POTENCIAL TERAPÉUTICO DE LAS CÉLULAS MADRE EN LA ...147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/JULIA MAROTO...
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FACULTADDEFARMACIA
UNIVERSIDADCOMPLUTENSE
POTENCIALTERAPÉUTICODELASCÉLULASMADRE
ENLAENFERMEDADCRÓNICAHEPÁTICA
Autor:
D.N.I.:
Tutor:AránzazuSánchez
Convocatoria:JUNIO2016
1
ÍNDICE
1.-RESUMEN.......................................................................................................................................................................22.-INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................................................23.-MATERIALYMETODOS...........................................................................................................................................44.-RESULTADOS................................................................................................................................................................54.1.-REPROGRAMACIÓNCELULARYDIFERENCIACIÓNDEiPSCsAHEPATOCITOS.......................54.2.- REGENERACIÓN HEPÁTICA TRAS EL TRASPLANTE DE HEPATOCITOS PROCEDENTES DE iPSC........................................................................................................................................................................................74.3.-APLICACIÓNTERAPÉUTICADELASiPSCENTERAPIAGÉNICADEENFERMEDADESHEPÁTICAS...................................................................................................................................................................................................94.4.-HÍGADOSBIOARTIFICIALESEHÍGADOSINVITRO...............................................................................104.4.1.-HÍGADOSBIOARTIFICIALES.........................................................................................................11
4.4.2.-INGENIERÍADETEJIDOS:HÍGADOSINVITRO……………………………………………………11
4.5.-CÉLULASMADREMESENQUIMALESENCARCINOMAHEPÁTICO................................................126.-DISCUSIÓN.................................................................................................................................................................147.-CONCLUSIÓN………………………………………………………………………………………………………………….16
8.-BIBLIOGRAFÍA...........................................................................................................................................................16
2
1.-RESUMEN
En la búsquedade alternativas frente al trasplante hepático como solución a determinadas
enfermedadeshepáticascrónicas,encontramosque lascélulasmadre, sobre todo lasMSCy
lasiPSC,estánsiendoampliamenteestudiadas.
Las iPSC sirven como fuente para generar hepatocitos que posteriormente podrán ser
trasplantadosdirectamente al hígadooutilizados en la generacióndeórganos invitroode
órganosbioartificiales(BAL).Estolespermiteserusadastantoenregeneraciónhepáticatras
infeccionesolesionescomoenenfermedadesdeorigengenético.
LasMSChansidosuperadasenmuchosaspectosporlasiPSC,perocontinúasiendoestudiado
supapelenrelaciónalcarcinomahepático,dondepodríandesarrollarunimportantepapelen
lainmunomodulación.
2.-INTRODUCCIÓN
Las enfermedades hepáticas suponen una importante causa de muerte a nivel mundial,
resaltandolacirrosis(duodécimacausademuerte,)yelhepatocarcinoma(decimosextacausa
de muerte), siendo la mayoría de los casos debidos a enfermedades infecciosas,
principalmenteenpaísesenvíasdedesarrollo(1)(2).Adíadehoylaúnicasoluciónefectivaen
estadosavanzadosdeestostrastornoseseltrasplantehepático.Estetratamientoconllevauna
elevadamorbilidad y un elevado coste económico para los sistemas sanitarios, resultando
además insuficiente para curar a todos los enfermos debido a la escasez de donantes y al
posiblerechazo(3).
Desde losaños60seempezaronaprobarnuevasestrategiascentradasenel trasplante de
hepatocitos, tantoautólogos(loshepatocitos trasplantadosseobtienendelpropiopaciente)
comoxenotrasplantes(loshepatocitos trasplantadosenestecasoseobtienende individuos
deotrasespecies)(4).Estasnuevastécnicascelularesseenfrentaronadiversosproblemas,por
un lado, los hepatocitos porcinos (xenotrasplantes) daban lugar al desarrollo de una
respuesta inmunitaria y no eran capaces de mimetizar totalmente las funciones de un
hepatocito humano. Por otra parte, el uso de cultivos de hepatocitos in vitro demostró
dificultades,comounadifícilconservaciónenfrío(criogenización)(5),aloquesesumaba,en
3
aquelloshepatocitosprocedentesdecélulastumorales,undéficitdefuncionalidadpuestode
manifiesto en la incapacidad de llevar a cabo el ciclo de la urea(6). Estas dificultades en la
generación de hepatocitos viables se resolvieron parcialmente mediante el uso de células
madre como posible terapia alternativa, al resultarmenos invasiva,más barata y ser poco
inmunogénica,debidoestoúltimoaquelafuentedeestascélulaseraelpropiopaciente.Las
másestudiadashastaelmomentosonlascélulasmadrehematopoyéticas(HSC)ylascélulas
madremesenquimales(MSC).Ambashandemostradociertaeficaciaenmodelosanimalescon
daño hepático, tanto agudo como crónico, presentando capacidad regeneradora e
inmunomoduladora(7)(8).Por otro lado tenemos las células madre embrionarias, aunque las
implicacioneséticasdesuusocomplicansuaplicaciónmásalládelcampoinvestigador(9).
Enrelaciónal carcinomahepático los resultadosobtenidossonmuyvariables,nopudiendo
confirmarsesilaterapiacelularconMSCsuponeunamejoraotienepotencialparaagravarun
posible hepatocarcinoma, en parte debido a la dificultad para dirigir eficazmente a estas
célulashaciaunalocalizaciónconcreta(10).
Frenteaestoslinajescelularessehacomenzadoainvestigarrecientementeelposiblepapel
de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que presentan una mejor capacidad
proliferativa y se pueden obtener desde una gran variedad de tipos celulares mediante
técnicasde reprogramación génica(11). Sehademostradoque las iPSC retienen información
génica de sus células de procedencia, lo que sugiere que dependiendo de sus células de
procedencialasiPSCtendránunacapacidaddediferenciaciónuotra(12).
