Practica Nº 5

UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General

PRACTICA Nº 5

ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

Es bien conocido que las actividades vitales de los organismos están condicionadas por su ambiente. Modificando fundamentalmente estos factores, el organismo bien se adapta a las nuevas condiciones o en todo caso muere; en esto está implicado la magnitud y el tipo de cambio operado. Este es el aspecto en el que los microorganismos difieren de las células de plantas superiores y animales.

El conocimiento de los factores físicos que controlan la supervivencia y multiplicación de los microorganismos nos sirven como instrumento de control de la actividad bacteriana para ser esta incrementada, disminuida o destruida completamente.

El tipo de muerte bacteriana por agentes físicos está relacionado al número de bacterias sobrevivientes, lo que significa que el proceso de desinfección no es repentino sino gradual, en el que el número de microorganismos muertos por unidad de tiempo es mayor al principio y mucho menor cuando la acción continúa.

I. EFECTO DE LA TEMPERATURA

Las bacterias son TIENEN capacidad de sobrevivencia amplia con límites de temperatura variable, su rango decrecer y ejercer sus actividades está entre los 0 y 90°C.

CONDICIONES QUE VARIAN LA MUERTE TÉRMICA:

1. Contenido DE AGUA DEL MEDIO: La muerte bacteriana se genera por coagulación de las proteínas del protoplasma. Cuanto+es el % de agua en el medio,-será la T para matar la bacteria.

2. Contenido de agua de los organismos: A CANTIDAD - de agua, los microorganismos se secan y se produce +resistencia a la temperatura.

3. Concentración de hidrogeniones: Lo microorganismos mueren fácilmente en condiciones ácidas o alcalinas, requiriéndose temperaturas -menores que en medios neutros.

4. Composició n del medio: Los medios que contienen alta concentración de proteínas + la temperatura requerida para destruir bacterias, ya que las proteínas forman una película alrededor de los microorganismos como medio de protección indirecta ante situaciones desfavorables.

5. Edad de las células: Las células viejas son más resistentes que las células jóvenes a las condiciones adversas.


Objetivo:

- Determinar la temperatura de muerte térmica de los microorganismos estudiados tratados a 40° C y 65° C durante diferentes intervalos de tiempo.

- Determinar el número de microorganismos supervivientes resistentes al tratamiento térmico.

Materiales:

Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Procedimiento:

1. Dos cultivos de 24 horas de edad de E. coli y S. aureus crecidos en Caldo Nutritivo se someterán a 40° C y 65° C.

2. Cada 0, 40, 80 y 100 minutos se cogerá 1 ml de cada uno los tubos que contienen las cepas microbianas en ambas temperaturas y se sembrará por el método de difusión en el medio de cultivo Agar Nutritivo.

3. Rotular correctamente las placas Petri indicando el tratamiento y la cepa microbiana.4. Incubar a 28° C por 48 horas en posición invertida.5. Realizar el recuento de microorganismos en cada uno de los tratamientos.6. Resultados: Anotar los resultados en el siguiente cuadro:

Temperatura Tiempo (min) Crecimiento microbiano (UFC/ml)Escherichia coli Staphylococcus aureus

40° C

04080

100

65° C0

4080

100

7. Con los resultados obtenidos elaborar la curva de supervivencia de microorganismos en papel milimetrado comparando el tiempo de exposición (eje X) y las UFC/ml (eje Y) para cada una de las temperaturas evaluadas por microorganismos evaluado.

8. Con los resultados obtenidos halle el Tiempo de Reducción decimal o valor D en ambas temperaturas utilizando la siguiente fórmula:

Donde: Dt: Tiem en min para - el 90% el # de microorganismos de una población a una t dada. x: Minutos a una determinada temperatura

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No: n° de células al inicio del tratamiento térmicoNx: n° de células supervivientes después de un tratamiento

9. Interpretación y Discusión de resultados. A partir de las curvas graficadas indique los resultados obtenidos para cada una de las variables estudiadas y explique los resultados obtenidos utilizando bibliografía adecuada (artículos científicos, libros).

