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INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN EXPERIMENTAL CURSO DE FARMACOLOGÍA 2008

ARTÍCULO ORIGINAL EFECTO ANTIDIARRÉICO Y ANTIESPASMÓDICO DEL EXTRACTO METANÓLICO DE PUNICA GRANATUM L. (GRANADA) EN RATONES Ochoa Christiam L., Chapoñan Martin O., Granda Cecilia A., Quintana Willy, Chauillco Xavier W., Puerta Everth B., Gutierrez Graham

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA, FACULTAD DE MEDICINA SN FERNANDO UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS. [email protected]: correspondencia del autor. Entregado el 22 de julio de 2008 al Departamento de Farmacología Facultad de San Fernando -UNMSM

RESUMEN INTRODUCCIÓN.- La granada (Punica granatum L.) es empleada tradicionalmente en nuestro país y en muchos otros para tratar la diarrea aguda simple. No existe mucha información sobre la validación pre clínica del efecto antidiarréico y antiespasmódico del extracto de la cáscara de granada actualmente, por lo cual nos propusimos comprobar su actividad farmacológica como parte de un estudio pre clínicos.

METODOLOGÍA.- Para comprobar el efecto antidiarréico en ratones machos (laca strain), primero se formaron 3 grupos aleatoriamente de 6 ratones cada uno. El grupo 1 sirvió de control negativo (1 ml solución salina), el grupo 2 recibió el extracto metanólico (300mg/kg v.o) reconstituido en agua y el grupo 3 recibió Loperamida (3g/kg v.o.). Media hora después se administró el aceite de ricino (0.3ml) como inductor de diarrea. Para comprobar el efecto antiespasmódico se empleó el modelo in vivo de tránsito intestinal en ratones. Se formaron 3 grupos aleatoriamente. Un grupo con el extracto de granada metanólico reconstituido en agua (300mg/kg v.o.), un control positivo con Loperamida (3g/kg. v.o.) y un control negativo que solo recibió solución salina (1ml).

RESULTADOS.- Se encontró que en el tratamiento con extracto metanólico de granada disminuyó significativamente la cantidad total de deposiciones (7) frente al control negativo (20) después de 2 horas de inducción. Por otra parte, el tiempo de aparición de la primera defecación semilíquida del grupo granada fue 80 minutos mas tarde que la del grupo control negativo. También se encontró que en el tratamiento con el extracto de granada el tránsito intestinal disminuyó significativamente (61.55% ± 21.26) respecto del control negativo (95.97% ± 2.53) pero no frente al grupo con Loperamida (18.69% ± 7.23) para un p<0.05.

CONCLUSIÓN.- Los resultados hallados demuestran el efecto antiespasmódico y el efecto antidiarréico del extracto metanólico reconstituido en agua de Punica granatum en ratones probablemente debido al alto contenido de taninos, antocianinas y polifenoles con propiedades antisecretorias, antiespasmódicas y antiinflamatorias en la mucosa gastrointestinal.

Palabras clave: antidiarréico, antiespasmódico, Punica granatum, aceite ricino


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ABSTRACT BACKGROUND.- pomegranate (Punica granatum) in used in our country and other countries around the world as a traditional medicine for treatment of simple acute diarrhea. There is no much information of preclinical validation of antidiarroheal and antispasmodic effect of pomegranates extract. We purpose probe the pharmacological activity of this plant as a part of a preclinical study.

METHODS.- to probe the antidiarroheal effect in mice we divided them in 3 groups of 6 mice each one. Group one was used as negative control (1ml saline solution), group 2 received metanolic extract of pomegranate (300mg/kg v.o.) and group 3 received loperamide (3g/kg i.p.). After 30 minutes they were given 0.3ml of castor oil as a diarrhea inductor. To probe de antispasmodic effect we used and in vivo model of intestinal transit in mice. 3 groups were formed randomly. One group received metanolic extract (300mg/kg v.o.), one positive control with loperamide (3g/kg i.p.) and a negative control which only received saline solution (1ml).

RESULTS.- It was found a significant decrease in the number of defecations in pomegranate group (7) compared with the control (20) after 2 hours form induction. On the other hand, the time elapsed for the first semiliquid defecation was 80 minutes later in pomegranate group than negative control. We also found a significant decrease in intestinal motility in metanolic extract group (61.55% ± 21.26) compared with the negative control (95.97% ± 2.53). However there was no statistic difference with the loperamide group (18.69% ± 7.23) using a p<0.05.

