PRÁCTICA NÚMERO 1: Cultivos fúngicos
Transcript of PRÁCTICA NÚMERO 1: Cultivos fúngicos
PRACTICA NÚMERO 1: CULTIVOS FÚNGICOS
OBJETIVOS:
Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:
Diferenciar los diferentes tipos de medios de cultivo.
Diferenciar el crecimiento de levaduras y mohos en medios de cultivo
en placa y en tubo.
Señalar los pasos para realizar un microcultivo.
Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente:
aire agua y tierra.
MEDIO DE CULTIVO
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales
preparadas en el laboratorio. Al conjunto de estas soluciones líquidas o sólidas
que contienen los nutrientes necesarios para el crecimiento de los
microorganismos se les conoce como medio de cultivo.
El medio de cultivo es aquella solución que cuenta con los nutrientes
necesarios para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos
(bajo condiciones favorables de temperatura y pH, exento de todo microorganismo
contaminante), así como efectuar pruebas de susceptibilidad.
Los medios de cultivo pueden clasificarse:
Según su consistencia:
a. Líquidos
b. Sólidos
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
10
Los medios líquidos son infusiones preparadas bien sea colocando carne
picada en agua o disolviendo en esta un extracto de carne comercializado, no
llevan ninguna solución solidificante. Contienen proteínas, factores esenciales de
crecimiento y oligoelementos. A estos medios se les pueden añadir otros
nutrientes como peptonas y glucosa así como cloruro de sodio y un tampón de pH.
Los medios sólidos están constituidos por un medió líquido mas una
solución gelificante, como el agar en polvo que se disuelve por ebullición, que los
solidifica. Pueden ser trasvasados en tubos o placas de Petri. Estas últimas son
recipientes de vidrio o plástico transparente con una tapa y ofrecen una gran
superficie para la siembra.
Según su aporte nutritivo:
a. Básicos
b. Complejos
Los medios básicos contienen las sustancias mínimas para el crecimiento
de hongos metabólicamente no exigente. Pueden contener agar o no dependiendo
si se quieren sólidos o líquidos, respectivamente; peptonas, glucosa. Deben
poseer un pH y una osmolaridad adecuada para la multiplicación de los hongos.
Estos medios también pueden ser utilizados como base en la preparación de otros
medios como los enriquecidos, selectivos, entre otros.
Los medios enriquecidos pueden contener suero, sangre o factores
esenciales específicos como vitaminas o cofactores para el crecimiento de hongos
exigentes en requerimientos nutritivos y que no crecen bien en los medios básicos.
Según su finalidad:
a. Medios de aislamiento: Utilizados para el aislamiento de levaduras por
la técnica de agotamiento, han de ser sólidos. Ejemplo, Agar Sabouraud, Agar
Lactrimel
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
11
b. Medios selectivos: Son aquellos que permiten la recuperación de un
hongo en específico e inhiben el crecimiento de otro. Ejemplo, Sabouraud con
clicoheximida (inhibe hongos contaminantes como Aspergillus, etc).
c. Medios selectivos diferenciales: son aquellos medios utilizados para
recuperar o aislar un hongo en específico, por ello, para diferenciar las distintas
colonias, se les añade sustancias que confieren un color diferente a las colonias
según la distinta actividad metabólica. Para este propósito se utilizan azúcares
como el manitol, la lactosa, sorbitol y otros, junto a un indicador de pH como rojo
neutro, azul de bromotimol, etc. Ejemplo. CHROMagar Candida utilizado en la
identificación de Candida albicans, Candida krusei y Candida tropicalis.
Los medios de cultivo utilizados en micología contienen nutrientes
suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrógeno,
vitaminas, oligoelementos, etc). El pH ligeramente ácido tiende a facilitar el
crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros
microorganismos.
A los medios de cultivo se les puede añadir antibióticos antibacterianos para
inhibir el crecimiento de las bacterias saprófitas que suelen contaminar las
muestras. Los más usados son el Cloranfenicol y la Gentamicina. Se añade
también actidiona (Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos saprófitos
ambientales. Los medios cuya composición contengan actidione no debe ser
utilizados para el aislamiento de Cryptococcus neoformans, ya que inhiben su
crecimiento.
