucosa, causando daño tisular e inhibiendo procesos metabólicos por mecanismos aún no definidos. La enterotoxina B de S. aureus afecta al sistema nervioso autónomo que resulta en una peristalsis excesiva que causa vómito profuso. Es la responsable de la intoxicación alimentaria de ‘sobremesa’, ya que se manifiesta a las dos horas de haber ingerido el alimento contaminado. Exoenzimas Muchas bacterias elaboran productos extracelulares que no son directamente tóxicos para las células pero contribuyen con el proceso de la enfermedad. S. aureus produce coagulasa que coagula el plasma sanguíneo transformando el fibrinógeno en fibrina; el coágulo formado lo ayuda a evadir la fagocitosis. En etapas posteriores sintetiza hialuronidasa o factor de difusión que le sirve para diseminar la infección a través de los tejidos. P. aeruginosa produce dos proteasas (proteasa alcalina y elastasa) que contribuyen en su virulencia y están involucradas en el daño corneal asociado con queratitis. El epitelio bronquial también es afectado por una hemolisina. Bacteroides elabora una variedad de enzimas que tienen actividad contra un rango de tejidos y células y contribuyen al cuadro patogénico. Están incluidas colagenasas, proteasas contra inmunoglobulina A (IgA), hialuronidasa, condroitín sulfatasa (destruye el casco), fibrinolisina, neuraminidasa, heparinasa y ADNasas. Citotoxinas El sobrenadante de un cultivo de Pasteurella haemolytica es especialmente tóxico para leucocitos bovinos y juega un rol considerables en el desarrollo de neumonía o fiebre del transporte en la que intervienen también P. multocida, Haemophilus pleuropneumoniae, Mycoplasma y diversos virus respiratorios.

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Bordetella bronchiseptica posee una toxina que destruye los cornetes nasales del cerdo provocándole rinitis atrófica. Cepas enteropatógenas de E. coli (EPEC) producen una verocitotoxina, conocida como Shiga-like-toxin (SLT) por su similitud con la producida por Shigella y es responsable de la enfermedad de los edemas en los cerdos y del síndrome urémico hemolítico (SUH) en el hom bre. Bibliografía: Blanke, S.R. Portals and pathways: Principles of bacterial toxin entry into host cells. Microbe, ASM, 1(1): 26-32 2006. Cicuta, M.E. Toxinas bacterianas. Cátedra de Microbiología, FCV/UNNE, 5 pp. 1998. Acción de agentes físicos y químicos sobre las bacterias, virus y hongos Desde el punto de vista médico y del laboratorio de Microbiología, trabajar con medios estériles es de fundamental importancia, de otra manera no se podría llevar a cabo ningún estudio. La destrucción completa de microorganismos se realiza por medios físicos (esterilización por calor, radiaciones o filtración) o por medios químicos (desinfección por líquidos, desinfectantes o antisépticos, vapores o gases). Esterilización entonces es la destrucción completa de toda forma de vida existente en el interior o superficie de cualquier material. Desinfección es el conjunto de prácticas para prevenir o destruir gérmenes patógenos. Asepsia es la privación total de gérmenes, sean patógenos o no. Antisepsia es la creación de un medio disgenésico para destruir o impedir el desarrollo. Generalmente se usan tópicos o antisépticos. Germicida o desinfectante: destruye bacterias (bactericida), virus (viricida) u hongos (fungicida). Agente bacteriostático o fungistático: impide el crecimiento o reproducción de bacterias u hongos. Esterilización por agentes físicos: La esterilización es un proceso gradual, depende de la temperatura de exposición, tiempo, número y clase de microorganismos (es más fácil esterilizar un elemento limpio que uno sucio), medio de suspensión. Calor: Siempre que sea posible debe ser el método de elección porque es el más confiable y universalmente aplicado por su eficacia. Punto de muerte térmica: Es la temperatura más baja capaz de matar una suspensión bacteriana en 10 minutos. Tiempo de muerte térmica: Es el menor tiempo necesario para matar una suspensión bacteriana a una temperatura determinada. El calor puede ser seco (fuego directo o aire caliente en hornos, se consigue esterilizar a 160ºC durante dos horas o 170ºC una hora) o húmedo (pasteurización, tindalización, ebullición, vapor fluente o a presión= autoclave: 110-115ºC, a ½ atmósfera, durante 15 minutos para medios sensibles al calor; 121 ºC, 1 atmósfera durante 20 minutos para medios de cultivo en general y 128 ºC, 1,5 atmósferas durante 30 minutos para material muy contaminado). La humedad hace más efectiva la penetración del calor. pH: El agregado de sales alcalinas aumenta la temperatura de ebullición: carbonato de Na………… 104ºC Carbonato de K …………..135ºC ClNa……………………. 109ºC Cl2Ca……………………. 179ºC Nitrato de K ……………. 115ºC

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Radiaciones: (Esterilización en frío) La energía se transmite en el espacio a través de radiaciones ionizantes (rayos cósmicos, particulados o de e- α, β, mesones o mesotrones, electromagnéticos o δ, Röentgen o X), de longitud de onda pequeña, gran poder de penetración y alta energía (~) y no ionizantes (radiaciones ultravioleta o UV e infrarrojas o IR), de longitud de onda amplia, poco poder de penetración (no atraviesan vidrio) y baja ~. La energía radiante de la luz solar procede de la fusión nuclear de 4 átomos de H en uno de He que libera gran cantidad de energía en forma de muchos tipos de radiaciones caracterizada cada una por la frecuencia y longitud de onda (λ). La luz viaja en pequeños paquetes de ~, fotones o cuantos similares a los protones y electrones pero sin carga eléctrica. Cuando una molécula absorbe luz, recibe ~. La cantidad es inversamente proporcional a λ (a > λ < ~ ). Cuando la luz choca con una molécula, un e- puede ser transportado a un orbital más alejado del núcleo con una nueva distribución electrónica de la molécula que queda excitada (forma más activa que la inicial). La vuelta al estado inicial produce fluorescencia o fosforescencia. En la fotosíntesis la célula transforma la energía lumínica en energía química al sintetizar sus compuestos hidrocarbonados. Cuando la ~ absorbida es = o > a 10 electro-voltios se produce la eyección o expulsión de e- y la molécula queda ionizada. En el espectro visible y UV la ~ es insuficiente para extraer e- pero produce cambios fotoquímicos. En la zona de los rayos IR la energía absorbida se disipa en forma de calor. Rayos β, catódicos o de e-: Se obtienen e- en un tubo catódico al vacío y son acelerados por fuerzas electrostáticas o microondas. Tienen bajo poder de penetración por carga de materia y masa. Se emplean para esterilizar material de suturas y quirúrgicos, son rápidamente irradiados sobre mesadas durante la fabricación. Rayos δ: Son emitidos por 60Co y 137Ce. Tienen gran poder de penetración. Las variables que afectan son tensión de O2, son más efectivos en medios con peróxido u ozono (O3). Los radicales SH2 y agentes reductores actúna como protectores por reducir la tensión de O2. La pérdida de agua disminuye la la formación de peróxido. Las bacterias vegetativas son más sensibles que los esporos, hongos, levaduras y virus. También se aplican para elementos de cirugía, plásticos (jeringas, tubuladuras) prótesis, catéteres, equipos de transfusión, antibióticos, vitaminas y hormonas. Desafortunadamente cuando se quisieron usar en alimentos, el sabor de los mismos puede ser afectado. En los rayos no ionizantes UV la λ bactericida más efectiva o sea de mayor absorción por el ADN, es de 260 nm. El mecanismo de la acción letal es que forma dímeros de pirimidina (timina) que distorsionan el ADN y producen errores al dificultar el apareamiento de bases. Existen sin embargo reparaciones pre-replicativas (fotorreactivación) cuando se activan enzimas que hidrolizan los dímeros o por acción de endonucleasas yu post-replicativas cuando se diluyen los dímeros en la progenie. La radiación UV se produce artificialmentye en lámparas de vapor de mercurio (Hg). Debido a su bajo poder de penetración tiene aplicación limitada a superficies de mesadas y pasillos que deben estar limpios dados que la materia orgánica, polvo o suciedad protege a la bacteria. Vibraciones ultrasónicas: El pasaje de sonido a través de un líquido provoca cambios alternativos de presión (cavidades) de 10 μ que crecen hasta colapsar violentamente produciendo altas velocidades y presiones de 1.000 atmósferas que desintegran la célula. Las bacterias Gram (-) son más sensibles que las Gram (+) que resisten debido a su gruesa pared celular. Hay muchos sobrevivien tes, se usa para estudiar componentes bacterianos. Ondas de radiofrecuencia: La industria alimentaria fue pionera en su uso. No es práctica ya que se necesitan difcerentes frecuencias para matar todos los tipos de microorganismos, además puede interferir con sistemas de comunicación local.

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a) Espectro completo en escala exponencial; b) Regiones ultravioleta, visible e infrarroja en escala aritmética. Fuente: Stanier et al. Microbiología 2ª Ed. Ed. Reverté S.A. 1996

Filtración: Se utiliza para soluciones, líquidos orgánicos (plasma, suero, leche) o gases que no pueden ser calentados. Se necesita vacío o presión para que pase la solución a través del filtro. En la actualidad los más usados son los filtros de membrana (Millipore) que son discos porosos de ésteres de celulosa (acetato o nitrato de celulosa), con un diámetro de poro de 0,2 μ. En el proceso hay que proceder a pasar primero por filtros clarificantes para retener las partículas más grandes hasta llegar a lo filtros esterilizantes. Existen también filtros de aire de alta eficiencia para retener partículas (HEPA = high efficiency particulate air) muy utilizados en las cabinas de flujo laminar para trabajar en ambientes estériles y de protección al operador. Estos filtros deben reunir una eficiencia mínima del 99,97% en la partícula más difícil de filtrar de 0,3 μ. Desinfección por agentes químicos:

La desinfección consiste en prácticas higiénicas para eliminar gérmenes patógenos. Los factores que influyen en la desinfección son los siguientes:

- tiempo de contacto: no todos los gémenes mueren al mismo tiempo. Hay una disminución gradual en el número que es mayor en los primeros momentos. Las células en crecimiento son más sensibles que las maduras.

- Temperatura: la muerte es un proceso químico que aumenta con la temperatura, existe un rango óptimo para cada desinfectante.

- pH: afecta al microorganismo, existe también un pH óptimo, cualquier situación desfavorable afecta al microorganismo aumentando su sensibilidad al desinfectante. Atraviesan mejor la membrana celular en formas no ionizadas.

- Concentración: a mayor concentración mayor efectividad, pero existen límites de concentración efectiva. No reduce el tiempo de exposición

- Naturaleza y número de microorganismos: se debe estimar el tipo de microorganismo a combatir, sobre todo si es esporulado o no.

- Presencia de materia orgánica: como suero, sangre o pus que pueden adsorberse a coloides proteicos e inactivarse.

Las condiciones que debe reunir un antiséptico ideal son:

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- potencia germicida, que sea efectivo a bajas concentraciones, - velocidad de acción, que sean rápidos, por ejemplo los halógenos son más veloces que los

metales pesados, - activo en presencia de materia orgánica, - soluble, - poca toxicidad para el tejido (fenol precipita proteínas) - económico.

Valoración: Coeficiente fenol (CF) es la división de la mayor dilución germicida que destruye en 10 minutos a la bacteria, por la correspondiente dilución fenólica que actúa en igual tiempo. Ej. desinfectante X dilución 1/300, fenol 1/90 300/90 = 3,33 cuando el resultado es > 1 su potencia es > que fenol y a la inversa si es < 1 su potencia es < al fenol. Los desinfectantes, antisépticos o biocidas pueden ser inorgánicos (halógenos, oxidantes, metales pesados) u orgánicos (alcoholes, aldehídos, ácidos, álcalis, fenoles, detergentes, colorantes, nitrofuranos). Halógenos: Yodo y cloro (CF = 200) son los más utilizados. Son excelentes esporicidas o sea que tienen un amplio espectro microbicida (bactericida, fungicida, viricida). Se ligan e inactivan con proteínas, corroen metales. I: + alcohol = tintura de I , es efectiva al 1 o 2% + detergente o agentes activos de superficie = yodofores, povidona I, se usa para preparar campos quirúrgicos por su alta efectividad. + agua = solución acuosa de Lugol. Cl: Se usa como cloraminas o hipoclorito de Na. Cl + agua = ácido hipocloroso en la forma no disociada efectiva, a una concentración de 0,2 ppm se combina con proteínas primero y luego oxida las bacterias liberando O2 que tiene efecto desodorante. Extermina la mayoría de los gérmenes en 20 segundos. La lavandina pura viene a una concentración de 5,25% (52.500 ppm) de Cl útil. Se utiliza diluida 1/100 = 525 ppm, excelente desinfectante para baños, instrumental y equipos de la industria alimentaria, lugares públicos. Oxidantes: Agua oxigenada o peróxido de H (H2O2) es un antiséptico débil, al 3% es rápidamente neutralizada por la materia orgánica de los tejidos. Oxida grupos SH2 originando puentes disulfuro (S-S) inactivando así a enzimas cambiando su conformación con pérdida de la función que lleva a la muerte celular. Sirve además para coagular la sangre de heridas y al liberar O2 por las catalasas titulares, forma burbujas que realizan limpieza mecánica y despega las gasas adheridas. Permanganato de K: posee acción más enérgica, tiñe la piel de rojo. Metales pesados: mercurio (Hg), plata (Ag), cobre (Co), zinc (Zn). Las sales solubles precipitan proteínas con grupos SH2 dando proteinatos insolubles. No son esporicidas, bacteriostáticos de acción lenta. Hg: Sales inorgánicas solubles: cloruro y bicloruro de Hg son muy tóxicos. Compuestos inorgánicos insolubles: óxido de Hg rojo y amarillo. Compuestos orgánicos: timerosal o tiomersal, mertiolate (CF 40), mercurocromo Ag: (CF 6,7) Las sales inorgánicas como nitrato de Ag se usaban en la oftalmía gonocóccica del neonato. Luego se combinaron con compuestos orgánicos haciéndolas más suaves como el vitelinato (Argirol) y albuminato (Protargol) de Ag.

