OPCIÓN X MEMORIA DE RESIDENCIA PROFESIONAL
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OPCIÓN X MEMORIA DE RESIDENCIA PROFESIONAL Determinación de Proteasas en el Germinado de Trigo que Rompan Epítopes de las Prolaminas en la Harina de Trigo Que para obtener el título de: INGENIERO BIOQUÍMICO Presenta: Mendoza Llerenas Edgar Omar INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COLIMA LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE COLIMA Tecomán, Colima, 08 de Septiembre del 2008. 1
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OPCIÓN X
MEMORIA DE RESIDENCIA PROFESIONAL
Determinación de Proteasas en el Germinado de Trigo que Rompan Epítopes de las
Prolaminas en la Harina de Trigo
Que para obtener el título de:
INGENIERO BIOQUÍMICO
Presenta:
Mendoza Llerenas Edgar Omar
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COLIMA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE COLIMA
Tecomán, Colima, 08 de Septiembre del 2008.
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Instituto Tecnológico de Colima y
Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima.
Laboratorio de Biotecnología
Asesores externos:
Dr. Peña Beltrán Elpidio,
Profesor investigador- Asociado “C”, de la Facultad de Ciencias Biológicas y
Agropecuarias.
Universidad de Colima.
Dr. Osuna Castro Juan.
Profesor Investigador- SNI nivel I, de la Facultad de Ciencias Biológicas y
Agropecuarias
Universidad de Colima.
Asesor interno:
Química Valencia Macías Ana Rosa
Profesora del Instituto Tecnológico de Colima
Departamento de Ingeniería Bioquímica
Tecomán, Colima 2008.
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Pagina
1.- Introducción 6 2.- Justificación 8 3.- Objetivos 9 4.- Caracterización del área en que participó 10 5.- Problemas a resolver, jerarquizados 10 6.- Alcances y limitaciones 11 7.- Fundamento teórico 12 7.1.- Proteínas del trigo 12 7.1.1.- Gliadinas y gluteninas 12 7.1.2.- Albúminas y globulinas 14 7.1.3.- Proteínas involucradas en el mecanismo de defensa del trigo. 14 7.2.- Germinado de semillas de los cereales 16 7.3.- Enzimas proteolíticas en el trigo 17 7.3.1.- Clasificación de enzimas proteolíticas 17 7.3.2.- Proteasas en el germinado de trigo 19 7.4.- Enfermedad de los celiacos por sensibilidad al gluten 20 7.4.1.- Epítopes 20 8.- Procedimiento y descripción de las actividades realizadas 22 8.1.- Materia prima 22 8.1.1.- Germinado de las semillas de trigo 22 8.2.- Preparación de extractos enzimáticos 22 8.3.- Extracción diferencial de proteínas 23
8.4.- Extracción de proteínas totales 23 8.4.1.- Diálisis 24
8.4.2.- Ultrafiltración 25 8.4.3.- Liofilización 25
8.5.- Actividad proteolítica en solución 26 8.5.1.- Cuantificación de proteínas 26 8.5.2.- Identificación de actividad con gelatina 29 8.5.3.- Identificación de actividad con azogelatina 30 8.5.4.- Identificación de actividad con ninhidrina 31
8.6.- Identificación de las proteínas en SDS-PAGE desnaturalizante 33 8.7.- Identificación del patrón diferencial con zimogramas 35 8.7.1.- Determinación de actividad con zimogramas 1-D 35 8.7.2 - Determinación de actividad con zimogramas 2-D 38 9.- Resultados, fotos, gráficas y discusión 41 9.1.- Selección del germinado de trigo 41 9.2.- Análisis de actividad enzimática en solución 42 9.2.1.- Análisis de actividad con gelatina 42
9.2.2.- Análisis de actividad con azogelatina 43 9.2.3.- Análisis de actividad con ninhidrina 45 9.3.- Análisis de actividad con SDS PAGE desnaturalizante 46 9.4.- Análisis de actividad con zimogramas 1-D y 2-D 48
10.- Conclusiones y recomendaciones 52
Referencias 54
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1.- INTRODUCCIÓN
El trigo es uno de los tres cultivos más importantes en el mundo, junto con el
maíz y el arroz. El trigo posee la habilidad de dar un alto rendimiento de
producción en un amplio rango de condiciones geográficas. Según el informe de
abril de Perspectivas de cosechas y situación alimentaría elaborado por la FAO, la
producción mundial de cereales en 2007 alcanzó una cifra récord de
2 082 millones de toneladas, en el cual el trigo participó con 626 millones de
toneladas. México es el principal país productor de trigo en América central y el
Caribe. Uno de los componentes más importantes del trigo es el gluten, el cual le
proporciona propiedades únicas a la masa de harina de éste grano, por lo que es
procesado en una gran variedad de productos, principalmente alimenticios. Es por
ello que las proteínas del gluten han sido ampliamente estudiadas desde hace
aproximadamente 250 años. La determinación de la estructura y composición del
gluten son la base para el mejoramiento de diferentes productos, ya que la calidad
final depende de estas características (Peña et. al. 2005; Wallace et. al. 2003). Las
proteínas del grano determinan las propiedades de la masa, en particular las
proteínas de reserva, que conforman el gluten, el cual forma una red elástica en la
masa, con diferentes características reológicas, que están en función del tipo y
cantidad de éstas (Shewry, et. al., 2002). Otros cereales que también contienen
gluten son la cebada y el centeno. El gluten se puede obtener de la harina de trigo
mediante un lavado suave con agua, la masa cohesiva resultante se compone de
alrededor de 75 % de proteínas llamadas prolaminas, el resto es almidón y lípidos.
