Genética Molecular

Ricardo Fujita, Ph.D.

Centro de Genética y Biología Molecular

Instituto de Investigación

Facultad de Medicina USMP

rfujita1@yahoo.com

La Información GenéticaDetermina lo que somos

(características de la especie e individual)

Cigotos => unión de gametos

Permanente

Temporal

Programa

Ejecución

2 X 102 X 1014 14 células adultocélulas adulto2X102X102323 60 años 60 años

FertilizaciónFertilizaciónInformación Genética

Antecedentes caracterización del material hereditario

• Teoría celular• Teoría cromosómica de la herencia• Composición química del núcleo• Transformación de bacterias• Transducciòn de fagos• Proporcion de bases nitrogenadas• Difracción de rayos X

Composición química del núcleo

• F.Miescher, 1869: nucleos y esperma de salmon: sustancia fosfórica no proteica.

• P.A. Levene, 1920’s– [P] = [D-ribosa] = [4 bases nitrogenadas]– P:D-ribosa:base => nucleotido– Extraccion fibrilar => cadena.

• R. Feulgen, 1920, tinción nuclear específica, cuantitativa= gametos 1/2 de otras células.

Carbonos de la desoxi/oxi ribosa

• 1’ Base nitrogenada1’ Base nitrogenada• 2’ H (ADN) / OH (ARN)2’ H (ADN) / OH (ARN)• 3’ OH-Interaccion con P 3’ OH-Interaccion con P

(5’) de otro nucleótido(5’) de otro nucleótido• 4’4’• 5’ – PPP- interaccion 5’ – PPP- interaccion

con OH (3’) de otro con OH (3’) de otro nucleótidonucleótido

La formación de nucleótidos de DNA

fosfato + desoxirribosa + base nitrogenada = Deoxinucleótido

5’

1’

3’

1

2 345

67

89

12

34

5

6

Bases Nitrogenadas

R. Franklin y M. Wilkins, 1953Estudios de Difraccion de rayos X

- Hélice- bases perpendiculares al eje- 0.34 nanometros (nm)/base-peldaño- 1 vuelta completa ~ 3.4 nm => 10 bases / vuelta- 2 nm (20 Amstrong) de ancho

FOTO 51

• Química del ADN• Distancias (rayos X)• Helice (1, 2, 3?)• Esqueleto ribosa-fosfato• Bases perpendiculares• Chargaff [A]=[T], [C]=[G]

Modelos moleculares(Rompecabezas con fierros y cartulinas) doble cadena

Para tener 2 nm de ancho solo se puede arreglar de una forma: antiparalela

A frente a T (2 enlaces de Hidrógeno)G frente a C (3 enlaces de hidrógeno)

DOBLE CADENA ANTIPARALELA

Las 2 bases complementarias soncoplanares: pares de bases

Los esqueletos azucar-fosfato estanal exterior-”barandas”- (ácido) y las bases al interior-”peldaños”.

Las cadenas complementarias, antiparalelas forman la doble hélice

Cada cromosoma cientos de millones de pares de bases. “Barandas” repeticiones idénticas, secuencia de bases: información genética

El DNA es doble cadena antiparalelaEl DNA es doble cadena antiparalelaSi se conoce una hebra se conoce la otraSi se conoce una hebra se conoce la otra

Toda la información genética se escribe en una secuencia 4 letras de DNA:

• Inicio de replicación

• Estructura del cromosoma: telómero, centrómero

• Gen:– Exones/intrones – Inicio y final de trascripción– Regiones promotoras– Regiones reguladoras

Secuencia Parcial del Gen de la Insulina

Qué somos…depende cómo estamos escritos…

…ATTTGCAGTTCCAGTCATTGCAATTGCCATTGCCAAC…

Propiedades fisicoquímicas del DNA

• Doble cadena complementaria antiparalela• A:T 2 enlaces de hidrógeno, G:C 3 (mas

fuerte)• Denaturación: apertura de doble cadena• Renaturación: cierre de doble cadena• Hibridación: una hebra se aparea con otra

complementaria

Denaturación

Agentes químicos (hidróxidos), alta temperatura (> 90°C), baja salinidad

Secuencias ricas en AT (doble enlace) más fáciles de denaturar que las ricas en GC (triple enlace)

Se rompen los enlaces de hidrógeno y se separan las cadenas

5`3’

5’ 3’

Dos cadenas se aparean por reconocimiento de bases y vuelven a formar enlaces de hidrógeno

Renaturación

RENATURACIÓN

Hibridación: renaturación o apareamiento con otras moléculas complementarias de DNA

Hay competencia dependiendo de la cantidad de moléculas

Apareamiento 1 vs. ?

5’ ACCCTAATTTAACAAAC 3’

5’ GGCCACCACGGCCC 3’

5’ GTTTGTTAAATTAGGGT 3’

5’ TGGGATTAAATTGTTTG 3’

1

2

3

3’CAAACAATTTAATCCCA 5’

5’ GTTTGTTAAATTAGGGT 3’

5’ GTTTGTTAAATTACAGC 3’

5’ GTTTGTTACATTAGGGT 3’

Apareamientos perfectos e imperfectos

Diagnóstico genDiagnóstico genéético glaucoma familia Andahuaylastico glaucoma familia Andahuaylas

Guevara-Fujita, Perez-Grosman, Estrada, Pawar, Vargas, Richards & Fujita (2008). Journal of Glaucoma 17:1 67-72

Normal (perfecto)

Afectado (imperfecto)

CSGE-Conformational Sensitive Gel electroforesisdetecta mutaciones apareamiento imperfecto

A

C

Replicación• Principio Universal todas especies • Reproducción individuo, preservación especie • Objetivo: 2 copias exactas para 2 células hijas. De cigoto a

indivíduo (1014) vida (1023). Provisión genética a las siguientes generaciones.