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Alcoholes: El más usado es el alcohol etílico (CF 0,4) al 70-90% en agua, desnaturaliza (coagula) proteínas y disuelve membranas lipídicas, tiene acción germicida rápida. Es efectivo contra virus desnudos y envueltos, no es esporicida. El alcohol isopropílico es más tóxico, provoca narcosis. Agentes alquilantes: Aldehídos (formaldehído, glutaraldehído) óxido de etileno, alquilan proteínas inhibiendo la actividad enzimática. Formaldehído o metanal: gas sintético, la solución acuosa al 40% se lo considera puro, se lo utiliza al 4%. Se polimeriza fácilmente a paraformaldehído o formalina en estado sólido, es un potente germicida universal, de amplio espectro ya que es esporicida, bactericida, fungicida y viricida. Sustituye el H2 de los grupos carboxilo, sulfhidrilo (SH2) e hidroxilo (OH) de proteínas dando hidroximetilo. Tiene gran poder de penetración, no se altera con la materia orgánica. Sus vapores se utilizan para inactivar vacunas y convierte las exotoxinas en toxoides. La forma sólida que viene en polvo, hojuelas o pastillas se calienta a 150ºC y sirve para desinfectar habitaciones, cabinas, estufas, en una proporción de 0,3 g / 30 cm3. No exige ventilación prolongada luego de su uso. Se debe tener cuidado en presencia de ácido clorhídrico (ClH) + formol = éter biclorometil que es carcinógeno. Es explosivo en concentraciones al 7 – 73%. Glutaraldehído: Es un dialdehído, esteriliza en frío instrumentos quirúrgicos, es 10 veces más efectivo que formol, menos tóxico pero más caro. Óxido de etileno: Sustituye grupos alquilos de la célula por átomos de H débiles, bloqueando grupos activos de las proteínas; es mutagénico para bacterias y carcinógeno para el hombre. Tiene gran penetrabilidad, se utilizan autoclaves de este gas: 450 – 800 mg / l aire, a 55-60ºC y 40% de humedad, durante 4 a 18 hs. Es recomendado para artículos de goma, telas, lentes, plásticos, papeles y libros. Queda adherido al caucho de zapatos y guantes, es irritante para la piel. Tiene amplio espectro microbicida, es esporicida, requiere de equipos especiales. Es muy usado en hospitales donde hay grandes volúmenes de elementos para esterilizar de esta manera. Agentes que desnaturalizan proteínas: Ácidos: Depende del grado de disociación de H+. Los ácidos orgánicos débiles (ácido acético o vinagre, ácido benzoico, láctico, cítrico y propiónico) son más efectivos que los fuertes. Se usan como conservantes de alimentos. Los ácidos más fuertes (inorgánicos) se usan para limpiar incrustaciones minerales, óxido de hierro, etc. Álcalis: Depende de la concentración de OH-. Destruyen esporos pero no bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) de la tuberculosis. Se usan hidróxido de Ca (agua de cal), soda cáustica (NaOH), fosfato tri-sódico para lavar equipos de ordeñe, que poseen grasa y proteínas. Fenol o ácido carbólico: Se extrae del alquitrán de hulla por destilación o por síntesis. Se usa al 5%, puro es cáustico. Caracterizado por uno o más grupos carboxilos unidos al anillo benceno. Coagula proteínas, destruye la permeabilidad selectiva de membrana resultando en pérdida de constituyentes celulares y muerte. Son muy eficaces para BAAR. Se usan para desinfectar ambientes, pisos, paredes y equipos. Alquifenoles metilados en posición orto, meta y para-cresol (creolina, lisol) Halofenoles: cloroxilenol (CF 70, Espadol) y hexaclorofeno (CF 125, Fisohex) luego prohibido por toxicidad neurológica en bebés por absorción dérmica. Agentes tensioactivos: Detergentes: Son agentes surfactantes o tensioactivos, disminuyen la tensión superficial o interfacial del agua y así moja fácilmente las superficies. Detergentes aniónicos: jabones. Sales metálicas (Na, K) de ácidos grasos superiores (saturados: mirístico, palmítico, esteárico; no saturados: oleico y linoleico). Se preparan por saponificación de

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grasas animales con NaOH o KOH. Tienen acción bactericida débil, más bien actúan englobando y arrastrando las bacterias y suciedad. Detergentes catiónicos: Compuestos de amonio cuaternario (NH4) como cloruro de benzalconio (CF 275), bromuro de cetilpiridinio, cetrimide, lauril sulfato de Na. Son potentes germicidas (bacterias, virus), no esporicidas ni efectivo contra BAAR. Se usan para limpiar y desinfectar instrumentos, utensilios, elementos de goma y también en el tambo e industria láctea. Son inactivados por proteína, jabones y fibras de celulosa. Detergentes no-iónicos: Poseen poca o ninguna actividad desinfectante. Tween 80 facilita la separación y dispersión de micobacterias y proporciona fuente de ácido oleico. Tinturas: También derivadas del alquitrán de hulla Trifenilmetanos o rosanilina: Cristal violeta o violeta de genciana, violeta de metilo, verde de malaquita, verde brillante. Interfieren con la síntesis de glucopéptido de pared celular y LPS de ME de Gram (-). Se inactivan con el suero. Tinturas con acridinas: Flavinas: proflavina y acriflavina. Interfieren con la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas en bacterias. Además son mutagénicos porque se intercalan entre bases continuas. Sirve de antiséptico de heridas. Derivados de tionina: Azul de metileno. Es efectivo en altas diluciones. Biguanida: Clorhexidina, es un excelente desinfectante para la piel y mucosas debido a su baja toxicidad. Bloquea la síntesis de lípidos para la membrana plasmática. Es biocida contra las formas vegetativas bacterianas, no es esporicida ni efectivo contra BAAR. Bibliografía: Stanchi, N.O. Microbiología Veterinaria. 1ª ed. Ed. Intermédica. Buenos Aires. 2005. Stanier, R.Y.; Ingraham, J.L.; Wheelis, M.L. & Painter, P.R. Microbiología, 2ª Ed. Ed. Reverté S.A. 750 pp, 1996. División Bacteriana

La molécula de ADN es una doble hélice constituida por un par complementario de cadenas polinucleotídicas que se mantienen unidas por dos o tres puentes laxos de hidrógeno entre bases que permitan la distancia ( A=T y G=C). Es una secuencia lineal de pares de nucleótidos cuyo orden constituye el mensaje genético que contiene toda la información necesaria para determinar la estructura y función de la célula. Las bacterias son haploides: el único cromosoma que poseen se encuentra superenrollado y en contacto con un mesosoma en el lugar donde se forma la horquilla duplicativa o replicón (oriC). El ADN bacteriano tiene una longitud de 1 mm lo que corresponde a 5 x 106 pares de bases (pb) y un peso molecular de 3 x 109 Daltons (D). Es una molécula fuertemente cargada ya que cada pb contiene un resto P (extremo 5`) y OH (extremo 3`) ionizados. En los eucariotas los neutralizan proteínas histonas mientras que en las bacterias existen pequeñas poliaminas (espermina, espermidina y putrescina). Para duplicarse debe primero desenrollarse por acción de una topoisomerasa o ADN girasa que alivia el superenrollamiento para que los termine las helicasas. Las proteínas de unión a cadena simple o SSB se adhieren a las cadenas abiertas de ADN que quedan expuestas a la acción de la ADN-polimerasa III que polimeriza o sintetiza ADN nuevo en sentido 5’ → 3’. Sólo una cadena parental, la conductora o líder, es copiada de manera continua en esta dirección; la cadena antiparalela, es retrasada o rezagada porque necesita la síntesis previa, por medio de una ARN-polimerasa, proteína iniciadora o primasa, de una corta cadena de ARN cebador o primer que proporcione oxidrilos libres 3’ a los que la ADN-polimerasa III añada desoxinucleótidos. La síntesis se lleva a cabo en cortas secuencias de 1.000 a 2.000 nucleótidos de ADN (fragmentos de

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Okazaki). La ADN-polimerasa I remueve los cebadores hidrolizándolos y por último la polinucleótido (PN)-ligasa sella los fragmentos con enlaces fosfo-diéster.

No está aún dilucidada la acción de la ADN-polimerasa II. A medida que el ADN se desenrolla la horquilla avanza por la molécula. La velocidad de avance es constante. Por ejemplo el tiempo que necesita para la duplicación completa del ADN un E. coli es de 40 minutos a 37ºC, si la división celular dura > de 40’ se debe a síntesis de proteínas y ARN. En un medio rico, que permita que el ciclo dure < de 40’, no aumenta la velocidad de síntesis sino el número de horquillas o replicones (hasta 3) que originan 4 copias del cromosoma antes que finalice el ciclo anterior. Esto permite que el tiempo de generación (intervalo entre dos duplicaciones) se acorte a la mitad (20’). Los cromosomas hijos se separan antes de la división celular.

Horquilla replicativa. Fuente: Brock Biología de los microorganismos, 8ªed. Prentice Hall , 2000. La maquinaria de división bacteriana, extraído de Margolin, W. (1999) The Bacterial Cell Division Machine. ASM News, 65 (3): 137 – 143.

La división celular es compleja y variada. En eucariotes los microtúbulos del huso mitótico sirven para la separación y dirección de los cromosomas, su posición es crucial para el plano de división celular. Cómo funcionan estos mecanismos en las bacterias? Como las células eucariotas, la mayoría de las bacterias en crecimiento se dividen rápido ni bien los cromosomas hijos se han dividido y segregado exitosamente. Aunque los mecanismos moleculares que intervienen son menos conocidos que en los eucariotes, las estrategias bacterianas parecen ser diversas, reflejando quizás, los diferentes tipos físicos bacterianos. Es así que la gruesa pared celular de los enterococos contiene bandas que se corresponden con los futuros sitios de división, otros Gram (+) como Bacillus subtilis forman un septum grueso en un punto medio. Varias bacterias Gram (-) como Escherichia coli que tienen pared celular fina parecen dividirse superponiendo las invaginaciones de la membrana citoplasmática o mesosomas, pared celular y membrana externa.

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División binaria (binary fission) y estadíos de esporulación (sporulation) de Bacillus subtilis. Cell envelope: envoltura celular. FtsZ ring: anillo proteico que marca sitio de división. Nucleoid: nucleoide. Mother cell: célula madre. Forespore: preesporo. Spore: esporo. Fuente: Microbe (ASM), 1(3): 129 2006

Existe una proteína específica (FtsZ), análoga a actina o tubulina de los eucariotes, que

marca el plano de división en forma de anillo, en el centro exacto de la célula vegetativa de E. coli. Comparte secuencias homólogas con tubulina y también es una GTPasa, es decir hidroliza moléculas de GTP luego de formar estructuras que semejan polímeros de tubulina. Homólogos de FtsZ han sido encontrados en todas las especies de bacterias y Archaea investigados, con excepción de la parásita intracelular obligada Chlamydia trachomatis que posee otro tipo de multiplicación. La evidencia estructural, genómica y funcional sostiene la idea de que tubulina evolucionó a partir de FtsZ. Existen evidencias de que el septum para la próxima división se inicia antes de la misma en la célula madre .

Anillos (en rojo) de proteína FtsZ en E. coli, antes de la división celular. Fuente: ASM News 65 (3), 1999. Crecimiento bacteriano: El crecimiento es el aumento ordenado de constituyentes químicos. Puede ser individual (aumento de tamaño, aumento de la masa total por acumulación de reserva, glucógeno o ácido β poli hidroxibutírico, PHB) o poblacional (aumento del número de individuos). La medida del crecimiento en poblaciones unicelulares se realiza utilizando dos parámetros no equivalentes: masa celular / volumen determinado (generalmente ml) y número de células / “ “ “

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Medida de la masa celular: Por método directo, se determina el peso seco celular en un volumen determinado.

Generalmente 1 mg de peso seco se corresponde con 1.000 a 5.000 millones de bacterias. Por método indirecto se mide, a) algún componente (C – N), b) la cantidad de una enzima en un proceso metabólico de respiración o cantidad de ácido láctico en una ferm entación y c) la cantidad de un precursos radiactivo (aa marcados). Por métodos ópticos: colorimétrico o espectrofotómetro, determina la cantidad de luz difractada por una suspensión bacteriana. El poder de difracción es proporcional a la concentración (a > concentración > difracción) dentro de ciertos límites, siendo el inferior de 107 células/ml = 0,01 a 0,5 mg/ml, si la suspensión está muy concentrada diluir. La relación masa de células suspendidas / densidad óptica se obtiene empíricamente midiendo directamente el peso seco de la suspensión celular de determinada densidad óptica. Medida del número de células: Recuento total: Utilizando la cámara de recuento globular de Neubauer o de Petroff-Hausen con el microscopio. A simple vista es muy utilizado el método de turbidimetría con el nefelómetro de Mac Farland (Fig. ). Consiste en una serie de 10 tubos conteniendo una sal insoluble (sulfato de bario) que representan concentraciones que van desde 3 x 108 microorganismos/ml (Tubo Nº 1) a 3 x 109

(Tubo Nº 10). Es muy utilizado en la elaboración de vacunas por su simplicidad.