Las prolaminas se dividen en dos grupos basados en su solubilidad: gliadinas y
gluteninas, según la clasificación de Osborn de 1907 (Loponen et. al. 2007). El
gluten forma una red elástica en la masa, proporcionándole diferentes
características reológicas, que están en función del tipo y cantidad de las
prolaminas (Shewry, et. Al., 2002). Las gliadinas son el principal factor causante
de la Enfermedad de los Celiacos (EC), que es una enteropatia por sensibilidad al
gluten. La EC es un desorden alimenticio muy común, con una prevalencia del 0.5
al 2% entre las diferentes poblaciones (Begoña D. y Cisca W., 2005). En Londres,
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Inglaterra, una investigación basada en un estudio de población, usando estudios
serológicos, se ha encontrado que 1 de cada 150 individuos padecen intolerancia
al gluten es decir son celiacos (Dewar et. al. 2004). En un estudio realizado por
Castaño et. al. (2004), muestra que 1 de cada 118 nacidos en España son
celiacos. El 26 de mayo del 2007 se publicó una plana completa acerca de este
padecimiento, en uno de los diarios de mayor circulación en México, “el universal”,
en donde se informa que el 1% de los mexicanos (aproximadamente un millón de
personas) sufre de intolerancia al gluten, de acuerdo con estimaciones hechas por
especialistas del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición (INCMN), de la
Secretaría de Salud.
El gluten no era común en la dieta humana, si no hasta hace aproximadamente
diez mil años, cuando la gente comenzó a asentarse en un mismo lugar y se volvió
agricultor. Desde entonces los granos han reemplazado la dieta básica de
nuestros ancestros, quienes comían principalmente frutas, raíces, legumbres,
nueces y los animales que cazaban, y los han colocado en la base de la pirámide
alimenticia. Este hecho cambió el estilo de vida y de alimentación, sin embargo
nuestra constitución genética es la misma. Por lo tanto la EC es una consecuencia
de ése cambio.
Actualmente la industria recurre a una gran cantidad de enzimas para llevar a
cabo sus procesos. Las enzimas pueden provenir de forma extracelular ó
intracelular, de diferentes organismos como: bacterias, levaduras ó vegetales. De
acuerdo a la reacción que catalizan las enzimas se clasifican en oxidoreductasas,
transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas, según la Comisión de
Enzimas. Las proteasas pertenecen al tipo de hidrolasas, ya que rompen enlaces
del tipo peptídico. La tripsina (CE 3.4.21.4.) se utiliza para hacer preparaciones de
leche que puedan digerir fácilmente por los niños, es decir sustituto de leche
materna. La papaína (CE 3.4.22.2.) se utiliza en preparaciones como ablandadora
de carne y en la industria cervecera como clarificante.
Se han realizado un gran número de estudios sobre enzimas, entre las cuales
se encuentran las proteasas generadas durante la germinación de la cebada
(llamada malta), en beneficio de la industria cervecera (Jones et. al. 2000).