• Fase S ciclo celular Semiconservativa, bidireccional• Maquinaria enzimática compleja y precisa• Alta fidelidad, verificación y reparación: estabilidad genética

individuo y especie• Dirección siempre: 5’ a 3’• Una cadena continua y la otra discontinua• Fallas en replicación: enfermedades degenerativas, cáncer• http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

Replicación necesita:

• Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP, dTTP

• Origen de replicación (secuencia específica). Reconocimiento 200-300 bp una cadena rica en A yTs.

• DNA polimerasa: siempre sintetiza 5’ -> 3’, necesita 3’OH libre para continuar

• RNA cebador (Primer): pequeño segmento de RNA, donador de extremo 3’OH iniciador para DNA pol

• Complejo con otras proteínas: helicasa, SSB, primasa, topoisomerasa, etc.

Características de la replicación del DNA

Semiconservativa (una hebra antigua con una nueva)

Bidireccional a ambos lados del origen de replicación)

E. Coli 4.5 Mb, 30’

Origen de Replicación

Esquema de las burbujas de replicación en eucariotas

(E. coli) 1 sola horquilla de replicación 30’ Genoma 4.5 millones bp (4.5 Mb)Genoma humano (3, 200 millones de pares de bases), cuanto tiempo? 500 horas (20 días?). Linfocitos en cultivo 20 horas => varios puntos a la vez, 20,000 puntos, 150 kb c/u

Incorporación de BrdU en distintos momentos

A B C D

A BC D

A B C D

Problemas de la DNA polim. en una horquilla de replicación:

?

tira continua, líder

Replicación siempre 3’a 5’DNA pol necesita 3’OH

tira descontinua, retardada

¿Çómo hace tira retardada?Replicación necesita 3’OHRNA cebador (primer)Primasa

primer RNASSB (RP-A)

topoisomerasas

helicasas

Dirección deldesenrrollamiento

Esquema general de la replicación

(cadena contínua)

(cadena discontínua)

Antibióticos y replicación

• Inhibición topoisomerasas: quinolonas bacterianas, ciprofloxacina, norfloxacina. Irinotecán cáncer.

• Sulfonamidas: inhibe ácido fólico bacteriano: cofactor indispensable para fabricar nucleótidos

• Arabinósidos: reemplaza ribosa (no tiene 3’OH) en nucleótido. Citarabina (antileucémicos), ara A (antiviral). Primasa y DNA Polimerasa afectados

IrinotecanTopoisomerasa

Bases Nitrogenadas

Tipos de mutaciones a nivel molecular

AACGTTGACCC

Sustituciones: AACGTCGACCC

Deleciones: AACGTACCC

Inserciones: AACGTTAAGTGACCC

Repeticiones AACGTTGTTGTTGACCC

TG

Causas de Mutaciones

• Internas (espontáneas): oxidación, metilación,

desaminación, depurinación, depirimidinación.

• Externas (inducidas): radiación: X, , UV,policíclicos

aromáticos (benzopireno, humo, brea, naftalina)

Reparación

• Integridad de la información genética– Funcionamiento normal– Transmisión de los caracteres

• Chequeo:– Replicación: DNA polimerasa

3’endonucleassa– Reparación de daño

• Problemas de reparación: enfermedades degenerativas (envejecimiento celular) y cáncer

Principales tipos de reparación

• BER (Escisión de 1 base)

• MMR (Reparación de mal apareamiento)

• NER (Escisión de nucleótidos)

• HR/NHREJ (Reparación homóloga/no homóloga)

• Emergencia demasiadas mutaciones: Respuesta

SOS (emergencia) procariotes / p53 (paro ciclo

celular – apoptosis)

Sistema de reparación

• Más de 150 genes conocidos• Varios complejos proteicos en sistema de

recombinación (sensores moleculares)• Homología de genes de reparación

conservada en evolución• Pasos: reconocimiento, endonucleasa,

exonucleasa/helicasa, DNA polimerasa, ligasa

Reparación por desigualdad

Si la nueva hebra está equivocada, cómo reconocemos la correcta, (antigua?)

5’ CCATTGATTATT 3’3’ GGTACCTAATAA 5’

Defecto de apareamiento

hebra antigua es metilado, nueva todavía

(BER) Escisión de 1 base

-Depurinación (rotura de enlace glucosídico) espontánea-Desaminación de A y C yremoción por N-glucosidadasa

(NER) Reparación por escición de nucleótidos

- Daño a varias bases(hasta ~ 30)-UV: dímeros de timina,- Daño con distorsión física - Xeroderma pigmentosa Síndrome de Cockayne

Double strand break

Non homologousEnd joining

Secuencia parecida

Secuencia idéntica

Traslocación, inversión

Recombinación homóloga y NO homóloga

Síndromes debidos a fallas en reparación (1)

Síndromes debidos a fallas en reparación (2)

BRCA: reconocimiento mutaciones doble hebra y supresor de tumor (paro ciclo celular)

Mutaciones asociadas a XP, CS y TTD

3p25

9q22.3

13q22

5q12.3

11