Para obtener iPSC humanas, las células adultas que mejores resultados han dado son los
fibroblastosde lapiel.Estorepresentaungranavancealnorequerirseunmétodo invasivo
paralaobtencióndelascélulas,siendosuficienteconunabiopsiadelapiel.Unavezobtenidos
los fibroblastos, estos son tratados acorde a los protocolos establecidos para conseguir su
reprogramaciónacélulaspluripotentes,ysuposteriordiferenciaciónhaciahepatocitos(13).Se
aplicaron para su reprogramación diferentes factores de transcripción, resaltando Oct4
(octamer-binding transcription factor 4), Sox2 (sex-determining region Y box 2), Klf4
(Kruppel-like factor4)y c-Myc. (OSKM).Para sudiferenciación, seutilizaron losprotocolos
que previamente se habían aplicado en la diferenciación de células madre del endodermo
(ESC).Adíadehoyaúnseestánperfeccionandolastécnicasdediferenciación,puesaúnnose
ha establecido ninguna capaz de generar células completamente equivalentes a los
hepatocitos primarios(14). En los métodos empleados actualmente, se intenta imitar el
4
desarrolloembriológiconatural,recreandolasseñalesmolecularesycelularesquesedanen
cadafasedeesteproceso.
Unavezfinalizadoelprocesodediferenciación,paraasegurarqueloshepatocitosderivados
de iPSC obtenidos sean los deseados, se comprueba la presencia de marcadores de
diferenciaciónespecíficosdeloshepatocitos,comosonlacapacidaddesecrecióndealbumina
(ALB),dealfa-fetoproteína(AFP),dealfa1-antitripsina(AAT),deurea, también laexpresión
dedeterminadasproteínasyladelCYP450ensusisoformasCYP3A4yCYP3A7.
Los hepatocitos producidos podrán ser trasplantados directamente en el organismo para
promover la regeneración hepática, así como utilizarse en la creación de hígados
bioartificiales (BAL), suponiendo ambas técnicas una alternativa al tratamiento habitual de
trasplantehepático(15).
En resumen y teniendo en cuenta los últimos avances en el campo de la terapia celular,
recogeremos el posible papel futuro de las célulasmadre, especialmente de las iPSC, en el
tratamiento de las enfermedades crónicas hepáticas, resaltando la cirrosis y el carcinoma
hepático.
3.-MATERIALYMETODOS
Se realizó una búsqueda sistemática de revisiones bibliográficas así como de estudios
científicos. Se llevó a cabo esta búsqueda en inglés a través de Pubmed utilizando como
palabras o expresiones clave: iPSC, “induced pluripotent stem cells”, “liver”, “hepatocyte
differentiation”,“iPSCderivedhepatocytes”“reprogramming”.Pubmedesunaherramientade
búsqueda de libre acceso a la base de datos MEDLINE dónde encontramos citaciones,
resúmenes y artículos de investigación biomédica. En cuanto a los criterios de inclusión,
hemos tratado de seleccionar artículos con investigaciones del 2010 en adelante, que se
centren en el estudio de células humanas como fuente de producción de iPSC, así como su
estudioenmodelosanimalescondañohepáticocrónico,principalmenteenratones.
5
4.-RESULTADOSYDISCUSIÓN
Las iPSC representan una innovadora fuente de células útiles enmedicina regenerativa, ya
que pueden reprogramarse y posteriormente diferenciarse hacia cualquier tipo de célula
adultamadura,comoeselcasodeloshepatocitos,pudiendoserutilizadosenterapiacelular,
ingenieríadetejidosycreacióndehígadosbioartificiales(16).
4.1.-REPROGRAMACIÓNCELULARYDIFERENCIACIÓNDEiPSCsAHEPATOCITOS
Los factores de transcripción requeridos según el grupo de Takahashy et al para la
reprogramacióncelularhaciacélulaspluripotenteseran4(OKSM):Oct4,Sox2,Klf4yc-Myc.
Actualmentesehandejadodeusarlosfactoresdetranscripciónc-MycyKlf4,queapesarde
estarpresentesenlaembriogénesis,elevabanelriesgodeproduciruntumorsegúnThomson
etal,yporellohansidosustituidosporNanogyLin28(17).Enrelaciónaminimizarelriesgode
desarrollo tumoral derivado del uso de vectores virales se está investigando el empleo de
microRNA(18).
UnavezobtenidaslasiPSCsonsometidasaunaseriedepruebasconelfindecaracterizarlasy
garantizar el éxitodelprocesode reprogramación. Se llevaa caboun testdepluripotencia,
quecomprendeel testde la fosfatasaalcalinaasí comoun testdedeteccióndemarcadores
(como mínimo Oct4, Nanog, Sox2, SSEA3, SSEA4, Tra-1- 60, Tra-1-81), un test de
diferenciación in vitro, con el fin de detectar las tres capas germinales mediante
inmunocitoquímica,uncariotipoyuntestconelfindeidentificarlahuellagenéticamediante
elanálisisdemicrosatélites(19).
Figura1:Esquemadeobtencióndehepatocitosdesdefibroblastos.SubbaRaoMetal(2013)
6
LosprimerosprotocoloscreadosparadiferenciarESCinvitrohaciadistintostiposcelulares,
tambiénaplicablesaladiferenciacióndeiPSC,estabanbasadosenobservacioneshechaspor
biólogos durante el estudio del desarrollo embriológico natural y del mismo modo se
definieron lascondicionesdecultivo.Enestosmanualesserecogen4estadios: inducciónal
endodermo,especificaciónhepática,expansiónhepatoblásticaymaduraciónhepática;aestas
fases llegamos mediante la administración de varios factores de crecimiento en un orden
determinadoyconelusodefactoresdetranscripción(20).
