Presentación trabajo práctico Curva de Calibración

Valentina Ferrada Rubio

03 septiembre 2007

Universidad de Chile

Facultad de Medicina

Bioquímica Aplicada

¿Qué es una curva de calibración?• Es una curva que se construye a partir de

diferentes concentraciones de un analito y su respuesta frente a una reacción. Este gráfico tiende a ser lineal, mientras progrese según la ley de Lambert Beer.

A(DO) = log(I0/I)

A (DO)= k*c

Curva de calibración del Glicógeno

• Materiales: Equipos

EspectrofotómetroMicropipetas automáticas

Materiales de laboratorioMatraces aforadosVasos precipitadosPuntas para p100, p200Tubos Khan de vidrio

Protocolo

• Se ocupó una solución estándar de 50 mL de glucosa 2 g/L, en ácido benzoico 3 g/L

• 5 mL de reactivo de glucosa (1 mL para cada tubo)

Procedimiento:

• Calculamos los volúmenes que necesitábamos de la solución estándar para cada tubo

1.- V(1) * 2 mg/mL = 0.5 mg/mL * 1 mL

V(1) = 0.25 mL

2.- V(1) * 2 mg/mL = 1 mg/ mL * 1 mL

V(1) = 0.5 mL

3.- V(1) * 2 mg/mL = 1.5 mg/mL * 1 mL

V(1) = 0.75 mL

4.- V(1) * 2 mg/mL = 2 mg/mL * 1 mL

V(1) = 1 mL

• Para que todos los tubos quedaran con 2 mL, se les agregó agua destilada a los tubos que lo necesitaban.

Tabla:

 [glucosa]

mg/mL

Solución Estándar

mL H2O dest.Reactivo

mL Absorbancia

Tubo 1 0,5 0,25 0,75 1  

Tubo 2 1 0,5 0,5 1  

Tubo 3 1,5 0,75 0,25 1  

Tubo 4 2 1 0 1  

Blanco 0 0 1 1  

• Las absorbancias dadas en los diferentes tubos fueron:

  Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3 Abs. 4

Tubo 1 0,1337 0,126 0,1391 0,1403

Tubo 2 0,4048 0,2989 0,2648 0,2834

Tubo 3 0,4663 0,4567 0,4911 0,4353

Tubo 4 0,7334 0,6192 0,6175 0,6031

• Con estas absorbancias se calcula el promedio, para luego sacar la desviación estándar (S)

  Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3 Abs. 4 Promedio S

Tubo 1 0,1337 0,126 0,1391 0,1403 0,134775 0,00651633

Tubo 2 0,4048 0,2989 0,2648 0,2834 0,312975 0,06278388

Tubo 3 0,4663 0,4567 0,4911 0,4353 0,46235 0,02313576

Tubo 4 0,7334 0,6192 0,6175 0,6031 0,6433 0,06049931

• Posteriormente, se calculó el Intervalo de confianza (IC), el Coeficiente de Variación (CV), el Coeficiente de Exactitud (CE) y BC.

  Promedio S DE simple IC superior IC inferior CV BC CE

Tubo 1 0,134775 0,00651633 0,0065 0,14514 0,12441 4,834969 6.96% 93.04%

Tubo 2 0,312975 0,06278388 0,0627 0,41286 0,21208 20,06019 22.68% 77.32%

Tubo 3 0,46235 0,02313576 0,0231 0,49915 0,42554 5,003949 5.85% 94.14%

Tubo 4 0,6433 0,06049931 0,0604 0,739554 0,547045 9,404525 12.87% 87.71%

• Obtenidos estos datos, se puede hacer una curva de Regresión lineal. Concentración

mg/mLAbsorbancia

(460 nm)

0,5 0,134775

1 0,312975

1,5 0,46235

2 0,6433

Regresión linealy = 0,335x - 0,0304

R2 = 0,9987

00,10,20,30,40,50,60,7

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Concentración mg/mL

Ab

sorb

acia

(46

0 n

m)

Serie1

Lineal (Serie1)

• R² es un Coeficiente de Regresión que indica que tan adecuada quedó la recta en

relación a los puntos. Mientras más cercano a 1 sea este coeficiente, mejor es la recta.

R²= 0.9987

• Ecuación de la recta

y= 0.335x – 0.0304

• Según la ley de Lambert Beer, la Absorbancia (A) es igual a la Concentración de la muestra (c) por una constante (k):

A= k*c

• Para calcular la constante (k), es necesario calcular el promedio de las absorbancias dadas en cada tubo:

k= A / c

Tubo 1: k1= 0.134775 / 0.5

k1= 0.26955

• Tubo 2 k2 = 0.312975 / 1.0

k2 = 0.312975

• Tubo 3: k3= 0.46235 / 1.5

k3= 0.3082

• Tubo 4: k4 = 0.6433 / 2.0

k4 = 0.32165

Promedio:

k1 + k2 + k3 + k4 / 4 = 0.303075

• Con el valor de k se puede construir una nueva recta. La variable incógnita será la Absorbancia.

Tubo 1: A= 0.303075 * 0.5

A1= 0.1515

Tubo 2: A= 0.303075 * 1.0

A2= 0.303075

Tubo 3: A= 0.303075 * 1.5

A3= 0.4546

Tubo 4: A= 0.303075 * 2.0

A4= 0.60615

Concentración v/s Absorbanciay = 0,3031x - 4E-05

R2 = 1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Concentración (mg/mL)

Ab

sorb

anci

a (4

60 m

n)

Serie1

Lineal (Serie1)

Concentración mg/mL absorbancia (460 mn)0,5 0,15151 0,303075

1,5 0,45462 0,60615

Gráfico resultante:

• El valor del coeficiente de regresión es igual a 1, lo que indica que la recta quedó

muy adecuada en relación a los datos.

EjemploConcentración

analito Abs. 1 Abs. 2 Abs. 3

15 0.15 0.20 0.17

30 0.32 0.26 0.35

45 0.42 0.39 0.45

60 0.55 0.57 0.60

Promedio

0.1733

0.31

0.42

0.5733

Curva resultante:

Regresión lineal y = 0,0087x + 0,0416

R2 = 0,9964

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 20 40 60 80

Concentración analito

Ab

sorb

anci

a

Serie1

Lineal (Serie1)

Concentración analito

Absorbancia

15 0.1733

30 0.31

45 0.42

60 0.5733

Conclusión

Los métodos estadísticos son necesarios para validar la curva de calibración.

Los valores muy dispersos pueden deberse a errores aleatorios.

Fin