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II. ACCIÓN DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

Este factor viene a ser la presión desbalanceada que da lugar a los fenómenos de difusión y ósmosis, en una solución donde hay diferencia de concentraciones.

Si un organismo está inmerso en una solución que tenga alta presión osmótica, el agua saldrá de la célula hasta que establezca un equilibrio entre el interior y exterior celular lo que ocasionará que la membrana citoplasmática y el protoplasma se contraigan hacia el centro de la célula; es entonces que la célula ha entrado en el proceso de crenación.

Lo contrario ocurre cuando una célula está en un medio con baja presión osmótica, el agua ingresará a la célula hasta establecer equilibrio en el exterior celular, y si la diferencia de presión es grande la membrana tenderá a explotar y se dirá que la célula ha entrado en estado de plasmólisis.

Objetivo:

- Determinar la concentración de NaCl que afecta el crecimiento microbiano.

Material

- Cepa de Escherichia coli de 24 horas de edad crecida en caldo nutritivo- 4 Placas con concentraciones crecientes de NaCl al 5%, 10%, 20% y 40% en medio

base Agar Nutritivo.- 1 placa con Agar Nutritivo.- Asa de siembra- Encendedor

Procedimiento

1. En las placas con diferentes concentraciones de NaCl, sembrar la cepa de E. coli por el método del estriado.

2. Repetir el paso anterior utilizando una placa con Agar Nutritivo que contiene concentración normal de NaCl.

3. Rotular las placas Petri con la cepa microbiana utilizada.4. Incubar a 28°C por 48Hrs.5. Comparar el crecimiento microbiano entre las placas que contienen las diferentes

concentraciones de NaCl y la placa con Agar Nutritivo que contiene concentración normal de NaCl.

6. Interpretación y Discusión de resultados.

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ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

I. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE IONES HIDRÓGENO (pH) EN LOS MICROORGANISMOS.

El efecto de distintas concentraciones de iones hidrógeno es considerado con respecto a su capacidad para suprimir el crecimiento microbiano. Los microorganismos se inocularán en un medio que es capaz de mantener el crecimiento siempre y cuando el pH sea tolerable. La única diferencia entre las distintas probetas de medio de cultivo radica en el pH de los caldos en cuestión. Se observará el crecimiento y se tendrá conclusiones. Para que estos resultados sean válidos es preciso la observación de todas las probetas en un mismo tiempo.

Objetivo:

- Determinar el efecto del pH en el crecimiento y desarrollo microbiano.

Materiales

- Cultivos de 24 horas de edad de Escherichia coli. - Tubos con caldo nutritivo estéril previamente ajustados con HCl 1.0N y NaOH 1.0N a

valores de pH de 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 y 11.0 (1 de cada una)

Procedimiento.1. Inocule con una azada el cultivo de E. coli en cada uno de los tubos de caldo nutritivo con

distintos valores de pH. 2. Incube a 28° C y anote sus observaciones en términos de la cantidad de crecimiento al

segundo y cuarto día. Emplee la siguiente escala: + = Poco crecimiento

++ = Regular Crecimiento+++ = Crecimiento moderado++++ = Abundante crecimiento

3. Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:

TABLA DE RESULTADOS

pH 3.0 pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 pH 11.0

E. coli J

4. Interpretación y Discusión de resultados.

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II. ACCIÓN DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS.

Objetivo- Observar y comparar el efecto de los desinfectantes y antisépticos en el desarrollo

microbiano.

Materiales- Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.- Medio de cultivo: Agar nutritivo- Desinfectantes: Lejía al 10%, cresol al 5%, Pinesol.- Antisépticos: Alcohol al 70%, agua oxigenada de 10 volúmenes, merthiolate, jabón

medicado (Protex)- Discos de papel filtro, pinzas, hisopos.- Plumón indeleble.

ProcedimientoAgentes desinfectantes

1. Dividir la placa de Agar Nutritivo en 3 mitades utilizando plumón indeleble.2. A partir de un cultivo de 24 horas de edad de la cepa de E. coli coger con un asa de kohle

el inóculo necesario y sembrarlo sobre la superficie de cada parte de la placa de Agar Nutritivo.