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También se han realizado investigaciones sobre proteasas que aparecen durante
la germinación del grano de trigo, sin embargo hasta el momento ningún estudio
se ha efectuado sobre la correlación que existe entre las enzimas que aparecen
durante el germinado de trigo, los epítopes (sección de aminoácidos que reconoce
el organismo humano como antígeno) que se encuentran en le gluten y la
utilización de éstas en la industria panadera. De igual manera se podrían utilizar
éstas enzimas también en toda la industria alimenticia que utilice el gluten como
materia prima.
En la industria panadera, la degradación proteolítica, durante la fermentación
de la masa, libera aminoácidos que actúan como precursores de saborizantes, sin
embargo, bajo ciertas condiciones, ésta proteólisis también podría alterar la
formación de la red de gluten, lo cual produciría un cambio desfavorable en las
propiedades reológicas de la masa (Loponen et. al. 2004). Brijs et. al. (2002),
Kiyosaki et. al. (2007) y Jones et. al. (2000), comprobaron que las proteasas
endógenas de la harina de cereales, así como del germinado de las semillas,
degradan las prolaminas en condiciones ácidas, además de que sus efectos sobre
las propiedades reológicas en la masa de harina de trigo son mínimos (Loponen
et. al. 2004).
2.- JUSTIFICACIÓN
Este trabajo pretende demostrar que se puede utilizar determinadas enzimas
del germinado de trigo, para romper los epítopes del gluten. Éstas deben
manifestar una alta actividad específica sobre las secciones de aminoácidos, que
el organismo reconoce como antígenos; de ésta manera se podrían emplear
dichas enzimas, no sólo, en la industria panadera, si no también en toda la
industria alimenticia donde se incorpore el gluten como materia prima. En el
mercado general, éstos productos son denominados: “libres de gluten”. Con otras
palabras, el objetivo es mejorar la calidad de vida de las personas, sean ó no
celiacas, incluyendo en su dieta una mayor variedad de alimentos inocuos y mejor
digeribles (que los que se consumen comúnmente).
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3.- OBJETIVOS
Objetivo general:
Determinar el rompimiento de epítopes en las prolamias por las
endoproteasas extraídas del germinado de trigo.
Objetivos específicos:
Determinar el tipo de proteínas de reserva en el gluten de trigo por SDS-
PAGE.
Obtener extractos crudos de enzimas a diferentes tiempos durante la
germinación del trigo.
Establecer el patrón de expresión diferencial de los extractos crudos de
enzimas mediante zimogramas.
Cuantificar la actividad enzimática utilizando como sustrato: gelatina,
azogelatina y proteínas totales del trigo.
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4.- CARACTERÍSTICAS DEL ÁREA EN QUE PARTICIPÓ
El área en que se desarrollo el proyecto pertenece a la investigación
biotecnológica, en la cual se contó con el apoyo del departamento de investigación
y desarrollo del corporativo Bimbo® S. A. de C. V.
Todos los estudios y análisis se realizaron en el laboratorio de biotecnología
de la Universidad de Colima, ubicado en: Km 40 autopista Colima-Manzanillo,
Tecomán, Colima, México. C. P. 28100.
5.- PROBLEMAS A RESOLVER, JERARQUIZADOS
Reunir los materiales y reactivos necesarios para las pruebas de actividad
enzimática.
Determinar los protocolos experimentales para el análisis de proteínas, así
como adecuarlos a las prolaminas y extractos crudos de enzimas.
Establecer las condiciones a nivel laboratorio de la desintoxicación
enzimática del gluten de trigo.
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6.- ALCANCES Y LIMITACIONES
Se logró obtener la estandarización y ajuste de varios protocolos, que nos
ayudarán a llevar a cabo posteriormente la tesis. Las limitaciones fueron, que el
método por el cual se midió actividad enzimática no discriminaba entre el sustrato
y las proteínas no proteasas contenidas en los extractos “crudos” enzimáticos. Es
por ello que se prefirió otro método, usando ya sea azogelatina ó azocaseína
como sustrato, para poder distinguir entre los diferentes extractos, cual es el que
libera mayor cantidad de residuos de aminoácidos, para leerlos en un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 440 nanometros. El motivo por el
cual no se alcanzó a llevar a cabo el análisis con estos azoreactivos son: la
azocaseína que se pidió a Sigma-Aldrich no pudo pasar por la aduana, debido a
restricciones por el reglamento de seguridad; La azogelatina se tiene que sintetizar
químicamente, por lo tanto se pidieron los reactivos necesarios, los cuales se
tardaron casi un mes en llegar. Este proyecto de residencia continuará con la
culminación de la tesis de licenciatura, maestría ó doctorado; de esta manera se
cumplirán todos los objetivos, además de caracterizar las enzimas, que presenten
mayor actividad (hacia los epítopes), secuenciarla y clonarla en Pickia Pastoris ó
Escherichia coli, expresarla y producirla en un biorreactor.