Entre los medios más empleados en la Micología se encuentran:
Medio Sabouraud Dextrosa (SAB):
Contiene un 2% de glucosa y es ligeramente ácido (pH=6.9), se considera
el medio estándar para recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que
pueden aislarse en el laboratorio de micología clínica. Es el medio estándar para
observar la morfología típica de los hongos, pero no es el medio ideal de
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
12
crecimiento o para estudiar la esporulación. Permite el crecimiento de
actinomicetos aerobios.
Se utiliza indistintamente en tubo o en placa.
Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina:
Es el medio Sabouraud clásico con la incorporación de los antibióticos
Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos
filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayoría de
bacterias. Se utiliza en tubo o en placa.
Agar Lactrimel de Borelli:
Se emplea para favorecer la producción de pigmentos y la esporulación de
la mayoría de dermatofitos. Contiene harina de trigo, leche descremada en polvo,
agar, miel y antibiótico.
Los medios de cultivo pueden ser preparados en placa o en tubo. Los
medios en placa tienen la ventaja de ofrecer mayor superficie para el aislamiento
pero, para soportar la deshidratación durante el largo período de incubación a que
van a ser sometidos (un mes o más), has de contener una gruesa capa de medio
(25 a 40 ml). Son más peligrosos a la hora de su manipulación y fáciles de
contaminar. Mientras que los medios en tubo tienen una superficie de trabajo
mucho más pequeña, pero ofrecen máxima seguridad en su manipulación y buena
resistencia a la deshidratación y a la contaminación. (Figura 2 y 3)
Figura 2: Medio de cultivo en placa de Petri.
Figura 3: Medio de cultivo en tubo
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
13
A la hora de elegir un medio de cultivo adecuado se debe tener en cuenta el
tipo de muestra y los microorganismos fúngicos que requieren ser aislados. Si la
muestra procede de zonas presuntamente contaminadas, es fundamental incluir,
junto a los medios normales, medios que contengan sustancias inhibitorias de
bacterias y hongos saprofitos (cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida).
Tanto la muestra como las placas y tubos que se van a sembrar deben
manipularse por medidas de seguridad y para evitar contaminaciones ambientales,
los cultivos con crecimiento micelial (temperatura ambiente) de Histoplasma
capsulatum, Paraccoccidioides brasiliensis y Coccidioides posadasii o C. immitis
deben ser manipulados en campana de flujo laminar. Han de rotularse
adecuadamente, con el número de la muestra y la fecha en que se realiza la
siembra. Las placas se precintan con cinta de Parafilm, en la que se realizan un
par de aberturas, y los tubos se dejan con el tapón de rosca a medio cerrar (para
mantener la aerobiosis).
Para realizar un cultivo fúngico, generalmente los especímenes se colocan
sobre la superficie del medio de cultivo y se conservan a temperatura ambiente
(26 a 27 ºC); en caso de micosis sistémicas, es mejor a 30-37 ºC. Las levaduras
se siembran con técnica de agotamiento en placa. Los pelos y escamas se
disponen en fragmentos en diferentes puntos de la superficie del medio. En
líquidos, heces y pus se deben sembrar aproximadamente 0,5 a 1,0 ml por tubo.
Las levaduras se desarrollan en 24 a 48 horas, los contaminantes en dos a cuatro
días y la mayoría de los hongos patógenos requiere una a dos semanas.
La identificación de los hongos se basa en el examen macroscópico de la
colonia y en sus características microscópicas. Semejanzas macroscópicas como
la forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la producción de
pigmentos son muy útiles para la identificación (cuadro 1). En los medios de
cultivo las levaduras forman colonias húmedas, cremosas, opacas o pastosas, y
los hongos filamentosos producen colonias algodonosas, lanosas o pulverulentas.
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
14
En general, la morfología microscópica de los hongos es estable y presenta
pocas variaciones. La identificación definitiva se basa en la forma característica,
método de producción y ordenamiento de las esporas, siendo también importante
conocer el tamaño y la disposición de las hifas en el caso de los hongos
filamentosos, en los levaduriformes se observa la presencia de blastoconidias,
seudohifas, clamidosporas. (Cuadro 2)
CARACTERÍSTICAS
MACROSCÓPICAS HONGO FILAMENTOSO HONGO LEVADURIFORME
COLOR
Colonia
Reverso
Pigmento del medio
TAMAÑO DE LA COLONIA
Diámetro
ASPECTO
Aterciopelada,
algodonosa,
pulverulenta
Cremosa
Cuadro 1. Descripción macroscópica de los hongos
CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS HONGO FILAMENTOSO
HONGO
LEVADURIFORME
MICELIO
HIALINOSEPTADO
OBSERVACIÓN DE BLASTOCONIDIAS,
SEUDOHIFAS Y CLAMIDOSPORAS
ASEPTADO
DEMATIACEOSEPTADO
ASEPTADO
GRUESO
DELGADOPRODUCCIÓN, TAMAÑOY
DISPOSICIÓN DE LAS CONIDIAS
DEPENDIENDO DE LA ESPECIE
Cuadro 2. Descripción microscópica de los hongos
La preparación del material para la observación microscópica puede
realizarse en fresco, con cinta de celofán adhesiva o mediante cultivo en lámina
o microcultivo.
