32Pi

5’Bacterias más

fagosAislamiento de

ácidos nucleicos

Ultracentrifugación en CsCl y BrEt

DNA

RNA

F.I.G.: Experimento de Volkin and Astrachan, 1956

Cómo seguiría el experimento?

Qué esperaría?

F.I.G.: Experimento de Volkin and Astrachan, 1956

En un cultivo de E. coli fue infectado con un becteriófago T2

Luego de la infección se dio un pulso de 32P por unos pocos minutos

Luego se aislaron ácidos nucleicos, se separó por ultracentrifugación el ADN del ARN y se vió que sólo el ARN presentaba marca. Se trató con álcali (degrada sólo el ARN) y se analizó la composición de bases. La sorpresa es que esta composición reflejaba la composición del fago

Ellos dicen:” This labeled RNA may be largely responsible for phage synthesis”

Habían descubierto el RNA mensajero, ellos lo llamaron DNA-like RNA pero no fue aceptado.

F.I.G.: Experimento de Pardee, Jacob y Monod 1960

Hasta el año 1960 se pensaba que todos los moldes necesarios para la síntesis proteica se encontraban en el RNA ribosómico (rRNA). Sin embargo, los pesos moleculares de las proteínas varían hasta en dos órdenes de magnitud respecto de los pesos de los rRNA (5S, 16S, y 23S).

Monod había puesto a punto cómo manipular bacterias por mutaciones y conjugación. Utilizó la enzima β-galactosidasa que hidroliza la lactosa. Sabían que cuando una bacteria mutada perdía la capacidad de metabolizar la lactosa, y era conjugada por otra, la bacterias rápidamente recobraban la capacidad de metabolizarla.

Cómo esta información podía pasar tan rápidamente sugería la existencia de una molécula simple que fuera complementaria al ADN .

Act

ivid

ad β

-gal

acto

sida

sa

lactosa glucosaglucosa

F.I.G.: Experimento de Jacob y Monod 1961

Jacob y Monod decidieron continuar el estudio de la degradación de la lactosa en E. coli , de la cual se sabía que estaba controlada por tres enzimas cuyos genes se encuentran adyacentes en el cromosoma bacteriano.

Cuando cultivaban bacterias en glucosa como fuente de carbono podían observar cómo la concentración de β-galactosidasa era muy baja. Al sustituir glucosa por lactosa se observaba un rápido aumento en los niveles de β-galactosidasa y de las otras dos enzimas Al retirar de nuevo la lactosa, los niveles de las tres enzimas disminuían rápida y drásticamente. Este hecho sugería que los moldes para la síntesis de estas enzimas eran muy inestables, sintetizándose y degradándose rápidamente, lo cual no encajaba con la elevada estabilidad de los rRNAs. Lo llamaron RNA mensajero.

F.I.G.: Experimento de Jacob y Monod 1961

F.I.G.: Experimento de Niremberg, Matthei y Ochoa 1962

El código genético debía ser un lenguaje usando los cuatro nucleótidos que especificara 20 aminoácidos.

1 nucleotido= 4

2 nucleótidos= 4 x 4 = 16

3 nucleótidos= 4 x 4 x 4 = 64

Se aceptó la hipótesis de triplete (codon) y se comenzó a experimentar

Posibles experimentos?

F.I.G.: Experimento de Niremberg, Matthei y Ochoa 1962

Descifrado del código genético

http://www.dnaftb.org/dnaftb/22/concept/index.html

•La RNA polimerasa, a diferencia de la DNA polimerasa, no requiere cebador para comenzar la síntesis de RNA.

•.En procariotas hay un único tipo de RNA polimerasa que, en realidad, es un gran complejo multienzimático asociado con varias proteínas que participan en diferentes momentos de la transcripción. En eucariotas hay tres diferentes que transcriben diferentes tipos de genes.

•Cuando va a iniciar la transcripción, la RNA polimerasa se une al DNA en una secuencia específica denominada secuencia promotora o promotor.

•Señales de terminación de diverso tipo

•En procariotas, mensajeros policistrónicos

•En eucariotas la mayoría de los transcriptos sufren splicing. Concepto de exones e intrones.

F.I.G.: Transcripción

F.I.G.: Transcripción

Transcription

F.I.G.: Gen

Entonces, los genes son unidades codificantes para proteínas y ARNs que contienen:

Secuencia codificante

AUG UAA

5’UTR 3’UTR

Promotor

F.I.G.: Genes Procariotas

Codon de iniciación

Codon de iniciación

Codon de iniciación

Codon de stop Codon de stop Codon de stop

Señal de terminaciónPromotor Mensajero policistrónico

F.I.G.: Genes Eucariotas

Codon de stop

Señal de poladenilació

n

Promotor

exon exon exon

intron intron

Codon de iniciación

Codon de iniciación

Codon de stop

AAAAAAAA

Splicing

Mensajero maduro

RNA Processing

F.I.G.: Genes Procariotas

F.I.G.: Traducción

Requiere de tres tipos de RNA: mRNA, rRNA y tRNA

Los rRNA junto con proteínas ribosomales forman los ribosomas

F.I.G.: Traducción

F.I.G.: Traducción

Existen tantas aminoacil t-RNA sintasas como aminoácidos, que son específicas para producir la unión de cada aminoácido a su correspondiente t-RNA

La especificidad está dada en las bases modificadas del brazo aceptor, en el anticodón y bases adyacentes. Fue demostrado por mutaciones puntuales en los genes de t-RNAs. Además las aminoacil tRNA sintasas poseen un segundo sitio que une aminoácidos con características semejantes, lo que aumenta la especificidad de la unión (proof reading).

La especificidad de la unión codón-anticodón reside sólo en el anticodón aun con otro aminoácido cargado. Experimento de marca de Cys desulfurada convertida en Ala

F.I.G.: Traducción

F.I.G.: Traducción

Traducción: tres etapas

F.I.G.: Traducción

F.I.G.: Traducción

F.I.G.: Traducción

Lsa actividad de peptidil transferasa está asociada al RNA más que a las proteínas ribosomales,esto es:

Los ribosomas son ribozimas, RNAs con actividad enzimática capaces de catalizar reacciones

Observaciones. Ausencia parcial de proteínas ribosomales no inhiben la actividadLos rRNA están mehjor conservados que las proteínas ribosómicasLa mayoría de las mutaciones que confieren resistencia a antibióticos o inhiben la síntesis de proteínas están en genes de RNA rinosomales

F.I.G.: Traducción

Translation

F.I.G.: Traducción

Transcripción y traducción simultáneas en un gen bacteriano

F.I.G.: Traducción

Inhibidores de la traducción