POLIPEPTIDOS CON ACTIVIDAD NARCOTICA

MARGARITA M. PurG, PEDRO GAscóN, JosÉ M. MusACCHIO

INTRODUCCIÓN. - La morfina y los demás op1aceos «reaccionan» con lugares de acción específicos (receptores narcóticos) situados a ni­vel del sistema nervioso central en relación con las vías y centros nerviosos encargados de la percepción del dolor (SNYDER, 1975). Tam­bién se han descrito receptores narcóticos en algunos órganos perifé­ricos de determinados mamíferos, sin que se conozca hasta el presente el papel fisiológico que desempeñan; los receptores periféricos que tienen mayor interés en farmacología son los que se encuentran a nivel del ileon de cobaya y del conducto deferente de ratón, ya que ambos constituyen preparaciones biológicas excelentes para la determinación de la actividad narcótica «in vitro».

La existencia de un receptor narcótico específico en el organismo de los mamíferos, hace pensar en la existencia de un transmisor fisio­lógico capaoz de unirse a este receptor. HUGHES (1975) fue el primero que consiguió extraer y purificar a partir del cerebro de cerdo, una subs­tancia endógena que posee las mismas propiedades biológicas que la morfina, a la que denominó «ENKEPHALIN» o encefalina. Actualmente se conoce que la encefalina obtenida a partir del cerebro de cerdo está formada por una mezcla de dos pentapéptidos denominados Metionina­Encefalina (H-Tir-Gli-Gli-Fen-Met-OH) y Leucina-Encefalina (H-Tir-Gli­Gli-Fen-Leu-OH) que se distinguen entre sí únicamente por el aminoá­cido terminal. Ambos péptidos (Met-E y Leu-E) poseen actividad nar­cótica «in vitro», es decir, son capaces de inhibir las contracciones pro­ducidas por la estimulación eléctrica del íleon de cobaya y del con­ducto deferente de ratón, y también de despla~ar la unión estereospecí­fica de los opiáceos radioactivos a los receptores narcóticos localizados en las membranas cerebrales. Utilizando este último método de valo­ración de la actividad narcótica, TERENIUS y WAHLSTROM (1975) y PASTERNAK y cols. (1975) fueron capaces de demostrar la presencia de encefalina en extractos de cerebro de buey, rata y conejo. TERENIUS y

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W AHLSTROM (197 5, b) demostraron además en el líquido cefalorraquí­deo humano la presencia de una substancia que se comportaba de for­ma semejante a la encefalina obtenida de extractos de cerebro. Inde­pendientemente, Cox y cols. (1975) aislaron a partir de extractos de hipófisis de buey, otro pépticlo con activíclacl narcótica «in vitxo», pero cuya características químicas difieren notablemente de las de la ence­falina descubierta por RuCHES. Actualmente se conoce que la encefali­na no se encuentra homogéneamente distribuida en el cerebro de los mamíferos, sino que presenta al parecer una distribución regional se­mejante a la de los receptores narcóticos; estudios preliminares llevados a cabo en distintos laboratorios demuestran la existencia de concen­traciones elevadas de encefalina en el cuerpo estriado e hipotálamo de conejo (HUGHES, 1975) buey y ratón (PASTERNAK y cols., 1975 y 1976), con concentraciones mucho menores a nivel de la substancia blanca y cerebelo.

