UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLÍN

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE QUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA No 7. OBSERVACIÓN DE EFECTOS RELACIONADOS CON LA FOTOSÍNTESIS.

OBJETIVOS

Familiarizarse con la metodología para aislar cloroplastos.

Comprobar la formación de poder reductor en la etapa lumínica de la fotosíntesis.

Conceptualizar sobre este esencial evento para la vida en el planeta. FUNDAMENTO TEORICO

INTRODUCCION.

La fotosíntesis es el origen de la mayor parte de la energía de la biosfera y se encarga de la fijación del CO2 y de la producción de prácticamente la totalidad del O2 en la atmósfera, a la par que produce el alimento que sostiene la vida en el planeta. El proceso, que ocurre en los cloroplastos de las plantas y algas superiores, comprende dos fases independientes: la fase lumínica que se realiza en la membrana de los tilacoides, y la fase oscura que ocurre en los estromas del cloroplasto. Como reacción neta de la fotosíntesis se acepta la siguiente:

6CO2 + 6H2O C6H12O6 + 6O2h

Pero los detalles del evento indican que los átomos del O2 provienen únicamente del H2O, y que los oxígenos del CO2 se integran a la molécula de la glucosa y a otras moléculas de agua. Por ello la reacción dada realmente es una simplificación de esta otra:

6CO2 + 12H2O C6H12O6 + 6H2O + 6O2h

LOS CLOROPLASTOS.

Estos son los orgánulos de las plantas y las algas, que funcionan como los verdaderos laboratorios del proceso fotosintético. En las plantas, la mayoría de ellas se encuentra en las células situadas bajo la superficie de las hojas, llamadas células mesófilas, y cada una puede contener entre 20 y 50 cloroplastos. La estructura interna de un cloroplasto tiene cierta similitud con la de una mitocondria:

Una membrana externa muy permeable.

Una membrana interna con permeabilidad selectiva, que encierra el compartimiento interno, en el cual se encuentra lo siguiente:

a. El estroma, o matriz gelatinosa que contiene la mayoría de las enzimas responsable de la fase oscura de la fotosíntesis.

b. Los tilacoides, embebidos en el estroma, que son una red de membranas internas plegadas en forma de sacos o discos planos, que cuando se apilan forman una estructura llamada grana. En las membranas del tilacoide se hallan los componentes necesarios para desarrollar la fase lumínica de la fotosíntesis.

FASE LUMINOSA DE LA FOTOSINTESIS.

Es la etapa donde la energía solar se convierte en energía química. Los pigmentos de los cloroplastos atrapan la energía solar e inducen la oxidación de la molécula de agua, con la producción concomitante de energía química en forma de NADPH y ATP:

H2O O2Luz

ATPADP + Pi

NADPHNADP+

Para que ello se realice, es necesario que ocurran los siguientes eventos:

a. Absorción de energía solar por los pigmentos (P680 y P700) y su excitación para formar especies con gran poder reductor y especies con gran poder oxidante:

Especies excitadas con poder reductor

Especies positivas con gran poder oxidante.

b. Transporte de los electrones impulsados por la energía solar, a través de una cadena de sustancias entre las que se incluyen proteínas y quinonas:

h

P680

ACARREADORES

DE

ELECTRONES

ACARREADORES

DE

ELECTRONES

P700

h

e- e-

c. Rompimiento de la molécula de H2O para generar O2 y electrones que se transportan por la cadena:

2H2O 4H+ + 4e

- + O2

d. Recepción de los electrones por parte del NADP+ para generar NADPH:

2NADP+ + 4H

+ + 4e

-2NADPH + 2H

+

e. Formación de ATP a expensas del gradiente electro-químico de protones que se va creando a medida que los electrones fluyen desde el H2O hasta el NADP+:

ADP + Pi ATP + H2O

El esquema completo de la fase luminosa se puede visualizar así:

2H2O

O2 + 4H+

4e-

P68 0

4h

ACA RR. P70 0

4h

ACA RR. 4e-

2NADP+ + 2H+

2NADPH

Que resumidamente se puede escribir así:

2H2O + 2NADP+ 8h

O2 + 2NADPH + 2H+

El esquema se completa con la formación del ATP:

