OPTIMIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO POR ...€¦ · A la Profesora Miriam Regnault...

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE FARMACIA

OPTIMIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO

POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

(HPLC) CON DETECCIÓN U.V A SER APLICADO EN EL

ENSAYO DE DISOLUCIÓN DE SILIMARINA CÁPSULAS

FARMACÉUTICO, JACQUELINE PÉREZ

FARMACÉUTICO, ANA MARÍA SOJO

CARACAS, OCTUBRE 2013

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE FARMACIA

POSTGRADO DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

OPTIMIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO

POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

(HPLC) CON DETECCIÓN U.V A SER APLICADO EN EL

ENSAYO DE DISOLUCIÓN DE SILIMARINA CÁPSULAS

FARMACÉUTICO, JACQUELINE PÉREZ

FARMACÉUTICO, ANA MARÍA SOJO

Trabajo presentado ante la ilustre Universidad Central de Venezuela para optar al título de Especialista en Aseguramiento de la Calidad

TUTOR: PhD, MIRIAM REGNAULT

iii

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a Dios por permitirnos culminar esta meta y por estar siempre

presente en nuestras vidas.

A la Universidad Central de Venezuela, Facultad de Farmacia, por

brindarnos la oportunidad de seguir creciendo profesionalmente.

A la Profesora Miriam Regnault nuestra Tutora, por aceptar este reto junto a

nosotras, por brindarnos su apoyo, conocimientos y orientación en todo

momento para el logro de los objetivos propuestos.

A Laboratorios Vargas, S.A por permitirnos llevar a cabo este proyecto, por

darnos todo el apoyo en lo económico, aporte de infraestructura y materiales

para la realización de este trabajo de grado.

A nuestros padres por su apoyo incondicional.

A todas aquellas personas que de una u otra manera contribuyeron al

desarrollo y conclusión de este Trabajo Especial de Grado.

iv

RESUMEN

La silimarina es un flavonolignano extraído de la planta Silybum marianum

(cardo mariano), perteneciente a las familias de las Asteraceae. Es de origen

mediterráneo que crece espontánea en zonas baldías de Europa, Norte de

África y el Medio Oriente y en algunas partes de USA. Los frutos del cardo

mariano contienen glucósidos, lípidos, prótidos, esteroles y se ha

comprobado que se trata de una mezcla de varios componentes de

estructura química semejante. Estos compuestos reciben el nombre de

silibinina (en mayor proporción), silidianina, silicristina e isosilibinina. La

silimarina es empleada por la medicina alternativa complementaria en

tratamientos de enfermedades hepáticas. Clínicamente se ha sugerido que

tiene efecto hepatoprotector en varias forma de hepatitis toxica, hígado

graso, cirrosis, hepatitis virales y actividad antioxidante.

El presente trabajo tiene como objetivo la optimización y validación de un

método analítico por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para

su aplicación en el ensayo de disolución de un producto farmacéutico

nacional en cápsulas conteniendo silimarina. Para la optimización del

método se evaluaron dos tipos de solventes orgánicos, sistemas de

gradientes de elución y velocidad de flujo. Las condiciones óptimas se

consiguieron utilizando una columna de fase reversa Lichrospher 100 RP18

25 cm de longitud, 4,0 mm de diámetro interno y tamaño de partícula 10μ, un

gradiente de elución: (0 – 20) minutos 57%A : 43%B flujo de 0,5mL/min;

(21 – 40) minutos 52%A : 48%B, flujo de 0,8 mL/min; (41 – 45) minutos

57%A : 43%B, flujo de 0,5 mL/min, empleando como solvente A: Solución de

ácido fosfórico 0,05 M pH 3,0; solvente B: metanol, detector U.V a una

v

longitud de onda de 288nm, un volumen de inyección de 50 µL, y bajo estas

condiciones se realizó la validación de la metodología analítica. Se demostró

que el método cumple con los parámetros de validación establecidos:

Especificidad: es capaz de separar los compuestos de interés sin que exista

interferencia de otras sustancias. Linealidad: la curva de calibración fue

lineal en el rango de 40 – 140% de la concentración estándar de trabajo.

Precisión: RSD a los 15 y 45 minutos menor al 10%. Precisión Intermedia:

RSD a los 15 y 45 minutos menor al 15%. Exactitud: porcentaje de

recuperación del analito para los 15 minutos entre 91 y 104% y para los 45

minutos entre 95 y 101%. Límite de detección: 6,46 x 10 -11 mg/mL. Límite

de cuantificación: 1,95 x 10 -10 mg/mL. La precisión intermedia demostró la

fortaleza del método analítico al no ser afectado por la variabilidad

operacional y ambiental.

El presente trabajo representa una mejora en los tiempos de análisis y

precisión de los resultados analíticos de la cuantificación del producto

Silimarina, con respecto al procedimiento objeto de estudio.

vi

INDICE

pp.

AGRADECIMIENTOS……….................................................................... iii

RESUMEN……………………………………………………………………… iv

LISTA DE TABLAS…………………………………………………………… ix

LISTA DE GRAFICOS……………………………………………………….. xi

LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………. xii

1. INTRODUCCION…………………………………………………………. 1

1.1 Compuestos Fenólicos. Flavonoides ……………………………. …. 5

1.2 Metodologías empleadas para la cuantificación de Silimarina…….. 5

1.3 Disolución de Formas Farmacéuticas Sólidas………………………. 9

1.3.1 Parámetros Generales del Ensayo de Disolución………………… 11

1.3.1.1 Aparatos de Disolución…………………………………………….. 11

1.3.1.2 Velocidad de Agitación…………………………………………….. 12

1.3.1.3 Medio de Disolución………………………………………………... 13

1.3.1.4 Tiempo……………………………………………………………….. 15

1.4 Fundamentos de Cromatografía Líquida……………………………… 16

1.4.1 Eficiencia del Proceso Cromatográfico……………………………… 16

1.4.2. Tiempo de Retención………………………………………………… 17

1.4.3. Factor de Capacidad…………………………………………………. 18

1.4.4. Resolución del Proceso Cromatográfico…………………………… 18

1.4.5 Asimetría del pico (Factor de Cola o tailing factor)………………… 22

1.5 Validación de un Método Analítico…………………………………….. 22

1.5.1 Datos requeridos para la Validación………………………………… 22

vii

1.5.2 Exactitud……………………………………………………………….. 24

1.5.3 Precisión……………………………………………………………….. 24

1.5.4 Especificidad………………………………………………………….. 25

1.5.5 Límite de Detección………………………………………………….. 26

1.5.6. Límite de Cuantificación…………………………………………….. 26

1.5.7 Linealidad e Intervalo………………………………………………… 27

1.5.8 Robustez………………………………………………………………. 28

1.6 Aptitud del Sistema…………………………………………………….. 28

2. OBJETIVOS………………………………………………………………. 30

2.1- Objetivo general……………………………………………………….. 30

2.2– Objetivos específicos…………………………………………………. 30

3. METODOLOGIA …………………………………………………………. 31

3.1 Materiales y métodos…………………………………………………… 31

3.1.1 Equipos………………………………………………………………… 31

3.1.2 Patrones de Referencia……………………………………………… 32

3.1.3 Muestra de Silimarina Cápsula…………………………………….. 32

3.1.4 Reactivos y Solventes………………………………………………. 32

3.1.5 Columna………………………………………………………………. 32

3.1.6 Condiciones Cromatográficas………………………………………. 33

3.1.7 Preparación de las Soluciones de Estándar y Muestra………….. 33

3.2 Procedimiento…………………………………………………………… 34

3.2.1 Optimización del Método Analítico………………………………….. 34

3.2.1.1 Optimización de la Fase Móvil……………………………………. 34

3.2.2 Validación……………………………………………………………… 37

3.2.2.1 Validación del método cromatográfico…………………………… 37

viii

3.2.2.1.1 Especificidad…………………………………………………….. 37

3.2.2.1.2. Adecuación del Sistema……………………………………….. 38

3.2.2.1.3 Linealidad………………………………………………………… 38

3.2.2.1.4 Precisión………………………………………………………….. 39

3.2.2.1.5 Exactitud………………………………………………………….. 39

3.2.2.1.6 Límite de detección y Límite de cuantificación……………… 40

3.2.2.1.6.1 Límite de Detección…………………………………………. 40

3.2.2.1.6.2 Límite de Cuantificación……………………………………. 40

3.2.2.1.7 Fortaleza………………………………………………………… 41

3.2.2.1.8 Validación del Método de Disolución…………………………. 41

4. RESULTADOS Y DISCUSION………………………………………… 42

4.1 Desarrollo del método analítico……………………………………… 42

4.1.1 Optimización de la Fase Móvil……………………………………. 42

4.2 Validación………………………………………………………………. 59

4.2.1 Especificidad…………………………………………………………. 59

4.2.2 Adecuación del Sistema…………………………………………….. 63

4.2.3 Linealidad……………………………………………………………. 65

4.2.4 Precisión……………………………………………………………… 66

4.2.5 Exactitud……………………………………………………………… 73

4.2.6 Límite de Detección…………………………………………………. 79

4.2.7 Límite de Cuantificación…………………………………………….. 80

4.2.8 Fortaleza………………………………………………………………. 80

5. CONCLUSIONES………………………………………………………… 81

6. RECOMENDACIONES………………………………………………….. 81

7. BIBLIOGRAFIA…………………………………………………….......... 82

ix

LISTA DE TABLAS

pp.

I. Datos requeridos para la Validación (USP 35, 2012).......................... 23

II. Comparación de la resolución, tiempo de elución y número de platos

teóricos de los cromatogramas obtenidos de los sistemas de gradientes 1, 2

y 3……………………………………………………………………………… 49

III. Tiempo de retención de los patrones y la muestra de Silimarina cápsulas,

Especificidad…………………………………………………………………. 59

IV. Resumen de los parámetros cromatográficos………………………… 63

V. Resultados linealidad y rango……………………………………………. 65

VI. Datos Analista 1 y Analista 2 para calcular el porcentaje disuelto de

silimarina cápsulas…………………………………………………………… 67

VII. Áreas de la muestra a los 15 y 45 minutos (Analista 1)……………. 69

VIII. Resultados de repetibilidad a los 15 minutos (Analista 1)………….. 70

IX. Resultados de repetibilidad a los 45 minutos (Analista 1)……………. 70

X. Áreas de la muestra a los 15 y 45 minutos (Analista 2)……………….. 71

XI. Resultados ensayo de disolución a los 15 minutos (Analista 2)……... 72

XII. Resultados ensayo de disolución a los 45 minutos (Analista 2)…….. 72

XIII. Áreas de la muestra de referencia para la exactitud a los 15 y 45

minutos…………………………………………………………………………. 74

XIV. Resultados del ensayo de disolución de referencia para la exactitud a

los 15 minutos…………………………………………………………………. 74

XV. Resultados del ensayo de disolución de referencia para la exactitud a

los 45 minutos…………………………………………………………………. 75

XVI. Áreas de la muestra a los 15 y 45 minutos…………………………… 76

x

XVII. Resultados de Exactitud a los 15 minutos…………………………… 77

XVIII. Resultados de Exactitud a los 45 minutos………………………….. 77

XIX. Resultados de los Límites de Confianza a los 15 minutos…………. 78

XX. Resultados de los Límites de Confianza a los 45 minutos………….. 78

XXI. Respuesta del ruido de fondo analítico……………………………… 79

xi

LISTA DE GRAFICOS

pp.

1. Linealidad (área vs. concentración mg/mL)…………………………… 66

xii

LISTA DE FIGURAS

pp.

1. Estructura química de los compuestos activos del Silybum marianum:

Silicristina, Silidianina, Isómeros de Silibinina (Silibinina A y B), e isómeros

de Isosilibinina (Isosilibinina A y B) Fuente: Lee J et al. (15)…………….. 4

2. Nomograma de Fuerza de solvente para HPLC en fase reversa. Fuente:

Regnault, M. (18)……………………………………………………………… 21

3. Cromatogramas del método analítico de casa matriz: patrón silibinina A y

B y muestra de disolución……………………………………………………. 43

4A. Cromatogramas del ensayo para la proporción 50% metanol en la fase

móvil: patrón silibinina A y B, y muestra de disolución…………………… 45

4B. Cromatogramas del ensayo para la proporción 45% metanol en la fase

móvil: patrón silibinina A y B y muestra de disolución…………………… 46

4C. Cromatogramas del ensayo para la proporción 40% metanol en la fase

móvil: patrón silibinina A y B y muestra de disolución…………………… 47

5A. Cromatogramas del ensayo evaluando Sistema de gradiente N° 1

patrón silibinina A y B y muestra de disolución…………………………… 50

5B. Cromatogramas del ensayo evaluando Sistema de gradiente N° 2


5C. Cromatogramas del ensayo evaluando Sistema de gradiente N° 3


6A. Cromatogramas evaluando pH 5,0 en la fase acuosa, empleando

Sistema gradiente N° 3: patrón silibinina A y B y muestra de disolución... 54

6B. Cromatogramas evaluando pH 3,0 en la fase acuosa, empleando

Sistema gradiente N° 3: patrón silibinina A y B y muestra de disolución… 55

xiii

7A. Cromatogramas evaluando como fase orgánica acetonitrilo, empleando

el Sistema gradiente N° 4: patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

…………………………………………………………………………………… 57

7B. Cromatogramas evaluando como fase orgánica acetonitrilo y metanol,

empleando el Sistema gradiente N° 5: patrón silibinina A y B y muestra de

disolución…………………………………………………………………........ 58

8A. Cromatogramas del ensayo de especificidad: patrón silicristina, patrón

silidianina, patrón isosilibinina A y B………………………………………… 60

8B. Cromatogramas del ensayo de especificidad: patrón silibinina A y B,

muestra de disolución……………………………………………………….. 61

8C. Cromatogramas del ensayo de especificidad: blanco A (Solución de

Buffer pH 7,5), blanco B (Solución Acido fosfórico 0,05M pH 3,0 – Metanol

(50:50) y placebo……………………………………………………………... 62

1

1.- INTRODUCCION

Las plantas medicinales se han usado desde la antigüedad para el

tratamiento de diversas enfermedades y son parte integral de muchas

culturas a lo largo del mundo, su uso se ha diversificado extensamente por

su actividad antitumoral, antimicrobiano, inmunológica, anticonceptiva,

padecimientos hepáticos, gastrointestinales, hipoglicemiantes, entre otras.