A partir del descubtimiento y caracterización de la encefalina se ha estudiado con especial interés el polipéptido hipofisario beta-lípotro­pina W-LPH), ya que la secuencia de aminoácidos de la Met-E coincide exactamente con los aminoácidos 61 al 65 de la misma. La función fisiológica de la ~-LPH se desconoce hasta el momento; la ~-LPH está constituida por 91 aminoácidos cuya secuencia completa está estable­cida para algunos mamíferos incluyendo al hombre (LI y CHUNG., 1976). Recientemente se ha demostrado que algunos péptidos derivados de la ~-LPH poseen actividad narcótica tanto «in vitro» como «in vivo»; tiene especial interés el denominado fragmento C de la ~-LPH (ami­noácidos 61 al 91) ya que se ha comprobado que presenta gran afini­dad por los receptores narcóticos «in vítro», a la vez que tma gran po­tencia analgésica «in vivo» (Cox y cols., 1976, BRADBURY y cols., 1976). Incubando ~-LPH con extractos acuosos de cerebro (GUILLEMIN y cols., 1976) o con tripsina (BRADBURY y cols., 1976), se ha logrado obtener fragmento C. Actualmente se especula sobre el papel fisiológico de la ~-LPH en el sentido de que quizá pueda comportarse como un precur­sor o «prehormona» para una serie de oligopéptidos con actividades neurotropas diversas (GurLLEMIN y cols., 1976).

El estudio cuantitativo de las propiedades analgésicas de las ence­falínas presenta grandes dificultades debido a su rápida inactivación en el organismo. Recientemente, algunos laboratorios han podido de­mostrar que la inyección intraventricular de Leu-E y Met-E produce analgesia de corta duración (BELLUZI y cols., 1976, BusCHER y cols., 1976, CHANG y cols., 1976), aunque las dosis necesarias para producir efectos apreciables son relativamente elevadas. La inversión del efecto analgésico por medio de la administración de naloxona, un antagonista narcótico específico, prueba que las encefalinas producen analgesia por interacción con el receptor narcótico a nivel central.

M. M. PUlG 1 COLS. POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD 1'\ARCÓTICA 1293

En el presente trabajo, hemos determinado la actividad narcótica de las encefalinas que se encuentran fisiológicamente en los mamíferos (Met-E y Leu-E), y de cuatro derivados sintéticos, la amida de la me­tionina encefalina (MetA-E), el derivado sulfonado de la misma (SMet-E) y los derivados 3-bencil-tirosina de la metionina encefalina (BTMet-E) y de la leucina encefalina (BTLeu-E). La actividad narcótica de los dis­tintos péutidos se estudió «in vitro» en el íleon de cobaya, preparación biológica que como dijimos anteriormente, se considera adecuada para la determinación de la actividad opiácea de este tipo de fármacos (Kos­TERLITZ y WATERFIELD, 1975). En el íleon de cobaya, la morfina y los demás narcóticos son capaces de inhibir las contracciones del músculo liso producidas por estimulación eléctrica; estos efectos inhibitorios son invertidos específicamente por pequeñas concentraciones de un antago­nista específico como la naloxona.

La destrucción enzimática de los distintos péptidos se determinó in­cubándolos con el intestino de cobaya o con membranas de cerebro de rata con el fin de estudiar su velocidad de inactivación en contacto con distintos tejidos.

MATERIAL Y MÉTODOS. - Iteon de cobaya: Se han utilizado coba­yas macho de la cepa «English Short Hain> blancos, de un peso apro­ximado de 400 gramos. Los animales fueron sacrificados por medio de un golpe en la cabeza y posteriormente desangrados cortando las arte­rias del cuello. Se abrió el abdomen con una incisión en la línea me­dia y el íleon fue separado del resto del intestino; sistemáticamente se descartaron los 20 cm. distales del íleon. En nuestros experimentos he­mos utilizado dos preparaciones biológicas de intestino de cobaya: a) la preparación de músculo longitudinal-plexo mientérico, que denominare­mos «tira» de íleon, y b) el segmento de íleon entero. La disección de la tira se llevó a cabo de acuerdo a la descripción de PATON y ZAR (1968) y KosTERLITZ y cols. (1970). En forma re­sumida, se colocó w1a porción de fleon de unos 8 ero. de longitud so­bre una varilla de vidrio de unos 7 mm. de diámetro, tratando de que la unión del mesenterio al intestino quedase en línea recta; con una torunda de algodón húmeda, se separó el músculo longitudinal del circular todo a lo largo de la unión mesentérica y una porción circu­lar en la parte superior del segmento de íleon. Cogiendo con unas pin­zas esta porción superior, se separó la tira suavemente; esta contiene la totalidad del músculo longitudinal y la mayor parte del plexo mienté­rico que está fuertemente adherido a las fibras longitudinales.

