péptidos sintéticos truncados desde la región - terminal ...

38 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el

desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria

La purificación del fragmento F(ab)2´ se llevó a cabo utilizando proteína A sefarosa. El aislamiento del fragmento se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE como lo muestra la Figura 2-7C, donde se observa una banda con movilidad relativa entre 100 kDa a 96 kDa correspondiente al fragmento F(ab)2´. Las líneas 2-7 corresponden a algunas de las fracciones eluídas. La letra “a” representa la molécula de inmunoglobulina completa, “b” corresponde a el fragmento F(ab)2´. Como se muestra en la Tabla 2-1 se obtuvo suficiente cantidad de todos los fragmentos F(ab)2´ de inmunoglobulina inducidos por los pseudopéptidos para los experimentos funcionales tanto in vivo como in vitro.

2.3.4. Mapeo epitópico de los anticuerpos policlona les de péptido 1513 y sus análogos

Con el fin de establecer la reactividad específica de cada anticuerpo inducido por los pseudopéptidos se tomó la secuencia del péptido nativo 1513 y se derivó un grupo de péptidos sintéticos truncados desde la región N- terminal hasta la región C-terminal. Como se muestra en la Tabla 2-2. Para determinar el reconocimiento específico de los anticuerpos anti-pseudopéptidos se empleó la técnica de ELISA. Los anticuerpos inducidos por el péptido nativo 1513 parecen ser poliespecíficos debido a que reconocen toda la estructura primaria (Figura 2-8A). Por el contrario los anticuerpos inducidos por los 5 pseudopéptidos fueron monoespecíficos debido a que están dirigidos contra la porción C- terminal de la MSP1 42-

61.

2. Capítulo 2 39

Figura 2-8: Mapeo epitópico de anticuerpos policlonales inducidos por el péptido 1513 y sus análogos por la técnica de ELISA. (A) Reactividad de anticuerpos policlonales inducidos por el péptido nativo 1513. (B) Reactividad de anticuerpos policlonales inducidos por el pseudopéptido ψ-437. (C) Reactividad de anticuerpos policlonales inducidos por el pseudopéptido ψ-439. (D) Reactividad de anticuerpos policlonales inducidos por el pseudopéptido ψ-440. (E) Reactividad de anticuerpos policlonales inducidos por el pseudopéptido ψ-441. (F) Reactividad de anticuerpos policlonales inducidos por el pseudopéptido ψ-442. De acuerdo con nuestros resultados la secuencia consenso mejor representada evidencia constituir un posible epítope B no reportado anteriormente en la secuencia 51MVLNEGTSGTA61.



Tabla 2-2: :Mapeo de anticuerpos inducidos por el péptido nativo 1513 (MSP-1 42-61) y sus peptidomiméticos mediante secuencias truncadas del péptido 1513.

Como control del ensayo se utilizó una secuencia no relevante, el péptido codificado como 1585 (MSP-11282-1301), esta secuencia es derivada del fragmento C-terminal de la MSP-11282EVLYLKPLAGVYRSLKKQLE 1301. La reactividad contra el péptido 1585 fue comparable con la reactividad de los anticuerpos contra la albúmina como se muestra en la Figura 2-8. Como blanco del experimento, se utilizó solución salina o buffer fosfato salino (PBS).

2.3.5. Patrones de estructura secundaria determinad os por dicroísmo circular del péptido 1513 sus análogos y sus fragmentos F(ab) 2´

Los perfiles estructurales obtenidos por la técnica de dicroísmo circular del péptido 1513 y sus análogos ψ-437, ψ-439, ψ-440, ψ-441 y ψ-442 tanto de sus polímeros como sus monómeros se muestran en la Figura 2-9 el péptido 1513 tanto en su forma polimérica como monomérica muestran una tendencia alfa helicoidal, estos rasgos estructurales se pierden con la introducción de la modificación. Según estos perfiles determinados experimentalmente, se puede observar como la tendencia estructural del peptido nativo 1513 y su forma polimérica 9464 es alfa helicoidal, mientras que todos sus análogos pseudopeptídicos sin excepción modifican este patrón haciéndolo más relajado estructuralmente, de acuerdo al cambio del perfil en