(1)

Constituyen una alternativa viable para resolver en buena medida los

problemas de salud, de manera complementaria e inclusive de manera

integral y de bajo costo. La cultura de nuestros pueblos en el uso de las

plantas medicinales, se ha caracterizado por el uso directo sin más

modificación que la provocada por su deshidratación y decocción. Bajo este

criterio de consumo es como se han establecido tradicionalmente

alternativas viables para resolver sus problemas de salud sobre todo en

aquellos grupos desfavorecidos históricamente tanto social como

económicamente. A esta costumbre también se ha sumado parte de la

población con mayores recursos culturales y económicos; de tal manera que,

con base a esta práctica médica actualmente existe un incremento en el

desarrollo y uso de fitofármacos como nuevo recurso de aplicación

fitoterapéutica. (2)

Las plantas medicinales han sido usadas por cientos de años para el

tratamiento de desordenes del hígado. Estos tratamientos incluyen hepatitis

viral aguda, hepatitis crónica viral, colelitiasis crónica, enfermedad hepática

crónica y envenenamiento por hongos. Estas patologías han sido estudiadas

sin que a la fecha se cuente con tratamientos satisfactorios y efectivos

2

empleados por la medicina convencional. Ante este problema actualmente

se ha puesto mucha atención en el uso de otras alternativas de la Medicina

Alternativa Complementaria, utilizando como principal recurso las plantas

medicinales; particularmente aquellas que sean ricas en compuestos poli-

hidroxifenólicos, flavonoides y terpenoides los que con sus grupos

hidroxifenólicos reaccionan con radicales libres formando aductos que no

resultan ser tóxicos. Las plantas que contienen esta clase de compuestos se

caracterizan por su potente efecto hepatoprotector. (2)

En las enfermedades del hígado se produce un estrés oxidativo donde

participan diferentes sustancias ricas en oxigeno, que en primera instancia

afectan la membrana celular por peroxidación de los lípidos y se producen

tóxicos que se unen a proteínas y ADN formando aductos que alteran la

estructura y significado fisiológico y metabólico de estas biomoléculas. Si los

agentes generadores de radicales libres actúan de manera intensa y crónica

además de activar las células estelares producen muerte celular, por lo tanto

en este cuadro multifisiopatológico, el hígado se convierte en el órgano clave

que requiere mucha atención para prevenirlo de agentes tóxicos que alteren

su metabolismo. (2)

Una de las plantas más estudiadas en enfermedades hepáticas es la

Silybum marianum (cardo mariano) perteneciente a la familia Asteraceae, es

una planta anual o bianual que puede alcanzar 1 ó 2 metros de altura, sus

hojas son ovaladas, de color verde y con nervios blancos, sus flores son

púrpura con grandes espinas en su base. Es de origen mediterráneo que

crece espontánea en zonas baldías de Europa, Norte de África y el Medio

Oriente y en algunas partes de USA. (3) (4)

3

Los frutos del cardo mariano contienen glucósidos, lípidos, prótidos,

esteroles. En la década de 1960, los principios biológicamente activos de las

semillas y extractos de los frutos, fueron aislados y se elucidaron las

estructuras químicas, lo que condujo primeramente a una mezcla que

contiene aproximadamente 60% de Silimarina la cual consta de cuatro

flavonolignanos de Silibinina (50 a 60%), Silidianina (10%), Silicristina (20%),

Isosilibinina (5%) sobre esta mezcla de flavonolignanos se han realizado la

mayoría de los estudios clínicos. (3) (5)

La silimarina es empleada por la medicina alternativa complementaria en

tratamientos de enfermedades hepáticas. Clínicamente se ha sugerido que

tiene efecto hepatoprotector en varias formas de hepatitis tóxica, hígado

graso, cirrosis, hepatitis virales y actividad antioxidante. Las actividades

descritas se deben a los flavolignanos de la silimarina que actúan como

agentes antioxidantes y depuradores de radicales libres. (2)

4

Figura 1. Estructura química de los compuestos activos del Silybum marianum:

Silicristina, Silidianina, Isómeros de Silibinina (Silibinina A y B), e isómeros de Isosilibinina (Isosilibinina A y B) Fuente: Lee J et al. (15)

5

1.1.- Compuestos Fenólicos: Flavonoides

Existen una serie de principios activos de plantas que proceden de rutas

biosintéticas mixtas, este es el caso de un importante grupo de moléculas

activas denominadas genéricamente flavonoides o compuestos fenólicos.

Los flavonoides se originan a través de la combinación de la ruta del acetato

y del sikimato, vías mediantes las cuales se biosintetiza la estructura diaril-

propanica; en la naturaleza pueden encontrarse tanto en forma libre o

combinados con azúcares mediante uniones de oxígeno y carbono

heteroxidicas, la mayoría de ellos están constituidos por un núcleo

bencénico unido a una gamma pirona, incluyendo además en distintas

posiciones; C1, C2 o C3, un segundo anillo bencénico dando lugar a los

neoflavonoides, flavonoides propiamente dicho o a los isoflavonoides. (6)

1.2 Metodologías empleadas para la cuantificación de Silimarina

La presencia de la mezcla de estos flavonolignanos en la planta Silybum marianum

ha sido demostrada, pero debido a la complejidad de la muestra y la baja

concentración en que ellos están presentes, es necesario disponer de un

método analítico que muestre una adecuada sensibilidad y selectividad para

realizar la cuantificación e identificación.

Hasta ahora, los principales componentes de la silimarina se han extraído,

separados y analizados por TLC, HPLC, espectrofotometría UV-Vis,

detección electroquímica o MS y electroforesis capilar. (7)

La metodología más frecuente para la cuantificación e identificación de la

Silimarina es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), varios

autores han realizado estudios para el desarrollo y optimización de métodos

6

analíticos empleando columnas C18, C8 en fase reversa, detectores U.V,

masas y de arreglo de diodos.

Quaglia et al. (8) realizaron un estudio para la determinación del contenido

de silimarina en el extracto del fruto seco de Silybum marianum mediante

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y electrofóresis capilar,

empleando como columnas Purospher C18 (250 x 4mm) 5µm (Sistema 1) y

Lichrosphere C8 (250 x 4mm) 5µm, (Sistema 2). En el sistema 1 la fase

móvil empleada fue una mezcla de agua acidificada a pH 2,6 con ácido

fosfórico al 10% mezclado con acetonitrilo en una proporción de (62:38), en

el sistema 2 se empleó una elución por gradiente, usando como solvente A:

agua acidificada a pH 2,3 con acido fosfórico al 10%, solvente B: Acetonitrilo;

Solvente C: Metanol. En ambos casos se uso un flujo de 1mL/min y como

detector un equipo de arreglo de diodos a una longitud de onda de 289nm.

En la determinación del porcentaje de silimarina en los frutos seco de

Silybum marianum se obtuvieron resultados comparables por HPLC y

electroforesis capilar. El HPLC permitió una buena separación entre los

picos de silibinina e isosilibinina, aunque este comportamiento no fue similar

en electroforesis capilar.

Ding et al. (9). En el 2001 lograron separar y cuantificar por cromatografía

líquida de alta resolución (HPLC) los compuestos activos de la silimarina,

(silibinina, isosilibinina, silidianina, silicristina), empleando una columna

VP-ODS (150 x 4,6 mm) 5µm; precolumna: (10 x 4,6mm) 5µm, como fase

móvil metanol y una mezcla de solvente agua: dioxano (9:1), se empleó una

elución por gradiente a una velocidad de flujo de 1,5mL/min y temperatura

de 40°C, longitud de onda de 288nm. Se logró confirmar la separación de

7

los dos diasteroisómeros de silibinina e isosilibinina por cromatografía líquida

de espectrometría de masas.

Kvasnicka et al. (10) analizaron los componentes activos de silimarina en

preparaciones farmacéuticas; mediante cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) y electroforesis capilar, evaluando los parámetros de

precisión, exactitud, linealidad y límite de detección. La separación se

realizó mediante una columna Purospher RP18 (150 x 4 mm) 5µm, como

fase móvil se empleo una mezcla de Acido Fosfórico 85%: Metanol: Agua

(0,5: 46: 64), flujo 1 mL/min, detector UV-Visible y una longitud de onda de

288 nm, con un tiempo de corrida de 25 minutos. Se determinó que las dos

metodologías estudiadas producen resultados comparables.

Zhao et al. (11), realizaron una determinación simultánea de diterpenos,

flavonolignanos y compuestos fenólicos en preparaciones de Silybum

marianum y Salvia miltiorrhiza mediante cromatografía líquida de

espectrometría de masas con ionización electrospray, (HPLC-DAD-ESI MS).

Se utilizó una columna Shimadzu, Japan (150 x 4.6mm) 5µm, como fase

móvil se empleo una mezcla de gradiente Metanol (A) y una solución

acuosa de Acido Fórmico al 0,5% (B), un flujo de 1,2 mL ∕min a una

temperatura de 30ºC, longitud de 254 y 280 nm, usando un detector de

arreglo de diodo y masa. Se obtuvieron resultados de fácil interpretación

concluyendo que este método puede emplearse con comodidad y

sensibilidad para los análisis de control de calidad de los preparados que

contienen compuestos S. miltiorrhiza y S. marianum.

Li et al. (12) desarrollaron un método para la cuantificación de Silibinina A y

Silibinina B en plasma humano mediante la cromatografía líquida de

8

espectrometría de masas con ionización electrospray, se utilizó una columna

Agilent Zorbax Eclipse XDB C18 (250 x 21,2 mm) 5µm, la fase móvil estuvo

compuesta por una mezcla de metanol y agua conteniendo 0,1% de acido

fórmico (48:52, v/v), a una longitud de onda de 288nm. El método

desarrollado fue selectivo y reproducible para la determinación de Silibinina

A y Silibinina B.

De igual forma Lee et al. (13) Desarrollaron un método para la cuantificación

simultánea de seis activos que constituyen estándares comerciales de

silimarina, basado en cromatografía líquida de espectrometría de masas con

ionización electrospray (HPLC-DAD-ESI MS), empleando una columna

YMC ODS-AQ C18 (2.0mm x 100mm) 3µm, a una temperatura de 40ºC,

usando como fase móvil acetato de amonio ajustada a pH 4.0 con acido

fórmico (A) y una mezcla de metanol/agua/ acido fórmico (90:10:0,1) (v/v/v/)

(B). Este método demostró ser útil en la evaluación y cuantificación de los

seis activos constituyentes de productos comerciales extraídos del cardo

lechozo y que son administrados en pacientes con Hepatitis C.

En el año 2009, Liu et al. (14). Desarrollaron un método para la

determinación de los compuestos activos de la silimarina, mediante

cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC), empleando una columna

C18 Acquity UPLC BEH, (50mm x 2,1mm), 1,7µm y una fase móvil de

metanol y agua conteniendo 0,1% de acido fórmico, con tiempos de corrida

de 9 minutos; con detector UV-Visible, a una longitud de onda de 288 nm. El

método desarrollado resultó ser capaz de disminuir los tiempos de retención

y demostró una mejor resolución en comparación a los métodos

convencionales por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), estos

9

resultados indican que este tipo de columna y fase móvil con adición de

modificadores fueron significativos para la separación de los compuestos

isómeros en el extracto herbario.

1.3 Disolución de Formas Farmacéuticas Sólidas

Desde finales de la década de 1960 las pruebas de disolución se

convirtieron en un requisito obligatorio para diversos preparados

farmacéuticos. La disolución es una herramienta cualitativa que puede

proporcionar información valiosa acerca de la disponibilidad biológica de una

droga así como la uniformidad entre un lote y otro, y se considera hoy en día

una de las pruebas de control de calidad más importantes realizadas en los

preparados farmacéuticos. (16) (22)

Para determinar la velocidad de disolución de las drogas en preparados

sólidos en condiciones estandarizadas deben considerarse procesos

fisicoquímicos como: la humidificación de los preparados sólidos, el proceso

de hinchamiento, la desintegración y la desagregación. La humidificación de

la superficie de los preparados sólidos controla el acceso de líquido hacia la

superficie del mismo y muchas veces es un factor limitante en el proceso de

disolución. La velocidad de humidificación va a depender de la tensión

superficial en la interfase y del ángulo de contacto entre la superficie del

sólido y el líquido; por lo que en algunos casos es necesaria la incorporación

de tensoactivo en el preparado o al medio de disolución para reducir el

ángulo de contacto e incrementar la disolución. (16)

La presencia de aire en el medio de disolución hace que las burbujas de aire

sean atrapadas en los poros de los comprimidos y actúen como barrera en la

interfase. En el caso de las cápsulas, la capa de gelatina es

10

extremadamente hidrofilica, por tanto, no existen problemas en cuanto a la

capacidad de humidificación del preparado.