Figura . Nefelómetro de Mac Farland. Recuento viable: Consiste en realizar diluciones del líquido problema, (leche, orina)( si es sólido se debe homogeinizar respetando proporciones, sembrar 1 ml de por lo menos dos o tres diluciones, colocar agar disuelto, incubar a 37ºC por 24 hs. , contar las unidades formadoras de colonias (UFC) y multiplicar por la dilución correspondiente. Expresión matemática del crecimiento: En condiciones favorables una población bacteriana duplica su número (crecimiento geométrico) en períodos regulares de tiempo. Si consideramos que una población o clon se origina a partir de una bacteria y ésta se divide cada 20 minutos lo podemos expresar en la siguiente tabla. Tiempo (minutos) Número de divisiones Nº aritmético de microorganismos Log.2 0 0 1 0 20 1 2 1 40 2 4 2 60 3 8 3 80 4 16 4 100 5 32 5 120 6 64 6 140 7 128 7 160 8 256 8

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180 9 512 9 200 10 1024 10 Curva semilogarítmica de crecimiento bacteriano:

Se emplea logaritmo dado el alto nº de bacterias que conforman una población. El logaritmo de un nº en base X es el exponente al que hay que elevar X para obtener dicho nº. El logaritmo del nº de células aumenta proporcionalmente con el tiempo, independientemente de la base empleada.

Se emplea un eje de coordenadas colocando en la absisa el tiempo expresado en minutos y en la ordenada el nº de microorganismos expresado en logaritmo, por eso la curva de crecimiento resultante se denomina semilogaritmica. Consta de cuatro fases:

Fase de latencia, lag o retardo: en ella la célula está preparando toda la maquinaria divisoria. Fase de crecimiento logarítmico o exponencial: comienza cuando la velocidad de

crecimiento alcanza una velocidad constante. En la naturaleza, un ejemplo de crecimiento exponencial continuo lo tiene la microbiota del rumen, dado que constantemente se incorporan nutrientes y se eliminan los desechos.

Fase estacionaria: cuando no se renuevan los nutrientes, la velocidad de crecimiento declina como consecuencia del agotamiento de un determinado nutriente o acumulación de productos de desecho que se vuelven tóxicos para la bacteria. Es en este momento que se desencadena la esporulación en aquéllos géneros genéticamente dotados para tal fin (Ej.: Bacillus y Clostridium).

Fase de declinación o muerte: Disminuye la población viable. Bibliografía: Angert, E. Beyond binary fission: some bacteria reproduce by alternative means. Microbe, ASM, 1 (3): 127-131 2006. Genética bacteriana

Gen: es un segmento de ADN o ARN de algunos virus, cuya secuencia de bases determina, por el proceso de transcripción, una secuencia de bases de ARN y, por el proceso de traducción, una secuencia de aminoácidos (aa) de una cadena polipeptídica (pp). Consta de exones que se transcriben y traducen (expresan) y de intrones que no se transcriben.

Genomio o genoforo: es el conjunto de genes de un organismo. Genotipo: es la disposición particular de los genes. Fenotipo: es la manifestación biológica o morfológica, la ‘expresión genética’ y es el

resultado de la interacción del genotipo con el medio interno y externo de la célula. Se puede ver o medir. La mayoría de los pp tienen un PM de 30.000 a 40.000 D, lo que constituye una cadena de 250 a 300 aa. Si cada aa es codificado por 3 pb, un gen promedio tiene 900 a 1.000 pb. El cromosoma bacterianoi es capaz de codificar unas 3.000 proteínas.

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Fuente: Stanier et al. Microbiología 2ª Ed. Ed. Reverté S.A. 1996 Todos los caracteres son susceptibles de cambiar. Estos cambios pueden ser:

1) Cambios no heredables (temporarios): Desaparecen con la causa. Ej.: Bacillus anthracis capsula en el organismo porque necesita defenderse de los medios de protección del hospedador, pero no en medios de cultivo donde forma colonias rugosas, sin cápsula.

Klebsiella sp. desarrolla una gran cápsula en medios ricos en hidratos de carbono. Salmonella sp. inhibe el desarrollo de flagelos en medios con 0,1% de fenol. En medios desfavorables las bacterias desarrollan formas pleomórficas. 2) Cambios hereditarios: Sin transferencia de genes: Mutación

Con transferencia de genes: Recombinación genética. Mutación: Es toda alteración en la secuencia de bases, sea detectable o no, sin incorporación de ADN exógeno. Las bacterias son haploides, contienen un solo juego de genes, por consiguiente, el efecto de una mutación no podrá enmascararse por el gen homólogo. Tipos de mutaciones: Existen macrodelecciones y macroinserciones, con pérdida o ganancia de un segmento de ADN respectivamente. Mutaciones puntuales, que alteran un pb, por supresión (microdelecciones), ganancia (microinserciones) o por reemplazo o sustitución de un pb que pueden ser transiciones (púrica por púrica o pirimídica por pirimídica) o transversiones (púrica por pirimídica o viceversa). púrica A…………………….T pirimídica ↕ ↕ púrica G…………………….C pirimídica

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Cuando la mutación puntual recae en el 3º pb del codón, generalmente son silenciosas dado que cada aa está codificado por más de un codón (existen 64 combinaciones de tripletes para 20 aa) y, por sinonimia genética, se codifica el mismo aa a pesar del cambio. Pero cuando afecta al 1º pb cambia el sentido de la proteína porque se codifica otro aa, existe corrimiento en la lectura con resultados drásticos que pueden llevar a pérdida de la función de una enzima (ez). Existen mutaciones supresoras que revierten el efecto de mutaciones anteriores. Si ocurren en el mismo gen se denominan intragénicas y si suceden en otro gen son intergénicas. Las mutaciones espontáneas ocurren espontáneamente, por errores al azar de la ADN-polimerasa que elige PN erróneos. Cada gen puede mutar con una frecuencia de 1 cada 500.000 pb y una célula cada 105 o 109. Las mutaciones inducidas aumentan su frecuencia 10 a 100 veces por la acción de agentes mutágenos físicos (rayos X, γ y UV ) y químicos (análogos de bases: 2 aminopurina, 5 bromouracilo, hidroxilamina, ácido nitroso, colorantes de acridina, bromuro de etidio).

Efecto fenotípico: Se observan variaciones morfológicas de colonias lisas (S= smooth= suave) capsuladas, virulentas a colonias rugosas (R= rough=rugosa) las bacterias crecen en forma desordenada, dando colonias de aspecto rugoso, opacas, sin el brillo de la cápsula perdida así como la virulencia. Son excepciones Bacillus anthracis, Mycobacterium bovis, M. tuberculosis, Brucella ovis y B. canis que aún formando colonias rugosas, tienen otros mecanismos de patogenicidad.

Las variaciones V-W (V=virulence=virulencia; w=without=sin virulencia) en Salmonella typhi y S. paratyphi por pérdida de una antígeno Vi de envoltura.

Generalmente las ganancias de una función se manifiestan inmediatamente, mientras que las pérdidas a veces sufren un retraso fenotípico del efecto mutagénico (hasta 14 generaciones). Es lo que ocurre cuando una bacteria se vuelve resistente a un fago, aún conserva receptores en su periferia que la siguen haciendo sensible.

Regulación de la expresión génica

Las bacterias tienen una gran variedad de mecanismos para controlar la expresión de sus

miles de genes, con lo cual logran que el producto de un gen determinado, sólo se sintetice cuando es necesario y en lo posible, en la cantidad óptima. Esto les permite una sorprendente capacidad de adaptación a cualquier cambio en la concentración de nutrientes del medio en que habitan, activando sólo cuando es necesario, determinadas vías metabólicas. Así evitan sintetizar enzimas cuando falta el sustrato correspondiente, pero siempre están preparadas para fabricarlas cuando aparece el sustrato en el entorno. Un importante mecanismo regulatorio se basa en la activación o desactivación de la transcripción de un grupo de genes cuyos productos tienen funciones relacionadas, que se encuentran organizados en una región del genoma de forma de regular su expresión en conjunto. Esta forma de organización genética, se denomina operón y le permite a la célula administrar en forma adecuada sus reservas energéticas.

Un operón consiste en un promotor que es el blanco de la regulación; genes adyacentes que

codifican cada una de las enzimas de una vía metabólica y una secuencia de terminación de la transcripción. De esta manera, todos los genes constituyentes de un operón, son transcriptos de manera coordinada, como ARNm policistrónico, es decir, multigénico, que es traducido secuencialmente en proteínas por los ribosomas. La iniciación de la transcripción puede regularse de forma negativa o positiva. Los genes bajo control negativo se expresan constantemente a menos que sean "desconectados" por una proteína represora que evitará la expresión del gen mediante su unión a una secuencia específica del ADN denominada operador, impidiendo que la ARN polimerasa inicie la transcripción en el promotor. Aquellos genes cuya expresión se encuentra bajo control positivo, no serán transcriptos a menos que esté presente una proteína activadora la cual

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se une a una secuencia específica del ADN y ayuda a la ARN polimerasa en los pasos iniciales de la transcripción.

Los operones pueden ser inducibles o reprimibles. Un ejemplo clásico es el del operón

lactosa (lac), descrito en E. coli. Este operón, contiene un conjunto de genes cuyos productos son las enzimas responsables de la degradación de la lactosa. En ausencia del disacárido en el medio, el operón es reprimido por la unión de una proteína represora a la secuencia del operador, lo que impide la función de la ARN polimerasa. La adición de lactosa anula esta represión, ya que el propio azúcar actúa como inductor, uniéndose a la proteína represora, impidiendo que ésta continúe asociada al operador. Este mecanismo de control negativo, asegura que el operón lac se transcriba sólo cuando lactosa se encuentre en el medio.

Recombinación genética es el proceso mediante el cual elementos genéticos de genomas de

diferentes individuos se combinan, lo que permite se lleve a cabo alguna nueva función y que puede dar como resultado una adaptación a los cambios en el medio ambiente. Éste es un evento evolutivo importante y las células tienen mecanismos específicos que aseguran que dicha recombinación se efectúe. Estos mecanismos son llamados transformación, transducción y conjugación.

La transformación es el proceso por el cual ciertas bacterias llamadas competentes son

capaces de incorporar ADN exógeno o extraño, proveniente de otras bacterias, que se encuentran libres en el medio. La virulencia de Streptococcus pneumoniae guarda relación con la presencia de cápsula polisacárida a su alrededor. Las colonias de bacterias capsuladas tienen un aspecto liso (S = smooth) cuando se cultivan en placas de agar y son capaces de matar a los ratones que son infectados experimentalmente. Las colonias rugosas (R = rough)de S. pneumoniae, carecen de cápsula y son avirulentas. Frederick Griffith en 1928 observó por primera vez la transformación cuando mezcló bacterias S muertas con bacterias R vivas y encontró que al inyectar la mezcla en ratones resultaba letal. Había algo que lo denominó principio transformante que pasaba de las muertas a las vivas, era ADN que codificaba la capacidad de fabricar cápsula y con ello la virulencia. La capacidad de captar el ADN exógeno denomina competencia o células competentes como Haemophilus influenzae, Neisseria spp., Streptococcus pneumoniae y ciertas especies de Bacillus. Si bien la mayoría de las bacterias no presentan capacidad natural para captar ADN, es posible inducir en el laboratorio la competencia, generando por distintos medios distorsiones en la membrana celular, por ejemplo mediante pulsos eléctricos (electroporación) o mediante cambios osmóticos y térmicos. Estos procedimientos son muy utilizados para introducir experimentalmente ADN extraño, por ejemplo un plásmido, en una bacteria y así “transformarla” para que adquiera un fenotipo de interés. Las bacterias también pueden ser transformadas con ADN viral, en cuyo caso el proceso se llama transfección.

La transducción es la transferencia de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un

fago o virus bacteriano o bacteriófago. Existen dos formas de transducción la específica y la generalizada. La primera ocurre cuando un fago temperado porta genes bacterianos adquiridos durante un ciclo infeccioso anterior, y al infectar una nueva bacteria e integrar su genoma al cromosoma bacteriano, incorporará a éste la información genética correspondiente a la bacteria infectada previamente. La transducción generalizada es llevada a cabo por partículas virales defectuosas, que se originan como cápsides vacías durante la replicación viral y que luego incorporan ADN de una bacteria, así al infectar una nueva bacteria podrá introducir en ella dicho material genético.

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Fijación de fago T4 (a) a LPS de ME (b) de Escherichia coli e inyección de ADN (c). Fuente: Brock Biología de los microorganismos, 8ªed. Prentice Hall , 2000.

La conjugación consiste en el intercambio de información genética desde una bacteria dadora a otra receptora mediante contacto a través de un puente protoplasmático. Los plásmidos son secuencias de ADN que existen en forma independiente del ADN cromosomal, las bacterias que lo poseen se denominan F+ (factor de fertilidad) ya que una copia de los mismos pasan a células F- convirtiéndolas en F+. En ocasiones el plásmido puede integrarse al cromosoma bacteriano en cuyo caso se denominan episomas. Teóricamente todo el cromosoma podría ser transferido, lo que requeriría más de 2 hs, pero la unión entre las bacterias persiste menos tiempo. Las cepas F+ conjugan con una frecuencia de 1 cada 106, es decir una cada millón de células, mientras que las que poseen episomas lo hacen 1 cada 102 o sea una cada cien por lo que reciben el nombre de alta frecuencia recombinatoria (hfr = high frecuency of recombination). Éste es un mecanismo muy efectivo para la transferencia de genes de resistencia antibiótica a uno o varios antibióticos a la vez lo que dificulta enormemente el tratamiento. Destino del exogenote: El ADN nuevo o extraño que ingresó a la bacteria se denomina exogenote, para diferenciarlo del propio o endogenote. Si sus bases no son homólogas con las de la bacteria recipiente, puede persistir y replicarse en forma autónoma, persistir sin replicarse o bien ser digerido por endonucleasas. Si sus bases son homólogas se recombina, se integra al ADN del hospedador por dos mecanismos: ruptura-fusión o copia-elección. En el primero se produce una apertura de la cadena y se incorpora el nuevo segmento, en el segundo, se alinea con el ADN original y la ADN polimerasa copia al nuevo. Diversidad bacteriana extraído de Saier, M.H. (2000) Bacterial Diversity and the Evolution of Differentiation. ASM News, 66 (6): 337 – 343.