El segmento de íleon entero se colocó, después de lavado adecuada­mente, directamente en el baño de órgano aislado. Ambas preparaciones de fleon se colocaron en distintos baños de órgano aislado de 10 ml. de volumen que contenían solución bicarbo-

1294 ANNALS DE MEDICINA

natada de Krebs a 37° C. El líquido nutricio fue aireado de forma con­tinua con carbógeno (95 % Oz-5 % COz) con lo que se mantuvo el pH de la solución en 7,4 . La preparación se estimuló eléctricamente por medio de electrodos circulares de platino situados en la parte superior e inferior del baño; los estímulos eléctricos consistían en impulsos rectangulares de 1 mseg. de duración, aplicados a un voltaje suficiente para producir la máxima contracción del músculo. La frecuencia de estimulación se mantuvo constante en 0,1 Hz (un estímulo cada 10 se­gundos). Las contracciones del músculo liso se registraron por medio de un transructor de tensión (Grass modelo FT 03) acoplado a un po­lígrafo. La tensión inicial se estableció en 1 g. para el segmento de íleon y en 0,3 g. para la tira muscular.

Todas las substancias utilizadas fueron disueltas en agua bidesti­lada y añadidas al baño en un volumen constante de 0,1 rol. Los deri­vados SMet-E y BHMet-E, al ser insolubles en agua, fueron disueltos en etanol 95 % y añadidos en un volumen de 0,005 rol. La misma can­tidad de etanol añadida a la preparación no alteró en absoluto la con­tractibilidad de la preparación ni su respuesta a los opiáceos.

Las curvas dosis-efecto de las encefalinas y sus derivados fueron de­terminadas en la tira de íleon y comparadas simultáneamente a la curva de morfina. El valor de la concentración inhibitoria cincuenta (Ciso co­rresponde a la concentración de fármaco necesaria para inhibir en un 50 % las contracciones del músculo producidas por la estimulación eléctrica. Estos valores fueron obtenidos por interpolación en las cur­vas dosis-efecto (log. de la concentración-probit), y las potencias rela­tivas se calcularon como la relación entre la Ciso de la morfina y la Ciso de cada uno de los péptidos.

Los experimentos realizados para determinar la velocidad de inac­tivación de los distintos compuestos, se llevaron a cabo incubando los péptidos con el íleon de cobaya o con membranas de cerebro de rata. En un primer grupo de experiencias, los péptidos permanecieron en con­tacto con el segmento de íleon o con la tira muscular por distintos períodos de tiempo, con el fin de comprar su velocidad de inactivación en presencia de distintas cantidades de tejido; las contracciones produ­cidas por estimulación eléctrica del íleon se registraron antes, durante y después de la adición de los fármacos; el tiempo de recuperación de la inhibición producida por los distintos péptidos se comparó con un patrón de morfina, substancia que no es inactivada por las peptidasas del intestino.

En otro grupo de experiencias, los péptidos fueron incubados con membranas de cerebro de rata a 25° e por distintos períodos de tiem­po y su actividad narcótica se determinó posteriormente en la tira de íleon. De esta forma se obtuvo una curva que representa la desaparición de la actividad narcótica en el tiempo.

M. M. PUIG 1 COLS. POLlPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD NARCÓTICA 1295

La síntesis de las encefalinas naturales y sus derivados, fue llevada a cabo por el Prof. Dr. John M. Stewart, Dept. of Biochemistry, Univer­sity of Colorado School of Medicine, Denver, CO, U.S.A.