2H2O + 2NADP+

O2 + 2NADPH + 2H+

2ADP + 2Pi 2ATP + 2H2O

8h

FASE OSCURA DE LA FOTOSINTESIS

Llamada así porque no requiere energía luminosa para su funcionamiento; también se le conoce como el ciclo reductor de las pentosas fosfato, la vía C3, el ciclo de Calvin-Benson. En esta fase las plantas utilizan la energía química captada (en forma de NADPH y ATP) para incorporar el CO2 atmosférico en moléculas de carbohidratos (sacarosa, almidón, celulosa):

CO2

ATP ADP + Pi

NADPH NADP+

CH2O

Esta fase es realmente la suma de 4 etapas:

a. Etapa de carboxilación. El CO2 se incorpora a una molécula de 5 carbonos (pentosa) llamada ribulosa-1,5-bifosfato, para generar dos moléculas de 3-fosfoglicerato (triosa):

C

C

CH2OP

H OH

OHH

C O

CH2OP

+ CO2

H2O

2 CHOH

COO-

CH2OP

Ru-1,5-BP (pentosa) 3-p-glicerato (triosa)

b. Etapa de reducción. El 3-fosfoglicerato con el concurso de los productos de la fase luminosa a (ATP y NADH), se reduce a gliceraldehído-3-fosfato, que es otra triosa:

2 CHOH

COO-

CH2OP

ATP ADP + Pi

NADPH NADP+

2 CHOH

CHO

CH2OP

3-p-glicerato(triosa)

gliceraldehido-3-p(triosa)

De las moléculas de gliceraldehído-3-fosfato generadas, 1/6 parte se usa para sintetizar carbohidratos y 5/6 partes para regenerar Ru-1,5-BP y volver a iniciar el ciclo.

c. Etapa de síntesis. Parte del gliceraldehído formado (1/6) lo usa la planta para sintetizar los carbohidratos que requiere: fructuosa, glucosa, sacarosa, almidón y celulosa:

2 CHOH

CHO

CH2OP

C6H12O6

sacarosa

almidón

celulosa

griceraldehído-3-p(Triosa)

hexosas

d. Etapa de regeneración. EL resto del gliceraldehído formado en la etapa de reducción (5/6), se utiliza para regenerar Ru-1,5-BP (pentosa), que es la molécula que inicialmente fija el CO2 atmosférica:

5 CHOH

CHO

CH2OP

3

C

C

CH2OP

OHH

OHH

C O

CH2OP

gliceraldehído-3-p(Triosa)

Ru-1,5-BF(Pentosa)

Esta etapa es la que garantiza que el proceso fotosintético se repita muchas veces (le da el carácter de cíclico), y que la síntesis de carbohidratos sea realmente apreciable.

El carácter cíclico de la fase oscura de la fotosíntesis se puede observar cuando se hace el balance de carbono en la formación de una molécula de glucosa (hexosa):

6CO2

12 Triosas6 Pentosas

10 Triosas2 Triosas

1 Hexosa

sacarosa almidón

CICLO DE CALVIN

La formación de una molécula de glucosa (6C) requiere la incorporación de 6CO2 (6C) a 6 moléculas de

Ru-1,5-BP (6 x 5 = 30C), para generar 12 moléculas de triosas (12 x 3 = 36C). Dos moléculas de triosas (2 x 3 = 6C) se emplean para formar una molécula de glucosa (6C). las 10 restantes (10 x 3 = 30C) se reordenan entre sí para generar 6 moléculas de pentosas (6 x 5 = 30C), que son las que asimilan el CO2, para que el ciclo vuelva a empezar.

Para obtener la reacción neta de la fase oscura se tendrá que saber que para incorporar una molécula de CO2 en una unidad básica de carbohidrato (CH2O), se deberá consumir 2 moléculas de NADHP y 3 de ATP:

CO2 + 2NADPH + 3ATP + 3H2O CH2O + 2NADP+ + 3ADP + 3Pi

VISION INTEGRADA DE LA FOTOSINTESIS Y SU EFICIENCIA ENERGETICA.