Las primeras formas de vida aparecieron alrededor de 3.500 millones de años atrás, eran procariotes. Las bacterias termofílicas fueron los primeros lineajes. Se tiende a definirlas por su relativa simplicidad morfológica y por la ausencia de varias características halladas en las células modernas. Aunque sus descendientes tienen un solo cromosoma, éste no se encuentra dentro de un núcleo y su citoplasma no contiene mitocondrias no organitos citoplasmáticos. Estos organismos son la base de los Dominios Archaebacteria y Eubacteria.

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Los procariotes tuvieron el mundo para ellos solos por 1.500 millones de años e inventaron la fotosíntesis durante ese tiempo. No antes de 2 billones de años atrás, la vida sobre la Tierra realizó otro paso gigante: la evolución de la célula eucariota. Varios biólogos creen ahora que esto arribó como resultado de una unión simbiótica mutuamente beneficiosa de diferentes clases de procariotes dentro de otro hospedador procariota. Las mitocondrias se especializaron en la oxidación de ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs) proveyendo energía inmediata a las células a través de adenosín tri-fosfato o ATP. Los plástidos pueden contener pigmentos fotosintéticos y enzimas (cloroplastos) o pueden almacenar nutrientes. Los eucariotas tienen su ADN organizado en un número determinado de cromosomas que se encuentran en el núcleo rodeados por una membrana. La división celular involucra un proceso complejo denominado mitosis en el cual la membrana nuclear se rompe y un huso mitótico de túbulos contráctiles se desarrolla por los que los cromosomas duplicados son guiados a los polos opuestos de la célula. Cada juego completo de cromosomas son envueltos por una nueva membrana nuclear y la célula finalmente se divide en dos. Sólo este tipo de células, con los mecanismos genéticos precisamente regulados tienen el potencial de evolucionar a organismos multicelulares en los cuales las células están organizadas en diferentes tejidos y órganos. Los procariotas tienen un solo cromosoma, usualmente circular, y se dividen por un proceso mucho más simple denominado fisión binaria, manteniendo su condición unicelular.

Si la vida arribó a la Tierra, la primera célula debió haber sido capaz de construir una forma de vida procariota resistente; pero si la vida se llevó a cabo en la Tierra, la primer célula debió haber sido una forma vegetativa capaz de crecer en el caldo primordial. Asumiendo que el segundo postulado es correcto, se puede proponer una secuencia de eventos que llevan a las cianobacterias actuales. Primero, condiciones ambientales moderadamente adversas necesitarían un simple programa reversible para formar un estadío inducido por estrés, similar al estado estrés-resistente de los tipos silvestres de E. coli que pueden permanecer sin duplicarse por varios días. Segundo, condiciones más severas promoverían el desarrollo de programas irreversibles pero cíclicos para construir un estado durmiente más resistente similar a los endosporos de Bacillus o exosporos de Streptomyces. Tercero, deficiencias nutricionales pueden llevar a organismos esporulantes simples a que sean capaces de realizar fotosíntesis y fijar N2, asemejándose a las actuales cianobacterias. Filogenia bacteriana, extraído de: Shapiro, J.A. (1999) Views about Evolution are Evolving. ASM News, 65 (4): 201 – 207 y Ludwig, W. and Schleifer, K.H. (1999) Phylogeny of Bacteria beyond the 16S rRNA Standard. ASM News, 65 (11): 752 - 757 La genética molecular tuvo un profundo impacto sobre la evolución; los procesos moleculares como replicación genómica y expresión génica, proveyeron información nueva sobre la estructura y organización del ADN. Estos análisis han llevado a comparar secuencias individuales, regiones cromosómicas y aún genomas enteros, atravesando los límites taxonómicos, haciéndonos comprender la ‘fluidez’ genómica, a través de sistemas bioquímicos celulares capaces de reestructurar las moléculas de ADN y reorganizar la informaciíon genética que codifican. Se ha descubierto que la emergencia de resistencia antibiótica bacteriana depende de un set de eventos genéticos que involucra plásmidos, transposones, integrones y todas las actividades bioquímicas que inactivan los antibióticos bombeándolos fuera de la célula, alterando los sitios blanco o proveyendo funciones celulares alternativas. Los microbiólogos aprendieron, antes que los biólogos, que las habilidades celulares de transferir y manipular moléculas de ADN constituyen una poderosa fuerza evolutiva. La naturaleza de la codificación genómica es un proceso más intrincado de lo que la biología molecular descubrió en épocas tempranas, cuando se concentraba en el código del triplete para aminoácidos y su correspondencia lineal entre ADN y secuencia proteica. Algunas informaciones genéticas tienen una extraordinaria plasticidad produciendo un sorprendente rango de mensajes específicos. Varios genomas tienen estructura modular; por ejemplo la mayoría de las proteínas

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están organizadas en número finito de dominios reconocibles que están repetidos y reacomodados en diferentes moléculas. Se ha comprobado que las secuencias de ADN que codifican estos dominios de proteínas homólogas son procedimientos más eficaces para sintetizar enzimas de gran actividad que tratando de mejorar la eficiencia por la modificación de las secuencias codificantes intactas. Los segmentos repetitivos de ADN representan otro aspecto de la plasticidad y adaptabilidad genómica. Existe amplia evidencia de la importancia funcional de estos elementos que incluyen secuencias simples repetitivas (que producen cambios en el nivel de la expresión génica y variaciones de fase en los determinantes patogénicos), arreglos en tandem y motivos ligados de ADN para factores de transcripción. Cambios en estos elementos repetitivos pueden llevar a nuevas configuraciones regulatorias de la arquitectura genómica y pueden ser la llave de eventos genéticos que lleven hacia la especiación.

Las recientes comparaciones de las secuencias genómicas de los procariotes están cambiando nuestra imagen de evolución bacteriana. Los datos de los proyectos genómicos microbianos indican que sólo un limitado número de genes, menos de 40, están presentes en todas las secuencias de los genomas dilucidados y comparten suficiente similitud para ser reconocidos y utilizados como marcadores potenciales.

La no homología entre genomas provee evidencia de que la transferencia lateral u horizontal de ADN entre especies es más extendida de lo que generalmente se asume, lo que hace dudar acerca de la validez de las rígidas ramas de los árboles filogenéticos. No se puede excluir completamente la posibilidad de que aún marcadores estables como los genes de ARN ribosomal están sujetos a esta transferencia lateral aunque sea menos intercambiable que la mayoría de los otros genes. Sin embargo, los árboles construidos en base a ARNr 16S reflejan la filogenia de los organismos, tal vez no en todos sus detalles, pero al menos globalmente y, por el momento, es el mejor método de inferir las relaciones filogenéticas entre bacterias. Varios caracteres importantes del genoma diferentes de las secuencias codificantes de proteínas son blancos de los cambios evolutivos. Las células frecuentemente leen múltiples mensajes en una simple secuencia de ADN. Por consiguiente, patrones de conservación y variabilidad pueden ser debidos a mensajes más que a estructuras proteicas. Los estudios moleculares de las mutaciones y arreglos en el ADN han demostrado que no ocurren al azar y no están limitados sólo a sustituciones de nucleótidos. Grandes segmentos de ADN pueden ser removidos y afectar por ejemplo, los blancos del sistema inmunológico al generar hipermutaciones en grupos de nucleótidos. Regulaciones temporales de períodos cortos de alta mutabilidad pueden coincidir con episodios ecológicos importantes cuando cambios mayores en el medio selectivo favorecen la emergencia de nuevas especies con nuevas adaptaciones. Clasificación bacteriana En 1923 D.H. Bergey en Estados Unidos, publica la primera edición del Manual de Bacteriología Determinativa, donde combina la morfología y fisiología y compila la mayoría de las especies bacterianas descriptas dentro del Reino Vegetal. Este manual tiene un fuerte apoyo del Comité Internacional de Sistemática Bacteriana (International Committee for Systematic Bacteriology o ICSB), fundado en 1930. En esa época se dieron cuenta que el código Botánico no era más adecuado para la taxonomía microbiana, es así como el ICSB deriva en el Comité Internacional de Sistemática Procariótica (International Committee for Systematics of Prokaryotes o ICSP) para desarrollar un código internacional de nomenclatura bacteriana.

La taxonomía numérica de Adamson mejoró la identificación fenotípica aumentando el número de tests y calculando los coeficientes de similitud entre cepas y especies. Los caracteres tienen igual peso y deben provenir de diversas categorías (morfología, fsiología, bioquímica, etc.). El número de características comunes es considerado una medida cuantitativa de la relación

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taxonómica, aunque esto no significa que los organismos esteésn también relacionados filogenéticamente.

Para regular los nombres de las especies biológicas, el botánico sueco Carl von Linné que vivió en el siglo XVIII (1707-1778) propuso un sistema binomial en su Systema Naturae (1735) para uniformar la nomenclatura.

Carl Woese (n. 15 de julio de 1928) es un microbiólogo estadounidense creador de la nueva taxonomía molecular basada en la comparación entre especies de la llamada secuencia del ARN ribosomal de 16s, que comparten todos los seres vivos del planeta y que apenas ha sufrido cambios desde la aparición en la tierra de las primeras formas de vida microbiológicas. Sus análisis filogenéticos en 1977 lo llevaron al descubrimiento de un nuevo dominio: Archaea.

La descripción del término especie se debe referir no a un solo tipo de organismo sino a un grupo relacionado filogenéticamente o filotipo. Lo mismo sucede con un género que abarca un grupo de especies relacionadas; una familia (sufijo aceae) un grupo de géneros relacionados; un orden (sufijo ales) un grupo de familias relacionadas; una clase un grupo de órdenes relacionados; una división un grupo de clases relacionadas y un Dominio o superrreino, un grupo de divisiones relacionadas. Anteriormente a esta clasificación que simplificó la taxonomía, las bacterias pertenecían al Reino Procariote.

Bibliografía:

Trüper, H.G. (1995) International Perspectives on Taxonomy: from the Past to the Future ASM News 71 (6): 273 - 277.

Cicuta, M.E. Árboles de evolución molecular. Cátedra de Microbiología, FCV/UNNE, 4 pp. 1999. Reconstruyendo el Árbol Universal de la Vida, extraído de Brown, J.R. (2004) Reconstructing The Universal Tree of LIFE , CHAPTER 2, PP. 15-33.

El árbol universal de la vida es la representación de la relación evolutiva entre los diversos organismos, suponiendo tácitamente la relación genética, el código genético que es ubicuo y se mantiene con muy poca variación y los procesos básicos de replicación, transcripción y traducción preservados en todas las células que agregan la noción de un origen o ancestro común aunque distante. A fines de 1970 Woese, Fox y colaboradores, iniciaron, en el campo molecular, la sistemática de procariotes digiriendo in vivo ARNr 16S marcado, usando ribonucleasa para producir ‘palabras’ de oligonucleótidos que fueron analizadas con dendogramas. Esto demostró que bacterias metanógenas inusuales estaban fuera de la raíz bacteriana, por lo que las denominaron Archeabacteria porque eran distintas de las verdaderas bacterias o Eubacteria y fueron capaces de prosperar en las rigurosas condiciones de la vida temprana en la Tierra, por eso también se las conoce como extremófilas, ya que soportan altas temperaturas (termófilas), altas concentraciones de sal (halófilas) y de ácido (acidófilas). Poseen mecanismos especiales que las capacitan para vivir en condiciones inhóspitas, sin necesidad de competir otros microorganismos. Sin embargo recientemenmte se han descubierto varias especies mesófilas que viven en océanos, lagos, suelo e inclusive en el intestino de animales. A fines de 1990 proponen formalmente el esquema tripartito de Dominios o superreinos.

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El árbol molecular de la vida, extraído de Pace, N.R. (1999) Microbial Ecology & Diversity. ASM News 65 (5): 328-333.

La composición de ADN, guanine–cytosine (GC) content of DNA, is one of the required characteristics on the minimum list of data needed for the description of a new genus. However, it is only an exclusionary determinant in the classification of bacteria, in that two strains differing by more than 10 mol% should not be considered as members of the same genus, whereas, on the other hand, a similar DNA base composition does not necessarily imply that the two strains are closely related. In practice, it has proved to be a valuable character for distinguishing between non-related bacteria, such as staphylococci (30–35 mol% GC) and micrococci (70–75 mol% GC).

Los marcadores de ARNr son estables, su transferencia horizontal no es frecuente, de las comparaciones de sus secuencias se puede deducir la relación filogenética de los procariotes ya que son ubicuas, funcionalmente constantes, conservadas y homólogas. Existe también congruencia en el patrón de ramificación del árbol filogenético derivado de los genes informacionales, conservados, involucrados en la transcripción y traducción. Además, los estudios genómicos son consistentes con los datos de ARNr y son ampliamente usados en la identificación de los procariotas no-cultivables que habitan el ambiente..

Schleifer, K.H. Classification of Bacteria and Archaea: Past, present and future. Sistematic and Applied Microbiology (In press) 2009

Fuente: Tórtora et al., Ed. Méd. Panam., 2007

Clasificación de los dominios bacterianos – Clasificación jerárquica de procariotes

Los dos dominios o imperios procariotas, Bacteria o Eubacteria y Archaea o Archaeobacteria, están subdividos en 30 divisiones o phyla: 27 en el dominio Bacteria, y 3 en el dominio Archaea. Éstas son células simples similares a las eubacterias pero diferentes

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bioquímicamente, son extremófilas, viven en fuentes de SH2, lechos oceánicos, soportan altas presiones y alta osmolaridad (como la del Mar Muerto). La separación está basada en secuencias de ARNr, ARN polimerasa, lípidos, su maquinaria transcripcional e histonas que las acercan a las eucariotas.