La primera aproximación a la producción de hepatocitos funcionales fue la producción de
célulasdelendodermo,quesonlascélulasembrionariasapartirdelascualessedesarrollan
loshepatocitos.EnestafasedeinducciónalendodermoserequierelaexpresióndeactivinaA,
que solo se expresa cuando la fosfatidil inositol 3-quinasa (PI3K) está suprimida. También
requierelaseñalizacióndelaproteínaWnt3a(Wingless-TypeMMTVIntegrationSiteFamily,
Member 3), así como la de FGF (Fibroblast Growth Factor)(21). Ha sido demostrado que la
inhibicióndelaglucógenosintasa3-quinasa(GSK-3)estambiénimportanteenlaformación
definitivadelendodermo.Ademáshaypequeñasmoléculascuyapresenciaesdefinitivapara
el desarrollo del endodermo, las dos más eficientes son el ácido benzoico y el
oxoheptanoico(14).EnestafaselascélulasexpresanSOX17(SRY(SexDeterminingRegionY)-
Box17)yFOXA2(ForkheadBoxA2),quesonmarcadoresdelendodermo,delmismomodo
aúnquedancélulasqueexpresanelmarcadordepluripotenciaOct4(22).
Se ha postulado que la inhibición de la ruta de señalización de p53 previene la apoptosis,
senescencia y la detención del ciclo celular incrementando por tanto la eficiencia de la
reprogramación,favoreciendolafasedeespecificaciónhepatoblástica(14).Ademásenestafase
lascélulassontratadasconHGF(HepatocyteGrowthFactor)yconDMSO(dimetilsulfoxido),
lo que produce un aumento de la proliferación y contribuye a su vez en la expansión
hepatoblástica(22).
Finalmente la fasedemaduraciónhepática se alcanza conel tratamientode las células con
dexametasona,traslocualcomenzamosaapreciarmarcadoreshepáticoscomoALB,AFPy
AAT22).
Por otro lado la matriz extracelular (ECM) se considera otro importante factor para la
diferenciación de las iPSC a hepatocitos. A su vez la ECM es órgano- específica, es decir es
diferente en cada órgano o tejido, por ello se la considera un importante órgano-
7
modulador(23). Elmecanismoa travésdel cual laECM intervieneen ladiferenciaciónde las
iPSCesaununmisterio,soloseconocequeesatravésdelainteracciónconlasintegrinasα-6
yβ-1,porloqueesuncampodeestudioabiertotodavía(14).
4.2.- REGENERACIÓN HEPÁTICA TRAS EL TRASPLANTE DE HEPATOCITOS
PROCEDENTES DE iPSC
Lasenfermedadescrónicashepáticasasícomoelfallohepáticoagudosuponenunamermade
las funciones hepáticas que en un alto porcentaje sólo puede ser revertida mediante el
trasplantedeunnuevohígado(24).Esporelloquesehaninvestigadoy desarrolladonuevas
técnicas para tratar esta patología, como es el trasplante de hepatocitos de diversas
procedencias,especialmentelosgeneradosapartirdeiPSChumanas(hiPSC).
Uno de los últimos estudios realizados con hiPSC en roedores, ha demostrado una buena
capacidaddeéstasparaserintegradasenunhígadodañado,desarrollandomicrovasculatura
y siendo capaces de segregar factores como el HGF, en una cantidad similar a la de los
hepatocitos derivados de BMSC (Bone Marrow Stem Cell), que permiten promover la
regeneración hepática y su funcionalidad(25). Esto ha quedado demostrado con el
sometimiento a diversas pruebas de estrés con CCL4, habiéndose observándose una
disminucióndelaletalidadencomparaciónahígadosdañadosquenorecibieronhiPSC(26).
Figura2:Papeldelascélulasmadreensituacionesdedañohepático.ZhangZetal(2013)
Zheng Zhang, Fu-Sheng Wang*Research Center for Biological Therapy, The Institute of Translational Hepatology,
Beijing 302 Hospital, Beijing 100039, China *Corresponding author. Address: Research Center for Biological Therapy, The Institute of Translational Hepatology, Beijing 302 Hospital, China.
Tel: + 86 10 63879735; fax: + 86 10 63879735. *E-mail addresses: [email protected] or [email protected]
Stem cell therapies for liver failuresand cirrhosis
Keywords: Mesenchymal stem cells; Liver failure; Liver cirrhosisReceived 16 November 2012; received in revised form 11 January 2013; accepted 17 January 2013
Liver failure Liver cirrhosis
Liver failure Liver cirrhosis
Support of growth of liver residual
hepatocytes
Hepatocyte regeneration
Fibrosis/cirrhosis development
Anti-scaring Apoptosis
Fibrotic reconstitution
NK
Replace hepatocyte
Activin KGFHGF
iPS ES
ES-iPS
TregHGF PGE2
IDO
+
A
B
M-CSFSDF-1
SCFLIF
MSCs
MSCs
HGF bFGF IL-10
Fas/FasL
DC CD4 CD8 B cell
Inflammation
Hepatocyte loss
Increasing functional hepatocytes Improving liver microenvironment
1 1
2
35
4
Hepatocytes
Hepatic stellate cellsExtracellular
matrix
Large-scale cohortrandomized controlled
The infused stem cells:type, number, route,
timing and end-points
Journal of Hepatology 2013 vol. 59 | 183-185
Hepatology Snapshot
Open access under CC BY-NC-ND license.