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
15
PREPARACIÓN EN FRESCO
Este procedimiento es el que utilizan la mayoría de los laboratorios, ya que
las muestras se preparan con facilidad y rapidez y además permite identificar
muchas de las especies de hongos más habituales. El mayor inconveniente de la
observación en fresco es que se puede alterar el ordenamiento característico de
las esporas al presionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es
válido en los casos en que es necesario conocer la disposición de las esporas.
Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuación:
1. Seleccionar una colonia aislada.
2. Calentar el asa en aguja (al rojo vivo) para esterilizar, dejar enfriar.
3. Extraer un fragmento de la colonia que contenga además un poco de
agar en la parte inferior.
4. Depositar el fragmento extraído sobre un portaobjetos en el cual,
previamente, se ha depositado una gota de azul de lactofenol.
5. Cubrir con un portaobjeto y presionar suavemente para dispersar la
colonia y el agar; de esta forma, la muestra está disponible para su
observación al microscopio.
PREPARACIÓN CON CINTA DE CELOFÁN ADHESIVA
Es un método rápido para observar microscópicamente los mohos sin
alterar el arreglo de sus conidias.
Una de las desventajas es que si la cinta transparente no se presiona con
suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya
que al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no se pueden
identificar.
En los casos en que mediante este método no se observen esporas deberá
realizarse la preparación en fresco.
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
16
El procedimiento se lleva a cabo como sigue:
1. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lámina portaobjeto.
2. Cortar un pedazo de cinta adhesiva transparente (2 a 3 cm) y fijarlo a un
asa en aguja.
3. Colocar la cinta sobre la superficie de la colonia de moho, haciendo presión.
4. Colocar la cinta sobre la lámina, cubrir con una laminilla.
5. Observar al microscopio.
MÉTODO DE MICROCULTIVO (Método de Riddel):
También llamado cultivo en lámina. Este cultivo se realiza una vez
recuperado el hongo del espécimen clínico. Es útil para la identificación de
especies de hongos filamentosos (exclusivamente).
La técnica de microcultivo se realiza de la siguiente manera:
1. Introducir en una placa de Petri un papel absorbente, una varilla de vidrio
en forma de U y una lámina portaobjeto. Esterilizar con calor seco.
2. Tomar una placa de Petri con agar Sabouraud o Lactrimel y bajo
condiciones de esterilidad cortar con un bisturí cuadros de 1 cm. de lado y
colocar uno de ellos sobre la lámina portaobjeto previamente esterilizada en
el paso 1.
3. Inocular en el centro de los cuatro lados del agar con el hongo en estudio y
colocar encima una laminilla o lámina cubreobjeto (Figura 4).
4. Humedecer el papel absorbente con aproximadamente 5 ml de agua
destilada estéril, para evitar desecación.
5. Incubar a temperatura ambiente. La colonia crecerá por debajo de la
superficie del cubreobjeto. Se examina el montaje periódicamente a simple
vista para determinar si la colonia ha crecido o se haya contaminado, se
deja por un lapso mínimo de 15 días.
6. Cuando es evidente el crecimiento, se retira cuidadosamente el cubreobjeto
con pinzas estériles y se coloca en un portaobjeto que contiene una gota de
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
17
azul de lactofenol. Si se desea un montaje permanente, se limpia la
superficie del portaobjeto e inmediatamente adyacente al borde del
cubreobjeto se aplica esmalte para uñas color claro.
7. Observar las dos láminas preparadas al microscopio óptico.
HONGOS CONTAMINANTES
Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos,
hallándose libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgánica en
descomposición. Las condiciones necesarias para que un hongo crezca en una
superficie son: existencia de esporas, base nutriente, humedad y temperatura
entre 4 y 38 oC.