Una vez que el preparado sólido se ha desintegrado en gránulos o

agregados, las características de penetración desempeñan un papel

importante en el proceso de desagregación. Los lubricantes hidrófobos,

como el talco y estearato de magnesio, muy a menudo empleados en la

preparación de los comprimidos y cápsulas, enlentecen la velocidad de

penetración y por lo tanto el proceso de desagregación. El gran tamaño de

los poros facilita la penetración pero si es demasiado grande puede inhibir la

penetración por disminución de la presión interna causada por la hinchazón

del desintegrante. (16) (22)

Una vez que se produce la desagregación y dislocación, las partículas de la

droga quedan expuestas al medio de disolución dando lugar al proceso de

disolución.

A medida que el concepto de disolución adquirió importancia durante las

últimas décadas, los métodos y técnicas in vitro han evolucionado

considerablemente. Uno de ellos es el método con cubetas o vasos, los

cuales incluyen todos los sistemas con compartimientos cerrados con un

mecanismo mezclador por convección forzada, en los cuales hay un

volumen de disolución (200 a 2000 mL) en una cubeta o vaso con un

mecanismo de agitación de rotación u oscilación. (16)

La USP 35 describe dos aparatos con este mecanismo, el aparato 1 consiste

en una cubeta cilíndrica de 1000 mL de vidrio o un material inerte, una

canasta de acero inoxidable cilíndrica de malla 40 conectada a un vástago

metálico de rotación y un motor de velocidad regulada. El conjunto se coloca

11

en un baño de agua que permite una temperatura constante de 37 grados

+/- 0,5 grados durante la prueba. Se inserta cada uno de seis comprimidos o

cápsulas en cada cesta y las canastas bajan hacia los vasos que contienen

el medio de disolución respectivo, posteriormente se toman muestras

filtradas de cada vaso con cierto intervalo de tiempo para la determinación

de la cantidad de ingrediente activo disuelto. (17)

El aparato 2, es similar al aparato 1, excepto a que se usa una paleta

metálica cubierta de un material inerte, dicha paleta va conectada a un motor

de velocidad regulada. En este caso, los comprimidos o cápsulas se dejan

caer libremente hasta al fondo y la paleta gira a la velocidad y tiempo

indicado (16).

1.3.1 Parámetros Generales del Ensayo de Disolución

1.3.1.1 Aparatos de Disolución

De acuerdo a la USP 35 la elección del aparato se basa en el conocimiento

que se tenga de la formulación y de los aspectos prácticos del desempeño

de la forma farmacéutica en el sistema de la prueba in vitro. El Aparato 1

(Cesta) y el Aparato 2 (Paletas) son los aparatos que se utilizan con mayor

frecuencia para las formas farmacéuticas orales solidas.

Si el Aparato 1 o 2 no fuesen apropiados, se puede utilizar otro aparato

oficial. El Aparato 3 (cilindro oscilante) ha demostrado ser especialmente útil

para formas farmacéuticas de liberación modificada tipo perlas. El Aparato 4

(Celda de flujo) puede ofrecer ventaja para las formas farmacéuticas de

liberación modificada que contienen ingredientes activos de solubilidad

limitada. Adicionalmente, el Aparato 3 o el Aparato 4 pueden resultar útiles

para cápsulas de gelatinas blandas, perlas, supositorios o fármacos poco

12

solubles. El Aparato 5 (paleta sobre disco) y el Aparato 6 (cilindro rotatorio)

han demostrado ser útiles para evaluar y analizar las formas farmacéuticas

transdérmicas. El Aparato 7 (soporte oscilante) se puede aplicar a formas

farmacéuticas orales de liberación modificada que no se desintegran, al igual

que a formas farmacéuticas transdérmicas. (17)

1.3.1.2 Velocidad de Agitación

Para cápsulas o tabletas de liberación inmediata, los aparatos de mayor uso

son el Aparato 1 (cesta) a 100 rpm o el Aparato 2 (paletas) a 50 ó 75 rpm.

Con una justificación apropiada, se aceptan otros aparatos y otras

velocidades de agitación.

Las velocidades menores de 25 o mayores de 150 rpm son usualmente

inapropiadas debido a la inconsistencia de la hidrodinámica por debajo de

los 25 rpm y por la turbulencia por encima de 150 rpm.

Las velocidades de agitación entre 25 y 50 rpm son generalmente

aceptables para las suspensiones. Para formas de dosificación que

presentan la formación de conos (montículos) debajo de la paleta a 50 rpm,

el cono puede reducirse al aumentar la velocidad de la paleta a 75 rpm,

reduciendo el artefacto para mejorar los datos. Si se justificará, se puede

emplear una velocidad de 100 rpm, especialmente para productos de

liberación prolongada. El aumentar o disminuir la velocidad de rotación del

aparato puede justificarse si los perfiles reflejan mejor el desempeño in vivo

y/o los resultados del método demuestran una mejor discriminación sin

afectar adversamente la reproducibilidad del método. (17)

13

1.3.1.3 Medio de Disolución

Los datos físicos y químicos para el fármaco y la unidad de dosificación

deben conocerse antes de seleccionar el medio de disolución. Dos

propiedades claves del producto farmacéutico son la solubilidad y la

estabilidad del fármaco en solución en función del valor de pH. Cuando se

selecciona la composición del medio se debe evaluar la influencia de la

soluciones amortiguadoras, el valor de pH y los surfactantes respecto a la

solubilidad y a la estabilidad del fármaco. Las propiedades claves de la

unidad de dosificación que pueden afectar la disolución incluyen el

mecanismo de liberación (inmediato, retardado o modificado) y la velocidad

de desintegración afectados por la dureza, la friabilidad, la presencia de

potenciadores de solubilidad y otros excipientes.

Por lo general, cuando se desarrolla un procedimiento de disolución, una

meta es tener condiciones de exceso de medio (sink condition), definido

como el volumen de medio igual a por lo menos tres veces el requerido para

formar una solución saturada del fármaco. Cuando la condición de exceso

de medio está presente, existirán mayores probabilidades de que los

resultados de disolución reflejen las propiedades de la forma farmacéutica.

No se recomienda emplear una mezcla de un disolvente orgánico y agua

como medio de disolución. Sin embargo, puede ser aceptable si existe una

justificación apropiada para este tipo de medio.

Con frecuencia se usa agua purificada como medio de disolución, pero no es

el ideal por diferentes razones. En primer lugar, la calidad del agua puede

variar dependiendo de la fuente y el valor de pH no estar controlado.

14

En segundo lugar, el valor de pH puede variar día a día y también puede

variar durante una corrida dependiendo de la sustancia activa y los

excipientes. A pesar de esta limitaciones, se debe tener en cuenta que el

agua es económica, está disponible, es de fácil eliminación, ecológicamente

aceptable y apta para productos con una velocidad de liberación

independiente del valor de pH del medio.

Las características de la disolución de una formulación oral deben evaluarse

en el rango de pH fisiológico entre 1,2 y 6,8 (de 1,2 a 7,5 para las

formulaciones de liberación modificada).

Durante el desarrollo del método, podría ser de utilidad medir el pH antes y

después de una corrida para determinar si cambia durante la prueba.

Los medios típicos para la disolución pueden incluir los siguientes

elementos: acido clorhídrico diluido, soluciones amortiguadoras en el rango

de pH fisiológico entre 1,2 y 7,5, fluido intestinal o gástrico simulados (con o

sin enzimas), agua y surfactantes (con o sin ácidos, soluciones

amortiguadoras) tales como: polisorbato 80, lauril sulfato de sodio y sales

biliares.

La molaridad de las soluciones amortiguadoras y de los ácidos usados

puede influenciar el efecto de solubilización y este factor puede ser

evaluado.

Para compuestos escasamente solubles, las soluciones acuosas pueden

contener un porcentaje de un surfactante (ej., lauril sulfato de sodio,

polisorbato u óxido de lauril dimetilamina) que se utiliza para mejorar la

solubilidad del fármaco. La necesidad de surfactantes y las concentraciones

usadas pueden justificarse mostrando los perfiles a diferentes

15

concentraciones. Los surfactantes pueden emplearse, ya sea como agentes

humectantes o para solubilizar el fármaco. (17)

1.3.1.4 Tiempo

Para las formas farmacéuticas de liberación inmediata, la duración del

procedimiento es usualmente entre 30 y 60 minutos; en la mayoría de los

casos, la especificación de un solo tiempo es adecuada para fines

farmacopeicos. Se deben seleccionar suficiente tiempos para una adecuada

caracterización de la fase ascendente y la fase de meseta de la curva o

perfil de disolución. De acuerdo con el sistema de clasificación

Biofarmacéutica, los fármacos altamente solubles y de alta permeabilidad

formulados como productos que se disuelven rápidamente no requieren

estar sujetos a un perfil de comparación si demuestra una liberación de 85%

o más de las sustancia activa dentro de 15 minutos. Para estos tipos de

productos solamente se requiere una prueba de un solo punto. Sin embargo,

la mayoría de los productos no caen dentro de esta categoría. Los perfiles

de disolución de productos de liberación inmediata por lo general presentan

un incremento gradual que alcanza entre 85 y 100% en un periodo de

aproximadamente entre 30 y 45 minutos. De este modo, los tiempos de

disolución en el rango de 15, 20, 30, 45 y 60 minutos son comunes para la

mayor parte de los productos de liberación inmediata. Para los productos de

disolución rápida, entre los que se incluyen las suspensiones, se puede

obtener información útil a partir de los primeros puntos, por ejemplo de 5 a

10 minutos. Para productos de disolución lenta, pueden ser de utilidad los

tiempos que sobrepasen los 60 minutos. Los tiempos de la prueba de

16

disolución para las pruebas farmacopeicas generalmente se basan en una

evaluación de los datos del perfil de disolución. (17)

1.4 Fundamentos de Cromatografía Líquida

Las técnicas de separación cromatográfica son métodos de separación de

múltiples etapas en los que los componentes de una muestra se distribuyen

entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra móvil. La fase

estacionaria puede ser un sólido, un líquido adsorbido sobre un sólido o un

gel, puede estar empacada en una columna, extendida en una capa,

distribuida como película o aplicada mediante otras técnicas. La fase móvil

puede ser gaseosa o líquida o un fluido supercrítico.

El termino cromatografía de líquidos, según se usa en los compendios es

sinónimo de cromatografía líquida de alta presión y de cromatografía líquida

de alta resolución. La cromatografía de líquidos es una técnica de

separación basada en una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida.

Las separaciones se logran por procesos de partición, adsorción o

intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria empleada. Las fases

estacionarias más comúnmente usadas son la sílice modificada o las

microperlas de polímero. (17)

1.4.1 Eficiencia del Proceso Cromatográfico

La eficiencia del proceso cromatográfico es medida en términos del número

de platos teóricos (N) de la columna ó del número de equilibrios que se

establecen en una columna de determinada longitud. Para los picos

gaussianos se calcula por la ecuación:

N= 16 ( tR / W )2

17

Donde:

tR = Tiempo de retención o tiempo necesario para eluir la máxima

concentración de la columna, medido desde el punto de inyección.

W = Ancho del pico en su base, que se obtiene extrapolando los lados

relativamente rectos del pico hasta la línea base.

El valor N depende de la sustancia cromatografiada así como de las

condiciones operativas, tales como la velocidad de flujo y la temperatura de

la fase móvil o gas transportador, la calidad del relleno, la uniformidad del

relleno dentro de la columna, y, para columnas capilares, el espesor de la

película de la fase estacionaria, el diámetro interno y la longitud de la

columna.

Debido a las posibles variaciones en la realización de la triangulación del

pico y al uso de integradores electrónicos, es conveniente determinar el

número de platos teóricos por la siguiente ecuación:

N= 5,54 (tR / W h/2)2

Donde:

W h/2= Es el ancho del pico a la mitad de la altura. Sin embargo, en caso

de discrepancias, solo se deben usar las ecuaciones basadas en el ancho

del pico en la línea base.

1.4.2. Tiempo de Retención

En cromatografía líquida y de gases, el tiempo de retención, tR, se define

como el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición

de la respuesta máxima. Se puede usar, tR, como un parámetro para la

identificación. Los tiempos de retención cromatográficos son característicos

de los compuestos que representan, pero no son únicos.

18

El tiempo de retención de un compuesto depende de la velocidad del flujo de

la fase móvil, volumen de la columna, composición de la fase móvil, pH,

empaque de la columna y temperatura.

Para lograr la separación de un compuesto de una mezcla, en una columna

cromatográfica, es necesario que el compuesto analizado sea parcialmente

retenido en ella.

1.4.3. Factor de Capacidad

El factor de capacidad (k') es un valor práctico que nos expresa el grado de

interacción del compuesto (s) con la columna:

k'=

Donde:

tR = Tiempo de retención del compuesto analizado

to = Tiempo de retención de un compuesto poco retenido ó no retenido en la

columna.

Idealmente los valores de k' varían entre 1 (poca interacción) y 10 (gran

interacción). Valores superiores a 10 significan que el tiempo de retención de

análisis es muy largo y probablemente la resolución no es adecuada debido

a que la difusión molecular provoca ensanchamiento de la bandas. (18)

1.4.4. Resolución del Proceso Cromatográfico

La resolución es la separación de dos componentes en una mezcla,

calculada por:

Rs= 2 (tR2 – tR1)/ (W1 + W2)

tR - to

to

19

Donde:

tR2 y tR1 = Tiempos de retención de los componentes 1 y 2

W1 y W2 = Anchos correspondientes en las bases de los picos 1 y 2

obtenidos extrapolando los lados relativamente rectos de los picos hasta la

línea base.

