PRACTICA Nro.4Determinacin de Lpidos Lic. Zulema Gallardo FloresOBJETIVOS: 1. Determinar los niveles de colesterol y triglicridos en sangre.1. Conocer la importancia de los lpidos en sangre y sus efectos en la salud. INTRODUCCIONSon macromolculas orgnicas (mayoritariamente biomolculas), compuestas principalmente por carbono e hidrgeno y en menor medida oxgeno, tambin pueden contener fsforo, azufre y nitrgeno

Los lpidos tienen la propiedad de ser relativamente insolubles en agua, y solubles en solventes no polares como el ter, cloroformo y benceno.Los lpidos son constituyentes importantes de la alimentacin no solo por su elevado valor energtico, sino tambin por las vitaminas liposolubles y los cidos grasos esenciales contenido en las grasas de los alimentos naturales.Es incorrecto referirse a todos los lpidos como grasas, puesto que stas son un subtipo de lpidos.

Los lpidos cumplen funciones diversas en los organismos vivientes: Reserva energtica (triglicridos). Estructural (fosfolpidos de las membranas celulares). Reguladora (hormonas esteroideas).Las lipoprotenas como constituyentes celulares se encuentran en las membranas celulares y en las mitocondrias y sirven como medio de transporte de los lpidos en la sangre.El perfil lipdico comprende en:1- lpidos totales2- triglicridos3- colesterol4- fosfolpidos5- electroforesis de protenas.

Las lipoprotenas plasmticas tienden a aumentar como resultado de:a. una sobreproduccinb. reducida utilizacin o hidrlisisc. deficientes catabolismo de los mismos

Tambin pueden verse alteradas por:a. Variacin fisiolgica: como la edad y peso.La edad tiende a elevar o disminuir los valores de fosfolpidos y colesterol.El peso tiende a elevar los valores de fosfolpidos y colesterol.b. Variaciones patolgicas: dislipoproteinemiaPrimaria:Tipo I: aumento de quilomicronesTipo IIA: aumento de LDLTipo II b: aumento del LDL Y VLDLTipo III: Beta anchaTipo IV: aumento del VLDLTipo V: aumento del quilomicrones y VLDLSecundaria:Hipotiroidismo: aumento del colesterolDiabetes sacarina: aumento de los triglicridosSndrome nefrotico: aumento de los lpidos totalesCOLESTEROLEl colesterol es uno de los lpidos ms importantes. Una de sus principales funciones es formar parte de la membrana plasmtica de las clulas eucariotas. Tambin es esencial para el crecimiento y viabilidad celular. Es peligroso cuando se halla en concentraciones demasiado elevadas en la sangre. Existen mtodos tanto de tipo qumico como enzimtico para determinar su concentracin en sangre.El colesterol es transportado como lipoprotenas, encontrndose la porcin ms alta en la B- LIPOPROTEINAS (LDL) que se forman a partir de las PRE- B LIPOPROTEINAS (VLDL) y una pequea proporcin en las -LIPOPROTEINAS (HDL).Su concentracin se ve alterada por:Edad, factores genticos, sexo, dieta, actividad fsica y hormonas.Se observa hipercolesterolemia en:Condiciones fisiolgicas: embarazoCondiciones patolgicas: ictericia obstructiva, colestasia, sndrome nefrtico y pancreatitis aguda.

Se observa hipocolesterolemia en:Condiciones fisiolgicas: desnutricin.Condiciones patolgicas: insuficiencia heptica grave, hipertiroidismo y procesos infecciosos agudos. Para determinar su concentracin en la sangre se emplean dos tipos de mtodos:Procedimientos qumicos:se utilizaron durante mucho tiempo para determinar el colesterol colorimtricamente, no obstante fueron abandonados por presentar gran cantidad de fallas y su dificultad para ser automatizados.