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7.- FUNDAMENTO TEÓRICO
7.1.- PROTEINAS DEL TRIGO
El gluten es la principal reserva de proteínas en las semillas de trigo; en él
se encuentran aproximadamente un 80% denominadas prolaminas, que a su vez
se dividen en gluteninas y gliadinas. En general todas estas proteínas se
denominan prolaminas, por su gran contenido de prolina, pero de la misma forma
tienen una gran cantidad de glutamina. En la semillas de cebada las proteínas se
nombran hordeínas y en el centeno secalinas. Basado en la extracción secuencial
de las proteínas, las gliadinas son solubles en alcohol y las gluteninas son
solubles en diluciones ácidas de acuerdo con el sistema de clasificación de
Osborn en 1907 (Loponen, et. al. 2007), En los granos de trigo se encuentran
también las proteínas solubles en agua, las albúminas, y otras en soluciones
salinas, las globulinas, que constituyen ambas alrededor de un 20% del total de
las proteínas del gluten.
7.1.1.- GLIADINAS Y GLUTENINAS
Las gliadinas comprenden aproximadamente un 40-50% de las proteínas
del grano de trigo. Las gliadinas son proteínas monoméricas, es decir, solo
pueden o no contener puentes disulfuro intramoleculares, y se pueden agrupar en
tres tipos α/β, γ, y ω, basado en su movilidad a pH bajo en gel de electroforesis
(α/β, γ, y ω, en orden de movilidad decreciente). Aunque la distribución de los
diferentes tipos de gliadinas depende fuertemente de la variedad (genotipo) y
condiciones de crecimiento (Dupont y Altenbach 2003) se puede generalizar que
el contenido de α/β-gliadinas y γ-gliadinas es mayor proporcionalmente que las ω-
gliadinas. Las ω-gliadinas tienen pesos moleculares alrededor de 50,000, el 80%
de su contenido es de glutamina, prolina y fenilalanina. La mayoría de estas
proteínas carecen de cisteína por eso no pueden formar puentes disulfuro, estas
proteínas consisten principalmente de secuencias repetidas (por ejemplo
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PQQPFPQQ). Las α/β-gliadinas y γ-gliadinas tienen pesos moleculares de 28,000
a 35,000 y tienen una proporción mucho menor de glutaminas y prolinas que las
ω-gliadinas. Las unidades repetidas de las α/β-gliadinas son dodecapeptidos tales
como QPQPFPQQPYPX, las cuales se repiten cada cinco veces y se modifican
por la sustitución de un solo residuo. Las unidades típicas de las γ-gliadinas son
QPQQPFP las cuales se repiten cada 15 veces y se esparcen con un residuo
adicional (Wieser 2007). La estructura secundaria de las gliadinas se caracteriza
por su conformación de giros β, causados por su contenido de glicina y prolina.
Las gluteninas comprenden entre un 30-40% de las proteínas del trigo. Las
gluteninas consisten de varias subunidades de cadenas de glutenina unidas por
puentes disulfuro, esta polimerización permite la formación de moléculas de peso
molecular que van de 500,000 hasta arriba de 10 millones. El tipo de gluteninas
que predomina son las del tipo LMW-GS (low-molecular-weight glutenins) estas se
encuentran en una proporción de aproximadamente el 20 % de las proteínas del
gluten, su composición es similar a las α/β- y γ-gliadinas, pero sus secuencia
predominante es QQQPPFS. El otro tipo de gluteninas son las HMW-GS (high-
molecular-weight glutenins) que representan más o menos el 10 % de las
proteínas del gluten. Estas a su vez se pueden agrupar en dos tipos las x y y, con
pesos moleculares de 83,000-88,000 y 67,000-74,000 respectivamente. Las
secuencias que pueden presentar son principalmente repeticiones de
hexapeptidos como QQPGQG, YYPTSP, y de tripeptidos QQP o QPG (Wieser
2007). Se han hecho estudios de campo que demuestran cómo las condiciones
medioambientales principalmente la temperatura y los fertilizantes afectan en la
cantidad, composición y/o polimerización de las proteínas del gluten, por ejemplo
que aumenta la cantidad de proteínas del grano en una relación de gluteninas a
gliadinas y de LMW-GS a HMW-GS con el incremento de fertilizantes
nitrogenados, también aumenta la cantidad de ω-gliadinas y la de HMW-GS en el
grano en condiciones de deficiencia de sulfuros (Dupont y Altenbach, 2003).