Esta ecuación es conveniente cuando los picos están bien resueltos (Rs ≥

1,5). Las bandas que se superponen tienen valores menores de resolución.

Por lo tanto, es necesario un valor adecuado de Rs pero además es

necesario que todos los componentes estén resueltos. Para análisis

cuantitativo, se recomienda una resolución en línea base (Rs ≥ 1,5) para

todas las bandas de interés. Una resolución en exceso de Rs = 1,5 asegura

un método más fuerte y pequeños cambios en la separación no

comprometerán el método. Es menos preciso cuantificar con valores de Rs <

1).

La resolución depende de las diferentes condiciones experimentales que

afectan el tiempo de retención y el número de platos teóricos.

Cuando los picos no están bien resueltos o se emplean integradores

electrónicos, es conveniente determinar la resolución, mediante la ecuación:

Rs= 1, 18 (tR2 – tR1) / (W1,h/2 + W2,h/2)

La resolución se puede controlar seleccionando las mejores condiciones

experimentales para ello es necesario estudiar la ecuación básica de la

Resolución (Rs ):

Rs= 1 /4 (α – 1) N0,5 (k' /1 + k')

20

Donde:

α = Factor de separación: k2 / K1

k2 / K1 = Factores de capacidad (k') para las bandas 1 y 2

N = Número de platos teóricos de la columna (promedio de las dos bandas)

K´ = Promedio de los valores de k' para las dos bandas

De acuerdo con esta ecuación, la resolución está determinada por tres

factores diferentes e independientes: el factor de separación (α), el número

de platos teóricos (N) y el factor capacidad (k').

El factor k'´ está relacionado directamente con la fuerza del solvente, por lo

que a valores mayores de k' mayor resolución del sistema cromatográfico.

Un aumento en k'´ también lleva a mayores tiempos de corrida y a bandas

más anchas, las cuales son más difíciles de cuantificar con exactitud, por lo

tanto, los valores de k' deben ser intermedios, en un rango entre 1 y 20 para

todas las bandas del cromatograma.

Los valores de k' < 1 debe evitarse ya que la resolución no es satisfactoria

porque bandas interferentes son más probables de aparecer y la

cuantificación se hace más difícil. En HPLC de fase reversa, la fuerza del

solvente incrementa con el porcentaje de fase orgánica en la fase móvil.

Durante el desarrollo de la metodología analítica lo recomendable es

comenzar con una fase móvil que es probablemente muy fuerte y luego ir

reduciendo la fuerza del solvente para aumentar k' en las siguientes

corridas. (18)

Una vez que la fuerza del solvente (k') ha sido ajustada adecuadamente

para la muestra, el próximo parámetro a estudiar es la selectividad de la fase

móvil (α), sin embargo en muchos casos, es posible obtener una separación

21

satisfactoria variando simplemente la fuerza del solvente. Para variar la

selectividad de la fase móvil es necesario sustituir un solvente orgánico por

otro para ello es necesario conocer que porcentaje de un solvente es

equivalente al otro solvente. (18)

Figura 2. Nomograma de Fuerza de solvente para HPLC en fase reversa. Fuente: Regnault, M. (18)

La Figura 2 muestra la conversión en fases móviles utilizadas en fase

reversa teniendo la misma fuerza (serie iso-elutrópica). Líneas verticales en

esta figura interceptan fases móviles con la misma fuerza, ejemplo: 70% de

metanol tiene la misma fuerza que 60% de acetonitrilo o 45% de THF. La

composición de la fase móvil tiene un gran efecto en la distancia entre las

bandas; ninguna otra variable ha probado ser tan poderosa en controlar los

valores α.

El número de platos teóricos (N), es importante en la resolución de la

muestra, por ello es necesario que el desarrollo de la metodología analítica

se inicie con una columna cromatográfica que posea un número de platos

teóricos apropiados, una vez ajustado N para alcanzar una resolución

deseada en la muestra, es importante que además se ajuste el tiempo de

Metanol Acetonitrilo Tetrahidrofurano

22

corrida (1 -20) minutos, la presión aproximadamente a 2000 PSI y fijar un

mínimo de consumo de fase móvil, aunque no es una limitante. (18)

1.4.5 Asimetría del pico (Factor de Cola o tailing factor)

El factor de simetría de un pico se calcula por:

AS = W0,05 / 2f

Donde

W0,05 = Es el ancho del pico al 5% de la altura

f = Es la distancia del máximo del pico hasta el borde inicial del pico,

midiendo la distancia en un punto ubicado al 5% de la altura de la línea

base.

En una separación cromatográfica debe establecerse el límite máximo de

asimetría del pico. Para un pico simétrico el factor es la unidad y su valor se

incrementa conforme la asimetría se vuelve más pronunciada. (17)

1.5 Validación de un Método Analítico

De acuerdo a la USP 35, la validación de un procedimiento analítico es el

proceso que establece, mediante estudios en laboratorio, que las

características de desempeño del procedimiento cumplen los requisitos para

las aplicaciones analíticas previstas. (17)

1.5.1 Datos requeridos para la Validación

Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varían desde determinaciones

analíticas muy rigurosas hasta evaluaciones subjetivas de atributos.

Considerando esta amplia variedad, es lógico que diferentes procedimientos

de prueba requieran diferentes esquemas de validación. La USP 35 clasifica

aquellas pruebas que requieran datos de validación en cuatro (4) categorías:

23

Categoría I: Procedimientos analíticos para la cuantificación de los

componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos

(incluyendo conservantes) en productos farmacéuticos terminados.

Categoría II: Procedimientos analíticos para la determinación de impurezas

en fármacos a granel o productos de degradación en productos

farmacéuticos terminados. Estos procedimientos incluyen análisis

cuantitativos y pruebas de límite.

Categoría III: Procedimientos analíticos para la determinación de las

características de desempeño (por ejemplo: disolución, liberación de

fármacos, etc.).

Categoría IV: Pruebas de identificación.

En la tabla I se indican los datos que normalmente se requieren para cada

una de estas categorías.

Tabla I. Datos requeridos para la Validación (USP 35, 2012).

Característica de Desempeño

Analítico

Categoría I

Categoría II Categoría

III Categoría

IV Análisis Cuantitativos

Pruebas de Límite

Exactitud SI SI * * NO

Precisión SI SI NO SI NO

Especificidad SI SI SI * SI

Límite de

Detección NO NO SI * NO

Limite de

Cuantificación NO SI NO * NO

Linealidad SI SI NO * NO

Intervalo SI SI * * NO

*Pueden requerirse, dependiendo de la naturaleza de la prueba específica.

24

Las características de desempeño analítico habituales que deben

considerarse en la validación de un método analítico son, exactitud,

precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación,

linealidad, intervalo, robustez.

1.5.2 Exactitud

La exactitud de un procedimiento analítico es la proximidad entre los

resultados de la prueba obtenidos mediante ese procedimiento y el valor

verdadero. La exactitud debe establecerse en todo su intervalo.

En la valoración de un fármaco, la exactitud puede determinarse mediante la

aplicación del procedimiento analítico con respecto a un analito de pureza

conocida, por ejemplo, un estándar de referencia.

La exactitud se calcula como el porcentaje de recuperación de la cantidad

valorada con respecto a la cantidad conocida de analito añadida a la

muestra, o como la diferencia entre la media de la valoración y el valor

verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza. (17)

La International Conference on Harmonisation (ICH) recomienda que se

evalúe la exactitud utilizando un mínimo de nueve determinaciones sobre un

mínimo de tres niveles de concentración, cubriendo el intervalo especificado

(es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada

concentración). (19)

1.5.3 Precisión

La precisión de un procedimiento analítico es el grado de concordancia entre

los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento

repetidamente a múltiples muestreos de una muestra homogénea.

25

La precisión de un procedimiento analítico habitualmente se expresa como la

desviación estándar o la desviación estándar relativa (coeficiente de

variación) de una serie de mediciones. La precisión puede ser una medida

del grado de reproducibilidad o de repetibilidad del procedimiento analítico

en condiciones normales de operación.

La precisión intermedia también conocida como tolerancia o fortaleza,

expresa la variación dentro de un laboratorio, por ejemplo en diferentes días,

con diferentes analistas, o con equipos diferentes dentro del mismo

laboratorio. La repetibilidad se refiere a la utilización del procedimiento

analítico en un laboratorio durante un período corto por el mismo analista

con el mismo equipo.

La precisión de un procedimiento analítico se determina mediante el análisis

de un número suficiente de alícuotas de una muestra homogénea que

permita calcular estadísticamente estimaciones validas de la desviación

estándar o de la desviación estándar relativa (coeficiente de variación). (17)

La International Conference on Harmonisation (ICH) recomienda que se

evalúe la repetibilidad utilizando un mínimo de nueve determinaciones que

cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres

concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentración) o

usando un mínimo de seis determinaciones al 100% de la concentración de

prueba. (19)

1.5.4 Especificidad

Es la capacidad de evaluar de manera inequívoca el analito en presencia de

aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, tales como

impurezas, productos de degradación y componentes de la matriz.

26

En análisis cualitativos (pruebas de identificación) debe demostrarse la

capacidad de distinguir compuestos de estructura estrechamente

relacionada cuya presencia resulta probable.

En una valoración, la demostración de especificidad requiere evidencia de

que el procedimiento no resulta afectado por la presencia de excipientes o

impurezas.

Si no se dispone de estándares de impureza o de los productos de

degradación, puede demostrarse la especificidad comparando los resultados

de las pruebas de muestras que contengan impurezas o productos de

degradación con los de un segundo procedimiento bien caracterizado por

ejemplo un procedimiento farmacopeico u otro procedimiento validado.

Cuando se utilizan procedimientos cromatográficos, deberán presentarse

cromatogramas representativos para demostrar el grado de selectividad y los

picos deberán identificarse adecuadamente. (17)

1.5.5 Límite de Detección

El límite de detección es una característica de las pruebas de límite. Es la

cantidad mínima del analito que puede detectarse en una muestra, aunque

no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales

indicadas. Las pruebas de límite simplemente comprueban que la cantidad

del analito se encuentra por encima o por debajo de un nivel determinado. El

límite de detección se expresa habitualmente como concentración del

analito, por ejemplo, porcentaje, partes por billón, etc. (17)

1.5.6. Límite de Cuantificación

El límite de cuantificación es una característica de las valoraciones

cuantitativas de los compuestos que se encuentran en baja concentración en

27

la matriz de una muestra. Es la mínima cantidad de analito en una muestra

que se puede determinar con precisión y exactitud aceptables en las

condiciones experimentales indicadas. Se expresa habitualmente en

concentración de analito (por ejemplo, porcentaje, partes por billón) en la

muestra. (17)

1.5.7 Linealidad e Intervalo

La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad para obtener

resultados de prueba sean proporcionales ya sea directamente, o por medio

de una transformación matemática bien definida, a la concentración de

analito en muestras dentro de un intervalo dado. La linealidad se refiere a la

linealidad de la relación entre la concentración y la medida de valoración.

El intervalo de un procedimiento analítico es la amplitud entre las

concentraciones inferior y superior del analito en la cual se puede determinar

al analito con un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad

utilizando el procedimiento según se describe por escrito. El intervalo se

expresa normalmente en las mismas unidades que los resultados de la

prueba (por ejemplo, porcentaje, partes por billón) obtenidos mediante el

procedimiento analítico.

La linealidad debe establecerse en el intervalo completo del procedimiento

analítico. Debería establecerse inicialmente mediante examen visual de un

grafico de señales en función de la concentración de analito del contenido. Si

parece existir una relación lineal, los resultados de la prueba deberían

establecerse mediante métodos estadísticos adecuados, (por ejemplo

mediante el cálculo de una línea de regresión por el método de los

cuadrados mínimos).

28

El intervalo del procedimiento se valida verificando que el mismo proporciona

precisión, exactitud, y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que

contiene el analito en los extremos del intervalo, al igual que dentro del

intervalo. (17)

La International Conference on Harmonisation (ICH) recomienda que, para

establecer la linealidad, se utilicen normalmente un mínimo de cinco

concentraciones.

Para pruebas de Disolución se recomienda ± 20% por encima del intervalo

especificado (por ejemplo, si los criterios de aceptación (Q) de un producto

de liberación controlada cubren una región de 30%, después de 1 hora, y

hasta 90%, después de 24 horas, el intervalo validado sería de 10% a 110%

de la cantidad declarada). (19)

1.5.8 Robustez

La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad

para no ser afectado por variaciones pequeñas, aunque deliberadas, en los

parámetros del procedimiento indicado y provee una indicación de su aptitud

durante condiciones normales de uso. La robustez puede determinarse

durante la etapa de desarrollo del método analítico. (17).

1.6 Aptitud del Sistema

Las pruebas de aptitud del sistema son una parte integral de los métodos de

cromatografía líquida. Se emplean para verificar que el sistema

cromatográfico sea adecuado para el análisis que se pretende efectuar.

Las pruebas se basan en el concepto de que el equipo, los sistemas

electrónicos, las operaciones analíticas y las muestras analizadas

constituyen un sistema integral que se puede evaluar como tal. (17)

29

El método analítico disponible para la cuantificación del porcentaje disuelto

de Silimarina; se basa en la técnica de Cromatografía Líquida de Alta

Resolución cuya metodología analítica viene descrita por casa matriz; sin

embargo debido a la complejidad de la muestra por tratarse de un producto

natural, los largos tiempos de retención y la gran variabilidad observada en

la ejecución de dicho procedimiento que genera grandes desviaciones en la

precisión de los resultados, se hace necesario proponer una optimización y

validación del método analítico vigente para garantizar con evidencia

documentada que el mismo cumple con los requisitos para las aplicaciones

analíticas propuesta.