El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado y edificios
puede producir en sus habitantes determinadas patologías entre las que cabe
destacar asma y alveolitis alérgicas. La contaminación ambiental por hongos en el
medio ambiente y en interior de edificios, es debida básicamente a hongos
filamentosos y levaduras.
Inoculo del hongo a los cuatro lados del cubo de agar
Cubo de agar
Lámina cubreobjeto
Varilla de vidrio en forma de “U”
Lámina Portaobjeto
Placa de Petri
Figura 4: Placa de microcultivo. Tomado de Arenas. Micología Médica Ilustrada. McGrawHill. México. 2003
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
18
Procedimiento para el aislamiento de hongos contaminantes
Aire:
Materiales: Placa de Petri con medio de cultivo Sabouraud o Lactrimel.
Las placas serán expuestas en diferentes ambientes (cerrados y externos),
mediante 2 procedimientos:
a. Captura por sedimentación:
1. Rotular una placa de Petri con el número del equipo de trabajo, profesor,
turno, fecha y lugar.
2. Destapar la placa y dejarla abierta por 10 minutos.
3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la próxima
actividad práctica.
b. Captura por choque sobre la superficie de agar:
1. Rotular una placa de Petri con el número del equipo de trabajo,
profesor, turno, fecha y lugar.
2. Destapar la placa y agitarla 10 veces.
3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la próxima
actividad práctica.
Agua:
Materiales: Un tubo con tapa de baquelita, estéril; 1 placa de Petri con Agar
Sabouraud o Lactrimel, pipeta Pasteur, hisopo estéril o asa de siembra.
1. Recolectar aproximadamente 10 ml de agua (poceta, filtros, entre otros.
Según le indique el profesor), con la ayuda de la pipeta Pasteur y colocarlos
dentro del tubo con tapa de baquelita estéril.
2. Rotular el tubo con el número del equipo de trabajo, profesor, turno,
fecha y lugar.
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
19
3. Sembrar la muestra en una placa de Petri con medio Sabouraud o
Lactrimel según le indique el profesor.
4. Rotular la placa con el número del equipo de trabajo, profesor, turno,
fecha y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la
misma.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la próxima actividad
práctica.
Tierra:
Materiales: 1 placa de Petri vacía y estéril, 1 placa de Petri con medio de
cultivo Sabouraud o Lactrimel, 1 baja lengua estéril, 1 tubo con tapa de baquelita
que contenga 1 ml de solución salina fisiológica (estéril).
1. Recolectar la tierra con baja lengua estéril y colocarla en la placa de
Petri estéril, vacía.
2. Llevar al laboratorio. Agregar una porción de tierra con la ayuda de un
baja lengua estéril dentro del tubo que contiene 1 ml de solución salina
fisiológica (SSF), mezclar para homogeneizar.
3. Agregar esta mezcla (Tierra+SSF) en la superficie de la placa de Petri
con agar Sabouraud o Lactrimel.
4. Rotular la placa con el número del equipo de trabajo, profaesor, turno,
fecha y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la
misma.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la próxima actividad
práctica.
Luego de la incubación por una semana a temperatura ambiente,
realizar el estudio macroscópico de las colonias aisladas (a simple vista),
anotando: color, presencia de pigmento, textura, bordes de la colonia.
Realizar también el estudio microscópico a través del reconocimiento de las
especies por medio de la morfología de las esporas.
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
20
ACTIVIDAD PRÁCTICA:
1. Describa las características macroscópicas de un hongo filamentoso y de un
hongo levaduriforme en medio de cultivo preparado en tubo y en placa de
Petri, siguiendo el siguiente esquema:
CARACTERÍSTICAS
MACROSCÓPICAS HONGO FILAMENTOSO HONGO LEVADURIFORME
COLOR
TAMAÑO DE LA COLONIA
ASPECTO
2. Describa las características microscópicas de un crecimiento micelial y uno
levaduriforme en láminas proporcionadas por el profesor, siguiendo
esquema. Dibuje las estructuras observadas.
CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS HONGO FILAMENTOSO
HONGO
LEVADURIFORME
MICELIO
PRODUCCIÓN, TAMAÑOY DISPOSICIÓN DE LAS
CONIDIAS
3. Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire,
agua y tierra.
Prác
tica
núm
ero
1: C
ultiv
os fú
ngic
os
21