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7.1.2.- ALBUMINAS Y GLOBULINAS
Las albúminas son proteínas solubles en agua y las globulinas en
soluciones salinas, ambas constituyen entre un 10-20% de las proteínas de la
harina del trigo. Generalmente estas proteínas no juegan un papel importante en
la calidad de la harina.
7.1.3.- PROTEINAS INVOLUCRADAS EN LOS MECANISMOS DE DEFENSA DEL TRIGO
Una de las principales fuentes de defensa contra el ataque de
depredadores (insectos) o de los patógenos, se basa en una serie de compuestos
que la propia planta sintetiza, entre los cuales las proteínas son las principales.
Las plantas carecen de un sistema de defensa basado en anticuerpos, como en
los animales. Las proteínas de las plantas tienen papeles claves, tanto como en
factores constitutivos de resistencia, como formando parte de la compleja cascada
de resistencia. Se encuentran diseminadas en semillas y otros tejidos de
almacenamiento así como en tejidos vegetativos, gomas y látex. Otras exhiben un
patrón de expresión en respuesta a infecciones o daño. Las más ampliamente
estudiadas son inhibidores de enzimas hidrolíticas, principalmente de proteasas y
amilasas (Blanco-Lebra y Aguirre 2002). Estos inhibidores frecuentemente están
en cantidades relativamente altas, por lo tanto actúan también como proteínas de
reserva. Los inhibidores de proteasas mejor estudiados son los de serín proteasas
como la tripsina, quimiotripsina y subtilisina. Otro tipo de inhibidores de
carboxipeptidasas y cisteinproteasas llamados cistatinas, se han analizado en el
trigo (Kiyosaki et. al. 2007). Las globulinas y albúminas son inhibidores de la alfa
amilasa/tripsina, de insectos y hongos patógenos, al mismo tiempo son proteínas
de reserva para la germinación del grano. Las serpinas y purotioninas, que pueden
servir de inhibidores de insectos ó de hongos patógenos antes de la germinación,
también pueden ser utilizados de nutrientes de reserva del embrión durante la
germinación (Dupont and Altenbach 2003). Las tioninas fueron primeramente
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purificadas de la harina del germen de trigo, en la década de los 40’s, y fueron
llamadas purotioninas. Estas tioninas del trigo (especificas del endospermo) han
demostrado ser tóxicas para una serie de organismos, incluyendo levaduras,
bacterias y hongos patógenos.
Por lo general los inhibidores de proteasas que se han encontrado
contienen altos porcentajes de cisteína formando puentes disulfuro, lo cual los
hace resistentes a la desnaturalización por calor o pHs extremos (Blanco-Lebra y
Aguirre 2002). Habitualmente tienen subunidades de pesos moleculares de
12,000–16,000, encontrándose en formas monoméricas, diméricas y tetraméricas.
Estas proteínas exhiben actividad inhibitoria contra varios tipos de alfa-amilasa (de
hongos y de saliva de insectos, pero no de plantas) y en algunos casos pueden
ser bifuncionales, es decir tanto de proteasas como de amilasas. Este tipo de
inhibidores puede extraerse selectivamente de mezclas de cloroformo/etanol, por
lo cual son referidos como proteínas CM. Estos incluyen inhibidores de tripsina y
alfa-amilasa.
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7.2.-GERMINADO DE SEMILLAS DE LOS CEREALES
El ciclo de vida de un grano de cereal tiene dos fases, desarrollo y
germinación, que son separados por un periodo de dormancia (Brijs, et. al. 2002).
Las semillas de las plantas guardan nutrientes de reserva entre los cuales se
encuentran carbohidratos y proteínas que son utilizados en las primeras etapas
de germinación, cuando los granos tienen la madurez morfológicamente necesaria
y las condiciones óptimas de humedad, temperatura y concentración de oxigeno.
