Papel de Dreissena polymorpha (mejillón cebra ) como ... · como reservorio de microorganismos...
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Papel de Dreissena polymorpha Papel de Dreissena polymorpha
como reservorio de microorganismos potencialmente patógenos y metales en el
ecosistema de la cuenca del Ebro y su riesgo para la salud y el medio ambiente
Benito M., Goñi P., Ormad M.P., Mosteo R., Valero P., Fernández M.T.,
polymorpha (mejillón cebra) polymorpha (mejillón cebra) reservorio de microorganismos
potencialmente patógenos y metales en el ecosistema de la cuenca del Ebro y su riesgo para la
salud y el medio ambiente
M.P., Mosteo R., Valero P., Fernández M.T., Cieloszyk J.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Ciclo reproductivo Dreissena polymorpha (Palau et al., 2004)
o Gran capacidad reproductora y
colonizadora.
o Primera detección España en 2001.
Archivo fotográfico www.chebro.es
o Primera detección España en 2001.
GRAVES PROBLEMAS MEDIOAMBIENTALES Y
ECONÓMICOSMapa de aguas afectadas por la presencia de
Mayo 2014 (Fuente: CHE)
o Morfología característica.
o Capacidad filtradora 1-2,5 l/día (15 a 40 µm).
GRAN CAPACIDAD GRAN CAPACIDAD BIOACUMULADORA
Mapa de aguas afectadas por la presencia de Dreissena polymorpha en la cuenca del Ebro.
Mayo 2014 (Fuente: CHE)
Investigar la posible acumulación de
fecal en mejillones cebra.
OBJETIVOSOBJETIVOS
OBJETIVO PRINCIPALfecal en mejillones cebra.
Identificar las Amebas de Vida Libre (AVL)
aguas superficiales y acumuladas en
Bacterias resistentes a la depredación
OBJETIVO PRINCIPAL
Estudiar el posible papel de Dreissena polymorpha como
Analizar la posible acumulación de metales
Dreissena polymorpha como bioindicador
bacterias indicadoras de contaminación
OBJETIVO PRINCIPAL
(AVL) y otros protozoos presentes en las
Dreissena polymorpha, así como de las
de las AVL (ARB).
OBJETIVO PRINCIPAL
Avanzar en el estudio sobre la integración del mejillón cebra en los
metales en D. polymorpha.
integración del mejillón cebra en los ecosistemas
METODOLOGÍA EXPERIMENTALMETODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Puntos de muestreo:
o Embalse Flix: 20 de marzo de 2014
o Embalse de La Sotonera: 22 de marzo de 2014
o Embalse de Sobrón(*): 5 de mayo de o Embalse de Sobrón : 5 de mayo de
o Acequia de Rimer: 6 de junio de 2014
Análisis de metales:
• Condiciones:
• Tª= -40ºC
• P= 10-1 bar
• 24 horas
• Condiciones:
• Tª= -40ºC
• P= 10-1 bar
• 24 horas
Liofilización
(*)Muerte ejemplares
Mapa de aguas afectadas por la presencia de Dreissena polymorpha
• 24 horas• 24 horas
Ionización en Plasma de Acoplamiento Inductivo- Espectrometría de Masas
22 de marzo de 2014
5 de mayo de 20145 de mayo de 2014
6 de junio de 2014
Dreissena polymorpha en la cuenca del Ebro. Mayo 2014 (Fuente: CHE)
Ionización en Plasma de Acoplamiento Espectrometría de Masas
METODOLOGÍA EXPERIMENTALMETODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Tratamiento previo
Preparación del extracto
Análisis bacteriológico (metodología bacteriana en aguas):
- E. Coli
- Salmonella spp.
Análisis secuencias: Blast/ BioEdit
- Salmonella spp.
- Enterococcus spp.
- Clostridium perfringens
Análisis de protozoos (microscopía y técnicas de Biología Molecular):- AVL y ARB
- Giardia duodenalis
- Cryptosporidium spp. (Tinción de
Aislamiento y cultivo de AVL
Preparación del extracto
Análisis bacteriológico (metodología bacteriana en aguas):
Electroforesis: Gel agarosa al 1,5%
Clostridium perfringens.