3. Utilizando una pinza estéril colocar un disco de papel filtro de 1.5 cm de diámetro embebido en la solución del desinfectante.

4. Realizar el mismo procedimiento para la cepa microbiana de S. aureus5. Incubar las placas a 28°C por 48 horas en posición invertida.

Agentes Antisépticos 1. Dividir la placa de Agar Nutritivo en 4 mitades.2. Realizar el mismo procedimiento descrito para los agentes desinfectantes y probar las

cepas de E. coli y S. aureus.3. Incube a 28° C por 48 horas y anote sus observaciones en términos de la cantidad de

crecimiento. Emplee la siguiente escala: + = Poco crecimiento

++ = Regular Crecimiento+++ = Crecimiento moderado++++ = Abundante crecimiento

4. Resultados: Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:

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5.

Interpretación y Discusión de resultados.

PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA

7

Antiséptico E. coli S.aureusAlcohol al 70%

H2O2

Merthiolate

Jabón Protex

Desinfectante E. coli S.aureusLejía

Cresol

Pinesol


El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye procesos de obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos. Asimismo, se encuentran las de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son intracelulares aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son liberadas por la célula para catalizar reacciones fuera de esta.Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su inoculación en medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como fuentes de energía, carbono, donadores de electrones, así como de otros nutrientes esenciales necesarios para su crecimiento.Existen numerosas pruebas bioquímicas con medios de cultivo adicionados de indicadores de pH para detectar la producción de ácido o álcali, con inhibidores selectivos como bilis, cianuro o con colorantes, sulfuros, etc. que facilitan la determinación de diferentes actividades metabólicas. La actividad que se evalúa con mayor frecuencia es: capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, etc.).El desarrollo de pruebas bioquímicas es importante para la identificación de especies bacterianas que proliferan en el área de alimentos, clínica y ambiental capaces de crecer utilizando diferentes sustratos y por lo tanto su potencial deterioro.

Objetivo- Caracterizar a los microorganismos en función de su capacidad fermentativa de

diferentes carbohidratos.

Materiales- Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.- Caldo Base Rojo de Fenol- Carbohidratos: Glucosa, Sacarosa y Lactosa- Pipetas estériles- Plumón indeleble.

Procedimiento1. Inocular 0.5 ml de cada cepa en una serie de tubos de caldo rojo fenol con glucosa,

lactosa, y sacarosa.2. Incubar los tubos a 28°C durante 48 horas. 3. Resultados: Determinar si hay crecimiento y cambios en el color del indicador

Criterios de evaluación:Producción de ácidoPrueba positiva (+): color amarilloPrueba negativa (-): color rojo

4. Interpretación de resultados y Discusión.

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CUESTIONARIO

1. De los microorganismos estudiados ¿qué estructuras bacterianas le confieren resistencia térmica? ¿Por qué?

2. ¿Cuál es el rango de temperatura en el cuál los microorganismos crecen y se multiplican rápidamente y en función de esto cuál sería la temperatura recomendada para la conservación de los alimentos? ¿Por qué?

3. ¿Qué cuidados debemos practicar frente a la cantidad de agua extra o intra celular en posibles productos frescos a temperatura ambiente?

4. ¿Qué ejemplos de aplicación están basados en la fisiología de la presión osmótica?5. ¿Cuál es la razón de usar alcohol de 70°?6. En un proceso productivo de derivados de frutas, ¿Cuál sería el agente contaminante

principal? ¿Cuál sería su agente químico de control? ¿Qué función cumpliría este agente? Proponga un ejemplo.

7. Explique el efecto de los desinfectantes y antisépticos en el desarrollo microbiano.8. De acuerdo a la capacidad fermentativa de los carbohidratos por las bacterias estudiadas

indique los alimentos que pueden ser potencialmente deteriorados por esta actividad metabólica. ¿Por qué?

9. Defina:

DesinfectanteAntisépticoBactericidaBacteriostáticoPlasmólisis.

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