30

2.- OBJETIVOS

2.1- Objetivo general

Optimizar y validar un método analítico por cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) para la determinación del porcentaje disuelto de silimarina

presente en las cápsulas de un producto farmacéutico nacional.

2.2– Objetivos específicos

Optimizar la metodología por cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC), empleando la metodología de referencia.

Validar la metodología por cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC) optimizada.

Aplicar la metodología por cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC) optimizada para el ensayo de disolución de silimarina

cápsulas.

31

3.- METODOLOGIA

3.1 Materiales y métodos

3.1.1 Equipos

Para la optimización, validación y aplicación del método analítico se empleo

un Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC) marca Waters provisto

de un inyector automático, sistema de bomba cuaternario 2695, detector de

absorbancia U.V 2487 Dual, acoplado a una computadora HP con Software

Empower 2 para controlar el sistema cromatográfico y procesamiento de

datos y una impresora HP. (Cienvar, Caracas-Venezuela).

Para los ensayos de disolución se emplearon dos (2) equipos disolutores

marca Hanson Research, modelo SR8 Plus y Vision Classic 6 (Cienvar,

Caracas-Venezuela).

Para las pesadas de reactivo, muestras y patrones se utilizaron dos (2)

balanzas. Una balanza electrónica, marca Mettler Toledo, modelo xs205 con

un rango de trabajo de (0 – 220) g, con una resolución de 0,1mg y la otra

una balanza digital, marca Ohaus, modelo Adventurer A210 con un rango de

trabajo de (0 – 210) g, con una resolución de 0,1mg (Cenatec, Caracas-

Venezuela).

Para el ajuste del pH del medio de disolución y la fase móvil se empleo un

pH metro digital Metrohm modelo 827 Lab.

Para la disolución del patrón se utilizo el equipo Ultrasonido modelo

Bransonic 8510.

32

3.1.2 Patrones de Referencia

Se dispuso de cantidad suficiente del patrón principal de Silibinina A y B, sin

embargo de los patrones de Silicristina, Silidianina e Isosilibinina A y B se

dispuso de cantidades reducidas para fines de identificación.

Silibinina A y B Lote: 960212-4 / Fh, Potencia: 93,2%, expiración 15

Septiembre 2015 (MADAUS, Colonia – Alemania)

Silicristina Lote: 99022-2 / Fh, expiración 21 Marzo 2016 (MADAUS,

Colonia - Alemania)

Silidianina Lote: 840705-4 / Fh, expiración 21 Febrero 2016

(MADAUS, Colonia - Alemania)

Isosilibinina A y B Lote: 01.015-345-1 / Euromed, expiración 27

Noviembre 2012 (MADAUS, Colonia - Alemania)

3.1.3 Muestra de Silimarina Cápsula

Las muestras evaluadas fueron obtenidas directamente de las muestras de

retención de un Laboratorio Nacional Lote: 1111033 Fecha expiración:

Noviembre 2014.

3.1.4 Reactivos y Solventes

Grado HPLC: Metanol y Acetonitrilo (Merck), grado reactivo: Fosfato de

potasio monobásico (Merck), Hidróxido de sodio (Merck), Ácido fosfórico (J.

T. Baker) y agua grado HPLC.

3.1.5 Columna

Se utilizó una columna de fase reversa Lichrospher 100 RP18 (Merck), 25

cm de longitud, 4,0 mm de diámetro interno y tamaño de partícula 10μ.

33

3.1.6 Condiciones Cromatográficas

Inicialmente se evaluaron las condiciones cromatográficas descritas en la

metodología analítica proveniente de casa matriz, las fases móviles

utilizadas fueron: Fase A (FA): ácido fosfórico: metanol: agua purificada

(5:35:65 v/v) y Fase B (FB): ácido fosfórico: metanol: agua purificada

(5:50:50 v/v), filtradas previamente por vacío a través de una membrana

filtrante de 0,2 micras, se empleó un gradiente de elución binario: (0 – 35)

minutos 100%FA : 0%FB; (35 – 40) minutos 0%FA : 100%FB; (40 – 41)

minutos 100%FA : 0%FB; (41 – 60) minutos 100%FA : 0%FB, a un flujo de

0,8 mL/min, temperatura de 30ºC, longitud de onda de 288 nm y un volumen

de inyección de 50 µL. Para la optimización de la metodología analítica se

modificaron los siguientes parámetros: pH y concentración de la fase

acuosa, sistema de gradiente de elución, velocidad de flujo.

3.1.7 Preparación de las Soluciones de Estándar y Muestra

Durante la optimización y validación de la metodología analítica se utilizaron

cuatro (4) patrones. Las soluciones madres de los patrones se prepararon

por día de análisis, disolviendo cantidades conocidas en metanol. Las

concentraciones empleadas fueron las siguientes: Silibinina A y B 0,2

mg/mL; Silicristina 0,5 mg/mL; Silidianina 0,5 mg/mL; Isosilibinina 0,5 mg/mL.

Se tomó una alícuota de las soluciones madre de cada patrón y se llevo a

volumen con el solvente (Solución Acido fosfórico 0,05M pH 3,0 – Metanol)

(50:50), para obtener las siguientes concentraciones finales: Silibinina A y B

0,008 mg/mL; Silicristina 0,25 mg/mL; Silidianina 0,25 mg/mL; Isosilibinina

0,25 mg/mL. Los patrones fueron filtrados a través de filtro millipore 0,45µm

y luego inyectados.

34

En relación a las muestras esta fueron tomadas directamente del vaso del

disolutor y filtradas a través de papel de filtro Whatman N° 41 (8-12) µm.

3.2 Procedimiento

3.2.1 Optimización del Método Analítico

La optimización del método analítico para la determinación del porcentaje

disuelto de silimarina se realizó partiendo de la metodología analítica de

casa matriz la cual permite una separación y cuantificación de los

compuestos de interés en un tiempo de corrida aproximadamente de 60

minutos. Para establecer las condiciones cromatográficas óptimas se

realizaron diferentes ensayos variando el solvente y pH de la fase móvil,

velocidad de flujo y gradiente de elución.

3.2.1.1 Optimización de la Fase Móvil

Se realizaron los ensayos partiendo de la composición química de la fase

móvil (Fase móvil A y Fase móvil B) descrita por casa matriz; la diferencia

entre ambas fases móviles radica en la proporción de agua purificada y

metanol empleadas para su preparación, sin embargo la cantidad empleada

de ácido fosfórico es la misma para ambas fases móviles, de acuerdo a esto

se realizaron pruebas modificando la proporción de metanol en la fase móvil

B variando así la fuerza del solvente (k'), conservando las condiciones

cromatográficas de casa matriz en cuanto a velocidad de flujo, temperatura y

volumen de inyección.

A fin de establecer la proporción de metanol para obtener una buena

separación de los compuestos evaluados, se realizaron tres (3) variaciones

de la proporción de metanol (fase orgánica), de la siguiente manera:

N° 1(50%FA : 50%FO); N° 2 (55%FA : 45%FO) y N° 3 (60%FA : 40%FO),

35

las fases móviles empleadas fueron: Fase Acuosa (FA): 1000mL agua

purificada + 100mL ácido fosfórico y Fase Orgánica (FO): metanol. Se

empleó un sistema isocrático a un flujo de 0,8 mL/min.

Una vez evaluada la proporción aproximada de metanol se utilizaron tres (3)

sistemas de gradientes y modificaciones de la velocidad de flujo para

optimizar los resultados obtenidos. Las fases móviles empleadas fueron:

Fase Acuosa (FA): 1000mL agua purificada + 100mL ácido fosfórico y Fase

Orgánica (FO): metanol. Los sistemas de gradientes evaluados fueron los

siguientes: Sistema de gradiente N° 1: (0 – 20) minutos 60%FA : 40%FO;

(21 – 60) minutos 55%FA : 45%FO, a una velocidad de flujo de 0,8 mL/min.

Sistema de gradiente N° 2: (0 – 20) minutos 57%FA : 43%FO a un flujo de

0,5mL/min; (21 – 50) minutos 55%FA : 45%FO, a un flujo de 1,0 mL/min.

Sistema de gradiente N° 3: (0 – 20) minutos 57%FA : 43%FO a un flujo de

0,5mL/min; (21 – 50) minutos 52%FA : 48%FO, a un flujo de 0,8 mL/min.

Aún y cuando se realizaron las pruebas antes descritas con la fase acuosa

(1000 mL Agua Purificada + 100 mL Acido Fosfórico concentrado) la cual

tiene un pH de 0,81 y una concentración de 0,75 Molar; se hizo necesario

realizar ajustes en cuanto a la concentración de ácido fosfórico en la fase

acuosa y el pH debido a que comprometía la eficiencia de la columna, el

rango de pH recomendado por Merck para esta columna Lichrospher 100

RP18 10μ (4,0 x 250) mm es de (2 - 7,5) razón por la cual se preparó una

solución de Acido fosfórico 0,05 Molar cuyo pH sin ajustar es 1,72. Se

realizaron pruebas evaluando el pH de la Solución de Acido fosfórico 0,05M

a 3,0 ± 0,01 y pH 5,0 ± 0,01 empleando como Sistema de gradiente el N° 3

36

descrito anteriormente. El pH se ajusto con una Solución de Hidróxido de

Sodio 5N.

De acuerdo con lo descrito por Regnault (18) para cambios en la selectividad

(α) a veces es necesario sustituir un solvente orgánico por otro, en este caso

se sustituyo el solvente metanol por acetonitrilo ya que por sus propiedades

químicas tiene una selectividad diferente a la del metanol y de acuerdo con

la revisión bibliográfica existen trabajos en los que se emplea el solvente

acetonitrilo en la fase móvil.

Para determinar la proporción de acetonitrilo en la fase móvil equivalente a la

utilizada con el metanol, se realizo la conversión empleando el nomograma

de fuerza de solvente para HPLC (Figura 2).

Posterior al cambio del solvente de la fase orgánica de metanol a acetonitrilo

se realizaron las pruebas empleando dos sistemas de gradientes de elución,

los cuales se describen a continuación: Sistema de gradiente N° 4: (0 – 20)

minutos 66%A : 34%B flujo de 0,5mL/min; (21 – 40) minutos 62%A : 38%B,

flujo de 0,8 mL/min, usando como solvente A: Solución de ácido fosfórico

0,05 M pH 3,0; solvente B: Acetonitrilo. Sistema de gradiente N° 5: (0 – 20)

minutos 66%A : 17%B : 17%C flujo de 0,5mL/min; (21 – 40) minutos 62%A :

19%B : 19%C flujo de 0,8 mL/min, como solvente A: Solución de ácido

fosfórico 0,05 M pH 3,0; solvente B: Metanol; solvente C: Acetonitrilo.

Para la selección del sistema de gradiente de elución más adecuado se

consideró la resolución, número de platos teóricos y el tiempo de elución de

todos los componentes.

37

3.2.2 Validación

Una vez optimizada la metodología analítica se procedió a la validación para

confirmar y documentar que las características de desempeño del

procedimiento cumplen con los requisitos para las aplicaciones analíticas

previstas.

Las características de desempeño analítico consideradas en la validación

fueron las siguientes: especificidad, linealidad, límite de detección, límite de

cuantificación, precisión, precisión intermedia y exactitud.

3.2.2.1 Validación del método cromatográfico

Las condiciones experimentales de trabajo definitiva fueron las siguientes:

columna: Lichrospher 100 RP18 10μ (4,0 x 250) mm; volumen de inyección:

50 µL; temperatura: 30°C; presión para el flujo de 0,5 mL/min = 715psi y

para el flujo de 0,8 mLmin = 1078 psi; tiempo de corrida: 45 minutos; longitud

de onda: 288 nm; Gradiente de elución: (0 – 20) minutos 57%A : 43%B flujo

de 0,5mL/min; (21 – 40) minutos 52%A : 48%B, flujo de 0,8 mL/min; (41 –

45) minutos 57%A : 43%B, flujo de 0,5 mL/min, empleando como solvente A:

Solución de ácido fosfórico 0,05 M pH 3,0; solvente B: Metanol.

El proceso de validación se realizo según lo descrito en la USP 35 y el

Procedimiento Interno (Validación de Procedimientos Analíticos

GCV000046-1.0) del Laboratorio donde se realizo el presente trabajo.

3.2.2.1.1 Especificidad

La especificidad consistió en realizar inyecciones del Blanco A (Solución de

Buffer pH 7,5), Blanco B (Solución Acido fosfórico 0,05M pH 3,0 – Metanol)

(50:50), placebo (preparado a partir de todos los excipientes de la

formulación a excepción del principio activo), muestra y patrón para

38

identificar las respuesta de estos aplicando el procedimiento analítico y

respetando las concentraciones finales indicadas en el mismo.

El procedimiento analítico cumple con los requerimientos de especificidad si

es capaz de separar la sustancia de interés sin que exista interferencia de

otras sustancias presentes; y si además, los productos de degradación y/o

sustancias relacionadas y otros componentes no interfieren con la

cuantificación de la sustancia de interés. (17)

3.2.2.1.2. Adecuación del Sistema

Se realizaron cinco (5) inyecciones consecutivas del estándar al 100% de la

concentración de trabajo y según la USP 35 el valor del porcentaje de

Desviación Estándar Relativa (%RSD) de las cinco inyecciones debe ser

menor o igual a 2,0 %. (17)

3.2.2.1.3 Linealidad

Se realizaron mediciones por duplicado de seis (6) soluciones estándar de

Silibinina A y B al 40%, 60%, 80%, 100%, 120% y 140% de concentración en

base al valor declarado del producto terminado.