CONCLUSION.- the results founded in the experiment shown the antispasmodic and antidiarroheal effect of Punica granatum in mice probably due the high contends of tannins, antocianins and polifenols which have antisecretory, antiespasmodic and antiinflamtory effect over the gastrointestinal epitelium.

KEY WORDS: antidiarroheal, antispasmodic, Punica granatum, castor oil

INTRODUCCIÓN La diarrea aguda es uno de los problemas más importantes que se afrontan en la salud pública. Los cuadros de diarrea aguda afectan a todos los grupos etarios, siendo más prevalente en los niños menores de 5 años. En este grupo poblacional las muertes producidas por los cuadros de diarrea aguda se calculan entre 5-8 millones por año, siendo la mayoría de casos pertenecientes a los países en vía de desarrollo (1).

La OMS la define como “la presencia de tres o más deposiciones líquidas dentro de 24 horas” (2). La diarrea se refiere a una disfunción en la absorción y secreción y electrolitos a nivel del epitelio intestinal. La alteración en la motilidad intestinal también contribuye a la producción de la diarrea. Las consecuencias de estas disfunciones se reflejan en la alteración de la frecuencia, cantidad y volumen de deposiciones (3).

La diarrea es producida por una serie de mecanismos endógenos y exógenos. Algunas condiciones patológicas como diabetes mellitus, síndrome de intestino irritable, enfermedad del colágeno vascular, entre otras, pueden producir cuadros de diarrea (4).

Los mecanismos exógenos que producen diarrea son más importantes en la producción de la diarrea. Sustancias como los órganofosforados o agentes procinéticos pueden producir diarrea. Muchas infecciones por organismos patógenos


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dan como resultado cuadros de diarrea; entre ellos están bacterias como Vibrio cholerae, (diarrea de tipo acuosa), Salmonella typhi y Shigella spp (diarrea de tipo sanguinolenta); parásitos como Giardia lamblia, Cryptosporidium, Ciclosporidium, Microsporidium; virus, principalmente los rotavirus. (5)

A nivel molecular una serie de sustancias están involucradas en la producción de la diarrea. Entre ellas se encuentran neurotransmisores como la acetilcolina, la sustancia P, taquininas (NK1 y NK2) y otros mediadores como VIP y PAF (6).

Las sustancias que se usan para combatir la diarrea son aquellas que combaten los mecanismos específicos por los cuales se produce la diarrea como los antibióticos y antiparasitarios. La sustancias inespecíficas tienen como mecanismo de acción reducir la motilidad y secreción como la atropina, la papaverina y la loperamida, entre otras (7).

La Punica granatum L. conocida popularmente como granada es un árbol frutal de la familia Punicaceae; originaria de Asia Menor (Arabia). Los principales constituyentes de la granada son los taninos hidrosolubles y condensados, así como alcaloides. Los taninos hidrosolubles son polioles con ácido gálico como sustituyente del éster, y los condensados son cadenas de flavan-3 ol como las catequinas y las epicatequinas. Otras sustancias extraídas del fruto de la granada como la punicalagina y la punicalina han sido reportadas como taninos hidrosolubles tóxicos a grandes dosis (8).

El uso popular extendido de esta planta le ha otorgado propiedades útiles para la medicina. Numerosas investigaciones realizadas con Punica granatum han demostrando su enorme potencial terapéutico, posee actividad antiespasmódica, antioxidante, anticancerígena, antiparasitaria y ya se encuentra en fase de estudios preclínicos sus propiedades como antiviral (9). Su actividad anti-influenza ha sido estudiada teniendo como modelo animal embriones de pollo, determinando las dosis no tóxicas del extracto hidroalcohólico de la planta, corroborando la razón de su uso folclórico en Cuba para el tratamiento de afecciones respiratorias (10).

Su efecto anti-angiogénico y pro-apoptótico que derivan de sus componentes fitoquímicos, son estudiados como una alternativa terapéutica natural para el tratamiento del cáncer. Las proantocianidinas presentes en la cáscara tiene propiedades antiangiogénicas. Fitoquímicos como el tocoferol, entre otros, presentes en el extracto acuoso de la cáscara de Punica granatum provocaron una ruptura del DNA de líneas celulares de Linfoma de Burkkit (11).

El extracto metanólico de las semillas de Punica granatum demostraron su efecto antidiarreico, basado en la actividad antisecretoria de la planta, frente a la inducción de diarrea por aceite de ricino y un aumento de la secreción intestinal de PGE2, en modelos experimentales de ratas (12).

