Presentación de PowerPoint€¦ · Clase 2 de Cromatografía . CONTENIDOS DE LA CLASE I-...
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Preguntas que puedo resolver con una cromatografía: 1- ¿Qué alcoholes y en qué concentraciones puedo encontrar en un vino? 2- ¿Hay residuos de pesticidas en las cáscaras de naranjas? Mancozeb (preventivo); carbendazim (curativo) 5 ppm 3- ¿Qué aminoácidos se acumulan en las hojas de trigo durante la etapa de llenado de granos?
CROMATOGRAFIA
SEPARAR-IDENTIFICAR-CUANTIFICAR
Permite separar analitos muy similares en sus propiedades físicas y químicas.
Enfermedades fúngicas
Necesitamos diferenciar entre etanol y metanol
CONTENIDOS DE LA CLASE I- Cromatografía: presentación general del método analítico y
presentación de términos nuevos propios de las cromatografías. Fase estacionaria, fase móvil y soporte Diferentes formas de clasificar a los métodos cromatográficos II- Cromatografía en columna: formas de realizarla, parámetro que se
mide. III- Cromatografía plana: formas de realizarla, parámetros que se
miden. IV- Cromatógrafos y cromatogramas: Equipos, descripción y análisis
de los gráficos.
Cla
se 1
C
lase
2
Fase estacionaria contenida en un soporte
Inyección de la muestra: punto de siembra
Muestra: dos analitos muy similares que necesito separar
Descripción general de una cromatografía
Fase estacionaria contenido en un soporte
Inyección de la muestra: punto de siembra
Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra
Descripción general de una cromatografía
Fase estacionaria contenida en un soporte
Fase móvil: circula atravesando la fase estacionaria y empuja a la muestra
Descripción general de una cromatografía
FASE ESTACIONARIA (FE): fija en un soporte sólida o líquida gaseosa cuanto más homogénea sea más eficiente será la separación cromatográfica FASE MÓVIL (FM): «empuja» a la muestra a través de la fase estacionaria líquida o gaseosa sólida FM líquido: CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA FM gas: CROMATOGRAFÍA GASEOSA la eficiencia de la separación cromatográfica se relaciona con la velocidad de FM SOPORTE: cromatografía plana: vidrio (capa fina); papel cromatografía en columna: vidrio; vidrio con relleno; capilares
1- Toda cromatografía pone en contacto dos fases inmiscibles. 2- La FM «empuja» a los analitos atravesando la FE.
3- Los analitos se desplazan a diferentes velocidades dependiendo de su afinidad por cada fase.
Clasificación de las cromatografías según el estado de agregación de las fases:
Fase móvil Fase estacionaria Cromatografía
Gas Liquida CGL
Sólida CGS
Líquida Liquida CLL
Sólida CSL
Clasificación de las cromatografías según la forma de contacto entre las fases (lo que depende del soporte):
Plana Columna
Placa de vidrio ó papel Wathman N° 1 Vidrio con relleno ó capilar
FM se mueve por acción capilar o por efecto de la gravedad.
FM se mueve por presión o por gravedad
Parámetro que se mide: Rf Parámetro que se mide: tr ó Vr
Lecho abierto Elución
Revelado Detector
Trabajo práctico
Clasificación de las cromatografías según el equilibrio existente entre las fases (mecanismo de separación):
Nombre Algunas características
C. de Adsorción FE sólida y FM líquido / gas Diferencias en la polaridad
C. de Reparto FE líquido y FM líquido / gas Diferencias en la polaridad
C. de intercambio iónico FE resina (sólido) con grupos cargados unidos covalentemente. FM líquido (gas) Reacción entre iones de carga opuesta.
C. de Exclusión molecular FE gel poroso FM líquido ( gas) Tamaños
C. de Afinidad FE especialmente diseñada para atrapar a un soluto en particular. Muy selectiva
Trabajo práctico
Trabajo práctico
Cromatografía de exclusión molecular: separa por tamaño
Moléculas grandes salen primero de la columna: menos retenidas por la fase estacionaria, tr pequeño.
¿Moléculas pequeñas?
Cómo será el tr???????
