PCR Y SECUENCIACIÓN DE ADN
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BIOTECNOLOGÍA © Prof. Víctor M. Vitoria (Profesor JANO) – Biología 2º bachillerato PCR Y SECUENCIACIÓN DE ADN BIOTECNOLOGÍA 2º bachillerato
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PCR Y SECUENCIACIÓN DE ADN. BIOTECNOLOGÍA 2º bachillerato. SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN. ADNs antiguos (Mamut) ADNs escena crimen ADNs embrionarias ADN genes virales. Generalmente las muestras suelen ser pequeñas. se necesita. AMPLIFICACIÓN. mediante. - PowerPoint PPT Presentation
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PCR Y SECUENCIACIÓN DE ADN
BIOTECNOLOGÍA 2º bachillerato
BIOTECNOLOGÍA
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SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN
Generalmente las muestras suelen ser pequeñas
ADNs antiguos (Mamut)
ADNs escena crimen
ADNs embrionarias
ADN genes virales
se n
ece
sita
AMPLIFICACIÓN
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dia
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TÉCNICA DE LA PCR es
Es un proceso repetitivo (desnaturalización, hibridación, extensión) del que se obtienen muchas copias de un mismo fragmento de ADN
(polymerase chain reaction)
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TÉCNICA DE LA PCRMateriales
• Muestra de ADN
• Cebador (P1 y P2)
• Fuente de calor
• Taq polimerasa (resistencia al calor)
1. Desnaturalización por calor.
2. Hibridación con el cebador.
3. Extensión de la cadena complementaria por Taq polimerasa.
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Una vez que se tiene cantidad suficiente de ADN…
SECUENCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DE ADN
Método del didesoxipara fragmentos
no muy grandes(fragmentos de unos 800 pb)
MATERIALES
Una opción es que cada didesoxinucleótido tenga una marca fluorescencia de color diferente. (otra posibilidad es hacer electroforesis en pozos separados)
Cuando un didesoxinucleótido se une a la cadena en extensión se detiene la síntesis ya que no se puede unir el siguiente nucleótido al C3 sin OH
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MÉTODO DEL DIDESOXI
Una vez que se tienen todos los materiales y el ADN desnaturalizado, se inicia la síntesis de la hebra complementaria. Una vez terminada se vuelve a desnaturalizar.
Se presenta lo que sucede a los fragmentos que terminan, por ejemplo, en ddA, es decir, localizan la posición de una T en el ADN a secuenciar.
En algunos ADNs, la ddA se unirá a la primera T que aparece, deteniéndose ahí la síntesis. Será un fragmento pequeño.L
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Se obtienen hebras de ADN de diferente longitud, todas ellas terminadas en A. Eso indica que en esa posición había una T en el ADN a secuenciar.
(lo mismo con ddT, ddA, ddC y ddG)
(en ese tubo de ensayo sólo habría ddA)
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MÉTODO DEL DIDESOXI
Fragmentos obtenidos según ADN a secuenciar
¿Cómo se separan los diferentes fragmentos queEstán en el tubo de ensayo?
Por ELECTROFORESIS en GEL de acrilamida
Cuatro pozillos diferentes en la electroforesisUn solo pozillo
(Los fragmentos más pequeños se desplazan más)
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MÉTODO DEL DIDESOXI
En el Proyecto Genoma se utilizaron métodos basados en este sistema pero con algunas diferencias y, sobre todo, ordenadores muy potentes.