El conocimiento de las etapas en la germinación de la semilla es de gran interés
para comprender el papel que juegan proteasas específicas en la movilización de
proteínas de reserva de manera secuencial. La germinación se puede dividir en
tres etapas, en la primera llamada de iniciación, la semilla absorbe agua y dura
alrededor de 1 hora, se activan enzimas preexistentes para la respiración,
glucólisis y síntesis de macromoléculas. En la segunda etapa se observa una
síntesis intensiva de ácidos nucleicos y proteínas (entre ellas enzimas), de esta
forma se puede tener una alta cantidad de aminoácidos liberados de las proteínas
de reserva por la actividad proteasa y que van a servir como eslabones para las
proteínas de crecimiento de la nueva plántula. En la tercera etapa comienza el
crecimiento de la radícula y de la plúmula.
Actualmente solo en la industria cervecera se trabaja con el germinado de
cebada, llamada malta, esto induce la producción de una gran variedad de
enzimas, específicamente proteasas y amilasas, que le proporcionan los
productos de la hidrólisis de las proteínas y carbohidratos respectivamente; de
esta forma las levaduras (cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae)
obtienen su fuente de nitrógeno y carbono, para llevar a cabo su crecimiento y
proporcionarle a las bebidas un valor nutritivo, entre otras cosas (Jones, et. al.,
2000).
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7.3.- ENZIMAS PROTEOLÍTICAS DEL GERMINADO DE TRIGO
La degradación de las proteínas de reserva comienza con el rompimiento
enzimático de los puentes disulfuro, lo cuales se producen por reacciones de
reducción en la cistina, formando de esta manera los grupos tiol en la cisteína.
Esto permite que se pierda la estructura compacta de la proteína e incrementa la
solubilidad para hacer a las proteínas del gluten más susceptibles al rompimiento
proteolítico. Se ha propuesto el sistema de la NADP/thioredoxina para explicar
como las proteínas del endospermo del trigo son reducidas y movilizadas durante
la germinación, incrementando la susceptibilidad proteolítica. Las proteínas
thioredoxina (12 kD) se activan por la NADPH Thioredoxin Reductasa (NTR) que
lleva a cabo la primera parte de desdoblamiento reduciendo los puentes disulfuro
de las prolaminas causando su depolimeraización asi como posiblemente la
inactivación de algunos inhibidores de proteinasas (Kobrehel et. al., 1992;
Buchanan et. al. 1997). Otro sistema propuesto es el de la Glutation reductasa
(GSH), esta se activa durante el desarrollo de las semillas reduciendo los puentes
disulfuro que unen a dos moléculas de glutation (las moléculas de glutation son
tripletes de γ-glutamilcisteinilglicina, sin embargo comparado con el sistema de
thioredoxinas el GSH es muy pobre. Recientemente se estudió el sistema de la
enzima Tiol: Proteina Disulfuro Oxidoreductasa (TPDO), la cual se probó
incubándola con gluten como sustrato lo que produjo una gran cantidad de grupos
tiol libres, indicando que la enzima reduce algunos de los puentes disulfuro en el
gluten. (Luponen et. al. 2007)
7.3.1.- CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS PROTEOLITICAS
Las enzimas proteolíticas son las que hidrolizan enlaces peptídicos, éstas a
su vez se pueden clasificar en base a su sitio especifico de corte como
exoproteasas (hidrolizan solo en sus extremos terminales ya sea
carboxipeptidasas o aminopeptidasas) y las endoproteasas (rompen enlaces
peptídico en la parte central de las proteínas).
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Otra clasificación se basa en la estructura química, de esta forma las cuatro
principales son las asparticproteinasas (CE 3. 4. 23), serinproteinasas (CE 3. 4.
21), cisteinproteinasas (CE 3. 4. 22) y metaloproteinasas (EC 3. 4. 24). Los
primeros dos grupos de proteasas se activan bajo condiciones ácidas; éstas se
localizan en el endospermo y están asociadas con las proteínas del gluten.
Cuadro 1. Enzimas proteolíticas del grano de trigo, en reposo y en la germinación.