8
Una de las claves de este estudio reside en elmétodo de implantación celular, habiéndose
empleadounaláminadehepatocitos,quefuedepositadaenlasuperficiehepática,envezdel
habitual método intraesplénico (consistente en la inyección de una suspensión celular a
travésdelbazo).Encomparaciónconésteseobservóunamejorimplantación(monitorizada
porlaintensidadenlaexpresióndeluciferasa,inducidamediantelaintroduccióndeunvector
deexpresión)yunaausenciadehepatocitosenlocalizacionesextrahepáticas,queesunode
los principales inconvenientes de la administración de células esplénicamente. La
monitorización de la ausencia de hepatocitos se realizó mediante el análisis de DNA de
diferentes localizaciones, amplificándose los fragmentos c-mos (ratón) y Alu (humano),
localizándoseesteúltimoúnicamenteenelhígado.
El método de implantación también resultó clave en la supervivencia demostrada tras las
pruebasdeletalidadconCCl4.Losresultadosdeestaspruebasseñalaronunamayortasade
supervivenciaenlosratonesquerecibieronlascélulasenlámina(63,2%),frentealosratones
que las recibieron por vía intraesplénica (33,3%) y los controles (16,7%). Además, tras un
análisis histológico de los diferentes hígados según el proceso de implantación seguido, se
observó unamayor incidencia de necrosis en los animales que recibieron el trasplante vía
esplénica.Estosindudaconfirmalaimportanciadelmétododeadministraciónenrelacióna
losresultadosderegeneraciónobtenidosyalaprevencióndeposiblesefectosadversos.
Figura3:Técnicadecultivoenláminaparaposteriortrasplante.NagamotoYetal(2016)
LacapacidadregeneradorapresentadaporlasiPSCpuedeversepotenciadasiseaplicanjunto
a células madre mesenquimales en enfermedad crónica hepática. En esta patología,
caracterizadaporunprocesoinflamatorioenelquelaarquitecturahepáticaesdistorsionada
y se produce muerte celular, es de vital importancia acompañar a los procesos de
regeneracióndeprocesosdeinmunomodulación.EsahídondelasMSChandemostradouna
gran eficacia al inhibir los linfocitos NK, B y T, así como impidiendo la maduración y
diferenciación de las células dendríticas (presentadoras de antígenos)(27)(28). Para la
Figure 1
2 days
monolayer culture on thin Matrigel 3D culture on Nanopillar platemonolayer culture on
TRCD
definitive hepatoblasts hepatocytemesendoderm hepatocytehuman 2 days 3 days 3 days4 days 13 days 10 days
A day 0 day 11 day 35 day 37
Ad-FOXA2(3,000 VP/cell)
Ad-FOXA2, Ad-HNF1α(1,500 + 1,500 VP/cell)
definitive endoderm cells
hepatoblasts hepatocyte-like cells
mesendodermcells
hepatocyte-sheet
human iPSCs
90100
B C F
10-1100101
αAT
rela
tive
gene
expr
essi
on
P=0.515
10-1100101
ALB
rela
tive
gene
expr
essi
on
* *P=0.004
2030405060708090
ALBASGR1
% o
f pos
itive
cel
ls
D E
10-1
100
101
CYP3A4
rela
tive
gene
expr
essi
on
P=0.056
10-1100101
CYP1A2
gene
expr
essi
onP=0.520
10-510-410-310-210
iPSCs iPS-HLCs PHH48hr
rela
tive
expr
essi
on
10-510-410-310-210
iPSCs iPS-HLCs PHH48hr
rela
tive
gene
expr
essi
on
CK18 αATG H I
01020
iPSCs iPS-HLCs10-3
10-2
10-1
iPSCs iPS-HLCs PHH48hr
rela
tive
expr
essi
on
10-410-310-2
10-1
iPSCs iPS-HLCs PHH48hr
rela
tive
gene
expr
essi
on
K
Liver Liver Liver
Human iPS-HLCs on a TRCD
CellShifter
1st transplantaion 2nd transplantaion
J
bilayeredhuman iPS-HLC sheets
with CellShifter
Liver Liver Liver
bilayeredhuman iPS-HLC sheets
9
aplicación humana, se han construido bibliotecas de líneas celulares con genotipos
seleccionados conocidos, proporcionando a los pacientes con MHC (Complejo Mayor de
Histocompatibilidad) cercano o similar, que puedan minimizar la necesidad de
inmunosupresiónparalograrelinjertodelascélulas(15).
Recientemente,sehademostradoquelasiPSCderivadasdehepatocitospuedenrestaurarla
función hepática en modelos animales con insuficiencia hepática (inducida mediante
hepatectomía)(26).Estosresultadosindicanunaalternativadetratamientoparalospacientes
conenfermedadhepáticaenfaseterminal.
Enelcasodelacirrosislaestrategiaterapéuticatambiénpuedebasarseenlasustituciónde
hepatocitos dañados o la regeneración de estos junto con la corrección de la fibrogénesis
desequilibrada que se produce en esta patología. Los informes sugieren que hepatocitos
diferenciados a partir de iPSC hanmejorado la regeneración del hígado en ratones(27), han
reducidolafibrosishepáticaenunmodeloderatón(28),yfavorecieronlaestabilizacióndela
cirrosis(porefectosderivadosdelarepoblacióndelhígadoporhepatocitos)(29).
LasprincipaleslimitacionesenelusodelasiPSCenmedicinaregenerativaradicanenelbajo
rendimientodelprocesode reprogramacióngenética(30), laduracióndeesteproceso (entre
12-20días)(31), lasdificultades en lapurificación(32) así comoen la integración específica al
lugar indicado y no en localizaciones no deseadas(33). Esto, unido a la posibilidad de una
desdiferenciación previa al trasplante y a la necesidad de más estudios sobre la memoria
genéticade las iPSC suponeun frenopara su aplicación clínica en el campode lamedicina
regenerativa(34)(35).