Procedimientos enzimticos:que determinan el colesterol total directamente en plasma en una serie de reacciones en las que se hidrolizan los steres de colesterol, se oxida el colesterol y el agua oxigenada resultante se determina enzimticamente. Adems se puede incluir una reaccin con peroxidasas en la cual se obtiene un colorante cuya absorbancia a 520nm es equivalente a la concentracin de colesterol.

Concentracin srica de colesterol mg/dlColesterol TotalHDL - ColesterolLDL- Colesterol

Deseable : menos 200 mg/dlLimite alto: 200 239 mg/dlAlto: 240 mg/dl o por encimaHombres :30 70 mg/dlMujeres : 35 85 mg/dlDeseable : menos 130 mg/dlLimite alto: 130 159 mg/dlAlto: 160 mg/dl o por encima

TRIGLICERIDOS (TAG)Los triglicridos son esteres de glicerol, compuesto por tres cidos grasos distintos. Su funcin es proporcionar cidos grasos libres para que la sangre los reparta a los diferentes tejidos, por lo que constituyen un importante combustible metablico y se almacenan en cantidades variables en los adipocitos, donde son suceptibles a la hidrlisis enzimtica.

Hipertrigliceridemia:Primaria: se registra en hiperlipemias familiares.Secundaria: se observa en la obesidad, diabetes sacarina, pancreatitis aguda y crnica y sndrome nefrtico.

Al igual que en la determinacin de la concentracin de colesterol, para medir la concentracin de TAG se emplean dos tipos de mtodos:

Mtodos qumicos:Incluyen la extraccin de los TAG mediante solventes orgnicos, luego estos triglicridos son hidrolizados a cidos grasos y glicerol, el cual es oxidado a formaldehdo, pudiendo ser este ltimo medido por diversos mtodos.Mtodos enzimticos:Los TAG son sometidos a hidrlisis, posterior a lo cual el glicerol obtenido es sometido a una serie de reacciones enzimticas acopladas en las que se forma un compuesto denominadonicotinamida adenina dinucletido fosfato(NADP) el cual puede ser medido por espectrofotometa.TRIACILGLICERIDOS (VALORES NORMALES)

40 170 mg/dl

CONDICIONES QUE DEBE REUNIR LA MUESTRA PARA REALIZAR UN PERFIL LIPIDICO.

1- PREPARACION DEL PACIENTE:a- no se debe variar los hbitos alimenticios durantes 3 das.b- tener un peso corporal establec-ayuno de 12 a 16 horasd- no consumir alcohol 72 horas antes del da de la toma de muestra.2-TECNICA DE EXTRACCION DE SANGRE:Un mtodo conveniente consiste en tener al paciente sentado, sujeto a un mnimo de tensiones y extraer la muestra de la vena ante cubital. Si se emplea torniquete se aconseja retirarlo antes de la extraccin ya que se ha informado de que el uso prolongado produce aumento en los valores lipiditos.3-ELECCION DEL PLASMA O SUERO:Para el anlisis qumico de lpidos y lipoprotenas se prefiere generalmente plasma. El anticoagulante aconsejado es EDTA slido (1 mg/ml de sangre) y las clulas sanguneas deben separase tan pronto como sea posible.4- CONSERVACION DE LAS MUESTRAS:Si no se va a realizar rpidamente las determinaciones de lpidos se recomienda la congelacin de las muestras las muestras se han de analizar en unos pocos das es suficiente su refrigeracin a 4 c. si la conservacin no es a corto plazo las muestras deben ser congeladas.Determinacin de triglicridosFundamento.:1- el glicerol y los cidos grasos se forman en una primera etapa por la accin de la lipasa sobre los triglicridos.2- El glicerol de fosforila por la adenosin-5-trifosfato(ATP) para producir glicerol-3-fosfato(G-3-P) y adenosin 5-difosfato(ATP) para producir glicerol- 3-fosfato (G-3-P) y adenosin 5- difosfato (ADP) en una reaccin catalizada por el glicerol- Kinasa.3- La G-3-P por la glicerol fosfato oxidasaproduciendo (DPA) y peroxido de hidrogeno.4- Los perxidos reaccionan con 4-aminoantipirina y 4-clorofenol bajo la influencia cataltica de la peroxidasa para formar quinoneimina.