2. Capítulo 2 41

cuanto a la disminución de la intensidad de los dos mínimos a 208 y 222 nm respectivamente. A B Figura 2-9: Perfil estructural por Dicroísmo Circular (DC) de monómeros y polímeros del péptido 1513 y sus análogos. A. perfil de estructura secundaria de todas las moléculas en sus formas monoméricas. B. Perfil estructural de las formas poliméricas de todas las moléculas derivadas de la secuencia nativa 1513. Por otra parte y contrario a la tendencia de las moléculas inductoras (péptido 1513 y sus análogos), las moléculas efectoras o inducidas por las primeras, los fragmentos F(ab)2´ muestran perfiles de estructura secundaria en los cuales se evidencia una tendencia a una clásica hoja β con una característica elipticidad molar de un mínimo en 220 nm, como se puede observar en la Figura 2-10. Esta tendencia se evidencia más claramente en los fragmentos F(ab)2´ inducidos por los pseudopéptidos ψ-439 (Met51-Val52) y ψ-440 (Lys50-Met51), indicados por las líneas verde y azul clara respectivamente, de acuerdo con el análisis de deconvolución la mayoría de los fragmentos F(ab)2´ muestran rasgos estructurales de hebras β; aquellos fragmentos no asociados a algún efecto protector en los experimentos in vivo muestran perfiles de estructura secundaria diferentes como en el caso del fragmento F(ab)2índucido por el pseudopéptido ψ-442 (Lys48-Glu49), el cual presenta un bajo porcentaje de hélice alfa, dato que concuerda con lo reportado en la literatura. (Kaufmann et al., 2006). Para obtener una interpretación de cada dato del perfil de estructura secundaria para cada fragmento se realizó la deconvolución de los datos utilizando el programa Continll el fragmento F(ab)2índucido por el péptido nativo 1513 muestra un alto contenido alfa helicoidal de aproximadamente 68.4% y un contenido de hojas β de 13,63%, el fragmento de F(ab)2índucido por el pseudopéptido ψ-437 muestra un contenido de hojas β de 51,30% y un 21,00% de vueltas. Para el fragmento F(ab)2´ inducido por el



pseudopéptido ψ-439 muestra un contenido de hojas β del 73,20% y un 15,00% de vueltas, el fragmento F(ab)2´ inducido por el pseudopéptido ψ-440 presenta un alto contenido de hojas β 85,80% y 10,60% de vueltas. El fragmento F(ab)2´, inducido por el pseudopéptido ψ-441 presenta un el 18,40% de contenido α-helicoidal y un 49,40% de hojas β y el 22,80% de vueltas. Para el fragmento F(ab)2´, inducido por el pseudopéptido ψ-442 muestra un contenido de hélices-α del 78,00 %, y 12,70% de hojas β. Figura 2-10: Perfil estructural por Dicroísmo Circular (DC) de los fragmentos F(ab)2´α-1513, α-ψ-437, α-ψ-439, α-ψ-440, α-ψ-441 y α-ψ-442.

2.3.6 Estudios de estructura secundaria por Resonan cia Magnética Nuclear de Hidrógeno RMN - 1H del péptido 1513 y sus derivados

Los estudios de RMN-1H mediante la aplicación de las técnicas bidimensionales TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) y NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) para generar datos más precisos acerca de la estructura 3D de las seis moléculas. Como resultado de estos experimentos se obtuvieron diagramas de conectividad entre las diferentes familias de hidrógeno de cada molécula tal como se aprecia en la Figura 22. Según se observa, la estabilidad de rasgos tipo hélice-α en el péptido nativo 1513 es más fuerte que en cualquiera de los péptido-miméticos. Esto se evidencia por la presencia de puentes de hidrógeno, propios de estructuras helicoidales, tal como se observa en el aparte A de la Figura 2-11. La tendencia estructural más relajada en los

2. Capítulo 2 43

dos peptidomiméticos es también evidente tal como se observa en B y en C respectivamente. El impacto estructural de los dos nuevos grados de libertad introducidos en los dos análogos moleculares es dramático tanto así que se pierden rasgos característicos de las hélices-α del péptido nativo en sus nuevos análogos. Figura 2-11 : Conectividades TOCSY y NOESY-RMN-1H para el péptido 1513 y sus análogos. Mediante modelización molecular y cálculo de estructura molecular se logró la obtención de imágenes tanto para el peptido nativo 1513 como para dos de sus análogos pseudopeptídicos ψ-437 y ψ-439 según se puede observar en la Figura 2-12.