4.3.-APLICACIÓNTERAPÉUTICADELAS iPSCENTERAPIAGÉNICADEENFERMEDADES
HEPÁTICAS.
DiferentesestudiossehancentradoenelpotencialusodeloshepatocitosderivadosdehiPSC
en enfermedades hepáticas innatas como pueden ser la deficiencia de α1-antitripsina, la
hipercolesterolemia familiar, la enfermedad de almacenamiento de glucógeno Tipo 1a, la
tirosinemia hereditaria, el síndrome de Crigler-Najjar y el déficit en el factor VII(36). Estas
enfermedades,cuyaúnicaposibilidaddecuraciónpasaporunamodificacióndelaexpresión
génica,suponenuncampoatractivoparaelempleodeiPSC.
En este caso las iPSC tendrían que sermodificadas genéticamente para soslayar el defecto
heredado,empleandotecnologíasdeedicióngenómicamediantenucleasasdezinc(37).Unavez
10
que, a partir de células del paciente conseguimos hepatocitos sanos, estos podrían ser
empleados en la generación de órganos in vitro para un posterior trasplante(38), en su
implantación directa en el hígado o en la creación de hígados bioartificiales
extracorpóreos(39). Diferentes estudios han demostrado resultados prometedores en
roedores, consiguiendomejorar laactividaddeaquellosprocesoscelularesafectadospor la
patologíaheredada.
Unodelosestudiosanalizadosrealizóunacomparaciónentreelusodehepatocitosnormales
yhepatocitosobtenidosa travésde iPSCenel tratamientode lahemofiliaBen ratones. La
obtención de los hepatocitos a partir de iPSC se hizo a partir de protocolos establecidos,
validándose a su vez la implantaciónde estos en el hígado. La efectividadde losdiferentes
tratamientos se valoró en función de la mejora de los tiempos de protrombina, medidos
mediante tromboelastrografía Los tiemposobtenidos fueron significativamentemejores en
ratonestratadosconiPSC,observándoseunaumentodelaactividaddelfactorIXdeentreun
2yun3%alas4semanastrasla implantación.Encomparaciónalostratamientosactuales
paralahemofiliaB,comopuedeserlaterapiadereemplazamientodelfactorIX,elempleode
hepatocitosdeiPSCsuponeunmenorcoste,unamenorincidenciadeeventoshemorrágicos
futurosyunmenorriesgodeanafilaxis(40).
4.4.-HÍGADOSBIOARTIFICIALESEHÍGADOSINVITRO
Denominamos hígado bioartificial (BAL) a un dispositivo extracorpóreo, compuesto por
células hepáticas, que es utilizado en casos de insuficiencia hepática aguda a fin de suplir
parcialmente las funciones del hígado dañado(41). Estos dispositivos no son capaces de
sustituirtotalmentelafunciónhepática,ysesuelenusarcomomedidapaliativaenesperaa
untrasplante.
Es importante diferenciar los diferentes BAL de lo que sería un hígado invitro. El término
hígado invitro hace referencia auna líneade investigaciónactual, encuadradadentrode la
ingeniería de tejidos, en la que se busca desarrollar hígados a partir de célulasmadre del
paciente,normalmentesobreunamatrizdecelularizada,conel findepoderusarlosparaun
trasplanteposterioroparaelestudiodeunapatologíadeterminada.
11
4.4.1.-HÍGADOSBIOARTIFICIALES
Ante un daño hepático agudo, se produce una insuficiencia metabólica. Esta situación se
caracterizaporunaumentode la concentraciónde sustanciasdedesecho, así comodeuna
incapacidad progresiva del organismo para mantener una homeostasis adecuada. La
acumulacióndedeshechosfuesolucionadaenunprincipiomediantelautilizacióndesoportes
extrahepáticos no biológicos, que recibían el nombre de “diálisis extrahepática”. Estos
métodos presentaban una cierta eficacia en la eliminación de sustancias tóxicas, pero eran
incapaces de restaurar las funciones metabólicas perdidas, entre las que resaltan la
ureogénesis, detoxificación enzimática, síntesis proteica, gluconeogénesis y la
inmunomodulación.
AnteestaproblemáticasurgieronlosBAL.Estosdispositivosestáncompuestosporunaserie
decartuchosconfibrashuecasdondesesitúanloshepatocitos.Loscartuchosestándiseñados
paramaximizar la superficie de células expuestas al plasma del paciente, permitiendo una
disposiciónen3Dquefacilitaelcrecimientodeloshepatocitos.Estossistemasbioartificiales
se encuentran actualmente en uso clínico, usando diferentes fuentes celulares, desde
hepatocitosporcinosa líneascelulares.ElprincipalsistemausadoeselHepatAssist(Alliqua
Inc.,Langhorne,PA,USA),formadoporcélulasporcinascriopreservadaspuestasencontacto
con el plasma a través de unamembranamicroporosa, impidiendo de estamanera que se
produzcanreaccionesinmunitarias.OtrosdispositivosusadosseríanelELAD(VitalTherapies
Inc., San Diego, USA), que usa células de hepatoblastoma C3A, y con eficacia probada
reduciendo los niveles de amonio y bilirrubina en casos de encefalopatía hepática. Otros
dispositivosmenosusadossonelAMC-BAL(AcademicMedicalCenter,Amsterdam,NL)yel
MELS(Charité,Berlin,GE)(42).