Se seleccionó una concentración estándar de trabajo de 0,008mg/mL de

silimarina la cual representa el 100%.

Para la solución estándar al 40% los valores de absorbancia se encontraron

alrededor de 0,006 UA y para un 140% alrededor de 0,018 UA por lo tanto

no se producen desviaciones de la ley Lambert Beer, adicionalmente se

cumple con el rango de trabajo adecuado para pruebas de disolución; según

lo establecido en la USP 35 se debe encontrar a ± 20% del valor

especificado (Q).

39

Se preparó una solución estándar madre de 0,194mg/mL con una potencia

de 93,2% y se disolvió con metanol en un ultrasonido por 20 minutos. Se

tomaron alícuotas de la solución estándar madre para obtener las siguientes

concentraciones: 0,00325mg/mL (40%); 0,00488mg/mL (60%); 0,00650

mg/mL (80%); 0,00813mg/mL (100%); 0,00975 mg/mL (120%); 0.0114

mg/mL (140%) y utilizando como solvente Solución Acido fosfórico 0,05M pH

3,0 – Metanol) (50:50).

Cada una de las inyecciones se inyecto por duplicado y la evaluación de la

linealidad del método se realizó por área de los picos cromatograficos en

estudio, mediante el cálculo de una línea de regresión por el método de los

cuadrados mínimos, reportando el coeficiente de correlación (r), la

intersección con el eje de ordenadas, la pendiente de la linea de regresión.

3.2.2.1.4 Precisión

La precisión de la metodología analítica se realizó en seis (6)

determinaciones de una muestra homogénea al 100 % de la concentración

de trabajo y fue realizada a nivel de repetibilidad y precisión intermedia.

La determinación de la precisión intermedia consistió en evaluar los

resultados obtenidos para el parámetro de precisión determinado en dos

series de experimentos realizados por dos analistas, en diferentes días y

equipo.

3.2.2.1.5 Exactitud

Se realizo sobre tres (3) preparaciones de muestras por triplicado a las

concentraciones aproximadas de 80%, 100% y 120% del analito en base al

valor declarado. Los resultados fueron evaluados mediante el Porcentaje de

analito recuperado por el método analítico.

40

3.2.2.1.6 Límite de detección y Límite de cuantificación

Aún y cuando la USP 35 y la International Conference on Harmonisation

(ICH) no incluyen la determinación de los parámetros de límite de detección

y límite de cuantificación para métodos de disolución, en este caso se

estimaron utilizando el enfoque basado en la desviación estándar de la

respuesta del blanco y la pendiente de la curva de calibración. (17)

3.2.2.1.6.1 Límite de detección

El límite de detección (LOD) puede ser expresado como: LOD: 3,3 σ / S

donde: σ es la desviación estándar de las respuestas, S es la pendiente de

la curva de calibración (Linealidad). La pendiente S se estimó de la curva de

calibración del compuesto de interés y la estimación de σ se baso en la

desviación estándar del blanco.

Para ello se realizo la medición de la magnitud de la respuesta del ruido de

fondo analítico analizando seis (6) determinaciones de muestras placebo y

calculando la desviación estándar de sus respuestas. (19)

3.2.2.1.6.2 Límite de Cuantificación

El límite de cuantificación (LOQ) puede ser expresado como: LOQ: 10 σ / S

donde: σ es la desviación estándar de las respuestas, S es la pendiente de

la curva de calibración (Linealidad).. La pendiente S se estimo de la curva de


desviación estándar del blanco.

Para ello se realizo la medición de la magnitud de la respuesta del ruido de

fondo analítico analizando seis (6) determinaciones de muestras placebo y

calculando la desviación estándar de sus respuestas. (19)

41

3.2.2.1.7 Fortaleza

Para la determinación de la fortaleza de la metodología analítica se

evaluaron los resultados obtenidos en la precisión intermedia ya que expresa

la variación dentro de un laboratorio y para ello, el método fue ejecutado por

dos analistas en días y equipos diferentes.

3.2.2.1.8 Validación del Método de Disolución

Las condiciones experimentales del ensayo de disolución para la Silimarina

cápsula, de acuerdo a lo establecido a la metodología analítica de casa

matriz, son las siguientes: medio de Disolución: Buffer fosfato pH 7,5;

volumen del medio: 900mL; temperatura: 37°C ± 0,5; aparato: N° 2 (paletas);

velocidad de agitación: 100 r.p.m; tiempo: (15 y 45) minutos; límite de

aceptación: A los 15 minutos: Mínimo 60% ; A los 45 minutos: Mínimo 80%

Preparación del medio de disolución (Solución de Buffer pH 7,5)

Para ello se pesaron 40,8 gramos de hidrógeno fosfato de potasio KH2PO4

y 9,12 g de Hidróxido de sodio se transfirieron a un beaker de 4000 mL, se

disolvieron con 2000 mL de agua purificada, se ajustó pH con una solución

de hidróxido de sodio 0,2N y se transfirió a una fiola de 6L, llevando a

volumen con agua purificada empleando para ello un cilindro graduado. Se

desgasificó al vacío por espacio de 15 minutos. pH inicial: 7,25 pH final:

7,53

Preparación de la Muestra

Para ello se agregaron 900mL del medio de disolución a cada vaso del

disolutor y se temperó a 37 °C ± 0,5 °C. Al alcanzar la temperatura, se

colocó una (1) cápsula, previamente pesada, en cada vaso y se comenzó la

agitación de las paletas. Al cabo de 15 minutos se tomó exactamente 5 mL

42

de muestra de cada vaso y se filtró por papel de filtro Whatman N° 41. Se

repuso en cada uno de los vasos los 5 mL de Buffer pH 7,5 a 37 °C ± 0,5 °C.

Se continuó la agitación hasta completar los 45 minutos, se tomó 5 mL de

muestra de cada vaso y se filtro por papel de filtro Whatman N° 41.

Las muestras tomadas se analizaron directamente sin diluir, inyectando

50µL y aplicando las condiciones de validación del método cromatográfico.

4.- RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 Desarrollo del método analítico

La optimización del método analítico para la cuantificación del porcentaje

disuelto de Silimarina cápsulas se realizó empleando como guía la

metodología analítica descrita por casa matriz. Se realizaron diferentes

pruebas en el sistema de gradiente, pH y concentración de la fase móvil y

velocidad de flujo.

La longitud de onda evaluada para el análisis fué 288nm ya que es la

indicada por casa matriz y de acuerdo con la revisión bibliográfica existen

trabajos en los que se emplea esta longitud de onda.

4.1.1 Optimización de la Fase Móvil

Para seleccionar la proporción de fase acuosa (Acido fosfórico + Agua) y

fase orgánica (metanol) requerida para optimizar la separación de los

compuestos de interés se estudiaron los cromatogramas del método

analítico de casa matriz (Ver Figura 3).

43

Patrón Silibinina A y B

Muestra de disolución

Figura 3. Cromatogramas del método analítico de casa matriz: patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

44

Se pensó en reducir la fuerza del solvente en la fase móvil, disminuyendo el

porcentaje de fase orgánica para incrementar el valor de k´ y por ende la

selectividad. Se evaluó bajo un sistema isocrático las siguientes

proporciones de metanol en la fase móvil: 50%; 45%; 40% inyectando la

solución de patrón de silibinina A y B y luego la muestra.

Las Figuras 4A; 4B; 4C muestran los cromatogramas obtenidos empleando

una velocidad de flujo de 0,8 mL/min. En el cromatograma del patrón de

silibinina A y B y de la muestra indicado en la Figura 4A, se observó que los

picos no están bien definidos, ni resueltos ya que los compuestos de interés

eluyen muy rápido debido a que existe poca interacción entre la fase

estacionaria y la muestra al trabajar con esta proporción de metanol (50%).

En los cromatogramas mostrados en la Figura 4B los resultados obtenidos

no fueron satisfactorios para el pico de silicristina ya que se observa la

presencia de un pico que afecta la integración del mismo y en el caso de los

cromatogramas mostrados en la Figura 4C aún y cuando se observa una

buena resolución de los picos silibinina A y silibinina B y de los picos

isoslibina A e isosilibina B el tiempo de elución de los compuestos aumenta

significativamente cuando se reduce la fuerza del solvente, sin embargo de

acuerdo con estas pruebas realizadas se puede deducir que el porcentaje de

metanol requerido para separar los picos de silicristina y silidianina oscila

entre (40 y 44)% y para la separación de los otros compuestos restantes la

proporción de metanol oscila entre (45 y 48)%.

45



Figura 4A. Cromatogramas del ensayo para la proporción 50% metanol en

la fase móvil: patrón silibinina A y B, y muestra de disolución.

46



Figura 4B. Cromatogramas del ensayo para la proporción 45% metanol en

la fase móvil: patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

47



Figura 4C. Cromatogramas del ensayo para la proporción 40% metanol en

la fase móvil: patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

48

Para mejorar la separación de los picos obtenidos en el ensayo de la

evaluación de la proporción de metanol bajo un sistema isocrático, se

cambió a un sistema de gradiente modificando las proporciones de las fases

móviles y velocidad de flujo. Las Figuras 5A; 5B; 5C; muestran los

cromatogramas obtenidos. En los cromatogramas del patrón de silibinina A y

B y de la muestra indicados en la Figura 5A empleando el Sistema de

gradiente N° 1, se observó que los picos de silibinina A y silibinina B tienen

buena resolución al igual que los picos de isosilibinina A e isosilibinina B, sin

embargo el pico de la silicristina no está bien definido ya que eluyen otros

picos que interfieren en su integración y los tiempos de retención de cada

uno de los compuestos se ve incrementado, por lo que se pensó en

aumentar la fuerza del solvente y disminuir la velocidad de flujo para el

tiempo de 0-20 minutos y de esta manera aumentar la resolución del pico de

la silicristina, para el tiempo de 21-50 minutos se mantuvo la proporción de

metanol a la empleada en la Figura 5A, sin embargo se aumentó la

velocidad de flujo a 1mL/min observando una disminución de los tiempos de

elución de los picos de silibinina A, silibinina B, isosilibinina A e isosilibinina

B (Ver Figura 5B). Adicionalmente; se estudió una fase móvil con los mismos

componentes empleados anteriormente pero esta vez aumentando la

proporción de metanol en el tiempo de 21-50 minutos y disminución de la

velocidad de flujo (0,8mL/min), la resolución y los tiempos de elución

obtenidos para los picos de silibinina A y silibinina B fue similar a la del

Sistema de gradiente N° 2, pero con un aumento en el número de platos

teóricos. (Ver Figura 5C).

49

Tabla II. Comparación de la resolución, tiempo de elución y número de

platos teóricos de los cromatogramas obtenidos de los sistemas de gradientes 1, 2 y 3.

Sistema de

Gradiente Resolución

Tiempo de

elución (min.)

Número de

platos teóricos

1 Silibinina A y B

= 1,6

Silibinina A= 31,00 Silibinina B= 33,55

Silibinina A=7275 Silibinina B=6985

2 Silibinina A y B =

1,5


Silibinina A= 8574 Silibinina B= 7965

3

Silibinina A y B =

1,5


Silibinina A=12029 Silibinina B=10866

La Tabla II compara la resolución, tiempo de elución y número de platos

teóricos de los cromatogramas obtenidos empleando los Sistemas de

gradientes 1, 2 y 3.

50



Figura 5A. Cromatogramas del ensayo evaluando Sistema de gradiente N°

1 patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

51



Figura 5B. Cromatogramas del ensayo evaluando Sistema de gradiente N°


52



Figura 5C. Cromatogramas del ensayo evaluando Sistema de gradiente N°


53

Para la selección del pH óptimo de la fase acuosa se evaluó el pH 3,0 ± 0,01

y pH 5,0 ± 0,01, empleando el Sistema de gradiente N° 3. En los

cromatogramas obtenidos del patrón de silibinina A y B y de la muestra para

el pH 5,0 mostrados en la Figura 6A, se observa una disminución en la

resolución del pico de la silicristina, situación que no se evidenció cuando se

realizó el ensayo a pH 3,0 en donde todos los picos están resueltos

mostrados en la Figura 6B. En los dos casos la resolución y los tiempos de

elución son similares, por lo tanto se consideró como pH óptimo 3,0 ± 0,01 y

de acuerdo con la bibliografía consultada el pH de trabajo reportado es de

2,6 para la mayoría de las fases acuosas para la determinación de la

silimarina.

54



Figura 6A. Cromatogramas evaluando pH 5,0 en la fase acuosa, empleando

Sistema gradiente N° 3: patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

55



Figura 6B. Cromatogramas evaluando pH 3,0 en la fase acuosa, empleando

Sistema gradiente N° 3: patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

56

Como inicialmente con el uso de metanol las separaciones de los

compuestos era aceptable empleando el Sistema de gradiente N° 3, se

realizaron pruebas sustituyendo el metanol por otro solvente orgánico

(acetonitrilo) de manera de evaluar cambios en la selectividad (α). Para

determinar la proporción de acetonitrilo en la fase móvil equivalente a la

utilizada con el metanol, se realizó la conversión empleando el nomograma

de fuerza de solvente para HPLC (Figura 2).