Figura 2-12: Modelización molecular y cálculo de estructura para la secuencia nativa 1513 y sus análogos ψ-437 y ψ-439. El efecto a nivel de la estructura global de la molecular evidencia rasgos conformacionales extendidos en los dos análogos.

2.4 Ensayos de actividad funcional in vivo de los fragmentos F(ab) 2´

2.4.1 Estandarización del modelo de infección in vivo con P. yoelii

Para establecer el modelo de infección con P. yoelii se inocularon intravenosamente ratones hembra de la cepa BALB/c con una dosis letal de 2 x 106 glóbulos rojos infectados con P. yoelii 17XL, se fijo un periodo de tiempo de 10 días para evaluar la aparición y el establecimiento de la parasitemia. 24 horas después los animales comenzaron a infectarse con un porcentaje de parasitemia de 0,2%, evidenciado por la

2. Capítulo 2 45

presencia de formas inmaduras del parásito como el estadio de anillos visualizados en las muestras de sangre recolectadas de todos los ratones. La parasitemia progresó durante los primeros 5 días post infección, seguido por la aparición de diferentes estadios del parásito tales como anillos, trofozoitos y esquizontes inmaduros. En el día 6 la infección por malaria llegó a ser asincrónica, todos los animales tenían niveles de parasitemia alrededor del 30%, los extendidos de sangre periférica mostraban esquizontes maduros y merozoitos libres. Una vez establecido el curso de la infección se obtuvo la cantidad de inóculo requerido para ser usado en los experimentos de transferencia pasiva por pases in vivo de la cepa. El éxito de la infección por P. yoelii 17XL de ratones BALB/c radica en la inoculación vía intravenosa de 5x104 glóbulos rojos infectados con una parasitemia del 20 % en el día 5 y el 50% de parasitemia en el día 7, estos resultados concuerdan con lo reportado por Ramos-Avila (Ramos-Avila et al., 2007).

2.4.2. Inmunización pasiva con los fragmentos F(ab) 2´ inducidos por el péptido 1513 y sus análogos pseudopeptídicos

Una vez establecido el modelo de infección descrito anteriormente se infectaron ratones hembra de la cepa BALB/c con 5x104 glóbulos rojos infectados con porcentajes de parasitemia del 0.2% en el día 6 ,15% en el día 8 y 32% en el día 11. El grupo control manejó de niveles de parasitemia alrededor del 40% y cuyos individuos no sobrevivieron más allá del día 8, todos los ratones del grupo control inoculados con solución salina murieron entre el tercer y octavo día del experimento, los ratones de los grupos transferidos pasivamente manejaron altos porcentajes de parasitemia incluso el doble del grupo control como se puede observar en la Figura 2-13, la inmunización pasiva con el fragmento F(ab)2´ inducido por los pseudopéptidos ψ-439, ψ-442 controlaron la parasitemia, los fragmentos F(ab)2´ inducidos por los pseudopéptidos ψ-437 y ψ-442 no confirieron protección y manejaron niveles parasitemia tan altas como el grupo control, en los extendidos de sangre periférica se observan las diferentes formas del parásito como anillos, trofozoitos, esquizontes maduros (Figura 2-10A).