REsuLTADOS.- Acción de las encefalinas y de sus análogos sinté­ticos sobre el íleo11 de cobaya: La morfina y los demás opiáceos inhiben las contracciones producidas por la estimulación eléctrica del íleon de cobaya; este efecto inhibitorio sobre el intestino, es completamente antagonizado por medio de pequeñas concentraciones de naloxona, una substancia de origen semi-sintético que actúa como un antagonista puro a nivel de los receptores narcóticos. Nosotros hemos estudiado la ac­ción narcótica específica de las encefali nas naturales (Met-E y Leu-E) y de sus derivados sintéticos (MetA-E, SMet-E, BTMet-E y BTLeu-E) en la preparación de plexo mientérico-músculo longitudinal de íleon de cobaya. Como control, hemos utilizado curvas de morfina, substancia que en nuestra experiencia produce una respuesta inhibitoria constante y bien establecida. En la fig . 1 se muestra un experimento típico en el cual se puede observar la acción de la morfina seguida de la inversión del efecto inhibitorio producida por la naloxona. En la parte inferior

L1.J + Met.A.-E

(10-?M)

+ + u_j

M N (2·10 7M) (2·10-7 M)

+ + LU

MetA-E N (1CJ7M) (2·10-7 M)

Frc. l. - Acción de la morfina (M) y de la MetA-E sobre las contracciones producidas por estimulación eléctrica de la tira de lleon de cobaya. El efecto de ambas substancias se muestra además después de añadir naloxona (N) a la preparación. La concentración de naloxona utilizada se eligió con el fin de obtener una recuperación completa de la inhibición producida por los distintos fármacos utiüzados. Las cifras indican la concen-tración final de substancia en el baño.

1296 ANNA LS DE MEDICINA

de la figura se demuestra la acción inhibitoria de la MetA-E sobre la misma preparación, al igual que la inversión por la naloxona. Todos los péptidos utilizados en este trabajo presentaron actividad narcótica es­pecífica en el íleon de cobaya, demostrada por la inversión producida por la naloxona. En la fig . 2 se muestran las curvas dosis-efecto de la inhibición producida por las distintas substancias estudiadas en compa­ración con el patrón de morfina. Estas curvas muestran, que de las dos encefalinas que se encuentran fisiológicamente en el organismo de los mamíferos, la Met-E es más activa que la morfina, y en cambio la Leu-E presenta una menor actividad. De los análogos sintéticos, sólo la MetA-E es más potente que la morfina. A partir de las curvas descri­tas, hemos calculado las Clso de cada una de las substancias y su po­tencia relativa en comparación con el patrón de morfina. De los resul­tados obtenidos en la tabla 1 se puede deducir que la Met-E y la MetA-E son respectivamente, alrededor de dos y tres veces más poten­tes que la morfina, mientras que la Leu-E y la SMet-E son unas cuatro veces menos activas. El derivado BTMet-E resultó ser cuarenta veces menos potente que la morfina, y la actividad opiácea de la BTLeu-E resultó despreciable.

l-iD o 0: a..

1~ 1cr6 1cr5 CONCENTRACION , CMl

FlG. 2.- Curvas dosis·efecto obtenidas de cada uno de . los fármacos en la tira de íleon de cobaya estimulada eléctricamente. Los resultados se representan gráficamente por medio de la relación entre el lag. de la concentración y el probit de los porcentajes de inhibición producidos por los distintos fármacos. Cada punto representa el valor medio de al menos cuatro experiencias distintas (véase tabla 1); las líneas verticales indican los errores

estandard de las medias.

M. M. PU[G I COLS. POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD NARCÓTICA 1297

TABLA l. -Potencia relativa de las encefalinas y sus derivados en la tira de ileon.

Substancia

Morfina Met-E Leu-E MetA-E SMet-E BTMet-E

Ciso (10-7M)

1,22 + 0,11 (30) 0,67 ± 0,05 ( 5) 4,00 + 0·78 ( 5) 0,44 ± 0,07 ( 4) 6,35 + 1,50 ( 4)

49,0 ± 6,30 ( 4)

Potencia relativa ( Mol'/ina= 1)

1,00 1,80 0,31 2,80 0,19 0,025

TABLA l. - Las CI5o se obt1.1vieron de las medias ± eJ error cstandard de los valores ob­tenidos a partir de las curvas dosis-efecto de cada substancia (véase fig. 2). Enue paréntesis, el número de experiencias realizadas para cada fármaco. Las potencias relati vas se obtuvie­ron por división de la CI5o de la morfina por las Ciso de cada uno de los péptidos, es decir tomando la morfina como la unidad (M = 1).