Por lo expuesto anteriormente, se decidió trabajar con un extracto metanólico de la cáscara de Punica granatum a dosis de 300mg/kg en modelos de ratones albinos, para evaluar su efecto antidiarreico y antiespasmódico inducido por aceite de ricino, teniendo como fármaco de comparación a la loperamida.


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MATERIALES Y MÉTODOS

PREPARACIÓN DE PLANTA Y DEL EXTRACTO La cáscara del fruto de Punica granatum (granada) fueron secadas a 38ºC en un

horno con aire circulante en el laboratorio de Farmacología de la Facultad de Medicina

de la UNMSM. El extracto metanólico de la cáscara del fruto se preparó según la

técnica del CYTED 1995 (13). El material seco fue pulverizado en un molino de cuchillas

y se maceró con metanol durante 72 horas a temperatura ambiente. Se filtró y el

filtrado se desecó a 38ºC en una estufa. El residuo seco se conservó en frasco color

ámbar a 4ºC hasta su uso. Al dosificarlo se reconstituyó el extracto en agua destilada.

ANIMALES Y TRATAMIENTO Se compraron 36 ratones macho (Laca strain) de 20-25g de peso de los bioterios del

Instituto Nacional de Salud (Chorrillos). Se les acondicionó un ambiente higiénico, con

temperatura ambiente de 23°C con agua y alimento balanceado estándar de ratón ad

libitum. Las consideraciones éticas se hicieron de acuerdo a los lineamientos del

departamento de Farmacología de la UNMSM. Los grupos fueron separados para 2

experiencias diferentes tratados de la siguiente manera:

MEDICIÓN DE LA MOTILIDAD INTESTINAL: EXPERIENCIA 1

Se formaron 3 grupos de 6 ratones cada uno.

Control negativo: recibieron una dosis con suero fisiológico 30 minutos antes de

la comida de carbón

Control positivo: este grupo recibió una dosis de loperamida 3g/kg v.o. 30

minutos antes de comida de carbón.

Tratamiento con EMG.- recibió una sola dosis intragástrica de extracto

metanólico de granada reconstituido en agua (EMG) (300mg/kg) 30 minutos antes

de la administración de carbón.

Los animales ayunaron 6 horas antes del experimento con agua ad libitum. El

momento del experimento todos los animales recibieron sus tratamientos

respectivos descritos líneas arriba y media hora después 1ml de comida de

carbón (10% carbón desactivado y 90% solución vehículo). Los animales se

sacrificaron 30 minutos después de administrado el carbón. El abdomen se

diseccionó y se evisceró todo el intestino empezando en el borde del píloro hasta

el ciego y se colocaron sobre papel bond de 80g. La distancia del carbón se midió

y se expresó en porcentaje de tránsito intestinal (%= distancia viajada por el

carbón / total del intestino del ratón multiplicado por 100).


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EXPERIMENTO DE DIARREA INDUCIDA POR ACEITE DE RICINO: EXPERIENCIA 2

Los ratones se dividieron en 3 grupos de 6 animales cada uno. El grupo 1 que

sirvió de control negativo (2 ml solución salina), el grupo EMG (300mg/kg v.o.) y el

grupo control positivo que recibió loperamida (3mg/kg v.o.). Una hora después la

diarrea se indujo administrando 0.3 ml de aceite de ricino vía oral (obtenido en la

Facultad de Farmacología de la UNMSM) a todos los grupos. Inmediatamente

después se empezó el conteo de defecaciones teniendo en cuenta frecuencia de

la primera deposición semilíquida y el número total de deposiciones semilíquidas

al cabo de 2 horas de observación.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

VARIABLES Tránsito intestinal: se refiere a la distancia recorrida por la sustancia marcadora

(carbón), siendo el 100% del recorrido la longitud del tubo digestivo que abarca

desde el píloro hasta la válvula íleo-cecal.

Actividad antiespasmódica: se define como la capacidad de reducir la motilidad

intestinal, medida por la reducción del porcentaje de tránsito intestinal con

respecto del grupo control negativo.

Diarrea inducida: se define como la aparición de deposiciones semilíquidas o

liquidas después de la administración de 0.3ml de aceite de ricino. Se medirá por

la frecuencia del a primera deposición y total de las deposiciones producidas en

las 2 horas siguientes a la administración de aceite de ricino.

Efecto antidiarréico: se define como la acción protectora del tratamiento frente a

la diarrea inducida por aceite de ricino medida por la frecuencia de la primera

deposición y el total de las deposiciones en un lapso de 2 horas después el

administración del inductor diarreico comparados con el grupo control negativo

PLAN DE ANÁLISIS

EFECTO ANTIESPASMÓDICO: Medidas las distancias recorridas por la comida de carbón en los distintos grupos,

los datos se presentaron con media, desviación estándar y se analizaron mediante

la prueba de t Dunnet para comparar los grupos tratamiento con el grupo control

con un p<0.05 aceptado como significativo.