Figura 2-12 : Evaluación de la parasitemia inducida por P. yoelii 17XL en ratones BALB/c. Uno de los animales del grupo de ratones transferidos pasivamente con el fragmento F(ab)2´inducido por el pseudopéptido ψ-440 controló y disminuyó rápidamente la parasitemia protegiéndose completamente, en el extendido de sangre periférica se observan algunas pocas formas del parásito rodeando el eritrocito y que no fueron capaces de invadirlo (Figura 2-14B). Figura 2-14: Extendido de sangre periférica de ratones infectados con P. yoelii 17XL. (A) Eritrocitos de ratón infectado con P. yoelii 17XL. (B) Extendido de sangre periférica del ratón 18 protegido contra la malaria por transferencia pasiva del F(ab)2´-α-ψ-440. Tinción con Wright, aumento 100x. Las flechas muestran la presencia de diferentes estadios intraeritrocíticos del parásito.

2. Capítulo 2 47

Como se puede observar en la Figura 2-15 el perfil de supervivencia del grupo 5 transferido pasivamente con el fragmento F(ab)2´ inducido por el pseudopéptido ψ-440 controló muy bien la infección por malaria causada por Plasmodium yoelii, los grupos inmunizados con el fragmento F(ab)2´ inducido por los pseudopéptidos ψ-439 y ψ-442 controlaron parcialmente la infección causando un retraso de 4 días en el inicio de la parasitemia, el grupo 1 inoculado con solución salina y el grupo 2 transferido con el fragmento F(ab)2´inducido por el péptido nativo 1513 se infectaron rápidamente y no controlaron la infección por malaria. Figura 2-15 : Patrones de supervivencia de ratones transferidos pasivamente con los fragmentos F(ab)2´ α-1513 y sus análogos.

2.5. Ensayos de actividad funcional in vitro de los fragmentos F(ab) 2´

Los pseudopéptidos conjugados a BSA y sus fragmentos F(ab)2´ muestran actividad neutralizante in vitro, los pseudopéptidos conjugados a BSA inhiben el proceso de invasión sólo a una concentración de 0.5 mg/mL mientras que los anticuerpos inducidos por estos lo hacen a concentraciones más bajas de 60 µg/mL (Figura 2-16). Los grupos de las fracciones purificadas inhiben en algún grado la invasión de P. falciparum a glóbulos rojos humanos. Los grupos de Ig utilizados para la transferencia pasiva inhiben la invasión de P. falciparum a glóbulos rojos humanos en un 53% a una concentración de 0,12 g/mL; el pool 3 correspondiente al grupo de fracciones del fragmento F(ab)2´ inducido por ψ-437; pool 15 inducido por ψ-441; pool 24 inducido por



ψ-439; pool 11 inducido por ψ-440 y pool 16 inducido por ψ-442 inhiben la invasión en un 84 %, 87%, 27%, 44%, 68% y 66% respectivamente a concentraciones menores de 100 µg/mL. El pool 19 correspondiente al grupo de fracciones del fragmento F(ab)2´inducido por ψ-442 inhiben un 60% a una concentración de 0,06 µg/mL los pooles 24- 32 (ψ-439), 15 (ψ-441) y 19 (ψ-442) muestra una inhibición dosis dependiente. El fragmento F(ab)2´inducido por el péptido nativo 1513 inhibe en menor porcentaje el proceso de invasión al glóbulo rojo con respecto a los fragmentos F(ab)2´ inducidos por los pseudopéptidos. Figura 2-16: Propiedades neutralizantes in vitro de los anticuerpos inducidos por el péptido 1513 conjugados a BSA y sus fragmentos F(ab)2´.

2. Capítulo 2 49

2.6 Conclusiones del Capítulo 2 2.6.1. Los conjugados del péptido 1513 y sus pseudopéptidos indujeron anticuerpos policlonales mono específicos en conejos Nueva Zelanda. 2.6.2 Estos anticuerpos reconocieron a la proteína MSP-1 del P. falciparum, evidenciando un epítope B (51MVLNEGTSGTA61 o MSP-151–61) en la región C-terminal de la secuencia MSP-151-61. 2.6.3. Los fragmentos F(ab)2’ obtenidos y purificados evidenciaron propiedades inhibitorias de la invasión in vitro de P. falciparum a glóbulos rojos humanos. 2.6.4. Los fragmentos F(ab)2’ transferidos por inmunización pasiva en ratones BALB/c infectados con la cepa de P. yoelii evidenciaron un efecto de control y protección contra la infección experimental.

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