Inactivación de las encefalinas: La inactivación de las encefalinas naturales y de sus derivados sintéticos se estudió en primer lugar en el íleon aislado de cobaya, preparación biológica que hemos podido de­mostrar que posee enzimas, peptidasas, capaces de degradar los poli­péptidos endógenos con acción narcótica. La figura 3 muestra la inacti­vación de los péptidos que presentaron una mayor actividad en el íleon de cobaya (Met-E, Leu-E y MetA-E). Esta figura indica que la MetA-E es relativamente más resistente a la inactivación que las encefalinas naturales Met-E y Leu-E, y que esta última es la que se inactiva con mayor rapidez. Como puede observarse, la recuperación de la prepara­ción se obtiene aproximadamente después de que los péptidos han es­tado en contacto con el íleon durante unos cincuenta minutos. Si duran­te este período de tiempo, en cualquier momento se lava la preparación o se le añade naloxona, se observa una recuperación completa e inme­diata de la misma. Por otra parte, si cuando la preparación está com­pletamente tecuperada después de una determinada dosis de encefalina, se añade de nuevo el péptido sin lavado previo, observamos de nuevo el efecto inhibitorio correspondiente, indicando que los receptores nat­córticos no se han desensibilizado. Hemos estudiado además la influencia de la cantidad de tejido so­bre la velocidad de inactivación de las encefalinas. En la fig. 4 se puede observar que la inactivaci6n es considerablemente más rápida en presencia de un segmento de íleon (peso del tejido húmedo 430 mg.) que en presencia de la tira (24 mg.), indicando que la desttucción está en relaci6JI directa con la cantidad de tejido. En la segunda gráfica de

1298 ANNALS DE MEDICINA

la misma figura se demuestra que cuando la MetA-E se mantiene en contacto con el íleon su capacidad de inhibir las contracciones produ­cidas por estímulo eléctrico disminuye progresivamente, mientras que el efecto de la morfina, un alcaloide, permanece inalterado.

Met.A.-E (5·10-7 M)

10

20 40 Tiempo en minutos

Frc. 3. - Tiempo de desaparición de la actividad inhibitoria de la Met-E, Leu-E y MetA-E sobre las contracciones inducidas eléctricamente en el segmento de íleon de cobaya. En abscisas se representa el tiempo que los diferentes péptidos permanecieron en contacto con la preparación. En ordenadas, el porcentaje de inhibición con respecto a la contracción

inicial¡ la acción de los péptidos se estudió en la misma experiencia.

Por úl timo hemos determinado la velocidad de degradación de los distintos péptidos con membranas de cerebro de rata. Las incubacio­nes se llevaron a cabo en un baño de agua a 25° e por distintos períodos de tiempo, y la determinación de la actividad narcótica se valoró en la tira de íleon estimulada eléctriczmente. Tal como se observa en la fig . 5, al 2.umentar el tiempo de incubación del péptido con las mem­branas de cerebro, disminuye su capacidad de inhibir las contracciones

:.L M. PUIG I COLS. POLIPÉPTIOOS CON ACTIVIIJAO NARCÓTICA 1299

e :a B ~20

Met.A.-Encefalina (5.10"7M)

X

10 10

o 10 20 30 60 o 10 20 30 Tiempo en minutos Tiempo en minutos

Frc. 4.- Comparación del tiempo de desaparición de la acción inhibitoria de la Met-E en la preparación del segmento de íleon de cobaya y en la tira de músculo longitu­dinal plexo mientérico. En abcisas, el tiempo que el pépt ido se mantuvo en contacto con cada una de las preparaciones. La segunda gráfica de esta figura presenta el mismo tipo de experiencia, en la cual se compara la acción de la morfina con la del péptido en el segmento de ileon de cobaya estimulado eléctricamente.