4.4.2.-INGENIERÍADETEJIDOS:HÍGADOSINVITRO
Las principales investigaciones dirigidas a la producción de órganos in vitro para ser
trasplantadossecentranenlaimplantacióndediferentestiposcelularessobreunamatrizque
permitaunadisposiciónlomássimilarposiblea laqueencontramosenunorganismo.Para
obtener estas matrices se aplican técnicas de descelularización o de impresión 3D
(bioprinting).
En las técnicas de descelularización, las células del órgano (en este caso el hígado) son
eliminadas mediante la perfusión de una mezcla de detergentes alcalinos y agentes
enzimáticos, que eliminan cualquier resto celular que pueda provocar una respuesta
12
inmunitaria.Estoesdesumaimportanciaparainiciarposteriormenteelcultivodediferentes
tipos celulares sobre lamatriz(43). Una vez obtenida lamatriz extracelular, normalmente a
partirdehígadodecerdo,seprocedeainiciarlarecelularización.
Figura4:Generacióndehígadosinvitro.HandaKetal(2014)
La importancia de las iPSC radica en su capacidad para diferenciarse en diferentes células
hepáticas según sea sometido a la acción de diferentes precursores. Es por esto que son
utilizadasparagenerarhepatocitos,célulasendoteliales,célulasepitelialesdelductobiliary
célulasestrelladas.Estascélulassonimplantadasenlamatriz,dentrodeunbiorreactorenel
medio adecuado, y tras un tiempo se obtiene una estructura tisular en tres dimensiones.
Actualmentelasmayorescomplicacionessecentranenestepunto,debidoaladificultadpara
conseguirórganosinvitrodemaneraestandarizadayquealcancenunosnivelesmínimosde
actividadbioquímica,comoparasupliraunhígadonormal(44).
4.5.-CÉLULASMADREMESENQUIMALESENCARCINOMAHEPÁTICO
LasiPSChandemostradotenerunfuturoprometedoreneltratamientodelasenfermedades
crónicas hepáticas, desplazando a lasMSC enmultitud de aplicaciones. Sin embargo, en el
tratamiento de una de las complicaciones más frecuentes de las enfermedades hepáticas,
comoeselhepatocarcinoma,lasMSCsiguenrepresentandounafuturaopciónterapéutica,a
pesardelapolémicaalrespecto.
Currently, themain challengewith determining the suitabilityand relevance of the various types of existing organotypic he-patic culture systems for different types of toxicological appli-cations has been the lack of consensus on the standardization ofsuch systems, namelydefinitions and criteria for the following: i)biological and toxicological parameters, ii) quality controlmeasures, iii) minimum acceptable levels of basic hepaticfunctions (protein synthesis, basal phase 1 and 2 enzyme acti-vitydespecially if pluripotent stem cellederived liver cells willbe used), and iv) concentration ranges for importantmediators ofchemical-induced stress, such as mitochondria activity andadenosine-triphosphate production. These criteria would alsoneed to be compared with those observed in vivo.
Significance and Future Perspectives
Beyond the potential clinical implications of assemblingwhole livers for transplantation, organ assembly for use inpreclinical models has the potential to make an immediateand substantial impact on a wide variety of therapeutic andtechnological developments (Figure 3). These models canoffer complex 3D configurations in a controlled and scalablesetting, addressing scientific and ethical concerns associatedwith forms of in vivo testing. Future work involvingcell-cell, cell-ECM biological features, and therapeutic ap-plications of assembled livers will have to incorporatehuman cell types into the organoids, as well as develop
technical consistency and comparable validation with otherknown standards for testing therapeutic strategies (Figure 3).The liver ECM presents an ideal scaffold for stem cell
differentiation into hepatocytes, as well as cell trans-plantation. Whole organ assembly could provide models tostudy liver development and hepatic maturation processes,as well as models to study the complex interactions betweenparenchymal and nonparenchymal liver cells. Finally, wholeorgan liver assembly could be used as an in vitro tool toaccurately predict drug metabolism and toxicity in humanliver grafts, potentially resulting in reduced costs and time indrug development, as well as reduced exposure to harmfulagents by patients during clinical trials.Organ-engineering approaches to stem celleniche in-
teractions in decellularized organs may also provide novel in-sights into the distinct roles of juxtacrine and paracrinesignaling in stem cell fate decisions, because co-cultures inorgan-specific structures allow for greater control overinteractions between cell types from the same organ. Further-more, it may be possible to generate entirely autologous organsrequiring little to no immune suppression, given that protocolsfor the directed differentiation of human pluripotent stem cellsinto liver nonparenchymal cells are available (Figure 3).Finally, organotypic ex vivo systems, although minimal-
istic, are likely to be of particular importance in the analysisof liver disease (eg, hepatocarcinoma and NASH), becausemouse models do not always recapitulate the pathophysio-logical characteristics seen in humans, and hepatocytes
Figure 3 Schematic representation of the regenerative medicine paradigm of whole liver assembly using human-induced pluripotent stem (iPS) celltechnology, cell differentiation, cell therapy principles, and natural liver matrix scaffolds to construct multicellular 3D tissue for biological research andtransplantation. Drawings are not to scale.
Handa et al
354 ajp.amjpathol.org - The American Journal of Pathology
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El microambiente tisular hepático tiene una amplia influencia en el desarrollo tumoral,
favoreciendoespecialmentelametástasisdetumorescolorrectales,pancreáticosoesofágicos.
ElpapeldelasMSCfrenteauncarcinomaradicaensucapacidadparamigrar.Lamigración
hacia lazonaafectadaporel tumorhasidodescritadebidoa lapresenciade receptoresde
citoquinas y TLR en la superficie de las células madres mesenquimales. Estos receptores
interactuarían con diferentes sustancias secretadas por el tumor, resaltando HGF, SDF-
1(Steroidogenic factor-1),b-FGF,VEGF-A (VascularEndothelialGrowthFactor-A)yVCAM-1
(VascularCellAdhesionProtein1).