TcnicaPreparar:Blanco reactivo: 1ml de reactivoEstndar: 0.01 de estandar+1ml de reactivoMuestra: 0.01 de muestra+ 1 ml de reactivo

Incubar los tubos por 5 minutos a 37 cLea el estndar y muestra contra el blanco reactivo a 500 nm antes de los 15 min.RESULTADOS:Estndar: 200mg/dlMuestra: 38 mg/dl.

Determinacin de colesterol totalFundamento:La determinacin de Colesterol Total est basada en el procedimiento enzimtico descrito por Allain, donde el colesterol--estearasa (CE) hidroliza los steres de colsterol a colesterol libre y cidos grasoso. En presencia de oxigeno, el colesterol libre es oxidado por la colesterol oxidasa (CO) a cholest-4-en-3-one y perxido de hidrogeno. Cuando el fenol est oxidativamente acoplado con 4-aminoantipirina en la presencia de peroxidasa (HPO), y perxido de hidrogeno se produce un cromoforo de quinoneimina. La intensidad de color producido es proporcional a la concentracin de colesterol y se mide coiorimetricamente a 500nm.

REACTIVOS:A. Reactivo A: solucin de 4-aminofenazona 25 mmol/l.B. Reactivo B: solucin de fenol 55 mmol/l.C. Reactivo C: suspensin conteniendo lipasa fungal 300 U/ml, colesterol oxidasa (CHOD) 3 U/ml y peroxidasa (POD) 20 U/ml.S. Standard: solucin de colesterol 2 g/l.

MATERIAL REQUERIDO:- Espectrofotmetro o fotocolormetro.- Micropipetas, pipetas y material volumtrico adecuados.- Frasco de vidrio color caramelo.- Tubos o cubetas espectrofotomtricas de caras paralelas.- Bao de agua a 37C (opcional).- Reloj o timer.

MATERIAL BIOLGICO:Suero, estable 6 das a 2-8C.

Determinacin de HDL-COLESTEROLLa funcin principal de lasHDLen el metabolismo lipdico es la captacin y transporte de colesterol desde los tejidos perifricos al hgado. Por este motivo la determinacin de HDL colesterol es una herramienta til en la identificacin de individuos de alto riesgo.FUNDAMENTOLas lipoprotenas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las lipoprotenas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de cido fosfotngstico en presencia de iones magnesio.Las HDL quedan en el sobrenadante separado por centrifugacin, donde se realiza la determinacin del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema enzimtico Colesterol oxidasa/Peroxidasa con colorimetra segn Trinder.REACTIVOS:-A. Reactivo A (Reactivo Precipitante): solucin de cido fosfotngstico 0,44 mmol/l y cloruro de magnesio 20 mmol/l.-Colestat enzimtico, Colestat enzimtico AA o Colestat enzimtico AA lquida.

MATERIAL REQUERIDO:- Espectrofotmetro o fotocolormetro.- Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados.- Tubos de Kahn.- Cubetas espectrofotomtricas de caras paralelas.- Bao de agua a 37C.- Reloj o timer.

MATERIAL BIOLGICO:Suero, estable 6 das a 2-8C.

CLCULO DE LOS RESULTADOS:

VALORES DE REFERENCIA:El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes Valores de HDL colesterol:0,40 - 0,60 g/l.No obstante, valores mayores de 0,40 g/l se consideran recomendables y los que se encuentren por encima de 0,60 g/l se han considerado como protectivos. Por el contrario, valores de HDL colesterol por debajo de 0,40 g/l se consideran como ndice significativo de riesgo de enfermedad cardaca coronaria.