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EFECTO ANTIDIARRÉICO: Se tabuló los resultados de las frecuencias de las primeras deposiciones y la

cantidad total de defecaciones de todos los grupos y se presentó en tablas de

contingencia para compararlos.

DISEÑO DEL ESTUDIO El diseño del estudio es de tipo prospectivo, analítico-experimental, aleatorizado,

completo, pre-clínico in vivo.

RESULTADOS

EFECTO ANTIESPASMÓDICO DE LA PUNICA GRANATUM El transito intestinal obtenido en el grupo control positivo con Loperamida (18.69% ± 7.23) fue bastante inferior al obtenido por el grupo control negativo (95.97% ± 2.53) con un p<0.05 (tabla1). De igual forma, el porcentaje de transito intestinal del grupo con tratamiento de extracto metanólico de granada (61.55% ± 21.26) fue considerablemente menor que el grupo control para p<0.05.

El grupo tratado con loperamida mostró la mayor reducción del transito intestinal (15.43% ± 5.84). El grupo con tratamiento de extracto metanólico mostro una reducción significativa del tránsito intestinal (61.55% ± 21.26) comparado con el grupo control negativo que logró un avance notable (95.97% ± 2.53).

El grupo tratado con extracto metanólico mostró reducción significativa del tránsito intestinal con respecto al grupo control negativo. Sin embargo, no es comparable estadísticamente con el grupo Loperamida. (anexo 1)

TABLA 1.- Efecto del extracto metanólico de la Punica granutum (EAG) y de la loperamida en el transito intestinal de ratones.

Tratamiento Longitud total del intestino (cm)

Distancia recorrida por el carbón (cm)

% tránsito intestinal

Control 61.66 ± 1.29 59.16 ± 1.29 95.97 ± 2.53 Loperamida (3 g/kg v.o.)

62.91 ± 4.58 14.58 ± 11.77 18.69 ± 7.23

EMG (300 mg/kg v.o.)

61.91 ± 7.18 42.5 ± 13.13 61.55 ± 21.26

Análisis estadístico: media y desviación estándar de 6 observaciones por grupo. Valores con p<0.05 fueron considerados significativos.


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EFECTO ANTIDIARRÉICO DE LA PUNICA GRANATUM La diarrea apareció después de 20 minutos en promedio en el grupo sin tratamiento (tabla 2). El grupo con extracto de granada y el grupo Loperamida mostraron la primera defecación mucho mas tarde pero a diferentes tiempos. La primera defecación semilíquida del grupo EMG se observo a los 80 minutos de inducir la diarrea con aceite de ricino. El grupo Loperamida no mostro defecaciones semilíquidas. En cuanto a la cantidad de deposiciones se observo marcada reducción de las heces en el grupo EMG comparado con el grupo control. Por otra parte, la Loperamida no mostro ninguna deposición semilíquida. Se observó durante toda la inducción signos de cólico abdominal intenso en el grupo control negativo pero no en los demás.

TABLA 2 Efecto del extracto metanólico de Punica granatum sobre la diarrea inducida por aceite de ricino en ratones.

Tratamientos Numero de heces acuosas en 2h

Tiempo de la primera defecación semilíquida

(minutos) Aceite de ricino + suero (2 ml/kg) 20 20

Aceite de ricino + EMG (300 mg/kg v.o.) 7 80

Aceite de ricino + loperamida (3g/kg v.o.) 0 No se observó

DISCUSIÓN DE RESULTADOS Los mecanismos fisiopatológicos de la diarrea incluyen aumento de la motilidad intestinal, aumento de la secreción intestinal, alteraciones de la absorción y procesos inflamatorios de la mucosa gastrointestinal. El proceso de la diarrea incluye números neurotrasnmisores como acetilcolina, noradrenalina y otros candidatos como ATP, CGRP,CCK-8, ENK, GAL, GABA, serotonina, NO, somatostaina, SP, VIP. Basados en le conocimiento limitado de todos estos factores desencadenantes de la diarrea capaces de alterar la secreción y motilidad del intestino numeroso trabajos se han encaminado par encontrar productos naturales o sintéticos que atenúen estos los efectos indeseados sin alteran los fisiológicos pero pocos resultados se obtuvieron tanto en eficacia como en seguridad (14). Los dos principales procesos implicados en todos los cuadros diarreicos agudos son el exceso de secreción por parte la mucosa en respuesta a la noxa de diversas toxinas producidas por agentes microbianos dentro del lumen intestinal y a la alteración de la mucosa gastrointestinal producto de un proceso inflamatorio subyacente que altera la permeabilidad, produce exudado y disminuye la capacidad de absorción (15). Los fármacos y productos naturales que se utilizan para atenuar los cuadros diarreicos utilizan sus principios activos para trabajar a nivel de estas dos principales causas de la diarrea principalmente.

