Presentación de PowerPoint · Guión de la presentación . Chromosome Proto-oncogene / Supressor...
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Técnicas de hibridación
Concepto, modalidades
y tipos de sondas
Aplicaciones principales
Federico Rojo
Fundación Jiménez Díaz
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Guión de la presentación
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Guión de la presentación
Chromosome
Proto-oncogene / Supressor gene
Cell extrinsic mechanisms:
• Radiation
• Topoisomerase inhibitors
• Oxidative stress
• Toxic agents
• Viruses
Cell intrinsic mechanisms:
• Aberrant DNA-repair mechanisms
• Non-canonical DNA
• Fragile sites
• Transcriptional stress
Alteraciones estructurales del DNA en cáncer
Chromosome
Proto-oncogene / Supressor gene
Point mutation Gene gain,
amplification
Local rearrangement
Deletion
Local rearrangement
Inversion
Chromosomal translocation
Balanced
translocation
Unbalanced
translocation
Isochromosome,
ring chromosome
Holland, AJ & Cleveland, DW. Nat Med 2012
Alteraciones estructurales del DNA en cáncer
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Guión de la presentación
Concepto de la hibridación in situ
Hibridación con sondas radiactivas (John, 1969)
Hibridación fluorescente (Pinkel, 1986) para marcado de cromosomas y de
cambios en genes
La base de las técnicas de
hibridación de DNA
Estrategias para el estudio de alteraciones
cromosómicas:
Hibridación in situ de DNA
1. Desnaturalización de las sondas de DNA
2. Desnaturalización del molde de DNA
(cromosoma)
3. Annealing (renaturalización, hibridación de
las pruebas)
4. Lavado de posthibridación, astringencia
(SCC, formamida)
5. Contratinción de los núcleos (DAPI, PI)
Hibridación in situ de fluorescencia
Sondas específicas de locus, centroméricas y
teloméricas
Normal
Abnormal
Centromeric probes Gene-specific probes
Telomeric probes
Sondas de fusión (fusion-probes) y de
separación (break-apart / split-probes)
Hoff, K et al. Anat Pathol 2010
Rhodamine
/ Texas red-
labeled
DNA probe
FITC-
labeled
DNA
probe
Anti-Texas
red
conjugated
with AP
Anti-FITC
conjugated
with HRP
Chromogenic
detection
Chromogenic
detection
Texas
red-
labeled
DNA
probe
FITC-
labeled
DNA
probe
DNP-
labeled
DNA
probe
DNP-
labeled
DNA
probe
Anti-DNP
conjugated
with HRP
Anti-DNP
conjugated
with AP
Silver
acetate
detection
Chromogenic
detection
FISH CISH SISH
Estrategias para el estudio de alteraciones
cromosómicas: Hibridación in situ
Estrategias para el estudio de alteraciones
cromosómicas: Hibridación in situ de DNA
Aplicaciones
• Detección de aneuploidia
• Análisis de centrómeros
• Estudio de cromosomas
• Análisis de genoma completo (pintado
cromosómico)
• Identificación de traslocaciones
• Detección de genes
• Estudio de microdeleciones
• Determinación de amplificación y
deleción génica
• Cromosomas en metafase
• Núcleos en interfase
• Tejidos fijados
• Células en cultivo
Estrategias para el estudio de alteraciones
cromosómicas:
Hibridación in situ de RNA (mRNA y miRNA)
Estrategias para el estudio de
alteraciones cromosómicas:
Cariotipo espectral, m-FISH
5
1
1
2
3
X
5
13
6 6
14
9
X
9
9
X
9
9
X
9
15
12
7
5
13
6
14
der(1)t(1;5)
B6-15 B6-1, B6-15
der(2)t(1;2) der(3)t(X;3)
HT29, C7-1, C7-15 HT29, C7-1, C7-15
der(5)t(5;13)
HT29, C7-1, C7-15
der(6)t(6;14)
B6-1, B6-15
der(6)t(X;6;9)
ins(X;9)
HT29 C7-15
der(9)t(X;6;9) der(12)t(7;12)
B6-15 HT29, C7-1
der(13)t(5;13)
HT29, C7-1, C7-15
der(14)t(6;14)
C7-1, C7-15
dup(19p)
- muestra cambios del número de copias de secuencias de DNA (pérdidas, ganancias y amplificaciones),
pero no detecta traslocaciones balanceadas.
- puede utilizarse tanto tejido fresco como fijado en formol y su sensibilidad es afectada por el porcentaje
de células tumorales de la muestra.
Estrategias para el estudio de
alteraciones cromosómicas:
Hibridación Genómica Comparada (CGH)
Estrategias para el estudio de
alteraciones cromosómicas:
Hibridación Genómica Comparada (CGH)
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Guión de la presentación
Traslocaciones en procesos linfoproliferativos
Jain, S et al. Int J Clin Exp Pathol 2010
Traslocaciones en sarcomas
Síndromes hereditarios asociados a sarcomas
en edad pediátrica
Slater, O & Shipley, J. J Clin Pathol 2007
• Alteraciones estructurales del DNA y
cáncer
• Hibridación in situ: concepto y tipos de
sondas
• Aplicaciones: diagnóstico, pronóstico y
predicción
• Tres ejemplos de estudio de traslocaciones
y de alteraciones numéricas
Guión de la presentación
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Chromosome 18
Chromosome X
Before translocation After translocation
Jefferson T, D Mol Pathol, 2005
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
•Los productos de fusión SYT-SSXn
actúan como proteínas nucleares
reguladoras de la expresión génica
pero carecen de dominio de unión a
DNA
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Amary, MFC et al. Mod Pathol 2007
Sarcoma sinovial:
Traslocación (X;18)(p11;q11)
Normal
Abnormal
SYT 3’
SYT 5’
Oxnard, GR et al. J Clin Oncol 2013
Targetable genes in NSCLC
Doebele RC et al. Clin Cancer Res 2012
Traslocación de ALK en cáncer de pulmón
Doebele RC et al. Clin Cancer Res 2012
Traslocación de ALK en cáncer de pulmón
Traslocación de ALK en cáncer de pulmón
Lindeman, NI et al. Arch Pathol Lab Med. 2013
- Evaluación de > 50 células
- Separación de señales: la distancia entre ambas equivale al diámetro de
una señal o se detecta únicamente la señal 3’
- > 15% de las células con alteración
ALK-3’
ALK-5’
Gerami, P et al. Am J Surg Pathol 2009
Bastian, BC et al. Am J Pathol 2003
Bastian, BC et al. Cancer Res 1998
Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas
North, JP et al. Am J Surg Pathol 2014
Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas
RREB1
CCND1
MYB
CEP6
Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas
Nú
me
ro d
e c
élu
las
Número de señales por núcleo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 1 2 3 4 5
CEP6
MYB
REBB1
CCDN1
% núcleos con incremento del gen RREB1:
% núcleos con ganancia relativa del gen RREB1:
% núcleos con incremento del gen CCND1:
% núcleos con pérdida relativa del gen MYB:
57% (> 29%)
73% (> 55%)
6% (> 38%)
55% (> 40%)
Utilidad del FISH en el diagnóstico diferencial en lesiones melánicas cutáneas
Mensajes finales
Las técnicas de hibridación in situ permiten
determinar alteraciones estructurales del
DNA (y el estudio de RNA)
Utilidad diagnóstica, pronóstica y predictiva
de respuesta