Frente de la
fase móvil
Línea de
siembra
Fase móvil
(líquido)
Soporte Frente de la
fase móvil
Línea de
siembra
Parámetro
Rf: RELACIÓN DE FRENTES
Rf= distancia recorrida por el analito/distancia
recorrida por la fase móvil
Rfx=dx/dFM
CROMATOGRAFÍA PLANA
REVELADO: permite poner en evidencia donde
quedó cada uno de los analitos separados
C. plana ascendente
Fase estacionaria????
Ejemplos de cromatografía plana
Pigmentos de hojas de espinaca
Pigmentos de cáscara de mandarinas
Control de impurezas
RF como criterio de identificación
Solución X(mm) Y(mm) Rf
Maltosa 20 144 0,1388
Glucosa 30 144 0,2083
Sacarosa 25 144 0,1736
Fructosa 33 144 0,2292
JUGO 20,1;
33,2 144
0,1395;
0,2305
Malt Gluc Sac Fruc JUGO
Placa de vidrio (soporte) con silicagel (FE) FM:butanol-acético-agua Revelado: resorcinol (universal para azúcares)
Línea de siembra
Frente del solvente
Y
X
Trabajo práctico: Cromatografía en papel
El jugo NO tiene glucosa y
sacarosa; posiblemente SI tiene
maltosa y fructosa.
Problema para resolver: La tabla muestra los resultados obtenidos en una cromatografía de papel. Explique el significado de Rf y sus valores extremos. Ordene los analitos de menor a mayor en cuanto a su afinidad por la fase móvil. Justifique.
Analito Rf
Glutamina 0,38
Lisina 0,78
Arginina 0,25
Cuestionario de cromatografía.
https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8
Fase estacionaria
Fase móvil
Soporte: columna
muestra(A y B)
Cromatografía en columna
Parámetro en función del tiempo
tr: TIEMPO DE RETENCIÓN
ELUCIÓN
A B
FM= eluyente
Fase estacionaria
Fase móvil
Soporte: columna
muestra(A y B)
Parámetro en función del
volumen de FM que circuló por la
columna
Vr: VOLUMEN DE RETENCIÓN
Cromatografía en columna
ELUCIÓN
A B
FM= eluyente
Cromatografía de intercambio iónico
FE: resina con carga positiva Intercambiadora de aniones
cationes
aniones
FE: resina con carga negativa Intercambiadora de cationes
Trabajo práctico
Fase estacionaria puede ser: Resina con grupos sulfónicos (cargas negativas) Resina con aminas cuaternarias (cargas positivas)
Clase 2 de Cromatografía
CONTENIDOS DE LA CLASE I- Cromatografía: presentación general del método analítico y
presentación de términos nuevos propios de las cromatografías. Fase estacionaria, fase móvil y soporte Diferentes formas de clasificar a los métodos analíticos II- Cromatografía en columna: formas de realizarla, parámetro que se
mide. III- Cromatografía plana: formas de realizarla, parámetros que se
miden. IV- Cromatógrafos y cromatogramas: Equipos, descripción y análisis
de los gráficos.
Cla
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C
lase
2
Fase estacionaria
Fase móvil
Soporte: columna
muestra(A y B)
Parámetro en función del tiempo
que transcurre desde que
inyectamos la muesta hasta que
salen los analitos.
tr: TIEMPO DE RETENCIÓN
Cromatografía en columna
ELUCIÓN
A B
FM= eluyente
Parámetro en función del
volumen de FM que circuló por la
columna.
Vr: VOLUMEN DE RETENCIÓN
Cromatógrafo gaseoso
FM: gas
Tubos de gas y válvulas
reguladoras de presión
Detector de CG: Conductividad térmica FID (detector de ignición a la llama)
Componentes de un cromatógrafo gaseoso
Reservorio de FM (gas)
Cromatógrafo HPLC (cromatografía líquida)
Detectores CL: índice de refracción; espectrofotometría UV-Vis.
Componentes de un HPLC (cromatógrafo líquido de alta resolución)
Reservorio de fase móvil
Ejemplos de cromatogramas registrados en un cromatógrafo
Columna rellena, 10 cm de largo y 0,3 cm diámetro FE: Polímero Acclaim Trinity P2 FM: Acetonitrilo – Buffer pH 4 Temperatura 60° C Caudal: 0,50 mL/min Vol de inyección: 5 µL
Contenido de azúcares en una etapa de la fermentación
Datos del cromatograma:
tr: identifica al analito.