producidas por estimulación eléctrica de la tira. Los péptidos .conser­varon su actividad narcótica cuando la incubación se llevó a c::~bo a 0° e, o cuando los oéptidos se incubaron a 25° e pero sin membranas. Pa­rece pues evidente que la oresencia de membranas y una temperatura adecuada son requisitos indispensables para la ínactivación de los pép-tidos estudiados. ·

DrscusiÓN.- El estudio de la acción de las encefalinas «Ín vitro» de­muestra que la actividad de la Met-E y Leu-E ob tenidas por síntesis es idéntica, en el lleon de cobaya, a la actividad de las encefalinas obte­nidas a partir de extractos de cerebro de distintos manúferos. Nuestros resul tados confirman por tanto, los resultados obten idos por HUGHES y cols. (1975) en el conducto deferente de ratón y en el íleon de cobaya con encefalinas naturales y sintéticas. En nuestra preparación , la Met-E resultó ser dos veces más activa que la morfina, mientras que la Leu-E presentó aproximadamente una tercera parte de su actividad.

Nuestro propósito al sintetizar nuevos derivados de las encefalinas, fue el estudio de su potencia en el íleon de cobaya v a la vez de deter­minación de su resistencia a las peptidasas de los distintos tejidos. Los resultados obtenidos muestran que, de los derivados sintéticos, sólo la MetA-E presenta una actividad narcótica ligeramente mayor que la de la Met-E. La oxidación del átomo de azufre de la metionina (SMet-E)

1300 ANNALS DE lliEDICINA

disminuyó considerablemente la actividad del péptido natural Met-E. Las sustituciones de distintos radicales a nivel del hidroxilo de la tirosina (análogo al OH en posición 3 de la morfina) o a nivel del grupo runino libre de la misma, análogo al nitrógeno en el anillo piperidinico de la morfina) disminuyen considerablemente la actividad opiácea de las encefalinas (CHANG y cols., 1976). Nosotros hemos podido comprobar que la adición de un anillo bencénico en posición 3 de la tiro­sina, disminuye unas cuarenta veces la actividad narcótica de la Met-E (BTMet-E).

Met.A.- Encefalina (2 ·10-'l M)

8 16 32 Tiempo en minutos

FIG. 5.- Inhibición de las contracciones producidas por estimulación eléctrica de la tira de lleon de cobaya por la MetA-E. En abcisas, el período de tiempo que el péptido per· maneció en contacto con membranas de cerebro de rata a 25• C, antes de ser añadido a

la preparación de intestino.

La presencia de enzimas que destmyen las encefalli1as en el íleon de cobaya ha sido descrita por distintos autores (HUGHES, 1975, TERE­NIUS y W AHLSTROM, 1975). Se conoce que, entre otros enzimas, las carboxipeptidasas son capaces de inactivar rápidamente las encefalinas naturales; en nuestras experiencias, hemos estudiado con especial in­terés la acción y degradación de la carboxamida de la Met-E (MetA-E)

M. M. PUIG I COI-S. POI. JPÉPTIDOS CON ACT IVIDAD NARCÓTICA l301

con la esperanza de obtener un péptido resistente a las carboxipeptida­sas. Nuestros resultados muesttan que la MetA-E es algo más resistente a la destrucción (proteolisis) en el íleon de cobaya que las encefali­nas naturales; esta diferencia no pudo ser observada cuando los pépti­dos se incubaron con membranas de cerebro de rata, lo que probable­mente indicaría que las carboxipeptidasas, desempeñan un papel más importante en la inactivación de las encefalinas a nivel del íleon, que a nivel del sistema nervioso central.

La disminución progresiva de la actividad inhibitoria que presentan los péptidos cuando se dejan en contacto con el íleon, no se debe a la aparición de taquifilaxia o habituación de la preparación, sino que es debida a la inactivación enzimática de los mismos. Este hecho queda demostrado si tenemos en cuenta que la acción inhibitoria de la mor­fina, estudiada en las mismas condiciones experimentales, permanece constante todo a lo largo de la experiencia; además, la velocidad de desaparación de la actividad inhibitoria de los péptidos es proporcinal a la cantidad total de tejido, lo que indicaría una destrucción más rá­pida debida a una mayor concen tración de enzimas .