Análisis de protozoos (microscopía y técnicas de Biología Molecular):
spp. (Tinción de Ziehl-Neelsen modificada)
PCR
METODOLOGÍA EXPERIMENTALMETODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Protozoo Región diana Cebadores
Amebas de Vida Libre
ASA.S1 JDP1/ JDP2
18S rADN región conservada FLA F/ FLA R
ITS/5.8S gen ribosomalITS 1/ ITS
Fw1
18S rADN región conservada EUK F/ EUK R
Cryptosporidium spp. (*) SSU rARN
SSU 1/ SSU 2
SSU 3/ SSU4
Giardia duodenalis(*) tpi
AL3543/ AL3546
AL3544/ AL3545
ARB(**) CebadoresLegionella
pneumophila
Mip-Leg-F 186/ Mip-Leg-R 186
N-Mip-Leg-F 186/ SN-Mip-Leg-R 186
Cianobacterias McyD-dir/ McyD-revCianobacterias tóxicas
McyD-dir/ McyD-rev
N-McyD-dir/ N-McyD-rev
Mycobacterium spp.Hsp65-dir/ Hsp65-rev
N-Hsp65-dir/ N-Hsp65-rev
Pseudomonas spp.R16S-dir/ R16S-rev
N-R16S-dir/ N-R16S-rev
(*) Nested PCR
(**) Pentaplex nested PCR
Cebadores Tamaño (pb) ReferenciaJDP1/ JDP2 500 Schroeder et al., 2001
FLA F/ FLA R 800-150 Tsvekova et al. 2004
ITS 1/ ITS 2
Fw1/ Fw2(*) 400-453 Pelandakis et al. 2002
EUK F/ EUK R Variable Robert P. Hirt et al., 1997
SSU 1/ SSU 2 1325Xiao et al., 1999
SSU 3/ SSU4 826-864
AL3543/ AL3546 605Sulaiman et al., 2003
AL3544/ AL3545 530
Tamaño (pb) ReferenciaR 186 186 (Roch and Maurin, 2005)
R 186 112 (Calvo L. et al., 2013)
282(Calvo L. et al., 2013)
282(Calvo L. et al., 2013)
194
354(Calvo L. et al., 2013)
300
962(Calvo L. et al., 2013)
476
RESULTADOS (Bacterias)RESULTADOS (Bacterias)EMBALSE DE SOBRÓN
Clostridium
perfringens
Escherichia
coli
Agua natural (UFC/100mL) 1,96E+04 2,31E+04
D. polymorpha (UFC/g mejillón) 2,58E+04 8,36E+02
UFC/g. mejillón/ UFC/g agua 131,6 3,6
ACEQUIA DE RIMERACEQUIA DE RIMERClostridium
perfringens
Escherichia
coli
Agua natural (UFC/100mL) 4,72E+02 5,90E+03
D. polymorpha (UFC/g mejillón) 5,73E+02 2,34E+02
UFC/g. mejillón/ UFC/g agua 121,4 4,0
EMBALSE DE FLIX
Clostridium
perfringens
Escherichia
coli
Agua natural (UFC/100mL) - -
Silverman et al., 1995; Vathanodorn et al., 1997; Abadías et al., 2013.
Agua natural (UFC/100mL) - -
D. polymorpha (UFC/g mejillón) 1,45E+02 5,22E+03
Relación concentración bacteriana agua/mejillón marcada por:
tamaño y metabolización de bacterias
Todas las bacteriaso R= 0,5509
Sin E. coli
o R= 0,9999
EMBALSE DE SOBRÓNEscherichia Enterococcus
spp.Salmonella
spp.
9,00E+02 2,98E+04
2,27E+02 5,11E+04
25,2 171,5
ACEQUIA DE RIMERTodas las bacteriaso R= 0,1441
Sin E. coli
o R= 0,7541
ACEQUIA DE RIMEREscherichia Enterococcus
spp.Salmonella
spp.
3,40E+01 8,85E+01
7,02E+01 4,01E+02
206,5 453,1
EMBALSE DE FLIX
Escherichia Enterococcus
spp.
Salmonella
spp.
- -
et al., 1997; Abadías et al., 2013.
