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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología
Biotecnología de enzimas: Inmovilización
Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa
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Catálisis enzimática heterogénea
Para combinar las ventajas de la catálisis homogénea y heterogénea, se desarrolló la heterogenización de la catálisis homogénea
Las enzimas inmovilizadas son enzimas físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida de espacio con la localizadas en una cierta región definida de espacio con la retención de sus actividades catalíticas, que pueden ser usadas repetidamente y continuamente
Los métodos más comunes de inmovilización de enzimasHeterogenización de enzimas solubles a través del acoplamiento de un soporte insoluble mediante: adsorción o enlace covalente, por entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o en microcápsulas
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Enzima Soporte
Propiedades bioquímicas Características químicas
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas están gobernadas
por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material
del soporte
Método de inmovilizaciónRendimiento (%)
Propiedades bioquímicas Características químicas
Tipo de reacción y cinética Propiedades mecánicas
Efectos de transferencia de masaEficiencia (η)
ComportamientoConsumo de enzima (U/kg producto)
Productividad (kg producto/U)
Estabilidad operacional# de ciclos
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Inmovilización de enzimas
• Costo de la enzima
• Grado de purificación requerido de la enzima
• Costo del proceso de inmovilización
• Estabilidad de la enzima
• Efectos de inhibición y envenenamiento
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Pros y contras de la Inmovilización
PROS
Alta estabilidad y resistencia al esfuerzo cortante y a la contaminación
CO(TRAS
Existencia de la resistencia a la transferencia de masa
contaminación
Fácil de desarrollar procesos continuos
Rápidas tasas de reacción
Fácil separación de los productos
Uso repetitivo del catalizador
Necesidad del proceso de inmovilización
Costos adicionales de reactivos para la inmovilización
Pérdida de actividad durante la etapa de inmovilización
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Inmovilización de enzimas
La inmovilización es la restricción espacial de la movilidad de la enzima
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Métodos de inmovilización
A: Métodos de enlace a soportes
a) Enlace covalente; b) Adsorpción física;
A
b) Adsorpción física; c) Fuerzas electrostáticas
B: Entrecruzamiento
C: Atrapamiento
Enzyme in Industry: Production and Applications, pg 66.
B C
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Atributos ideales de un soporte
• Alta área superficial
• Permeable
• Insoluble• Insoluble
• Alta rigidez
• Regenerable
• Resistente a ataque microbiano y químico
• Estable mecánicamente y térmicamente
• Hidrofobicidad controlada
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Métodos de inmovilización claves
• Unión Covalente
– Glutaraldehido– CNBr-activación– Ácidos cíclicos (glicoproteinas)– Carbodimidas
• Adsorción
Más común para enzimas
– Intercambio iónico– Hidrofobicidad
• Entrecruzamiento
• Encapsulación
– Geles poliméricos– Liposomas y otras bicapas
• Métodos emergentes
– Avidin/streptavidin y biotin– Oligonucleótidos-protein fusions– Materiales biocatalíticos– Silicones/silicatos/sol-geles
Más común para células
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Métodos de inmovilización: Soportes
Tipos de Soporte
• Inorgánicos: p.ej.
Tipos de enlace
• Enlace covalente • Inorgánicos: p.ej. Sílica, Vidrio poroso
• Orgánicos: p.ej. Poliamida, Poliacrilamida
• Biológicos: p.ej. Celulosa, Quitosano
• Enlace covalente
• Adsorción física
• Enlace iónico
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Enlace Covalente
Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
El soporte en este caso es amino alkoxy silano
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Enlace Covalente
Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237
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Adsorción Física
• Los biocatalizadores enlazan a los soportes por interacciones físicas tales como interacciones hidrofóbicas, fuerzas de van der Waal’s, etc. hidrofóbicas, fuerzas de van der Waal’s, etc.
• Frecuentemente se usan soportes inorgánicos. Actualmente, están disponibles varios materiales naturales que tienen fuertes capacidades de adsorción.
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Unión a un soporte por adsorción física
El método se basa en la adorción física de las moléculas de
enzima en la superficie de una matriz sólida, poniendo en enzima en la superficie de una matriz sólida, poniendo en
contacto una solución acuosa de enzima con el soporte.
Procedimiento estáticoElectrodeposiciónProceso de reactorBaño con agitación
Métodos deadsorción física
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Métodos de inmovilización : Atrapamiento
El método de atrapamiento de inmovilización está basado en la localización de una enzima dentro de un enrejado de una matriz polimérica o membrana de tal enrejado de una matriz polimérica o membrana de tal forma que previene la liberación de proteina mientras permite la penetración de substrato.
- La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz
del gel o a la membrana.
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Métodos de inmovilización : Entrecruzamiento
Definición: Formación de enlaces covalentes entre las moléculas de enzima, por medio de reactivos bi- o multifuncionales, formando agregados entrecruzados multifuncionales, formando agregados entrecruzados tridimensionales.
Métodos: Adición de una cantidad apropiada de agente entrecruzante a una solución de enzima bajo condiciones que den un aumento en la formación de enlaces covalentes múltiples.