La existencia de peptidasas en las membranas de cerebro de rata que­da demostrada por los siguientes hechos : 1) Los péptidos incubados con membranas a 0° e no pierden actividad en el íleon de cobaya; 2) las encefalinas incubadas a 25° e pero sin membranas de cerebro, permanecen activas y 3) la inactivación de las encefalinas es proporcio­nal al tiempo de incubación. Estos hechos indican claramente que la inactivación de los péptidos depende de la presencia de membranas en el medio de incubación y de una temperatura adecuada.

Hasta el momento no se ha descrito ningún enzima específico para la inactivación de las cncefalinas fisiológicas. Nuestras experiencias indi­can que probablemente existen muchos tipos diferentes de enzimas en­dógenos capaces de ioactivar los péptidos opiáceos.

En la actualidad estamos llevando a cabo experiencias adicionales con el fin de estudiar la actividad narcótica de las encefalinas y sus deri­vados sintéticos a nivel de los receptores de las membranas de cere­bro de rata, así como la posibilidad de impedir su destrucción por medio de inhibidores de las peptidasas.

New York University Medical Center Department of Pharmacology

550 First Ave., New York, N. Y. 10016, U.S.A.

1302 ANNALS DE MEDlCIN.~

BIBLIOGRAFIA

BELLUZI, J . D., GRANT, N., GARSKY, V., SARANTAKTS, D., WrsE, C. D., STEIN, L.: Nature, 260, 624-626, 1976.

BRATJDURY, A. F., SM YTH, D. G., SNELL, C. R., BIRDSALL, N. J. M., HuLME, E. C.: Natu­re, 260, 793-795, 1976.

BüsCHER, H. H ., HrLL, R. C., RoMER, D., CARDINAUX, F., CLOSSE, A., liAUSER, D., Pless, J.: Nature, 261, 423-425, 1976.

CnANG, J. K., FONG, B. T. W., PER"l_i A., PERT, C. B.: Life Sci., 1.473-1.482, 1976. Cox, B. M., GoLDSTEIN, A, LI, C. h.: Pro. Natl . Acad. Sci. U.S.A., 73, 1.821-1.823, 1976. Cox, B. M., ÜPHEIM, K. E., TESCIIEMACIIER, H., GoLDSTEIN, A.: Life Sci., 16, 1.777-1.782,

1975. GurLLEMIN, R., LING, N., BuRGUS, R.: C. R. Acad. Se. París, 282, 783-785, 1976. HuGES, J.: Brain Res., 88, 1-14, 1975. HuGES, J., s~uTTH, T. \VI., KosTERllTZ, H. w., FOTHERGILL, L. A., MORCAN, R. A., Mo-

RRIS, H. R.: Narure, 258. 577-579, 1975. RuCHES, J., s~uru, T., MORCAN, B .. FOTHERG!ll, L.: Life Sci., 16, 1.753-1.758, 1975. KosTERLITZ, H. W., LYDON, R. J., WATT, A. J.: Br. Jour. Pharmac., 29, 398-413, 1970. KosTERLITZ, H . W., WATERFtELD, A. A.: Ann. Rev. Pharmacol., 15, 29-47, 1974. Lr, C. H., CuuNG, D.: Nature, 260, 622-624, 1976. PASTERNAK, G. W., GooDMAN, R., SNVDER, S. H.: Life Sci., 16, 1.765-1.769, 1975. PAS'l'Jl.RNAK, G. W., SIMANTOV, R., SNVDER, S. H .: Molec. Phurmnc., 12, 504-513, 1976. PATON, W. D. M., ZAR, M. A.,: J. PhysioJ. , 194, 13-33, 1968. SNYDER, S. H.: Nacure, 257, 185-189, 1975. TERENIUS, L .. WAHLSTROM: Acta Physiol. Scand., 94, 74-81, 1975. b) Life Sic., 16, 1.759-

1.764, 1975.