- -
2,23E+01 4,47E+02
INDICADOR SEMI-CUANTITATIVO
Relación concentración bacteriana agua/mejillón marcada por:
tamaño y metabolización de bacterias
RESULTADOS (Bacterias)RESULTADOS (Bacterias)EMBALSE DE SOBRÓN
Clostridium
perfringens
Escherichia
coli
Agua natural (UFC/100mL) 1,96E+04 2,31E+04
D. polymorpha (UFC/g mejillón) 2,58E+04 8,36E+02
UFC/g. mejillón/ UFC/g agua 131,6 3,6
ACEQUIA DE RIMERACEQUIA DE RIMERClostridium
perfringens
Escherichia
coli
Agua natural (UFC/100mL) 4,72E+02 5,90E+03
D. polymorpha (UFC/g mejillón) 5,73E+02 2,34E+02
UFC/g. mejillón/ UFC/g agua 121,4 4,0
EMBALSE DE FLIX
Clostridium
perfringens
Escherichia
coli
Agua natural (UFC/100mL) - -
Bacterias Sobrón (Laboratorio de Microbiología del H.C.U. Lozano
o Citrobacter braakii.
o Stenotrophomonas maltophilia. (Corsaro et al., 2013)
o Pseudomonas spp.
Agua natural (UFC/100mL) - -
D. polymorpha (UFC/g mejillón) 1,45E+02 5,22E+03
Todas las bacteriaso R= 0,5509
Sin E. coli
o R= 0,9999
EMBALSE DE SOBRÓNEscherichia Enterococcus
spp.Salmonella
spp.
9,00E+02 2,98E+04
2,27E+02 5,11E+04
25,2 171,5
ACEQUIA DE RIMERTodas las bacteriaso R= 0,1441
Sin E. coli
o R= 0,7541
ACEQUIA DE RIMEREscherichia Enterococcus
spp.Salmonella
spp.
3,40E+01 8,85E+01
7,02E+01 4,01E+02
206,5 453,1
EMBALSE DE FLIX
Escherichia Enterococcus
spp.
Salmonella
spp.
- -
Bacterias Sobrón (Laboratorio de Microbiología del H.C.U. Lozano Blesa de Zaragoza, sistema API)
et al., 2013)
- -
2,23E+01 4,47E+02
RESULTADOS (Protozoos y ARB)RESULTADOS (Protozoos y ARB)
Análisis por PCR: 20 MUESTRAS
(AVL aisladas y directos)
� Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.
Trofozoíto Cercomonadida y forma flagelar de
Naegleria spp.
Trofozoíto de Cercomonadida
Trofozoíto de Naegleria spp. 100X
o 12 positivas (65%)o 10 identificadas (55%)
Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.
10%10%
40%
40%
AVL identificadas
Acanthamoeba spp.
Hartmannella spp.
Naegleria spp.
Huang et al., 2010; Kao et al., 2014; García et al., 2013
•33,33% Agua
•42,85% D. polymorpha
40%Naegleria spp.
Otras amebas
RESULTADOS (Protozoos y ARB)RESULTADOS (Protozoos y ARB)
Análisis por PCR: 20 MUESTRAS
(AVL aisladas y directos)
� Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.
Doble implicacióno AMBIENTALo SANITARIA
� Se detectan ARB en el 50% de las Amebas de Vida Libre aisladas.
o Legionella spp. en el 50% de las AVL.
Pseudomonas spp. en el 40% de las AVL.o Pseudomonas spp. en el 40% de las AVL.
MEJILLÓN CEBRA
AVL
García et al. 2013; Sharma et al., 2013et al.; Dini et al., 2000;
o 12 positivas (65%)o 10 identificadas (55%)
Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.
• Identificación de distintos géneros
• Acumulación de protozoos (AVL)
Se detectan ARB en el 50% de las Amebas de Vida Libre aisladas.
spp. en el 40% de las AVL.spp. en el 40% de las AVL.