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Métodos de inmovilización: Entrecruzamiento (cont…)
Handbook of Enzyme Biotechnology, pg. 585
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Limitaciones difusionales en sistemas de enzimas
inmovilizadas
( )
maximum rate of reaction
maximum rate of diffusion
m ss L b s
m s
mDa
V SJ k S S
K S
V�
k S
= − =+
= =maximum rate of diffusionDa
L bk S
�Da<<1 Limitado por reacción
�Da≈1 Reacción y difusión -resistencias comparables
�Da>>1 Limitado por difusión
�Da = �úmero de Damhköler
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Factor de efectividad
Para reacciones donde las limitaciones pueden ser importantes, la tasa de reacción aparente es frecuentemente expresada en términos de un factor de efectividad, η
reaction with diffusional limitationsreaction with diffusional limitations
intrinsic reaction rateη =
Para una reacción enzimática que sigue la cinética de Michaelis-Menten
m ssurface
m s
V Sr
K Sη=
+
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Limitaciones difusionales para enzimas inmovilizadas
en pellets porosos
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Perfil de concentración en estado estacionario en pellets
porososConsideraciones:
Cinética de Michaelis-Menten
Enzima uniformemente distribuida a través del pellet
No hay partición de substrato entre el interior y el exterior del pellet
Ecuaciones gobernantes:
2
2
0
2
( )
0
me
m
s
r
V Sd S dSD
dr r dr K S
S R S
dS
dr =
+ = +
=
=
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Adimensionalización
, , m
s s
KS rS r
S R Sβ= = =Definir variables adimensionales:
Introducir en los balances de masa y las condiciones frontera
22
2
0
2
1
(1) 1, 0, m m
er
d S d S S
r d r Sd r
V Kd SS R
Ddr
φ
β
φ=
+ =
+
= = =
A menos que la reacción sea de 1er orden, el sistema no tiene solución analítica con la cinética de Michaelis-Menten
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Gráfica η η η η versus φφφφ en el sistema Michaelis-Menten
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• Minimizar el radio de partícula dentro las limitaciones mecánicas
Diseño de pellets inmovilizados
• Optimizar la carga de la enzima– Alto contenido de enzima
incrementa la tasa intrínseca de la reacción pero disminuye el factor de efectividad
– Bajo contenido de enzima incrementa el factor de efectividad pero disminuye la tasa intrínseca de la reacción
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Reactores enzimáticos
Discontínuos (Enzimas libres einmovilizadas)
Tipos de
reactores
Contínuos (Enzimas inmovilizadas)
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Reactores discontínuos
Tipo tanque agitado con paletas Tipo tanque agitado con mamparas
que incluyen enzimas inmobilizadasTipo tanque agitado con paletas
que incluyen enzimas inmobilizadas que incluyen enzimas inmobilizadas
Reactor de lecho empacado
con reciclado total
Reactor de lecho fluidizado
con reciclado total
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Reactores contínuos
Tipo tanque agitado con recuperación por ultrafiltración
Reactor de lecho
empacado
Reactor de lecho
fluidizado
Reactor de fibra
hueca
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Reactor de tanque agitado contínuo
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Reactor de lecho empacado
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Reactor de lecho fluidizado
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Reactor de membrana
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Tecnología de enzimas comerciales
• High fructose corn syrup (xylose isomerase)
• L-Amino acids (amino acylase, amino acid dehydrogenases, lyases)
• D-Amino acids (hydantoinase)
• L-Aspartic acid (aspartase)
• L-Malic acid (fumarase)
• Glycidyl butyrate (lipase)
• Cis-dihydrodiols (dioxygenase)
• Muconic acid, chiral amines (aminotransferase)
• Semisynthetic penicillins and cephalosporins (penicillin amidase)
• Acrylamide (nitrile hydratase)
• Phenolic resins (peroxidase)
• Food applications (many)Industrial enzyme market ca. $1.5 billionChiral market estimated at $5-10 billionDiscovery markets - ??? (pharma spends ca. $15B/yr)
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• GI es un tetrámero de 4 unidades idénticas de cerca de 45,000 kDa
Información estructural
Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
• Compuesto como un dímero de dímeros
• Cada monómero está compuesto de aproximadamente 16 hélices alfa y 15 láminas beta
• La interface monómero-monómero es 3 veces más grande y fuerte que la interface dímero-dímero
• 2 Mn2+ son necesarios para la actividad xilosa y 2 Co2+ para la actividad glucosa isomerasa
From Bacillus Coagulans, Isolated by Novozyme, Inc.
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
La isomerización de glucosa a jarabes de maíz de alta fructosa (HFCS), exclusivamente como un reemplazo de costo reducido para soluciones de sacarosa y azúcar invertidasoluciones de sacarosa y azúcar invertida
•Background:Altas temperaturas de reacción para altos rendimientos de fructosapH ≥ 7 para la actividad y estabilidad de la enzimaPERO, la glucosa y la fructosa son inestables, fácilmente se descomponen a ácidos orgánicos y subproductos coloreadosEl tiempo de reacción debe ser minimizado
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
• Condiciones del proceso:
En reactores de lecho fijo contínuosEn reactores de lecho fijo contínuos
Temperatura: 55-60 oC
pH: óptimo pH de la enzima
Los gránulos de la enzima deben ser suficientemente rígidos para prevenir la compactación durante la operación
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Aplicaciones industriales
Glucosa isomerasa inmovilizada
Método de Inmovilización
Rendimiento
(kg productoseco/ kg enzima)
1. La enzima, después del aislamiento y purificación, es covalentemente inmovilizada sobre un soporte inerte
20,000
2. Entrecruzamiento de células que contienen las enzimas deseadas
2,000-4,000
3. La enzima parcialmente purificada es inmovilizada sobre resinas de intercambio iónico
7,000- 10,000
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Conclusiones
• La inmovilización permite el uso repetitivo de la enzima lo que significa un ahorro significativo en los costoslo que significa un ahorro significativo en los costos
• La selección de los métodos de inmovilización deberán estar basados en los requerimientos técnicos específicos y en el marco global de su aplicación comercial