Lista de nombres bacterianos con la nomenclatura actual (List of Bacterial Names with Standing Nomenclature, LBNSN) 2009 http://www.bacterio.cict.fr/classifphyla.html

Dominio Bacteria

Divisiones que incluyen géneros de interés veterinario (8): Firmicutes - Actinobacteria -Tenericutes - Proteobacteria - Fusobacteria - Spirochaetes - Chlamydiae - Cyanobacteria.

División Firmicutes (Gram +)

Familia Staphylococcaceae – Género Staphylococcus

Familia Streptococcaceae - Género Streptococcus.

Familia Enterococcaceae - Género Enterococcus .

Familia Listeriaceae - Género Listeria.

Familia Erysipelotrichaceae - Género Erysipelothrix.

Familia Bacillaceae – Género Bacillus.

Familia Clostridiaceae - Género Clostridium .

División Actinobacteria - Orden Actinomycetales –

Familia Actinomycetaceae - Género Actinomyces - Arcanobacterium - Mobiluncus.

Familia Corynebacteriaceae - Género Corynebacterium.

Familia Mycobacteriaceae – Género Mycobacterium.

Familia Nocardiaceae – Género Nocardia -Rhodococcus.

Familia Dermatophilaceae – Género Dermatophilus –

Familia Streptomycetaceae – Gén. Streptomyces.

División Tenericutes - Clase Mollicutes - Orden Mycoplasmatales

Familia Mycoplasmataceae - Géneros Mycoplasma - Eperythrozoon - Haemobartonella - Ureaplasma.

División Proteobacteria (Gram -)

Clase α - Proteobacteria

Familia Brucellaceae - Género Brucella.

Familia Anaplasmataceae - Géneros Anaplasma - Cowdria - Ehrlichia.

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Familia Bartonellaceae - Géneros Bartonella - Rochalimaea –

Familia Rickettsiaceae - Géneros Orientia - Rickettsia.

Clase β - Proteobacteria -

Familia Alcaligenaceae - Género Bordetella - Taylorella.

Familia Burkholderiaceae - Género Burkholderia.

Clase γ - Proteobacteria

Familia Enterobacteriaceae – Géneros Enterobacter - Escherichia - Klebsiella - Morganella - Proteus - Providencia - Salmonella - Serratia - Shigella - Yersinia.

Familia Vibrionaceae – Género Vibrio.

Familia Coxiellaceae - Género Coxiella.

Familia Pasteurellaceae - Géneros Actinobacillus – Avibacterium -Haemophilus - Histophilus - Mannheimia - Pasteurella.

Familia Pseudomonadaceae - Género Pseudomonas.

Familia Moraxellaceae – Géneros Moraxella.

Familia Cardiobacteriaceae - Género Dichelobacter (ex Bacteroides) nodosus

Clase ε - Proteobacteria

Familia Campylobacteraceae - Género Campylobacter.

Familia Helicobacteraceae - Género Helicobacter.

División Chlamydiae - Familia Chlamydiaceae - Género Chlamydophila.

División Fusobacteria - Familia Fusobacteriaceae - Género Fusobacterium.

División Spirochaetae –

Familia Brachyspiraceae - Género Serpulina.

Familia Leptospiraceae - Género Leptospira

Familia Spirochaetaceae - Géneros Borrelia - Treponema.

División Cyanobacteria.

Bibliografía: Trüper, H.G. Internacional perspectives on taxonomy: from the past to the future. ASM News, 71 (6): 273-277 2005. Principios de biología molecular

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La biología molecular bacteriana ayuda al desarrollo de nuevas formas de tratamiento y

control de enfermedades. Las técnicas de genética molecular incluyen métodos para aislar ADN e identificar regiones codificantes de funciones particulares. Ventajas: las bacterias son haploides, tienen una sola copia de cada gen, por consiguiente las mutaciones tienen efecto inmediato. Los tiempos de generación son cortos, la reproducción es asexual, crecen In Vitro formando clones.

La biología molecular identifica ácidos nucleicos de microorganismos directamente de la muestra, ya sea por técnicas de amplificación del ADN (reacción en cadena de la polimerasa o PCR) o bien por huellas dactilares o fingerprinting.

La extracción del ADN consiste en destruir el organismo (bacteria, virus u hongo) por medio de lisozima u otras proteasas, precipitar el ADN con alcohol, aplicar enzimas de restricción o endonucleasas (tijeras moleculares) que cortan la cadena en lugares específicos, separar los segmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa, revelarlos y observarlos.

A la hora de establecer un diagnóstico clínico microbiológico en un cuadro diarreico, por ejemplo en un animal recién nacido, no alcanzará con identificar fenotípicamente E. coli aislada del coprocultivo, sino que habrá que determinar si posee los genes codificantes de toxinas. Para ello, se han desarrollado técnicas denominadas de hibridación por sondas, que se basan en las propiedades de complementariedad de bases del ADN. Una sonda, es un fragmento de ADN complementario a una región de un gen que nos interesa identificar, que ha sido marcada (tinción filogenética) con algún indicador que pueda ser detectado luego de la hibridación. El marcado puede realizarse incorporando nucleótidos radioactivos o biotinilados o marcados con digoxigenina. Si en un cultivo bacteriano interesa saber si ésta posee el gen X cuya secuencia se conoce, podremos construir una sonda específica para dicho gen, extraer el ADN del cultivo y mezclarlo con la sonda, en condiciones que permitan desnaturalizar la estructura de doble cadena del ADN para permitir que la sonda logre hibridar con su secuencia complementaria. De esta forma, podremos evidenciar si el cultivo posee o no el gen buscado, ya que, de estar presente, encontraremos la marca correspondiente a la sonda incorporada al ADN. Esta técnica puede utilizarse aplicando la sonda directamente sobre una muestra clínica, por ejemplo una sección tisular, y se denomina hibridación in situ.

En la actualidad se dispone de muchas sondas específicas de ADN empleadas para el diagnóstico de muchas enfermedades bacterianas. La hibridación por sondas, así como otros métodos para detectar un gen en particular, es especialmente útil para realizar el diagnóstico etiológico de infecciones producidas por microorganismos cuyo cultivo es dificultoso, ya sea por un crecimiento muy lento, como Mycobacterium spp., o por tener requerimientos especiales, como Chlamydia spp., Rickettsia spp. y todos los virus.

El mayor problema en el diagnóstico utilizando hibridación por sondas, ha sido la baja sensibilidad de la técnica, ya que se requiere que en la muestra existan suficientes copias del gen buscado, como para que la marca correspondiente a la sonda sea detectada. En general, las técnicas de hibridación in situ con sondas no radioactivas, son capaces de detectar sólo más de 200 copias del gen. Por esto, muchas veces la sensibilidad de la técnica no es suficiente como para descartar como muestras negativas a aquéllas con las que se obtienen resultados negativos.

Uno de los avances más interesantes en el área de diagnóstico clínico, ha sido el desarrollo de un método que permite amplificar el número de copias de un determinado fragmento de ADN de interés. Esta técnica, llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR = polymerase chain reaction), permite la generación de millones de copias exactas de un fragmento de ADN, a partir de tan sólo 1 copia original en apenas 2 o 3 horas. Se basa en las propiedades de la replicación del ADN, que puede reproducirse in vitro si se coloca el ADN molde, en una mezcla de reacción con una enzima ADN polimerasa, nucleótidos y cebadores específicos para las regiones flanqueantes del fragmento que se desea amplificar. Esta mezcla, se coloca en condiciones de pH y osmóticas tales que permitan el funcionamiento adecuado de la polimerasa, y en condiciones de temperatura distintas. Primero, a altas temperaturas (94 o 95 ºC) para lograr que el ADN se desnaturalice, es

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decir que se separen ambas hebras; segundo, a temperaturas adecuadas para que los cebadores hibriden con el ADN molde (entre 40 y 55 ºC, según los cebadores); y en tercer lugar, a la temperatura adecuada para que la polimerasa de ADN lleve a cabo el proceso de replicación. Las polimerasas que se utilizan para esto, deben ser capaces de tolerar estas altas temperaturas de desnaturalización del ADN, por lo que la enzima utilizada, corresponde a una bacteria termófila, Thermus aquaticus, por lo cual se la llama Taq polimerasa, cuya temperatura óptima es de 72 grados. Hoy día se utiliza ésta y también otras enzimas, producidas en forma recombinante en E. coli . Estos cambios de temperatura, se realizan en un equipo conocido como termociclador, que es capaz de variar entre rangos muy amplios de temperatura en tiempos muy cortos. Este ciclado de temperaturas, por ejemplo 94º por 1 minuto, 45º por 1,5 minutos y 72 º por 1 a 5 minutos. se repite unas 30 veces, con lo que se logra que en cada ciclo se duplique el número de copias de cada una de las hebras del ADN molde, con lo que se logra un crecimiento exponencial. Este procedimento, puede aplicarse directamente sobre una muestra clínica, buscando determinar la presencia o ausencia de un microorganismo en particular, a través de la detección de una secuencia específica en su ácido nucleico.

Para revelar el resultado del ensayo, la mezcla de reacción debe ser utilizada como muestra en una corrida electroforética en gel de agarosa o de poliacril amida, en donde el ADN migra desde el polo negativo (ánodo) al positivo (cátodo), en mayor o menor medida según su peso molecular, es decir su tamaño en pares de bases. El fragmento a amplificar, es por supuesto de un tamaño conocido, por lo que podrá determinarse la presencia del gen buscado en la muestra, porque habrá amplificado en la reacción y presentará una banda del tamaño correspondiente en el gel. Los geles deberán ser revelados para que desarrollen una reacción de color visible, que nos ayude a determinar la presencia o ausencia de la banda de interés. En el caso de los geles de agarosa, el revelado se hace generalmente con bromuro de etidio, que es un agente intercalante del ADN, es decir que su molécula se intercala entre las bases del ácido nucleico. Este procedimiento, resulta en un “teñido” del gel, ya que el bromuro de etidio tiene la propiedad de fluorescer bajo luz ultravioleta, por lo que al ser expuesto el gel a UV, se evidenciará la presencia o ausencia de la banda correspondiente. En el caso de los geles de poliacrilamida, el revelado puede realizarse por tinción con nitrato de plata.

El resultado de la PCR, también puede hacerse evidente, combinándola con una técnica de hibridación por sondas. Esto se logra transfiriendo el ADN del gel a una membrana (por ejemplo de nitrocelulosa), y poner a ésta en contacto con una sonda específica. En este caso, el revelado lo brinda la marca de la sonda. Este procedimiento de transferencia de ADN a una membrana combinado con hibridación por sondas, se denomina Southern Blott.

La aplicación de la biotecnología molecular a la medicina, representa un campo de intensa investigación y vertiginoso desarrollo. La prevención, el tratamiento y el diagnóstico de muchas enfermedades que hasta hace pocos años resultaba imposible, hoy son una realidad, y cada vez más la biología molecular aporta conocimientos y tecnología aplicables a la mejora de la calidad de vida y la salud humana.

Las enzimas de restricción permiten construir el mapa físico del ADN que muestra la distancia de pares de bases (pb) y posiciones diferentes en moléculas. La distancia entre los sitios de corte determinan el tamaño de los fragmentos de restricción. Los más pequeños migran más rápido en un campo eléctrico, se comparan con marcadores de peso molecular conocido. El tamaño del freagmento de restricción no revelará su posición, para determinarla se usan 2 enzimas de restricción diferentes.

Secuenciación del ADN: La secuencia de ADN nos dará la secuencia de aminoácidos (aa). Es más fácil secuenciar ADN que ARN y proteínas. El método más utilizado es el de Sanger: Se emplean dideoxinucleótidos (ddN) que tienen H en lugar de OH en 3’(posición ribosa), pueden fosforilarse y unirse a la cadena pero no incorporan más nucleótidos por falta de OH y la c adena termina. Se producen 4 reacciones de polimerización separadas, cada una tiene pequeñas cantidades de un dd-TTP, ddGTP, ddATP y ddCTP mezclados con desoxinuleótidos normales

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(dTTP, dGTP, dATP y dCTP). Se agrega un cebador de ADN o primer pequeño de secuencia corta conocida, adyacente a secuencia desconocida + ADN polimerasa. Cuando el ddN es incorporado se termina la cadena en él. Para analizar se comienza con la secuencia más corta, como termina en el ddN, el templado contendrá en ese lugar la base complementaria. En la práctica es posible secuenciar de 200 a 300 bases de ADN clonado en juegos simples de ddN. Haemophilus influenza, la primer bacteria secuenciada en 1995 posee 1.800.000 pb, Mycobacterium tuberculosis 5.500.000 pb.

Fechas de secuenciación completa de genomas microbianos del grupo de Secuenciación Microbiana del Instituto de Investigación Genómica (TIGR).Fuente: Fox,J.L. ASM News, 66(12):727-731 2000. Bibliografía: Fox, J.L. Microbial genomics poised for progress. ASM News, 66(12):727-731 2000. Trüper, H.G. International perspectives on taxonomy: from the past to the future. ASM News, 71 (6): 273-277 2005. Cómo los genomas emergen de los genes?: Extraído de: Heinemann, J.A. & Billington, C. (2004) How do genomes emerge from genes? ASM News 70 (10): 464 – 471.

El intercambio genético entre los microorganismos fue reconocido hace 60 años y se transformó rápidamente en una herramienta fundamental en la investigación de la biología. La transferencia de ADN en la naturaleza probablemente sea alta en la comunidad para adaptarse a los cambios en el habitat y debe ser una poderosa conductora en el proceso evolutivo. La comparación de la secuencia de genes aislados directamente de los microorganismos en sus hábitats nativos sugiere que miembros de taxones microbianos naturales intercambian ADN entre especies no idénticas pero estrechamente relacionadas. Esta microheterogeneidad en las secuencias de genes indican que las comunidades ambientales son colecciones de grupos de organismos relacionados que posiblemente tienen similar fisiología y probablemente intercambien genes frecuentemente.