En los cromatogramas mostrados en la Figura 7A empleando el Sistema de

gradiente N° 4, se observó poca resolución de los compuestos y no se

evidenció la presencia de los picos de isosilibinina A e isosilibinina B.

En la Figura 7B se muestran los cromatogramas de patrón de silibinina A y

silibinina B y muestra de disolución empleando el Sistema de gradiente N° 5

donde se observó poca resolución para los picos de silicristina y silidianina

así como para los picos de isosilibinina A e isosilibinina B.

57



Figura 7A. Cromatogramas evaluando como fase orgánica acetonitrilo, empleando

el Sistema gradiente N° 4: patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

58



Figura 7B. Cromatogramas evaluando como fase orgánica acetonitrilo y metanol, empleando el Sistema gradiente N° 5: patrón silibinina A y B y muestra de disolución.

59

Después de evaluar los resultados obtenidos tanto para el patrón como para

la muestra, se seleccionó el Sistema de gradiente N° 3 como el óptimo

ajustando el pH de la fase acuosa a 3,0 ± 0,1, ya que proporciona un mayor

número de platos teóricos y menor tiempo de elución de los compuestos.

4.2 Validación

4.2.1 Especificidad

De acuerdo a los cromatogramas obtenidos (Figura 8A, 8B), los tiempos de

elución para los picos de Silicristina, Silidianina, Isosilibinina A y B, Silibinina

A y B (patrones y muestra) se describen en la Tabla III.

Tabla III. Tiempo de retención de los patrones y la muestra de Silimarina

cápsulas, Especificidad. Sustancia de

Interés

Tiempo de elución del

Patrón (min.)

Tiempo de elución

de la Muestra (min.)

Silicristina 14,03 14,40

Silidianina 17,05 17,41

Isosilibinina A y B 33,64 (A)* / 34,90 (B)* 33,99 (A)* / 35,38 (B)*

Silibinina A y B 28,12 (A)* / 29,66 (B)* 28,34(A)* / 29,96 (B)*

*A: Silibinina A *B: Silibinina B

Para determinar que no hay interferencia de los reactivos y excipientes de la

formulación, se inyectó un blanco A (Solución de Buffer pH 7,5), un blanco B

(Solución Acido fosfórico 0,05M pH 3,0 – Metanol (50:50) y placebo

(contiene todos los excipientes a excepción del principio activo). La Figura

8C muestra los cromatogramas obtenidos, no se evidenció ningún pico

cromatográfico que pudiera interferir en la cuantificación de la silimarina.

En base a los resultados obtenidos se puede decir que la metodología

analítica cumple con los requerimientos de especificidad, ya que los

60

resultados demuestran que es capaz de separar las sustancias de interés sin

que exista interferencia de otras sustancias presentes o productos de

degradación.

Patrón de Silicristina

Patrón de Silidianina

. Patrón de Isosilibinina A y B

Figura 8A. Cromatogramas del ensayo de especificidad: patrón silicristina, patrón silidianina, patrón isosilibinina A y B.

61

Patrón de Silibinina A y B


Figura 8B. Cromatogramas del ensayo de especificidad: patrón silibinina A y B, muestra de disolución.

62

Blanco A (Solución de Buffer pH 7,5)

Blanco B (Solución Acido fosfórico 0,05M pH 3,0 – Metanol (50:50)

Placebo

Figura 8C. Cromatogramas del ensayo de especificidad: blanco A (Solución de Buffer pH 7,5), blanco B (Solución Acido fosfórico 0,05M pH 3,0 – Metanol (50:50) y placebo.

63

4.2.2 Adecuación del Sistema

De las cinco (5) inyecciones consecutivas realizadas del estándar al 100%

de la concentración de trabajo de Silibinina A y B, se calcularon los

parámetros cromatográficos que determinan la adecuación del sistema.

Tabla IV. Resumen de los parámetros cromatográficos

Estándar Área

Silibinina A

Área

Silibinina B Área Total

1 554385 574853 1129238

2 553080 573936 1127016

3 554283 574693 1128976

4 554412 575289 1129701

5 555344 576578 1131922

Promedio 554301 575070 1129371

%RSD 0,1 0,2

El valor del porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD) de las cinco

inyecciones por área para la silibinina A fue de 0,1% y la silibinina B fue de

0,2% cumpliendo con el criterio de aceptación establecido por la USP 35

menor o igual a 2%.

Silibinina A Silibinina B

Factor de Capacidad (k’) 29,6 29,2

Número Platos Teóricos (N) 9179 7806

Factor de Cola (T) 1,2 1,5

Resolución de los picos (R) 1,2

64

En relación a los parámetros cromatográficos se tiene que el número de

platos teóricos es mayor a 2000 indicando que la columna es eficiente, ya

que a mayor número de platos teóricos aumenta el número de equilibrios

presentes en la columna, por lo tanto existe una mayor posibilidad de lograr

la separación de los compuestos.

El factor de capacidad (k') es un valor práctico que nos expresa el grado de

interacción del compuesto con la columna, el cual esta relacionado con el

coeficiente de distribución entre ambas fases, el valor de factor de capacidad

obtenido tiene valores ideales que van en un rango entre 1 y 20, para que la

resolución no tenga un excesivo tiempo de análisis. Sin embargo, en este

trabajo el valor obtenido de factor de capacidad es > 20 y existe una buena

separación de los picos de interés con el frente del solvente y esto favorece

la especificidad de la metodología analítica.

El grado de simetría de los picos, es importante ya que picos asimétricos

pueden presentar problemas con la integración, por lo que su medición es

relevante, puesto que puede llevar de acuerdo a su magnitud a errores

considerables de cuantificación. (21).

Se obtuvo un valor de 1,2 para la silibinina A y 1,5 para la silibinina B, para

un pico simétrico el factor de asimetría es la unidad y este se incrementa a

medida que la cola se hace más pronunciada, como norma general el factor

de asimetría debería encontrarse entre 0.8 y 1,5, aunque pueden aceptarse

valores de hasta 2,0 (20).

En este caso el valor obtenido se encuentra dentro del rango establecido

por lo que se considera aceptable.

65

De acuerdo con los valores obtenidos se puede decir que el sistema es apto

para la determinación del porcentaje disuelto de silimarina cápsulas.

4.2.3 Linealidad

Se prepararon seis (6) concentraciones del patrón de silibinina A y B al

(40%, 60%, 80%, 100%, 120% y 140%), cada concentración fue inyectada

por duplicado en el equipo HPLC y el procesamiento de los datos se hizo por

áreas. Los resultados se exponen a continuación.

Tabla V. Resultados linealidad y rango

Estándar Concentración

(mg/mL) Área

Silibinina A Área

Silibinina B Área Total

40%-1 0,00325082 220371 229346 449717

40%-2 0,00325082 220701 229536 450237

60%-1 0,00487622 335677 351865 687542

60%-2 0,00487622 336375 352266 688641

80%-1 0,00650163 440478 456668 897146

80%-2 0,00650163 439762 456283 896045

100%-1 0,00812704 565627 586101 1151728

100%-2 0,00812704 565377 585121 1150498

120%-1 0,00975246 658050 684006 1342056

120%-2 0,00975246 656315 681786 1338101

140%-1 0,01137788 773987 801234 1575221

140%-2 0,01137788 775780 805393 1581173

Factor de Correlación (r) 0,9995

Factor de Determinación (r2) 0,999

66

Gráfico 1. Linealidad (área vs. concentración mg/mL)

Se obtuvo que el método es lineal para el rango evaluado (0,003 – 0,011)

mg/mL con un factor de correlación mayor a 0,99 y un coeficiente de

determinación mayor a 0,98; lo que indica la relación lineal existente entre la

concentración y la respuesta emitida por el equipo, por lo que cumple con el

criterio de aceptación para el parámetro de linealidad ya que el valor de (r)

debe ser mayor que 0,990 y el valor de (r2) debe ser mayor o igual a 0,98

(21).

4.2.4 Precisión

La precisión se realizó bajo condiciones de repetibilidad y precisión

intermedia, el procesamiento de la data se hizo por áreas. Para la

repetibilidad fue evaluado el coeficiente de variación del analista 1 y para la

precisión intermedia fueron comparados los valores obtenidos entre ambos

analistas.

67

Tabla VI. Datos Analista 1 y Analista 2 para calcular el porcentaje disuelto de

silimarina cápsulas.

Peso Patrón (Analista 1) 21,8 mg

Área Promedio Patrón Silibinina A y B (Analista 1) 1103363

Peso Patrón (Analista 2) 21,7 mg

Área Promedio Patrón Silibinina A y B (Analista 2) 1118456

Potencia Patrón 93,2 %

Factor dilución Muestra 900

Factor dilución Patrón 2500

Contenido Declarado 108,2 mg/capsula

Peso Promedio Contenido Neto 361,93 mg

Peso cápsula vacía 75,4 mg

Fórmula para el cálculo del porcentaje disuelto de Silimarina:

% Disuelto

(S1 + S2 + S3 + S4 + I5 + I6) x Peso Std x Potencia de Std x FMx x P. Prom Cont. Neto x 100

(S7 + S8) x FStd x Peso Cont.Cap. x Cont. Declarado

68

Donde:

Mx : Muestra

Std : Estándar

F : Factor de dilución

S1: Área del pico del isómero Silicristina en la muestra

S2: Área del pico del isómero Silidianina en la muestra

S3: Área del pico del isómero Silibinina A en la muestra

S4: Área del pico del isómero Silibinina B en la muestra

I5: Área del pico del isómero Isosilibinina A en la muestra

I6: Área del pico del isómero Isosilibinina B en la muestra

S7: Área del pico del isómero Silibinina A en el estándar

S8: Área del pico del isómero Silibinina B en el estándar

Cont. Declarado: Contenido declarado (mg/cap.)

P. Prom Cont. Neto: Peso Promedio Contenido neto de las cápsulas

Peso Cont.Cáp: Peso contenido de la cápsula

Límite de Aceptación: A los 15 minutos: Mínimo 60% (23)

A los 45 minutos: Mínimo 80% (23)

69

La tabla VII presenta las áreas obtenidas a los 15 y 45 minutos del tiempo de

disolución para las seis (6) inyecciones de la muestra y las tablas VIII y IX

presentan los resultados obtenidos por el analista 1 para la repetibilidad.

Tabla VII. Áreas de la muestra a los 15 y 45 minutos (Analista 1)

Muestra

Área Silibinina

A

Área Silibinina

B

Área Silicristina

Área Silidianina

Área Isosilibinina

A

Área Isosilibinina

B

Dis-1-15min 1849643 3124146 4543181 2617502 673440 172258

Dis-2-15min 2055483 3472665 5033150 2863432 770391 213924

Dis-3-15min 1900534 3208270 4620862 2602988 712653 203480

Dis-4-15min 2090062 3535610 5130157 2911524 781413 223567

Dis-5-15min 2044427 3452268 5026859 2794682 765399 219966

Dis-6-15min 2001989 3390539 4936085 2709975 750396 220850

Dis-1-45min 2382213 4036490 6009416 3150014 889646 258691

Dis-2-45min 2541125 4307427 6516122 3355341 945499 278817

Dis-3-45min 2317771 3936005 5838752 3109030 865259 246776

Dis-4-45min 2483847 4212656 6337169 3311978 924655 269492

Dis-5-45min 2443567 4152144 6232711 3262125 910595 256585

Dis-6-45min 2325121 3960587 5904241 3064910 870985 249328

70

Tabla VIII. Resultados de repetibilidad a los 15 minutos (Analista 1)

Muestra

Sumatoria de todos los picos

(15 minutos)

Peso cápsula

llena (mg)

Peso contenido neto (mg)

% Disuelto (15 minutos)

Dis-1-15min 12980170 437,7 362,3 79

Dis-2-15min 14409045 467,6 392,2 81

Dis-3-15min 13248787 427,7 352,3 83

Dis-4-15min 14672333 464,1 388,7 84

Dis-5-15min 14303601 461,2 385,8 82

Dis-6-15min 14009834 435,0 359,6 86

Promedio 83

%RSD 2,8

Tabla IX. Resultados de repetibilidad a los 45 minutos (Analista 1)

Muestra


(45 minutos)

Peso cápsula

llena (mg)

Peso Contenido Neto (mg)


Dis-1-45min 16726470 437,7 362,3 102

Dis-2-45min 17944331 467,6 392,2 101

Dis-3-45min 16313593 427,7 352,3 103

Dis-4-45min 17539797 464,1 388,7 100

Dis-5-45min 17257727 461,2 385,8 99

Dis-6-45min 16375172 435,0 359,6 101

Promedio 101

%RSD 1,3

El valor del Porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD) de los

resultados de las seis (6) determinaciones a los 15 minutos fue de 2,8% y a

los 45 minutos fue de 1,3% demostrando que el método analítico cumple con

el parámetro de repetibilidad, ya que el (%RSD) debe ser menor o igual que

71

10% (20) de acuerdo con los criterios establecidos en el laboratorio donde se

realizó el estudio.

La tabla X presenta las áreas obtenidas a los 15 y 45 minutos del tiempo de

disolución para las seis (6) inyecciones de la muestra para el analista 2 y las

tablas XI y XII presentan los resultados obtenidos por el analista 2.