Determinacin de LDL-COLESTEROLEstudios sealan alLDLcolesterol como el factor clave en la patognesis de la ateroesclerosis y la enfermedad cardaca coronaria (ECC), mientras que el HDL colesterol es considerado como factor protectivo. Puede ocurrir un aumento en el LDL colesterol, an con concentraciones normales de colesterol, asociado a un incremento en el riesgo de ECC.FUNDAMENTOS DEL MTODO:El presente mtodo es un ensayo homogneo sin precipitacin, en dos pasos. En el primero, se agrega un tensioactivo (Reactivo A) que solubiliza las partculas lipoproteicas no-LDL. El colesterol liberado es consumido por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa en una reaccin sin desarrollo de color. Un segundo tensioactivo (Reactivo B) solubiliza las partculas de LDL formndose, por la presencia de enzimas y un Reactivo cromognico, un color proporcional a la cantidad de LDL colesterol presente en la muestra.REACTIVOS:- Reactivo A: solucinconteniendocolesterolesterasa1000 U/l, colesterol oxidasa 1200 U/l, peroxidasa 1250 U/l, ascorbato oxidasa 3000 U/l, 4-aminoantipirina 1 g/l y tensioactivo 7 g/l enbuffer MES 50 mM.- Reactivo B: solucin conteniendo N,N-bis-(4-sulfobutil)-m-toluidina disdica (DSBmT) 0,4 g/l y tensioactivo 10 g/l en buffer MES 50 mM.-Calibrador: suero humano liofilizado conteniendo lipoprotenas de diversos tipos incluyendo LDL. La concentracin es variable lote a lote (ver ttulo en el rtulo).MATERIAL REQUERIDO:- Material volumtrico para medir los volmenes indicados.- Analizador automtico.MATERIAL BIOLGICO:Suero, estable 6 das a 2-8C.

CLCULO DE LOS RESULTADOS:

VALORES DE REFERENCIA:El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de LDL colesterol en relacin al riesgo de contraer enfermedad cardaca coronaria (ECC):

- Riesgo bajo o nulo (sujetos normales): valores de LDL colesterol menores de 129 mg/dl.- Riesgo moderado a elevado (individuos con probabilidad de contraer ECC): valores entre 130 y 189 mg/dl.- Riesgo muy elevado (individuos sospechosos de padecer ECC): valores de LDL colesterol 190 mg/dl.Determinacin de TriglicridosFUNDAMENTOS DEL MTODO:

REACTIVOS:-Reactivo A: viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).-Reactivo B: solucin de buffer Good conteniendo clorofenol, pH 7,5.-Standard: solucin de glicerol 2,26 mmol/l (equivale a 2 g/l de triolena).-Calibrador A plus, cuando se emplea la tcnica automtica.MATERIAL REQUERIDO:- Espectrofotmetro o fotocolormetro.- Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados.- Tubos o cubetas espectrofotomtricas.- Bao de agua a 37C.- Reloj o timer.

MATERIAL BIOLGICO:Suero, estable 6 das a 2-8C.

CLCULO DE LOS RESULTADOS:

VALORES DE REFERENCIA:El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de Triglicridos:

Deseable: < 1,50 g/lModeradamente elevado a elevado: 1,50 - 1,99 g/lElevado: 2,00 - 4,99 g/lMuy elevado: 5,00 g/lConclusin

La determinacin de un perfil lipidico tiene gran importancia clnica ya que se puede emplear como un diagnostico primario de ciertas enfermedades, as como tambin en el seguimiento de algunas enfermedades como: diabetes mellitas, necrosis, obstruccin biliar y varias anormalidades metablicas que resultan de disturbios endocrinos.

BIBLIOGRAFIAngel, G. ngel, M. Interpretacin Clnica del Laboratorio. Transaminasas. Bogot Colombia. 2006.

Jimnez, E y otros. (1996) mejora contina de la calidad. Panamericana: Mxico, D.F