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Hasta 1970 la creencia de la diversidad evolutiva fue enmarcada en el contexto de que un organismo era procariota o eucariota. Carl Woese, a través de estudios filogenéticos moleculares de microorganismos revolucionó el entendimiento de la diversidad biológica y la evolución. Cuando Woese comenzó a analizar las secuencias de ARN ribosomal (ARNr) esperaba que las de diversos organismos cayeran dentro de dos o tres grupos fundamentalmente diferentes, provenientes o descendientes de los dominios actualmente designados Archaea (antes Archaeabacteria), Bacteria y Eucarya. El árbol de la evolución está lejos de ser completo, sin embargo, brinda un sentido más amplio del orden natural para la clasificación e identificación de los microorganismos. Este árbol filogenético basado en la secuencia provee una medida de la diversidad y un mapa del curso de la evolución que lleva a una descripción más exacta de los organismos modernos. Sólo una pequeña proporción de microorganismos, usualmente < del 1%, puede ser cultivado con las técnicas habituales. El comportamiento de estos microorganismos puede no ser representativo de lo que ocurre en las comunidades y ambientes naturales. De hecho, los microorganismos que son abundantes en su habitat han evadido los esfuerzos de ser cultivados. Las razones de estos fracasos están reflejando la inhabilidad para recrear condiciones apropiadas y lo que es aún más difícil: la interdependencia o sintropía entre dos o más microorganismos. La sintropía probablemente sea común en los ecosistemas microbianos. La biología molecular está abriendo nuevos caminos en el estudio de los microorganismos y sus diversos ambientes, sin necesidad de cultivarlos. Por ejemplo, analizando los genes relevantes obtenidos directamente de muestras ambientales, microorganismos de hábitats particulares pueden ser no sólo identificados sino contados y evaluados. Las secuencias de ADN microbiano son recursos para diseñar herramientas adicionales como sondas de hibridación que pueden ser usadas para identificar, monitorear y analizar los integrantes de un ecosistema particular. A pesar de todas las secuencias analizadas aún se está lejos de entender a las células y su ubicación en el medio, ya que estas secuencias nos dan a conocer las moléculas pero no las interacciones fisiológicas de las mismas. Muchos de los problemas que aquejan a la sociedad como manejo de efluentes, salud pública y control de epidemias, por citar algunos, involucran problemas fundamentales de ecología microbiana. Si se comprendiera la interacción que los microorganismos llevan a cabo en las comunidades responsables de esos procesos, se podrían canalizar algunas de sus actividades. El mundo microbiano promete recursos inagotables. La humanidad tiene una larga historia de dependencia de las comunidades microbianas para fabricar alimentos tales como el pan, embutidos, quesos y vinos. Recién en el siglo XX se han utilizado los microorganismos para obtener antibióticos y otros metabolitos. Tradicionalmente el desarrollo tecnológico microbiano se ha basado más en organismos separados que en comunidades microbianas. La combinación natural de las actividades microbianas prometen abundantes recursos para el futuro cuya llave emergerá con un conocimiento más profundo de la naturaleza del mundo microbiano. Diversidad bacteriana, extraído de: Ludwig, W. and Schleifer, K.H. (1999) Phylogeny of Bacteria beyond the 16S rRNA Standard. ASM News, 65 (11): 752 – 757. Saier, M.H. (2000) Bacterial Diversity and the Evolution of Differentiation. ASM News, 66 (6): 337 – 343. Shapiro, J.A. (1999) Views about Evolution are Evolving. ASM News, 65 (4): 201 – 207. Cicuta, M.E. Versatilidad microbiana. Cátedra de Microbiología, FCV/UNNE, 4 pp., 2003. Cicuta, M.E. Diversidad bacteriana. Cátedra de Microbiología, FCV/UNNE, 5 pp. 2002.

Los mecanismos microbianos pueden haber evolucionado en los reguladores de la morfogénesis y embriogénesis de los organismos superiores. Los procariotes, las primeras formas

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de vida y principales innovadores moleculares sobre la tierra, exhiben una tremenda diversidad. Los rangos de sus capacidades metabólicas y nichos ecológicos exceden ampliamente aquéllos encontrados en el mundo eucariota. El biólogo molecular francés Jacques Monod dijo una vez: “Lo que es verdad para E. coli también lo es para los elefantes”. Este precepto ha guiado en sus investigaciones a los biólogos en las pasadas décadas. Los mecanismos de división bacteriana, transcripción, traducción, segregación de proteínas y transporte molecular transmembrana son reconocidos como fenómenos universales La diversidad morfológica bacteriana tiene raíces tempranas La tierra fue inhóspita para la vida los primeros 0,2 – 0,4 billones de sus 4,5 billones de años. De acuerdo con los hallazgos en fósiles, las tempranas formas de vida procariotas se parecían a las cadenas de cianobacterias productoras de oxígeno existentes hace 3,8 billones de años atrás. Las células eucariotas arribaron de líneas procariotas divergentes a través de procesos endosimbióticos que ocurrieron por un período de alrededor de dos billones de años, hace tres o un billón de años. Los libros de texto describen tres formas dominantes de bacterias: esféricas, bacilares y espiralares. Sin embargo, estos tres tipos morfológicos no son completamente representativos del mundo procariota. Algunas bacterias como Nocardia y Streptomyces forman micelios como los hongos, mientras que otras como Rhodomicrobium e Hyphomicrobium se reproducen por gemación como las levaduras. Las especies de Streptomyces producen estructuras aéreas asemejándose a aquéllas de las plantas, mientras que las espiroquertas pueden asumir apariencias de serpientes. Por consiguiente, varios programas morfogenéticos están codificados dentro de los pooles de genes procariotas y ellos han arribado mucho antes de la aparición de las células eucariotas.

Bacteria fósil: Dos tipos de cianobacterias de Australia central, un sitio que data de la era Proterozoica, alrededor de 850 millones de años. Izquierda, colonia de forma chroococcalean, a la derecha Palaeolyngbya filamentosa. Fuente: PaleoBios,17(1): 20-26

Compárese esta última con el género viviente de Cyanobacterium oscillatoria:

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Fuente: gopher://gopher.adp.wisc.edu:2070/11/image/.bot/.130/Cyanobacteria Diferenciación de membranas intrabacterianas Las membranas de las bacterias fotosintéticas incluyen cromatóforos diferenciados para la función de fotosíntesis. Los componentes proteicos y lipídicos de los mismos son diferentes de aquéllos de la membrana celular. De una manera similar, las sulfobacterias contienen membranas proteináceas que rodean los gránulos de azufre en el citoplasma, protegiendo la célula de este elemento, mientras que en las Archaea membranas rodeadas de vacuolas de gas sirven como organelas de flotación, al igual que cepas de Cytophaga, Flavobacterium y Bacteroides.

Vida sin luz en las Galápagos: En la profundidad de los océanos, donde no llega la luz del sol, los seres vivos se han adaptado en forma sorprendente. Riftia pachyptila son gusanos que viven en las corrientes hidrotermales, alcanzan varios metros y poseen una estructura única, los trofosomas, densamente poblado por bacterias que lo proveen de todos los componentes orgánicos. Estas bacterias utilizan el sulfuro de H como fuente de energía para convertir del CO2 en azúcares. Fuente: Kirsti Ritalahti http://microbezoo.commtechlab.msu.edu/curious/caOc96KR.html Polaridad celular

Diversas bacterias forman estructuras multicelulares con marcadas divisiones de trabajo en

tipos celulares diferenciados divergentes. Por ejemplo, colonias de Proteus forman capas de células en“terrazas” sobre el agar, difundiéndose del sitio de inoculación. Estas estructuras se forman cuando células con pocos flagelos (swimmers) se cubren de miles de ellos (swarmers) migrando sobre superficies secas, función que no pueden realizar las primeras. Eventos propuestos Si la vida arribó a la Tierra, la primera célula debió haber sido capaz de construir una forma de vida procariota resistente; pero si la vida se llevó a cabo en la Tierra, la primer célula debió haber sido una forma vegetativa capaz de crecer en el caldo primordial. Asumiendo que el segundo postulado es correcto, se puede proponer una secuencia de eventos que llevan a las cianobacterias actuales. Primero, condiciones ambientales moderadamente adversas necesitarían un simple programa reversible para formar un estadío inducido por estrés, similar al estado estrés-resistente de los tipos silvestres de E. coli que pueden permanecer sin duplicarse por varios días. Segundo, condiciones más severas promoverían el desarrollo de

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programas irreversibles pero cíclicos para construir un estado durmiente más resistente similar a los endosporos de Bacillus o exosporos de Streptomyces. Tercero, deficiencias nutricionales pueden llevar a organismos esporulantes simples a que sean capaces de realizar fotosíntesis y fijar N2, asemejándose a las actuales cianobacterias. Perspectivas Las cianobacterias pueden haber sido los primeros organismos multicelulares con programas lineales y cíclicos de diferenciación temporal como así también patrones de formación espacial. La comprensión del proceso de desarrollo en bacterias puede proveer las bases de los correspondientes en plantas y animales. A medida que los eucariotes incrementaban el número de programas complejos, nuevos mecanismos regulatorios aparecieron, algunos de los cuales resultaron en la modificación de los preexistentes en los procariotes. Otros probablemente fueron nuevos. Al identificar las raíces moleculares de los complejos circuitos regulatorios se comprende mejor los pasos evolutivos de los programas de diferenciación en eucariotes. La genética molecular tuvo un profundo impacto sobre la evolución; los procesos moleculares como replicación genómica y expresión génica, proveyeron información nueva sobre la estructura y organización del ADN. Estos análisis han llevado a comparar secuencias individuales, regiones cromosómicas y aún genomas enteros, atravesando los límites taxonómicos, haciéndonos comprender la ‘fluidez’ genómica, a través de sistemas bioquímicos celulares capaces de reestructurar las moléculas de ADN y reorganizar la informaciíon genética que codifican. Se ha descubierto que la emergencia de resistencia antibiótica bacteriana depende de un set de eventos genéticos que involucra plásmidos, transposones, integrones y todas las actividades bioquímicas que inactivan los antibióticos bombeándolos fuera de la célula, alterando los sitios blanco o proveyendo funciones celulares alternativas. Los microbiólogos aprendieron, antes que los biólogos, que las habilidades celulares de transferir y manipular moléculas de ADN constituyen una poderosa fuerza evolutiva. La naturaleza de la codificación genómica es un proceso más intrincado de lo que la biología molecular descubrió en épocas tempranas, cuando se concentraba en el código del triplete para aminoácidos y su correspondencia lineal entre ADN y secuencia proteica. Algunas informaciones genéticas tienen una extraordinaria plasticidad produciendo un sorprendente rango de mensajes específicos. Varios genomas tienen estructura modular; por ejemplo la mayoría de las proteínas están organizadas en número finito de dominios reconocibles que están repetidos y reacomodados en diferentes moléculas. Se ha comprobado que las secuencias de ADN que codifican estos dominios de proteínas homólogas son procedimientos más eficaces para sintetizar enzimas de gran actividad que tratando de mejorar la eficiencia por la modificación de las secuencias codificantes intactas. Los segmentos repetitivos de ADN representan otro aspecto de la plasticidad y adaptabilidad genómica. Existe amplia evidencia de la importancia funcional de estos elementos que incluyen secuencias simples repetitivas (que producen cambios en el nivel de la expresión génica y variaciones de fase en los determinantes patogénicos), arreglos en tandem y motivos ligados de ADN para factores de transcripción. Cambios en estos elementos repetitivos pueden llevar a nuevas configuraciones regulatorias de la arquitectura genómica y pueden ser la llave de eventos genéticos que lleven hacia la especiación.

Las recientes comparaciones de las secuencias genómicas de los procariotes están cambiando nuestra imagen de evolución bacteriana. Los datos de los proyectos genómicos microbianos indican que sólo un limitado número de genes, menos de 40, están presentes en todas las secuencias de los genomas dilucidados y comparten suficiente similitud para ser reconocidos y utilizados como marcadores potenciales.

La no homología entre genomas provee evidencia de que la transferencia lateral u horizontal de ADN entre especies es más extendida de lo que generalmente se asume, lo que hace dudar acerca

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de la validez de las rígidas ramas de los árboles filogenéticos. No se puede excluir completamente la posibilidad de que aún marcadores estables como los genes de ARN ribosomal están sujetos a esta transferencia lateral aunque sea menos intercambiable que la mayoría de los otros genes. Sin embargo, los árboles construidos en base a ARNr 16S reflejan la filogenia de los organismos, tal vez no en todos sus detalles, pero al menos globalmente y, por el momento, es el mejor método de inferir las relaciones filogenéticas entre bacterias. Varios caracteres importantes del genoma diferentes de las secuencias codificantes de proteínas son blancos de los cambios evolutivos. Las células frecuentemente leen múltiples mensajes en una simple secuencia de ADN. Por consiguiente, patrones de conservación y variabilidad pueden ser debidos a mensajes más que a estructuras proteicas. Los estudios moleculares de las mutaciones y arreglos en el ADN han demostrado que no ocurren al azar y no están limitados sólo a sustituciones de nucleótidos. Grandes segmentos de ADN pueden ser removidos y afectar por ejemplo, los blancos del sistema inmunológico al generar hipermutaciones en grupos de nucleótidos. Regulaciones temporales de períodos cortos de alta mutabilidad pueden coincidir con episodios ecológicos importantes cuando cambios mayores en el medio selectivo favorecen la emergencia de nuevas especies con nuevas adaptaciones. Ingienería genética: Es la aplicación de los principios básicos de la genética microbiana en el aislamiento, manipulación y expresión del material genético. Una de las contribuciones más grandes de la ingeniería genética de bacterias, es su uso para el desarrollo de vectores o vehículos que permiten el clonado de cualquier secuencia de ADN. Los vectores más ampliamente utilizados con este fin, son los plásmidos bacterianos (plásmidos recombinantes). Clonar implica introducir un fragmento de ADN en un vector. Los vectores de clonación, deben permitir la inserción de un fragmento de ADN extraño y ser capaces de replicarse normalmente dentro de la bacteria. Los plásmidos tienen la capacidad de autoreplicarse y son elementos génicos factibles de ser transferidos entre bacterias e introducidos en una cepa deseada.