NADP+

NADPH

ATP

ADP + Pi

H2O O2 CO2 CH2O

ATP

NADP+

NADPH

ADP + Pi

FASE LUMINOSA(Tilacoides)

FASE OSCURA(Estroma)

h

Este esquema permite visualizar para la fotosíntesis la siguiente ecuación simplificada:

CO2 + H2O O2 + CH2O8h

Es decir, se requieren 8 moles de fotones de energía para fijar un mol de CO2. Para fijar 6 moles de CO2 en un mol de glucosa, se usan 48 moles de fotones, que cuando la luz es de 650 nm, equivalen a una energía de 8.842 kJ según la siguiente ecuación:

hcE

La realidad es que la formación de una mol de glucosa a partir de CO2 y H2O solo necesita 2870 kJ, lo que significa que el proceso fotosintético solo aprovecha el 33 % de la energía que absorbe. Otra forma de mirar la situación es que con la energía que absorben los cloroplastos (8.842 kJ) se podrían sintetizar 3 moles de glucosa, pero solamente se produce una. De manera que la eficiencia seria del 33 %.

MATERIALES Y REACTIVOS

Un bombillo de 100 W, centrífuga, 500 gramos de hojas frescas de espinacas o acelgas, hielo picado, licuadora, gasa, papel aluminio.

Solución de preparación de cloroplastos: preparar 100 mL de una solución con los siguientes componentes: Tris 20mM (pH = 7.8), KCl 40 mM, sacarosa 4 mM.

Solución de lavado de cloroplastos: se preparan 100 mL de solución con estos componentes: KCl 40 mM (pH = 7.8), sacarosa 4 mM, MgCl2 2 mM.

2,6-Diclorofenolindofenol (PM=326,09 g/mol) (DCFIF) 0.01%.

PROCEDIMIENTO.

1. PREPARACION DE CLOROPLASTOS.

1.1 Licue a velocidad máxima y durante 15 segundos 50 gramos de hojas frescas de espinacas o acelgas en 75 ml de la solución de preparación de cloroplastos.

1.2 Filtre el material licuado a través de una gasa pre-enfriada. Recoja el filtrado en tubos de centrifuga llenándolos hasta sus 2/3 partes (todos los tubos deben ser llenados al mismo nivel)

1.3 Centrifugue el material a 2500 rpm durante 10 minutos. Descarte el sobrenadante cuidadosamente y conserve el precipitado.

1.4 Disponga en un beaker con 30 mL de la solución de lavado, y resuspenda allí suavemente el precipitado obtenido de todos los tubos. Centrifugue nuevamente a 2500 rpm durante 5 minutos.

1.5 Descarte el sobrenadante y conserve el precipitado. Repita el lavado del precipitado dos veces más (del numeral 1.4).

1.6 Resuspenda el precipitado en 40 mL de la solución de lavado, tape con papel aluminio, marque como “Solución de cloroplastos” y conserve en un baño con hielo.

2. CURVA DE CALIBRACION Y MEDICION DE DCFIF OXIDADO

2.1 Marque 6 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla, cúbralos con papel aluminio y agregue

lo indicado, tenga en cuenta que una gota equivale a 0.05 ml:

Tubo Papel

aluminio Solución

cloroplastos DCFIF(gotas)

Solución de preparación

DCFIF(%) inicial

Ai Af

Blanco Si 1 ml 0 4 ml 0

1 Si 1 ml 1 (0.05 ml) 3ml+19 gotas

(3.95ml) 0.0003

2 Si 1 ml 3 (0.15 ml) 3ml+17 gotas (3.85ml) 0.0005

3 Si 1 ml 5 (0.25 ml) 3ml+15 gotas (3.75ml) 0.0007

4 Si 1 ml 7 (0.35 ml) 3ml+13 gotas (3.65ml) 0.0009

5 Si 1 ml 9 (0.45 ml) 3ml+11 gotas (3.55ml) 0.0011

2.2 Ajuste el colorímetro a 610 nm y coloque a cero con la solución de cloroplastos del tubo “blanco” y realice las lecturas de absorbancia iniciales (Ai) de los 5 tubos restantes.

2.3 Quite el papel aluminio de los 5 tubos y expóngalos durante 25 minutos, a la radiación emitida por un bombillo de 60 Watts. Fíjese que los tubos queden a la misma distancia del bombillo.