Proteasa Localización Rango de pH Numero CE optimo Aspartic proteinasas Endospermo, salvado, 3 - 3.5 CE 3.4.23.40 asociada al gluten Reposo Carboxipeptidasa II Endospermo, salvado, 4.5 - 6 CE 3.4.16.6 asociada al gluten Cisteinaproteinasa Aleurona 4 Cisteinaproteinasa Embrión 5.5 - 6 Serinaproteinasa Endospermo Embrión Metaloproteinasa Aleurona, 8 Escutelo Carboxipeptidasa IV y V Endospermo 4.5 - 5 Carboxipeptidasa I y III Aleurona 4.5 - 6 CE 3.4.16.5 Escutelo Germinación Endospermo DPP IV Embrion 7 CE 3.4.14.5 Aminopeptidasas Embrion/plantula 7.5 Prolilaminopeptidasa Plántula 7.5 CE 3.4.11.5 Oligopeptidasa B Embrión 8.5 CE 3.4.21.83
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7.3.2.- PROTEASAS EN EL GERMINADO DE TRIGO
En general las cisteinproteinasas son el grupo mas importante de proteasas
para hidrolizar las prolaminas durante la germinación del grano (Kiyosaqui et. al.
2007; Luponen et. al 2007), algunas de estas enzimas tienen una masa molar de
31-38 kD y su rango de pH optimo esta de 4-6. Aún no se han llevado a cabo
estudios sobre las metaloproteinasas en los granos de trigo, pero sí en los de
cebada.
Se han hecho estudios de algunas proteasas para utilizarlas en métodos
terapéuticos, específicamente para mejorar la calidad de vida de los celiacos, en
estas investigaciones prefieren aumentar la función proteolitica gastrointestinal
digestiva en los pacientes mas que una proteólisis durante el proceso de
fabricación de alimentos. Recientemente se han utilizado preparaciones con
bacterias acido lácticas que disminuyen la toxicidad de la harina de trigo durante el
tiempo de fermentación, pero su capacidad para hidrolizar polipéptidos de gliadina
depende de una gran mezcla sinergética de microorganismos que aportan su
dotación de peptidasas, ya que individualmente muestran una escasa capacidad
proteolitica, también se han realizado investigaciones con suplementos
terapéuticos orales a base de peptidasas, pero no han sido exitosos (De Angelis,
et. al., 2006).
Se han hecho estudios de las enzimas proteolíticas que aparecen durante
la germinación de centeno (Brijs, et. al. 2002), también de las enzimas
proteolíticas durante la germinación de la cebada y trigo (Jones, et. al. 2000). Sin
embargo no muestran correlación con de propiedades visco-elásticas de la masa
de harina de trigo.
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7.4.- ENFERMEDAD DE LOS CELIACOS POR SENSIBILIDAD AL GLUTEN
Desde el segundo siglo después de Cristo la palabra griega que se empleó
para identificar a los pacientes que presentan esta intolerancia fue koiliakos (de la
cual deriva Celiaco), de koilia, abdomen, kos, cavidad, que significa
originariamente “los que sufren del intestino”. En las personas con la Enfermedad
Celiaca (EC) mantienen fuera de su dieta los alimentos que contienen gluten. Al
ingerir éstos alimentos les induce la atrofia ó aplanamiento de la mucosa del
intestino delgado, lo cual provoca una infiltración linfocítica que incrementa la
proliferación de células epiteliales con la correspondiente hiperplasia nodular
linfoide (en las criptas), reduciendo la diferenciación de los enterositos. En
consecuencia la función de absorción es dañada, los pacientes frecuentemente
experimentan síntomas desde una simple letárgica y diarrea, hasta pueden
desarrollar anemia u osteoporosis (Dewar, et. al., 2004). Las gliadinas inducen la
liberación de zonulina en células epiteliales in vitro, la activación dirigida por la
proteína kinasa C (PKC) mediante la reorganización del citoesqueleto y
entrecruzamientos ajustados permiten un rápido incremento en la permeabilidad
intestinal (Clemente, et. al., 2003). La hidrólisis proteolítica de los epítopes del
gluten, es una tarea que muchos investigadores han tratado de hacer, sin
embargo solo se ha obtenido éxito a nivel laboratorio, con sustratos sintéticos y/o
gliadinas. Además, desde un punto de vista práctico se debería de tomar en
cuenta los efectos producidos en la reología de la masa, así como la calidad del
producto final. Otros estudios muestran un tipo de manifestación diferente en los
celiacos, la cual involucra a la piel, provocando una dermatitis hipertiforme; en
otros casos también se ha asociado a una disfunción neurológica llamada gluten-
ataxia (Hadjivassiliou et. al. 2003).