La Loperamida es un derivado butiraminico de piperidina con actividad sobre el receptor u y es un fármaco antidiarréico activo por vía oral. Es antisecretorio contra la


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toxina del cólera, E. coli y actúa en receptor tipo G1 (16). En el estudio se confirmó los efectos antiespasmódicos de la Loperamida evidenciados por el avance del carbón activado mucho menor que del control con un p<0.05. Similar resultado obtuvieron K. Sairam y cols. cuando compararon el efecto antidiarréico de la Mangifera indica utilizando loperamida como control positivo en ratones (17).

El grupo tratado con el extracto metanólico de granada reconstituido en agua (EMG) obtuvo diferencia significativa con un p<0.05 con respecto del control en los modelos de disminución de motilidad intestinal y efecto antidiarréico. Esto confirma las propiedades antidiarréicas que se le atribuyen a este producto natural. Iguales resultados en cuanto a la motilidad intestinal y el extracto de Punica granatum obtuvieron Das AK y cols. (18) al probar el efecto antidiarréico del extracto de semillas de la Punica granatum en ratas. Otro resultado parecido lo obtuvieron E. Y. Qnais y cols. que comprobaron el efecto antidiarréico del extracto acuoso del pericarpio de la granada en ratas (19) que a diferencia de nuestro experimento utilizaron un extracto acuoso en autoclave (120ºC) durante 15 minutos que garantizaba la presencia de algunos principios activos que se pierden en un proceso de extracción acuosa a base de deshidratación. El efecto global de inhibición del peristaltismo anormal que ejerce la granada se debe a diversos compuestos activos que contiene, principalmente taninos. La elevada concentración de gallotaninos y ellagitaninos como la punicalina y punicalagina (mayor a 28%) explica su acción antiespasmódica directa (20,21).

El aceite de ricino (castor oil) al contacto con las lipasas intraluminales libera acido rinoleico que actúa irritando la mucosa. El resultado final es una alteración de la membrana celular al flujo del agua y electrolitos aumentando significativamente la secreción intraluminal. Por otra parte, también se vio el papel del oxido nítrico en la inducción de diarrea por aceite de ricino, además de prostaglandinas y PAF. En el estudio del efecto antidiarréico de la granada se vio la disminución significativa de las deposiciones semilíquidas y retraso de la aparición de la primera deposición. Este efecto protector probablemente se deba a la constitución del extracto de Punica granatum que contiene flavonoides, polifenoles entre otros antiinflamatorios que reducen el efecto dañino del acido ricinoleico sobre la mucosa. Sin embargo, el principal principio activo que estaría implicado en la actividad antidiarréica de la Punica granatum son las antocianinas que se demostró son eficaces para inhibir la lipoperoxidación, la producción de oxido nítrico (NO) y la oxido nítrico sintasa (iNOS) en diferentes modelos experimentales. (22)

El efecto de la granada puede ser antiinflamatorio, antisecretorio y antiespasmódico por lo tanto actúa como agente antidiarréico eficiente para cuadros agudos de diarrea no complicados. Sin embargo, hay que considerar los efectos adversos que causa incluidos rash inexplicable, angioedema, urticaria, escozor, hinchazón de los labios, boca, lengua o garganta así como dificultades para deglutir. También se ha estudiado que la granada inhibe la isoenzima CYP3A4 hepática de rata y puede incrementar los niveles plasmáticos de carbamazepina y otras drogas que utilizan esta vía aunque su efecto no ha sido probado en humanos (23).


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CONCLUSIONES Los resultados hallados demuestran el efecto antiespasmódico y el efecto antidiarréico del extracto metanólico reconstituido en agua de la Punica granatum en ratones probablemente debido al alto contenido de taninos, antocianinas y polifenoles con propiedades antisecretorias, antiespasmódicas y antiinflamatorias en la mucosa gastrointestinal.

Se recomienda estandarizar la dosis para futuros estudios así como estudiar la dosis letal en animales de experimentación.

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