Utilizando estos procedimientos de clonado y expresión de genes, actualmente se producen muchas proteínas que son utilizadas para el tratamiento de diversas enfermedades humanas, como por ejemplo la diabetes, al producir la hormona insulina u otras como la hormona de crecimiento o el interferón, en bacterias recombinantes obteniendo cantidades suficientes como para su aislamiento y uso terapéutico. Por otra parte, la disponibilidad de antibióticos naturales para el tratamiento de las infecciones bacterianas, no es infinita, por lo que otra importante área de investigación, se centra en la aplicación de la ingeniería genética a la creación de nuevos fármacos antimicrobianos.

Otra importante aplicación de la biología molecular, es la producción de vacunas recombinantes contra infecciones víricas o parasitarias, en bacterias. Este procedimiento, se basa en la expresión en bacterias de genes de patógenos que codifican, por ejemplo, antígenos de superficie del virus o del parásito contra el que se desea vacunar, que sean capaces de actuar como inmunógenos adecuados. Así, clonando los genes apropiados en los microorganismos, podrán producirse grandes cantidades de antígeno puro. Este método, proporciona la ventaja de que se evita trabajar con microorganismos patógenos. El desarrollo de la vacuna contra la hepatitis B representa el primer éxito de las vacunas recombinantes. Es producida en una levadura, que ha sido transformada previamente con un vector recombinante que contiene el gen del virus clonado, encargado de codificar para una proteína de superficie inmunogénica. Estos métodos, pueden emplearse también para la producción de vacunas vivas, es decir vacunas a ser administradas con virus o bacterias vivas, que han sido manipuladas genéticamente para perder su virulencia pero que mantienen intactas sus propiedades inmunogénicas. A su vez, estos microorganismos, denominados atenuados, pueden utilizarse como vectores de genes de otros gérmenes patógenos, y lograr producir una vacuna que inmunice contra más de una enfermedad infecciosa a la vez. Estos procedimientos, son motivo de investigación en los laboratorios de desarrollo de vacunas en todo el mundo.

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Procesos fundamentales de ingienería genética. Fuente: Brock Biología de los microorganismos, 8ªed. Prentice Hall 2000.

Antibióticos

Es toda sustancia química derivada o producida por distintas especies de microorganismos (Bacillus, Penicillium, Streptomyces) o en forma semisintética, que es capaz de inhibir, en pequeñas concentraciones, el crecimiento de otros microorganismos. Propiedades de un buen antibiótico

1- Que posea toxicidad selectiva para el microorganismo que se quiera eliminar. 2- Que tenga efecto bactericida más que bacteriostático. 3- Que el microorganismo no se vuelva resistente genotípica ni fenotípicamente. 4- Que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos. 5- Que no sea alergénico ni provoque efectos colaterales adversos con administraciones

prolongadas. 6- Que sea activo en presencia de líquidos orgánicos (plasma, exudados). 7- Preferentemente hidrosoluble y estable. 8- Que los niveles bactericidas se alcancen rápidamente (farmacodinamia) y se mantengan por

períodos prolongados (farmacocinética) antes de su eliminación (generalmente por hígado o riñón).

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Sitios blanco de acción de los antibióticos 1- Interferencia con la síntesis de pared celular: β-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas,

tienamicinas), bacitracina, vancomicina o ristocetina, teicoplanina, fosfomicina, cicloserina, tirotricina.

2- Alterando permeabilidad de membrana celular: polipéptidos (polimixina, colistín, gramicidina), polienos (anfotericina B para micosis profundas y nistatina para micosis superficiales), imidazol y derivados (miconazol, ketoconazol).

3- Inhibidores de síntesis de ADN: mitomicina, quinolonas (ciprofloxacina, enrofloxacina, danofloxacina, norfloxacina), novobiocina, griseofulvina (fungistático).

4- Inhibidores de la transcripción del ADN: actinomicina D y rifamicinas. 5- Inhibidores de la síntesis proteica:

a- Que actúan en la subunidad ribosómica de 30S: aminoglucósidos (gentamicina, estreptomicina, kanamicina, tobramicina), tetraciclinas, nitrofurantoína.

b- Que actúan en la subunidad ribosómica de 50S: cloranfenicol, macrólidos (eritromicina, roxitromicina, espiramicina, oleandomicina, tilosina, tiamulina), lincomicina, clindamicina, ácido fusídico.

6- Antagonistas metabólicos: sulfonamidas, ácido para-amino-salicílico (PAS), trimetoprima, isoniacida (hidracina de ácido nicotínico).

1- Interferencia con la síntesis de pared celular bacteriana

ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS Mecanismo de acción: Unión irreversible con la transpeptidasa (proteína ligadora de penicilina o PLP) que cataliza la unión transversal de los tetrapéptidos de la pared celular. Las células en crecimiento son más afectadas. Familia de las Penicilinas

Producida por hongos del género Penicillium (P. notatum y P. chrisogenum), descubierta accidentalmente en 1929 por el Dr. Alexander Fleming cuando sus cultivos desaparecieron por contaminarse con estos hongos. Es una molécula constituida por un anillo β-lactámico y uno tiazolidínico. El primero es afectado por las β-lactamasas o penicilinasas que transforman a la molécula en ácido penicilinoico inactivo. Estas enzimas son constitutivas (se encuentran en el espacio periplásmico), en pequeña cantidad y tienen menor afinidad de sustrato en las Gram (-), en cambio en las Gram (+) son inducibles, producidas en gran cantidad y tienen gran afinidad por el sustrato. 1- Penicilinas efectivas contra Gram (+) (no atraviesan membrana externa de las Gram -)

a- Naturales (β-lactamasas sensibles): Penicilina G (bencilpenicilina, ácido sensible, administración parenteral exclusiva) y penicilina V (fenoximetilpenicilina, ácido resistente, administración oral). b- Semisintéticas (β-lactamasas resistentes) Meticilina, nafcilina, isoxazolilpenicilinas (oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina). 2- Penicilinas efectivas contra Gram (+) y (-), atraviesan membrana externa a- De espectro ampliado (β-lactamasas sensibles): ampicilina, amoxicilina, carbenicilina (efectiva contra Pseudomonas sp.) b- Penicilinas modernas: metampicilina, bacampicilina, ticarcilina, mecilinam. c- Acilureído penicilinas: azlocilina, mezlocilina, piperacilina (efectivas contra Pseudomonas sp.)

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Familia de Cefalosporinas

Ácido 7-aminocefalosporánico, constituido por un anillo β-lactámico y uno de dihidrotiazina, producida por el hongo Cephalosporium acremonium, descubierta por Brotzu en 1945. Las primeras descubiertas se denominan de primera generación (cefalotina, cefalexina, cefadroxilo, cefaloridina, cefazolina, cefacetril) al igual que las primeras penicilinas son efectivas contra Gram (+) y sensibles a las β-lactamasas; las de segunda generación son de espectro ampliado y de mayor estabilidad frente a las β-lactamasas (cefoxitina, cefamandol, cefuroxima, cefaclor) al igual que las de tercera generación (cefotaxime, ceftazidina, ceftriaxona, cefoperazona, ceftiofur, cefixime).

Sitio de ataque de β-lactamasa en penicilina y cefalosporina. Fuente: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch011.htm.

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Fuente: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch011.htm.

Otros antibióticos que actúan sobre la pared celular Cicloserina: Producida por Streptomyces orchidaceus , de molécula similar a la D-alanina actúa por inhibición competitiva de la enzima alanina-racemasa. Fosfomicina: Producida por Streptomyces fradiae, de molécula similar al fosfoenolpirúvico (PEP), inhibe los primeros estadíos de la síntesis de mureína. Bacitracina (Bacillus licheniformis), Vancomicina (Streptomyces orientalis), Ristocetina (Nocardia lurida) y Tirotricina (Bacillus brevis) impiden el transporte lipídico del aminoazúcar o glucopéptido sintetizado en el citoplasma celular.

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2- Antibióticos que alteran permeabilidad de la membrana celular bacteriana Polipéptidos Polimixina: polipéptido básico de baja difusibilidad y alta toxicidad sobre todo para gérmenes Gram (-) como Pseudomonas sp. Producido por Bacillus polimyxa es un decapéptido de cinco variedades (A,B,C,D,E). Las dos más utilizadas son B y E, esta última recibe el nombre de colistín.

Se unen a la superficie externa de la membrana celular modificando la estructura y presión osmótica, con pérdida de metabolitos por la unión y disrupción de fosfolípidos y lipoproteínas y desplazamiento de los iones de calcio y magnesio.

Polienos: Anfotericina B (obtenida de Streptomyces nodosus) para micosis profundas y nistatina (Streptomyces noursei) para micosis superficiales.

Inhiben microorganismos con esteroles en membrana citoplasmática (levaduras, hongos,

amebas y otros eucariotes). La interacción polieno-esterol cambia las propiedades físicas de la membrana formando cráteres y vesículas que aumentan la permeabilidad. Son nefrotóxicos.

Si la síntesis de esteroles se bloquea (imidazoles inhiben ergosterol) los polienos pierden el blanco y no son eficaces. No se debe dar polienos + imidazoles (miconazol, ketoconazol, itraconazol).

3- Inhibidores de síntesis de ADN Mitomicina: Forma uniones cruzadas covalentes e impide separación de las cadenas complementarias, avance de la horquilla duplicativa y síntesis de ADN. Es de uso experimental porque no diferencia ADN bacteriano del eucariótico. Quinolonas: Bloquea reversible y selectivamente la duplicaciçon del ADN bacteriano. Inhibe grupos de enzimas topoisomerasas que son necesarias para la separación, replicación y enrollamiento del ADN, una de las cuales es la ADN girasa formando complejos de relajación. Primera generación: Ácido nalidíxico y ácido oxolínico. Son muy efectivas en infecciones urinarias por Gram (-). Segunda generación : Ácido pipemídico Tercera generación: Ciprofloxacina, enrofloxacina, danofloxacina, norfloxacina . De

amplio espectro, efectivas en infecciones de diversos órganos. Novobiocina: Producida por Streptomyces niveus, inhibe enrollamiento del ADN por la ADN girasa, formando también complejos de relajación.. Griseofulvina (producida por Penicillium griseofulvum). Inhibe la mitosis en metafase, es fungistático. 4- Inhibidores de la transcripción del ADN: Actinomicina D : Oligopéptido cromóforo que se intercala entre bases de la curvatura menor del ADN distorsionando el ADN e impidiendo el avance de la ARN polimerasa. Rifamicinas: (Streptomyces mediterranei) Se une a la ARN polimerasa y bloquea la síntesis de cualquier ARN bacteriano

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5- Inhibidores de la síntesis proteica, inhibidores de la traducción:

a- Que actúan en la subunidad ribosómica de 30S: Aminoglucósidos, son bases inorgánicas, policationes, que se unen irreversiblemente a la subunidad de 30S interrumpiendo la síntesis proteica por lecturas erróneas del código, aminoácidos equivocados, proteínas defectuosas: gentamicina (Micronospora purpurea), estreptomicina (Streptomyces griseus), tobramicina (Streptomyces tenebrarius), neomicina (Streptomyces fradiae) Tetraciclinas: Cuatro anillos fusionados que se unen a la subunidad de 30S antes que el ARNt y de esta forma se paraliza la incorporación de aminoácidos durante la síntesis proteica. Atraviesan la membrana externa de las bacterias a través de porinas mediante difusión pasiva y llegan al citoplasma gracias a un mecanismo dependiente de energía. Existen naturales: clortetraciclina (aureomicina, Streptomyces aureofaciens), oxitetraciclina (terramicina, Streptomyces rimosus) y semisintéticas: tetraciclina, doxiciclina, minociclina. Son agentes básicamente bacteriostáticos, con actividad frente a una gran variedad de microorganismos, por lo que se convirtieron en antibióticos de uso habitual tanto en seres humanos como en animales.

Tetraciclina y tigeciclina. Fuente: Enf.Inf. y Microb.Clín. 28(2):122-130 2010

Principales componentes del grupo de las tetraciclinas

Generación Nombre genérico

Primera (1948–1963)

Clortetraciclina Producidas por 2 diferentes especies de Streptomyces descubiertas a finales de la década de 1940

Oxitetraciclina Obtenidas a patir de Streptomyces en la década de 1950

Tetraciclina Derivados semisintéticos caracterizados por su hidrosolubilidad

Demeclociclina

Rolitetraciclina

Limeciclina

Metaciclina

Segunda (1965–1972)

Doxiciclina Derivados semisintéticos de las primeras

Minociclina

Tercera (1993–)

Glicilciclinas (tigeciclina) Derivado semisintético de minociclina

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Generación Nombre genérico

Aminometilciclinas (PTK 7906)

En desarrollo experimental

Fuente: Enf.Inf. y Microb.Clín. 28(2):122-130 2010 Nitrofurantoína: es una familia muy amplia que abarca desde desinfectantes urinarios hasta gasas furacinadas para la dermis. b- Que actúan en la subunidad ribosómica de 50S: Cloranfenicol (Streptomyces venezuelae) Se une a dicha subunidad e impide unión del complejo ARNt-aa al ribosoma al inhibir la enzima peptidil-transferasa. A veces se une a la subunidad de 60S del sistema hematopoyético de mamíferos pudiendo causar anemias. Tienen un amplio espectro que incluye muchos aerobios Gram (+) y (-) e inclusive anaerobios. Se lo puede utilizar en el tratamiento de numerosas infecciones bacterianas como neumonía, peritonitis, abscesos internos. Su habilidad de cruzar la barrera hematoencefálica lo torna útil para el tratamiento de abscesos cerebrales y meningitis. Al ser bacteriostático constituye una alternativa secundaria y no es una droga de primera elección cuando se requiere de una rápida eliminación bacteriana. Puede causar anemia y pancitopenia, suprimir la síntesis de anticuerpos y causar aplasia de médula ósea (demostrado en humanos). Macrólidos: Poseen anillo grande, macrocíclico, son de amplio espectro, bacteriostáticos, menor efecto que cloranfenicol. Eritromicina (Streptomyces erythreus) con sus derivados roxitromicina, claritromicina, fluritromicina. Espiramicina, oleandomicina, tilosina, tiamulina Lincomicinas (Streptomyces lincolnensis),derivado SS: clindamicina, son tioazúcares de espectro similar a la penicilina, compiten con cloranfenicol por mecanismo similar al impedir la unión del complejo ARNt-aa al ribosoma, inhibe la traslocación (corrida del ribosoma sobre el ARNm) similar a los macrólidos, no deja libre al ribosoma para un nuevo aa.