Figura5:AccionesdelasMSCentumoreshepáticos.HernandaPYetal(2014)
Diferentes corrientes científicas defienden actualmente un papel dual de las MSC en el
carcinoma hepático, promoviendo o inhibiendo el crecimiento tumoral. Por un lado fueron
clasificadas según la expresión de TLR4 (Toll-like Receptor 4, proinflamatorio, atenúa el
crecimientotumoralydisminuyelasmetástasis)oTLR3(inmunosupresivo,incrementandoel
crecimiento tumoral y la metástasis). Otra corriente defiende que las MSC favorecen el
crecimiento tumoral al ser co-inyectadas junto a las células tumorales, o inhiben el
crecimientotumoralalseradministradasentumoresestablecidos(45).
joined the immune cell club, they are well-recognized for their potentimmunomodulatory capacity.
6.2. Immunomodulation by MSCs
MSCs canmodulate the function of several cell types of the immunesystem including those from innate immunity including natural killer(NK) cells [57] and macrophages [58]. MSCs are also capable of modu-lating the differentiation, activation and function of dendritic cells(DCs) [59], the most efficient antigen presenting cells. The key functionof dendritic cells (DCs) is translating innate to adaptive immunity andthese cells are thought to have important link with HCC progression[60]. T cells are the main components of adaptive immune system andare crucial in controllingmalignant disease, mediating both cytotoxicityof cancer cell themselves and release of anti-oncogenic cytokines [61,62]. MSCs can effectively inhibit T cell function through multiple path-ways [63,64].
Regulatory T cells (Tregs) are a specialized subset of T cells that sup-press activation of the immune system tomaintain homeostasis and tol-erance to self-antigens. In patient HCC tumor, increased frequencies ofhighly activated Tregs are infiltrating the tumor milieu and they aremainly localized in the stroma compartment of the tumors [55]. Fur-thermore, the frequency of Tregs in HCC has been associated withpoor prognosis [65–67]. In contrast to suppress cytotoxic T cells, MSCscan induce the generation and expansion of Tregs [68]. Additionally,MSCs have been reported to induce the production of IL-10 byplamacytoid dendritic cells (pDCs), which in turn triggered the genera-tion of Tregs [63]. However, potential interactions between these
immune cells with MSCs or tumor stroma in general, have been poorlystudied in the context of liver cancer, which certainly deserve moreattention for further research.
7. Therapeutic application of MSCs in liver cancer: call for caution
7.1. Potential therapeutic application
Evidence from various preclinical models showing that MSCs canmigrate into certain types of tumors has inspired the use of MSCs as ve-hicle for anticancer drug/gene delivery [11]. This notion was furthersupported by the fact that several studies have demonstrated potentialanti-cancer effects of MSCs [31,35,45,69]. In experimental HCC models,genetically modified MSCs have been used to deliver anti-cancer geneand inhibition of HCC cell proliferation was demonstrated in vitro andin vivo [70,71]. Another approach is to deliver oncolytic viruses(e.g. measles virus) by MSCs into the tumor, in order to avoid pre-existing immunity against the virus [72]. These observations encourageclinical investigators to design trials for treating HCC, which remains anunusually deadly disease, using MSCs as a vector.
MSCs have been extensively investigated in clinical trials to treatvarious diseases [73,74]. For treating cancer, trials have also been initiat-ed to treat ovarian cancer (NCT02068794), head and neck cancer(NCT02079324) and prostate cancer (NCT01983709). Although MSCshave not been used for treating liver cancer yet (to our knowledge),over 30 trials have been registered at ClinicalTrials.gov for treatingvarious liver diseases (Table 2).
Fig. 2. Proposedmechanisms for the tumor-suppressive and tumor-promoting effects ofMSCs. The properties ofMSCs and the particular tumormicroenvironmentmay result in dual rolesof MSCs that can suppress or promote tumor progression. The tumor-suppressive mechanisms are mainly due to secreted factors and downregulation of Wnt and NF-kB pathway. Thetumor-promoting mechanisms are mainly attributed to both secreted factors and direct effects via 1) supporting tumor vasculature, 2) EMT transition and 3) ECM remodeling. Theimmunosuppressive effects of MSCs (inhibit NK cells, macrophages, dendritic cells, T cells and support regeneration of Tregs) conceivably lead to tumor-promoting effect.
443P.Y. Hernanda et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1846 (2014) 439–445
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Entrelosmecanismosimplicadosenlainhibicióntumoralsehandescritolaregulacióndela
vía de señalizaciónWnt, favoreciendo la apoptosis, la regulación de la vía NF-kB (Nuclear
factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), clave en el inicio de procesos
tumorales y la secreción de microvesículas con capacidad para detener el ciclo celular y
producirapoptosisenlascélulastumorales.
PorotrapartenosencontramosconquelasMSCpuedenfavorecerenciertoscasoselavance
de los tumores, favoreciendo la creación de vasculatura en el tumor (implicando
principalmentealasproteasasSERPINE)ylaremodelacióndelamatrizextracelular.
Estadualidaden lasposiblesaccionesde lasMSChacemuydifícilestablecerunaindicación
terapéutica clara para su uso en un futuro cercano, siendo necesarias nuevas
investigaciones(46).
6.-DISCUSIÓN
Las terapias celulares tiene un enorme potencial como tratamiento de patologías
tradicionalmentecrónicasyconungrannúmerodecomplicaciones,comosonlasprincipales
hepatopatías, ya sea empleándolas directamente (en forma de trasplante) o de manera
indirecta(enlaobtencióndeórganosodispositivosbioartificiales).