2.4 Ajuste el colorímetro nuevamente a 610 nm y coloque a cero con la solución de cloroplastos del tubo “blanco” y realice las lecturas de absorbancia finales (Af) de los 5 tubos y registre los datos en la tabla.

3. COMPROBACION DEL PODER REDUCTOR GENERADO POR LA LUZ.

3.1 Marque 4 tubos de ensayo con los números 1, 2, 3 y 4. Envuelva los tubos 3 y 4 con papel de aluminio, y agregue lo indicado en la siguiente tabla:

Tubo Papel

aluminio Solución

cloroplastos Solución de preparación DCFIF Ai Af

1 No 1 ml 4 ml

2 No 1 ml 3ml + 16gotas (3.8 ml) 4 gotas (0.2ml)

3 Si 1 ml 3ml + 16gotas (3.8 ml) 4 gotas (0.2ml

4 Si 1ml 4 ml

2.5 Ajuste el colorímetro a 610 nm y coloque a cero con la solución de cloroplastos del tubo “blanco” del punto 2.1 y realice las lecturas de absorbancias iniciales (Ai) de todos los tubos (1 a 4).

3.2 Exponga los 4 tubos durante 25 minutos a la radiación emitida por un bombillo de 60 Watts. Fíjese que todos los tubos queden a la misma distancia del bombillo, los tubos 1 y 2 sin papel aluminio y los tubos 3 y 4 con papel aluminio.

3.3 Ajuste el colorímetro a 610 nm y coloque a cero con la solución de cloroplastos del “blanco” del punto 2.1 y realice las lecturas de las absorbancias finales (Af) para las soluciones de cloroplastos de todos los tubos (1 al 4).

3.4 Observe y compare los colores de los 4 tubos al inicio y al final. Anote los resultados de la intensidad de coloración azul en una escala de 1 a 10 (10 si la coloración es azul oscuro y 0 si la coloración es verde).

ESULTADOS Y PREGUNTAS

SOBRE EL PODER REDUCTOR GENERADO POR LA LUZ

1. Teniendo en cuenta los experimentos de la tabla 3.1 y Considerando que el DCFIF es un colorante que

cuando está oxidado es azul y cuando está reducido es incoloro que se indica en la siguiente reacción:

2H.

2H.

O

ClCl

N

OH

Azul

OH

ClCl

NH

OH

Incoloro

Explique a que se debe la diferencia de absorbancias Ai y Af de los tubos 1, 2, 3 y 4.

Escriba la reacción química que ocurrieron en los tubos 1, 2, 3 y 4.

Explique en cuales tubos se generó energía química (ATP y NADPH) a expensas de la energía lumínica.

Diga en cuales tubos los cloroplastos fijaron CO2 para iniciar la fase oscura de la fotosíntesis.

2. Haga un análisis con base en la visión integral de las dos fases de la fotosíntesis; fase lumínica y fase oscura que pudieron ocurrir en los tubos de ensayo.

3. Explique en qué consiste la reacción de Hill e investigue qué herbicidas inhiben la fotosíntesis mediante

la inhibición de la reacción de Hill.

SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE DCFIF OXIDADO

4. Explique para la tabla 2.1, porque los resultados de Ai y Af son diferentes si fueron medidos en las mismas soluciones, solo que Af se midió después de 25 minutos.

5. Considerando los datos de la tabla del punto 2.1, realice una gráfica Ai vs DCFIF (%) inicial y obtenga la pendiente de la regresión con su respectiva ecuación.

6. Con la ecuación obtenida cuantifique el % de DCFIF para los tubos (1 al 5) después de que fueron irradiados durante 25 minutos empleando la absorbancia final (Af) y de una explicación de los resultados.

BIBLIOGRAFIA

Práctica bioenergética (fotosíntesis). Dpto. de Biología. U de A. (Guía suelta). BOYER, R Conceptos de Bioquímica. Thomson Editores. México. 2000 BOHINSKI, R. Bioquímica. Prentice Hall. México. 1998 MATHEWS, C. y otros. Bioquímica. Addison Wesley. Madrid 2002

Documento recopilado y organizado por profesores y monitores de la Escuela de Química