Tabla X. Áreas de la muestra a los 15 y 45 minutos (Analista 2)

Muestra

Área Silibinina

A

Área Silibinina

B

Área Silicristina

Área Silidianina

Área Isosilibinina

A

Área Isosilibinina

B

Dis-1-15min 2253858 3679986 5365839 2870899 842098 191478

Dis-2-15min 2271021 3724951 5422005 2898519 849825 197847

Dis-3-15min 2331758 3839023 5584284 2952147 878668 201109

Dis-4-15min 2304805 3789590 5454796 2981544 864104 204213

Dis-5-15min 2280335 3758004 5540294 2853269 855740 200934

Dis-6-15min 2343215 3876582 5765684 2925915 876049 208370

Dis-1-45min 2747972 4537201 6940584 3293135 1024879 240054

Dis-2-45min 2666734 4424748 6735178 3183780 997907 236573

Dis-3-45min 2695737 4479181 6858875 3203678 1010098 237732

Dis-4-45min 2628841 4371622 6679133 3114987 981763 232726

Dis-5-45min 2620212 4357411 6707205 3075554 977049 236163

Dis-6-45min 2649090 4417734 6856795 3077870 988158 240129

72

Tabla XI. Resultados ensayo de disolución a los 15 minutos (Analista 2)

Muestra


(15 minutos)

Peso cápsula

llena (mg)

Peso contenido neto (mg)


Dis-1-15min 15204158 467,6 392,2 84

Dis-2-15min 15364168 456,1 380,7 88

Dis-3-15min 15786989 460,1 384,7 89

Dis-4-15min 15599052 449,1 373,7 91

Dis-5-15min 15488576 452,2 376,8 90

Dis-6-15min 15995815 456,6 381,2 91

Promedio 89

%RSD 2,8

Tabla XII. Resultados ensayo de disolución a los 45 minutos (Analista 2)

Muestra


(45 minutos)

Peso cápsula

llena (mg)

Peso Contenido Neto (mg)


Dis-1-45min 18783825 467,6 392,2 104

Dis-2-45min 18244920 456,1 380,7 104

Dis-3-45min 18485301 460,1 384,7 105

Dis-4-45min 18009072 449,1 373,7 105

Dis-5-45min 17973594 452,2 376,8 104

Dis-6-45min 18229776 456,6 381,2 104

Promedio 104

%RSD 0,4

Para la determinación de la precisión intermedia, los análisis fueron

realizados por dos analistas, en diferentes días y equipo, bajo las mismas

condiciones cromatográficas descritas en el punto 3.2.2.1. El valor del

porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD) de los resultados de las

73

doce (12) determinaciones (Analista 1 y 2) a los 15 minutos fue de 4,8% y a

los 45 minutos fue de 2,0 % demostrando que el método analítico cumple

con el parámetro de precisión intermedia, ya que el (%RSD) debe ser menor

o igual que 15% (20) de acuerdo con los criterios establecidos en el

laboratorio donde se realizó el estudio.

4.2.5 Exactitud

La exactitud demuestra la proximidad entre los resultados obtenidos de una

prueba y el valor verdadero, el ensayo se realizó sobre tres (3)

preparaciones de muestras por triplicado a las concentraciones aproximadas

de 80%, 100% y 120% del analito en base al valor declarado, para ello se

realizaron pesadas de la muestra a las concentraciones antes descritas.

Adicionalmente se realizó un ensayo de disolución de referencia para el

cálculo de exactitud, sobre seis (6) determinaciones a la concentración al

100% pesando cada muestra sin cápsula y añadiendo cada cápsula vacía,

aplicando las condiciones descritas en el punto 3.2.2.1.8.

Fórmula para el cálculo del porcentaje de recuperación de Silimarina:

% Recuperación = % disuelto Muestra_________ x 100

% disuelto determinado de referencia para la exactitud

La tabla XIII presenta las áreas obtenidas a los15 y 45 minutos del tiempo de

disolución para las seis (6) inyecciones de la muestra y las tablas XIV y XV

presentan los resultados obtenidos para el ensayo de disolución para fines

de cálculo para la exactitud.

74

Tabla XIII. Áreas de la muestra de referencia para la exactitud a los 15 y 45 minutos

Muestra

Área Silibinina

A

Área Silibinina

B

Área Silicristina

Área Silidianina

Área Isosilibinina

A

Área Isosilibinina

B

Dis-1-15min 2041188 3554278 4136321 2255834 882842 266829

Dis-2-15min 2142286 3721794 4370968 2294589 920267 279128

Dis-3-15min 2115684 3675107 4265323 2290878 912353 277278

Dis-4-15min 2140736 3738726 4321870 2322641 923708 280640

Dis-5-15min 2153072 3750982 4160773 2530326 923005 282090

Dis-6-15min 2140273 3737032 4350775 2266199 922524 276515

Dis-1-45min 2351100 4135179 4768990 2478895 1015000 304892

Dis-2-45min 2383705 4162030 4664606 2653975 1021408 311170

Dis-3-45min 2309770 4035192 4841209 2331516 992393 298991

Dis-4-45min 2329826 4070488 4869995 2377674 999238 297900

Dis-5-45min 2326052 4068059 4456266 2672986 1001984 302912

Dis-6-45min 2317901 4066557 4862147 2349871 999066 296597

Tabla XIV. Resultados del ensayo de disolución de referencia para la exactitud a los 15 minutos

Muestra


(15 minutos)

Peso Muestra

(mg)


Dis-1-15min 13137292 359,6 80

Dis-2-15min 13729032 360,6 83

Dis-3-15min 13536623 359,9 82

Dis-4-15min 13728321 360,3 83

Dis-5-15min 13800248 359,1 84

Dis-6-15min 13693318 360,0 83

Promedio 82

%RSD 1,8

75

Tabla XV. Resultados del ensayo de disolución de referencia para la exactitud a los 45 minutos

Muestra


(45 minutos)

Peso Muestra

(mg)


Dis-1-45min 15054056 359,6 91

Dis-2-45min 15196894 360,6 92

Dis-3-45min 14809071 359,9 90

Dis-4-45min 14945121 360,3 90

Dis-5-45min 14828259 359,1 90

Dis-6-45min 14892139 360,0 90

Promedio 90

%RSD 0,9

76

La tabla XVI presenta las áreas obtenidas a los 15 y 45 minutos del tiempo

de disolución para las nueve (9) determinaciones y las tablas XVII y XVIII

presenta los resultados de exactitud para cada concentración.

Tabla XVI. Áreas de la muestra a los 15 y 45 minutos.

Muestra

Área Silibinina

A

Área Silibinina

B

Área Silicristina

Área Silidianina

Área Isosilibinina

A

Área Isosilibinina

B

80%-1-15min 1692216 2825288 3381336 1782343 723981 221367

80%-2-15min 1667363 2780155 3483051 1647485 712446 222617

80%-3-15min 1744876 2934161 3724787 1670282 747789 227078

100%-1-15min 2032620 3399037 4376006 1971560 870085 269727

100%-2-15min 1916287 3185188 4091548 1877460 818969 259959

100%-3-15min 2179771 3653548 4843713 2079949 933562 291763

120%-1-15min 2654453 4441258 5934900 2242363 1138397 367568

120%-2-15min 2594784 4361868 5755895 2186216 1102657 346862

120%-3-15min 1874175 3156899 4139894 1777648 801700 254002

80%-1-45min 1853918 3134763 4110759 1722753 793212 250553

80%-2-45min 1858955 3136116 4071339 1793919 796157 255268

80%-3-45min 2213900 3735851 4942395 2093704 954500 310901

100%-1-45min 2236028 3783633 4937914 2134449 965979 309353

100%-2-45min 2276062 3838087 5093130 2107088 981311 322681

100%-3-45min 2819903 4779539 6427171 2320808 1212615 395609

120%-1-45min 2848047 4825038 6507302 2325007 1227079 402469

120%-2-45min 2685919 4522543 6092718 2196721 1154827 379786

120%-3-45min 1874175 3156899 4139894 1777648 801700 254002

77

Tabla XVII. Resultados de Exactitud a los 15 minutos.

Muestra


(15 minutos) Peso (mg)


% Recuperación

80%-1-15min 10626531 290,1 80 97

80%-2-15min 10513117 289,2 79 97

80%-3-15min 11048973 289,2 83 101

100%-1-15min 12919035 358,7 78 96

100%-2-15min 12149411 356,4 74 91

100%-3-15min 13982306 358,7 85 104

120%-1-15min 16778939 432,9 84 103

120%-2-15min 16348282 433,8 82 100

120%-3-15min 16695649 432,4 84 103

Promedio 99

Tabla XVIII. Resultados de Exactitud a los 45 minutos.

Muestra


(45 minutos) Peso (mg)


% Recuperación

80%-1-45min 12004318 290,1 90 100

80%-2-45min 11865958 289,2 89 99

80%-3-45min 11911754 289,2 90 100

100%-1-45min 14251251 358,7 87 96

100%-2-45min 14367356 356,4 88 98

100%-3-45min 14618359 358,7 89 99

120%-1-45min 17955645 432,9 90 100

120%-2-45min 18134942 433,8 91 101

120%-3-45min 17032514 432,4 86 95

Promedio 99

78

El valor mínimo de porcentaje de recuperación obtenido a los 15 minutos fue

91% y el máximo de 104% y para los 45 minutos el valor mínimo de

porcentaje de recuperación fue de 95% y el valor máximo de 101%, por lo

que se considera que el método cumple con el parámetro de exactitud ya

que los valores individuales de porcentaje del analito recuperado para las

diferentes concentraciones están dentro del criterio establecido por el

laboratorio donde se realizo el presente estudio (90 – 110) % (20)

Tabla XIX. Resultados de los Límites de Confianza a los 15 minutos

Muestra

Valor promedio

(% disuelto a los 15 min)

Desviación Estándar

Valor de Referencia (% disuelto) 15 minutos

Límite de confianza

p= 0,05 (95%)


p= 0,01 (99%)

80% 81 2,08

82

Límite superior 86,2

Límite Inferior 75,8



100% 79 5,57





120% 83 1,15





Tabla XX. Resultados de los Límites de Confianza a los 45 minutos

Muestra

Valor promedio

(% disuelto a los 45 min)

Desviación Estándar

Valor de Referencia (% disuelto) 45 minutos


p= 0,05 (95%)


p= 0,01 (99%)

80% 90 0,58

90





100% 88 1,00





120% 89 2,65





79

En las tablas XIX y XX se observan los límites de confianza, el cual indica

que los valores de la muestra para cada una de las concentraciones

evaluadas se encuentran en los intervalos descritos y con un nivel de

confianza del 95% y 99%.

4.2.6 Límite de Detección

El límite de detección (LOD) se determinó mediante la ecuación

LOD: 3,3 σ / S (19), para ello la pendiente S se estimo de la curva de


desviación estándar del blanco. Se realizó la medición de la magnitud de la

respuesta del ruido de fondo analítico analizando seis (6) determinaciones

de muestras placebo y calculando la desviación estándar de sus respuestas.

La tabla XXI presenta la magnitud de la respuesta del ruido de fondo

analítico analizado en seis (6) determinaciones de muestras placebo.

Tabla XXI. Respuesta del ruido de fondo analítico Placebo

Peso Placebo

(mg) Respuesta del ruido

fondo analítico

1 361,3 0,01058

2 359,1 0,00620

3 361,6 0,00503

4 362,7 0,00418

5 361,2 0,00364

6 362,0 0,00332

Promedio 0,005492

Desv. Std 0,002701

El valor obtenido de límite de detección (LOD) fue de 6,46 x 10 -11 mg/mL

80

4.2.7 Límite de Cuantificación

El límite de cuantificación (LOQ) se determinó mediante la ecuación

LOQ: 10 σ / S (19), para ello la pendiente S se estimo de la curva de


desviación estándar del blanco. Para ello se realizó la medición de la

magnitud de la respuesta del ruido de fondo analítico analizando seis (6)

determinaciones de muestras placebo y calculando la desviación estándar

de sus respuestas.

En la tabla XXI se presenta la magnitud de la respuesta del ruido de fondo

analítico analizado en seis (6) determinaciones de muestras placebo.

El valor obtenido de límite de cuantificación (LOQ) fue de 1,95 x 10 -10

mg/mL

4.2.8 Fortaleza

La fortaleza del método analítico optimizado quedo demostrada al ejecutar la

validación bajo diferentes condiciones dentro de un mismo laboratorio, en

este caso diferentes analistas, diferentes días y equipo, obteniendo

resultados reproducibles para los parámetros evaluados.

81

5.- CONCLUSIONES

El presente trabajo representa una mejora en los tiempos de análisis y

precisión de los resultados analíticos de la cuantificación del producto

Silimarina, con respecto al procedimiento objeto de estudio.

La optimización de esta metodología ofrece ventajas en comparación a la

empleada anteriormente, ya que se logró reducir el tiempo de corrida de 60

minutos a 45 minutos.

Los resultados obtenidos en la validación de la metodología analítica están

conformes con los criterios de aceptación establecidos y por lo tanto reúne

las capacidades de desempeño necesarios para cumplir con la aplicación

analítica propuesta para la cual fue diseñado.

6.- RECOMENDACIONES

Se recomienda que el método analítico optimizado se aplique para los

análisis de rutina del ensayo de disolución de silimarina cápsulas.

Se sugiere evaluar una columna con un tamaño de partícula más pequeño

(5µ) empleando las condiciones cromatograficas optimizadas, esto con la

finalidad de permitir separaciones más rápidas en comparación con

columnas con tamaño de partículas más grandes (10µ).

Así mismo se recomienda continuar evaluando la separación de este tipo de

compuestos con sistemas analíticos novedosos como la Cromatografía

Líquida de Ultra Rendimiento (UPLC), así como el uso de columnas

cromatográficas quirales que pudieran mejorar los resultados presentados

en este trabajo.

82

7. - BIBLIOGRAFIA

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