Metronidazol

El metronidazol es un compuesto 5-nitro-imidazol introducido en el año 1959 para el tratamiento de infecciones producidas por Trichomonas vaginalis. Su potente actividad anaerobicida lo ha convertido en un referente para estimar la actividad relativa de cualquier fármaco con actividad frente a anaerobios. Su espectro de acción abarca casi todas las bacterias anaerobias y muchos protozoarios. Está indicado para el tratamiento de miositis y colitis clostridiales e infecciones mixtas como la pleuroneumonía, combinado con otros antibióticos. El blanco por excelencia es Bacteroides fragilis.

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Metronidazol.Fuente: Enf.Inf. y Microb.Clín. 28(2):122-130 2010

7- Antagonistas metabólicos: Sulfonamidas

Descubierta por Domagk en 1935 la administra por primera vez en el tratamiento de las infecciones en el hombre. Es un pigmento rojo inactivo in vitro (sulfacrisoidina) que se activa in vivo (sulfanilamida). Están estructuralmente relacionadas con ácido paraaminobenzoico (PABA) y compiten con él por la enzima dihidropteroato sintetasa que interviene en el metabolismo del ácido fólico. Este ácido es imprescindible para la síntesis de precursores de los ácidos nucleicos bacterianos. Las células de los mamíferos requieren ácido fólico preformado, ya que no pueden sintetizarlo y, por tanto, no se ven afectadas por la acción de las sulfamidas. Las células eucariotas absorben ácido fólico de la dieta.

Son antimicrobianos sintéticos, bacteriostáticos, de amplio espectro, inicialmente con actividad frente a una gran variedad de microorganismos grampositivos y gramnegativos pero con posterior desarrollo de amplia resistencia.

Su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la síntesis de los ácidos nucleicos bacterianos. Dentro de las sulfamidas existen numerosos compuestos con diferentes propiedades farmacocinéticas y efectos secundarios. Sin embargo, todos comparten el mismo modo de acción y es frecuente la resistencia cruzada entre ellos. Actúan sinérgicamente con algunos componentes de la familia de las diaminopirimidinas, como la pirimetamina y trimetoprima, contra bacterias y algunos protozoos. En la actualidad, el uso de sulfamidas solas es excepcional, debido a su relativa baja actividad comparada con otros antimicrobianos, al problema de la resistencia adquirida y su perfil de toxicidad.

Existen cuatro grupos:

a) Sulfamidas de acción corta: sulfatiazol, sulfadiazina, sulfisoxazol. b) Sulfamidas de acción intermedia: sulfametoxazol, sulfamoxol. c) Sulfamidas de acción prolongada: sulfametoxidiazina, sulfametoxipiridazina d) Sulfamidas no absorbibles: Ftalilsulfatiazol.

También bloquean esta síntesis el ácido para-amino-salicílico (PAS). Trimetoprima inhibe en forma no competitiva bloqueando la enzima dihidrofolatoreductasa

con la que posee una tremenda afinidad. Esta enzima es necesaria para convertir el dihidrofoliato en tetrafoliato, sin los cuales la bacteria no puede sintetizaar ADN ni ARN. Las diaminopirimidinas (como la trimetoprima), al igual que las sulfamidas, interfieren en el metabolismo del ácido fólico, por lo que combinadas tienen efecto sinérgico. El cotrimoxazol, una asociación de trimetoprima y sulfametoxazol (TMP-SXT) en proporción 1/5, es la combinación empleada más frecuentemente.

Isoniacida (hidracina de ácido nicotínico) afecta la síntesis de lípidos, ácidos nucleicos y

micólicos de la pared celular de las micobacterias. Pirazinamida es un análogo de la isoniacida.

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Metabolismo del ácido fólico

Fuente: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch011.htm.

RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS

Las bacterias pueden resistir los antibióticos alterando las membranas y sistemas de transporte para prevenir la entrada del antibiótico dentro de la bacteria y/o activar el transporte del antibiótico fuera de la bacteria.

Los mecanismos incluyen:

1. Alteración de porinas en la membrana externa de los Gram-negativos previniendo el pasaje del antibiótico. Este mecanismo se aplica sólo en las Gram (-) dado que las Gram-positivas carecen de membrana externa y de porinas.

2. Alteración del transporte (carrier) de proteínas en la membrana citoplásmica bloqueando la introducción del antibiótico al citoplasma.

3. Producción de una nueva molécula de transporte en la membrana citoplásmica capaz ‘bombear’ el antibiótico fuera de la bacteria (eflujo).

4. Producción de enzimas que destruyen o inactivan el antibiótico. Como ejemplo, las beta-lactamasas destruyen el anillo betalactámico de algunas formas de penicilinas, monobactams, carbapenems y cefalosporinas inactivando estos antibióticos y convirtiéndose resistentes a los mismos.

La resistencia cromosómica, por mutación y selección, ocurre en el 20% de los casos. Son ejemplos la pérdida de la proteína ligadora de la penicilina (PLP), metilación del ribosoma de 30S para el caso de eritromicina o menor afinidad por la ADN girasa de las quinolonas. En cambio, la resistencia originada por infección por plásmidos o elementos extracromosómicos (EEC), ocurre en el 80% de los casos. Son ejemplos la modificación de la ARN

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polimerasa para las rifamicinas, de la dihidrofolatoreductasa para trimetoprima y dihidropteroato sintetasa para sulfonamidas. Ver Tabla . Tabla . Resistencia mediada por plásmidos Antibiótico Mecanismo Bacterias Beta-lactámicos Hidrólisis por β-lactamasas cocos Gram(+), enterobacterias, (penicilinas y cefalosporinas) Pseudomonas, Bacteroides Fosfomicina Glucosa alterada estafilococos, enterobacterias Vancomicina Nueva proteína enterococos Aminoglucósidos Acetilación, adenilación estafilococos, enterococos, y fosforilación enterobacterias, Pseudomonas Cloranfenicol Acetilación enterobacterias, Pseudomonas Trimetoprima Alteración de dihidrofolato- estafilococos, enterobacterias reductasa Extraído de: http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch011.htm. y http://www.racve.es/actividades/antibioticos%20arturo%20anadon.htm

Una bacteria puede convertirse en resistente a aminoglucósidos (estreptomicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, gentamicina, amikacina, etc.), agregando enzimáticamente nuevos grupos químicos (acetilos, hádenlos, fosforilos) a estos antibióticos e inactivándolos.

Las fluoroquinolonas (danofloxacina, enrofloxacina, norfloxacina, ciprofloxacin, etc.) trabajan inhibiendo uno o más grupos de enzimas topoisomerasas, necesarias para el superenrollamiento, replicación y separación del ADN circular bacteriano. Por ejemplo ADN girasa es una topoisomerasa que cataliza el supenrollamiento negativo del ADN circular DNA encontrado en las bacterias. Por otro lado, la topoisomerasa IV, está involucrada en la relajación del ADN, permitiendo la separación del cromosoma hijo al final de la duplicación. El antibiótico se une a estas enzimas bacterianas e impide que reaccionen con sus sustratos normales, por lo que la bacteria no puede replicar su ADN.

Antibiograma: Prueba de sensibilidad a los antibióticos

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Marshall, B.M.; Ochieng, D.J. and Levy, S.B. Reservorios de resistencia antibiótica no apreciados: Probado el rol de los comensales en la propagación de la resistencia antibiótica debe ayudar a preservar la eficacia de estas drogas críticas. Microbe (ASM), Features, May 2009.

Algunos colonizadores de la piel, orofaringe y tracto intestinal raramente causan enfermedad (ej.: bacterias ácido lácticas o lactobacilos). Otro grupo considerado generalmente nopatogénico, pero cuando se rompe el equilibrio en las presiones selectivas de los nichos microbianos, estas especies pueden adquirir el estatus de patógenos, que es más problemáticos si son portadoras de genes de resistencia o virulencia de los comensales vecinos. Éstos constituyen el grupo de patógenos oportunistas o comensales. Staphylococcus aureus, que regular u ocasionalmente coloniza el 80% de humanos, ahora frecuentemente cruza esta barrear. S. epidermidis y otros comensales tradicionales coagulasa-negativos produce infecciones bajo presiones extremadamente selectivas como estados inmunodeprimidos. Las especies que comúnmente alberga resistencia nativa en sus cromosomas (ej.: Pseudomonas, Stenotrophomonas y Acinetobacter), también pueden emerger bajo estas condiciones. La mayoría de los comensales, sin embargo, existen como residentes ambientales del agua y suelo, pero algunos de ellos se convierten en colonizadores transitorios de humanos y animales a través de la cadena alimenticia y otras rutas de exposición.

La evidencia acumulada sugiere un amplio intercambio de genes entre estos grupos. Los comensales poseen varios tipos de genes de resistencia que pueden estar organizados dentro de elementos genéticos llamados integrones. Los integrones llevan genes que otorgan resistencia a las primeras o segundas generaciones de antibióticos y son recuperados de casi cualquier tipo de ambiente. Actualmente también se recuperan integrones con genes de resistencia para las terceras o ciartas generaciones de antimicrobianos.

El problema actual de resistencia simultánea a varias drogas (multirresistencia) obedece a la transferencia horizontal de genes, un eficiente mecanismo por medio del cual los microorganismos se adaptan a los cambios ambientales por mutaciones al azar. Una creciente evidencia indica que grandes cantidades de material genético, incluidos los genes de resistencia, se transfieren entre las distintas especies microbianas. De los mecanismos conocidos, la transformación y conjugación parecen ocurrir con relativa frecuencia entre los densos paquetes de células de los biofilms, como los encontrados en el tracto intestinal y las superficies dentarias. En general, la conjugación es, quizás, el mecanismo más común de transferencia horizontal o lateral de genes, inclusive entre géneros diferentes.

La transferencia de genes de resistencia antibiótica de comensales a patógenos depende de la densidad células donantes y receptoras, la disponibilidad de mecanismosd de transferencia, nutrición y presiones selectivas. En este sentido, el medio intestinal es considerado óptimo. Los casettes de genes dentro de los integrones, encontrados en plásmidos y cromosomas, son los mayores medios para transportar e incorporar genes de resistencia antibiuótica. Existe una fuerte evidencia de transferencia directa de microorganismos asociados a animales y humanos como Salmonella, Vibrio, Campylobacter, Yersinia y Listeria. Ellos residen como comensales en varias

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especies animales, comportándose como patógenos cuando el hombre consume alimentos crudos, ahumados, fermentados o poco cocidos. En esos casos, la bacteria completa, con todos sus genes de resistencia genes es transportada de una especie a otra. Por ejemplo, cuando las fluoroquinolonas son usadas en pollos, los humanos expuestos a esos productos adquieren C. jejuni resistentes a fluoroquinolona. Sin embargo, existe poca evidencia de transferencia de genes de resistencia de E. coli, Bacteroides o Enterococcus asociados con animales, dentro de la flora humana que subsecuentemente cause infecciones resistentes a antibióticos. La evidencia más destacada resultó de un estudio con 20 años de seguimiento en el cual el antibiótico nurseotricina (una estreptotricina no utilizada en humanos) se usó durante dos años como promotor de crecimiento en varios establecimientos de porcinos. Resistencia mediada por plásmidos fue hallada en 33% de los coliformes de cerdos con diarrea, en 18% de los empleados y sus familias, en 16% de vecinos sanos y en 1% de los aislamientos del tracto urinario de los habitantes de comunidades vecinas.

Otros estudios mantienen la idea que microorganismos asociados con humanos acumulan genes de resistencia antibiótica de microbios asociados con animales. Por ejemplo, ganaderos y criadores comenzaron usando avoparcina, relacionada con vancomicina, como suplemento alimentario para el ganado y aves hace más de 20 años. Mientrastanto, se acumularon más y más enterococos, comensales del tracto digestivo humano, vancomicina resistentes, vía elementos de transferencia tipo Tn1546. Pequeñas diferencias en nucleótidos de estos elementos móviles permitieron determinar si los genes de resistencia antibiótica en enterococos derivaron de comensales asociados con porcinos y aves. Los hallazgos nuevamente involucraron al consumo de estas especies como fuente de resistencia a esos antibióticos, muy común ahora en los comensales humanos. Bibliografía: Baquero, F.; Coque, T.M. & Cantón, R. Antibiotics, complexity and evolution. ASM News, 69 (11): 547-552 2003. Cicuta, M.E. Bacilos y hongos productores de antibióticos. Cátedra de Microbiología, FCV/UNNE, 6 pp. 1997. Melana, M.R.C.de; Cicuta, M.E.; Boehringer, S.I.; Benítez, M.C.; Mazzanti, C.M.V.F.de; Roibón, W.R.; Kunert, J.A. y Barbetti, E. Beta lactamasa en cepas bacterianas de origen animal. Veterinaria Argentina (ISSN 0326-4629), VIII (79): 599-601 1991. Schlaes, D.M.; Projan, S.J. & Edward Jr., J.E. Antibiotic discovery: State of state. ASM News, 70 (6): 275-281 2004.