Área bajo el pico: indica la
cantidad de analito.
Ancho de la base: relacionado
con la eficiencia de la
cromatografía.
Análisis de un cromatograma
V´r = Vr-VM (VM volumen muerto de la columna)
tr = tiempo de retención Vr = volumen de retención t´r = tr-tM (tM tiempo muerto de la columna)
Área del triangulo:
base x altura
2
Línea de base: corresponde a la salida de fase móvil sin ningún analito.
Ancho de la base del pico: W
1-
2-
3-
4-
W
Parámetro
cuantitativo Área bajo la curva Parámetro cualitativo
Tiempo de retención
A B
C patrones
muestra desconocida
Señ
al d
e d
etec
tor
Tiempo ó Volumen
Rs = (trB – trA) (WA + WB ) 2
W:ancho del pico Cuanto más ancho es el pico más va a comprometer a la resolución.
RESOLUCIÓN
Rs >1,5 OK
Alta eficiencia
Baja eficiencia
Alta eficiencia
Baja eficiencia
Los picos deben ser agudos, es decir W pequeños
Una baja eficiencia terminará complicando la resolución, es decir los picos no se separan.
Eficiencia de una columna: Teoría de los platos teóricos Según la teoría de los platos teóricos…..la eficiencia de la columna para un determinado analito se relaciona con el número de equilibrios que se pueden establecer dentro de la columna (N).
N: Número de platos teóricos H: Altura equivalente del plato teórico
H = L/N (L es la longitud de la columna)
Eficiencia de la columna N H
Señ
al d
e d
etec
tor
Tiempo (min)
L= 5 cm tr W
Pico 1 5 7,2
Pico 2 12,5 6
L= 10 cm tr W
Paracetamol 2,665 0,34
Ibuprofen 3,673 0,22
1- Calcular la eficiencia de la columna para cada analito (N y H). 2- Calcular la resolución de los picos.
B: difusión longitudinal
¿Qué factores determinan el ancho de los picos? (y por lo tanto la eficiencia de la columna?)
FE: tamaño de partículas y
empaquetamiento
Coeficiente de difusión de los analitos en
ambas fases, por lo tanto de la
TEMPERATURA
VELOCIDAD CON QUE CIRCULA LA FM
C: RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MASA
FE y FM
Temperatura
VELOCIDAD CON QUE CIRCULA LA FM
¿Qué puedo modificar experimentalmente?
µ
Hmin
µop
difusión en remolino
H
Velocidad con que circula la fasemóvil: µ
Problemas a resolver: 1- En el caso de una cromatografía en columna a) ¿Cuáles son los parámetros que puede obtener de un cromatograma? b) ¿Cómo puedo obtener la eficiencia y la resolución de una columna a partir de
estos datos? c) ¿Cuáles son los factores que pueden modificar la eficiencia de una columna?
Justifique su respuesta.
2- La tabla muestra los resultados obtenidos del cromatograma correspondiente al análisis de ácidos grasos presentes en semillas de maracuyá. Calcule la eficiencia de la cromatografía para cada uno de los analitos obtenidos. Calcule la resolución de la columna para cada par de analitos indicando si han sido resueltos. Indique cuál es el analito con mayor afinidad por la fase estacionaria y cuál es el que tiene mayor afinidad por la fase móvil, justifique su respuesta.
analito tr W
palmítico 13,67 2
esteárico 15,63 3
oleico 15,96 5
linoleico 16 5
linolénico 17,65 9
Bibliografía Química analítica cuantitativa. R.A.Day, JR.A.L. Underwood. 5ta. Edición. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A.1r. Edición 1989. Capítulos 17 y 18. https://www.youtube.com/watch?v=dXR9wcK-LUo High Performance Liquid Chromatography HPLC . Fecha de acceso 16/05/18 https://www.youtube.com/watch?v=e_ZAsfZ1AUo Cromatografía gaseosa en español. Fecha de acceso 16/05/18