AVL ARB
“Caballo de Troya”
et al., 2013et al.; Dini et al., 2000; Abedkhojasteh, 2013; Por et al., 2009
RESULTADOS (Metales)RESULTADOS (Metales)
MetalLa Sotonera Flix Sobrón Caspe
µg/g µg/g µg/g µg/g
RD 60-2011 SUSTANCIAS PRIORITARIAS Y PREFERENTESCr 67,26 4,65 3,38 2,68
Se <MCD <MCD <MCD <MCD
Ni 18,64 8,70 5,85 7,16
Cu 13,37 13,06 8,09 7,17Cu 13,37 13,06 8,09 7,17
Zn 97,49 110,50 98,38 117,73
As 3,91 4,13 6,59 7,50Cd 0,62 0,64 2,51 1,28
Hg <MCD 0,10 0,15 <MCD
Pb 0,58 1,78 0,19 0,45
OTROS RESULTADOS SIGNIFICATIVOSAl 833,07 1447,86 100,19 151,98
Mn 40,19 72,89 16,43 41,39
Fe 952,19 1287,81 353,08 461,34
0,17Sb <MCD 0,17 0,03 0,04
Cs 0,24 0,35 0,05 0,06
Th 0,21 0,35 0,04 0,06
Total 66 metales analizados
RIESGO PARA EL ECOSISTEMA Y LA SALUD
MCD
µg/g
2011 SUSTANCIAS PRIORITARIAS Y PREFERENTES2,68 0,07
<MCD 3,25
7,16 0,48
7,17 0,37
No existen valores de
referencia en D. polymorpha
Resultado significativamente
superior: DISCORDANTE7,17 0,37
117,73 1,04
7,50 1,21
1,28 0,03
<MCD 0,08
0,45 0,06
151,98 8,76
41,39 0,09
461,34 34,24
superior: DISCORDANTE
La Sotonera y Flix
AGUA CONTAMINADA(Camusso et al., 2000; Faria et al., 2009;
Bourgeault et al., 2011)
0,04 0,01
0,06 0,01
0,06 0,01Sobrón y Caspe
AGUA NO CONTAMINADA (Camusso et al., 2000; Alcaraz et
al., 2010; Gundacker, 1998)RIESGO PARA EL ECOSISTEMA Y LA SALUD
RESULTADOS (Metales)RESULTADOS (Metales)
RIESGO PARA EL ECOSISTEMA Y LA SALUD
No existen valores de
referencia en D. polymorpha
Resultado significativamente
superior: DISCORDANTE
Sobrón y Caspe
AGUA NO CONTAMINADA (Camusso et al., 2000; Alcaraz et
La Sotonera y Flix
AGUA CONTAMINADA(Camusso et al., 2000; Faria et al., 2009;
Bourgeault et al., 2011)
(Camusso et al., 2000; Alcaraz et
al., 2010; Gundacker, 1998)
Se cumplen los límites :
o RD 60-2011
o Orden de 11 de mayo de 1988 RIESGO PARA EL ECOSISTEMA Y LA SALUD
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
1. Se demuestra la acumulación de bacterias en
factores como tamaño y metabolización, convirtiéndolo
calidad microbiológica del agua.
2. Se evidencia la capacidad del mejillón cebra para
Cryptosporidium spp. ni Giardia duodenalis pero
simultáneamente en una misma muestra.
3. El 50% AVL aisladas presentan en su interior
protegiéndolas de desinfectantes comunes, permitiendo
4. Correspondencia entre los metales de mayor concentración
obtenida en D. polymorpha. Por lo que puede resultar
biota.
obtenida en D. polymorpha. Por lo que puede resultar
biota.
5. Destacar su utilidad para analizar el estado ecológico
permanece en el sustrato al que se fija almacenando
el interior del mejillón cebra, determinada por
convirtiéndolo en un bioindicador semi-cuantitativo de
para la acumulación de protozoos. No se detecta ni
pero sí se identifican diferentes géneros de AVL
interior Legionella spp. y el 40% Pseudomonas spp.
permitiendo incluso que se reproduzcan en su interior.
concentración por la actividad desarrollada y la
resultar útil como indicador de calidad del agua enresultar útil como indicador de calidad del agua en
ecológico de una localización concreta, ya que
almacenando microorganismos y contaminantes del agua.
AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS
• Universidad de Zaragoza. Proyecto deecológico de las masas de agua medianteecológico de las masas de agua mediantebiológico (JIUZ2013-TEC-14)”.
• TRAGSA Empresa de Transformación Agraria,
• Confederación Hidrográfica del Ebro.• Confederación Hidrográfica del Ebro.
de Investigación “Evaluación del estadomediante el uso del mejillón cebra como indicadormediante el uso del mejillón cebra como indicador
Agraria, S.A.
GRACIAS POR SU ATENCIÓNGRACIAS POR SU ATENCIÓNProyecto de Investigación “Evaluación del estado ecológico de las masas de agua mediante el
uso del mejillón cebra como indicador biológico (JIUZ2013
POR SU ATENCIÓNPOR SU ATENCIÓNProyecto de Investigación “Evaluación del estado ecológico de las masas de agua mediante el
uso del mejillón cebra como indicador biológico (JIUZ2013-TEC-14)”