Unade lasprincipales fuentesde célulasmadrehepáticas, así comodehepatocitos, son las
denominadasiPSC.Estascélulas,quepuedenserobtenidasdeformapocoinvasivayque,al
provenir del propio paciente no presentan inmunogenicidad, centran hoy en día un gran
número de estudios acerca de su posible viabilidad en aplicaciones clínicas. Comoposibles
inconvenientes, las iPSCpresentanunamayorposibilidadde tumorogénesisprincipalmente
debido a los vectores, normalmente víricos, empleados en su obtención, estudiándose así
mismoposiblesalteracionesgenómicasenestascélulasquepuedanllevaraalteracionesenla
memoriaepigenética.
Frenteaestetipocelular,encontramosalasMSC,quehansidoestudiadasmásextensamente
e incluso probadas en diferentes ensayos clínicos, obteniéndose resultados contradictorios.
Sinembargo, lasprincipalesventajasde las iPSCfrentea lascélulasmadresmesenquimales
radican en su mayor capacidad para diferenciarse en diferentes linajes celulares y en su
utilidadcomomodeloparaelestudiodediferentesenfermedades(principalmentegenéticas)
yelpotencialtóxicodelosmedicamentos.Estosestudiosserealizansobrecultivoscelularesu
15
órganos in vitro cuyas características genéticas son idénticas a los del paciente y que son
obtenidosapartirdeiPSC.
La aplicación de células iPSC en el tratamiento de patologías hepáticas mediante
administración directa en el lugar de la lesión ha demostrado un mayor porcentaje de
implantaciónysupervivenciarespectoalaintroducciónporvíaintraesplénica,reduciendoel
número de células que proliferan en localizaciones extrahepáticas. Aún así, sigue siendo
necesarioeldesarrollodeunmétodoquepermitaquelascélulastrasplantadasseancapaces
de actuar en el foco de la lesión de manera específica, sobre todo cuando se trata de
localizacionesdedifícilaccesoquirúrgico,enlasquelaimplantaciónpuedenoserposible.En
elcampodelaregeneraciónsiguensiendonecesariolarealizacióndeestudiosalargoplazo,
quepermitandeterminardemanerafiablelaposibilidaddedesarrollodetumores,yaqueen
el proceso de reprogramación se emplean factores de transcripción relacionados con
mecanismosderegulacióntantodelcrecimientocomodelaproliferación.
UnodeloscamposdondemásestudiossehanrealizadoacercadelposiblepapeldelasiPSCes
en el de las enfermedadesmetabólicas de origen genético. En estas enfermedades, debidas
normalmentealaactividaddisminuidaoausenciadeunaenzima,lascélulasmadrespueden
jugar un importante papel, ya que no es necesaria la implantación de un gran número de
células. Esto se debe a que enmuchas de estas patologías una pequeña recuperación de la
actividad enzimática produce un cambio significativo en la sintomatología, como quedó
demostradoenunestudiollevadoacaboporlaUniversidaddeLovainaenelaño2014,enel
que se procedió al tratamiento con MSC de niños con la enfermedad de Crygler-Najjar,
caracterizada por un mal funcionamiento del ciclo de la urea, obteniéndose resultados
prometedores.
Enpacientesconundeterioroavanzadoenlafunciónhepáticayqueseencuentranenespera
para un trasplante se suelen utilizar los denominados BAL, o hígados bioartificiales. Estos
dispositivos compuestos de células hepáticas que suplen de manera parcial la actividad
metabólica del hígado dañado pueden ser de diferente naturaleza. Inicialmente los más
usados fueron los compuestosporhepatocitosporcinos,pero laposibilidaddel contagiode
zoonosisylasdiferenciasmetabólicasexistentesentreespecieshacequenoseanlasideales.
Actualmente se investigan dispositivos compuestos por células procedentes de líneas
tumorales o de células madre. El principal problema de las líneas celulares radica en su
incapacidadparaeldesarrollodetodaslasfuncionesmetabólicas,mientrasquelasderivadas
16
de célulasmadres tras su diferenciación alcanzanunmayor gradode funcionalidad, lo que
suponeunaventajaalahoradeserusadasenterapiasdesustituciónhepática.
Unavezllegadosaunestadioavanzadoenelquesóloesposibleeltrasplante,lageneración
de órganos invitro supone un campo prometedor. La obtención dematrices extracelulares
(ECM),yaseamediantetécnicasdedescelurizaciónobioprinting(procesodeimpresiónque
permitelacreacióndeestructurasbiológicasdesoporte,similaresalamatrizextracelular)y
la posterior implantación de tipos celulares en sus localizaciones permite la creación de
órganosartificiales.En lageneraciónde losdiferentes tiposcelulares jueganun importante
papel las iPSC, ya que al ser pluripotenciales permiten la obtención de la mayorías de los
linajes celulares implicados. En este caso, el principal inconveniente se encuentra en la
dificultadparasituar lascélulasenelmismo lugarqueenelórganooriginal,asícomopara
garantizarsucorrectodesarrolloyfuncionalidad.
7.-CONCLUSIÓN
Las enfermedades crónicas hepáticas suponen un problema sanitario global, causando una
elevadamorbilidadymortalidad.EnestecontextolasiPSCsemuestrancomounaalternativa
a las terapias tradicionales, con potencial para revolucionar el abordaje actual de estas
patologías.Sinembargo,debemosserprudentesconestasnuevasterapiasdebidoaqueaún
se encuentran en un estado de investigación inicial, presentando un amplio abanico de
inconvenientesqueaúnquedanporresolver.Endefinitiva, consideramosnecesarioapostar
de manera decidida por la investigación y el desarrollo de nuevas terapias celulares que
puedan reducir a la mínima expresión el importante impacto de las patologías crónicas
hepáticas.
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