7.4.1.- EPITOPES
Los epítopes o determinantes antígenos, son los sitios de una macromolécula
que son reconocidos individualmente por un anticuerpo específico o por un
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receptor de células T (TCR) específico. Un antígeno es cualquier molécula o
patógeno capaz de generar una respuesta inmunitaria. Un antígeno puede ser un
virus, una pared bacteriana, una proteína individual u otras macromoléculas que
son reconocidas individualmente. Un anticuerpo o un TCR concreto se unirá
solamente a una estructura molecular determinada dentro del antígeno, a la que
se llama determinante antígeno ó epítope.
Responder a moléculas pequeñas que son intermedios comunes y productos
del metabolismo celular no sería productivo para el sistema inmunitario, las
moléculas con pesos moleculares menores a 5000 no actúan como antígenos,
pero pueden unirse covalentemente a grandes proteínas en el laboratorio
pudiendo originar una respuesta inmunitaria. Estas pequeñas moléculas se llaman
haptenos, en otras palabras, estas moléculas no provocan una reacción
inmunológica, solamente conjugándose con proteínas portadoras.
21
8.- PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS
8.1.- MATERIA PRIMA
Se utilizaron granos de trigo de la variedad Bimbo I en todos los
experimentos. Estos fueron donados por el Sr. Javier Martínez Alemán del
departamento de investigación y desarrollo del corporativo Bimbo® S. A. de C. V.
Los extractos de enzimas del germinado, así como las proteínas totales del trigo,
las gliadinas y gluteninas se obtuvieron de la variedad Bimbo 1.
8.1.1.- GERMINADO DE LAS SEMILLAS DE TRIGO
Aproximadamente se tomaron unos 30 granos de trigo, previamente
esterilizadas superficialmente con una disolución de hipoclorito de sodio comercial
(Cloralex®) al 1% y enjuagadas dos veces con agua destilada. Se colocaron en
cajas petri de plástico desechables, con dos papeles filtro (Whatman 1)
humedecidos con aproximadamente 3 mL de agua destilada. Para evitar que se
escapara la humedad interior, se colocó una tira de plástico Parafilm® alrededor
de la caja, este paso también protegió la entrada de insectos u otros
microorganismos que pudieran contaminar las cajas. Se probó con dos diferentes
condiciones, una a 20 ºC en ausencia de luz (cubiertas completamente con papel
aluminio) y otra a temperatura ambiente, con 18 horas de luz y 6 de oscuridad.
Se prepararon ocho muestras, a cada una se le aplicó el mismo
procedimiento. Posteriormente se realizó el protocolo de extracción de enzimas.
Se tomo una caja cada 24 horas, durante los primeros ocho días desde el inicio de
la germinación del trigo.
22
8.2.- PREPARACIÓN DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS Los extractos enzimáticos se prepararon usando el método de extracción
para enzimas de Loponen (2007), con algunas modificaciones. A las semillas
germinadas se les cortó el brote y las raíces cuidadosamente con una navaja fina.
Las semillas se molieron con mortero y pistilo, la harina resultante se colocó en
tubos de 50 mL para centrifuga, se les agregó 5-6 mL de acetato de sodio 0.1 M
pH 4.7 y se incubó a 4 ºC en agitación por 35 minutos, después se centrifugó a
1,800 g´s (gravedades) por un tiempo de 60 minutos a 4 ºC, el sobrenadante se
separó y guardó a 4 ºC hasta su análisis. De esta forma se obtuvo cada uno de los
nueve extractos enzimáticos durante los nueve días que se llevo a cabo la
germinación. La concentración de proteínas de los extractos enzimáticos se midió
con un método analítico (Bio-Rad Labs.) basado en el método Bradford de 1976
(Gerrard et. al. 2001; Loponen et. al. 2007), y para la curva estándar se utilizo
albúmina de suero bovino (BSA).
8.3.- EXTRACCIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS
La extracción diferencial de proteínas se basó en un método modificado de
Hay y Sutton de 1990 y Batey et. al. de 1991 (Gerrard et. al. 2001). Cien
miligramos de trigos se molieron con mortero, se pesaron y colocaron en tubos
Eppendorf de 2 mL. Las albúminas y globulinas se extrajeron con 0.4 ml de
solución salina de NaCl al 2 % (p/v), mezclando en vortex cada 5 minutos por 30
minutos, después se centrifugó a 9,800 g´s durante cinco minutos, el
sobrenadante se separó y guardó en tubos Eppendorf a 4 ºC hasta su análisis.
Las gliadinas se extrajeron resuspendiendo el precipitado con 0.4 mL de etanol al
70 % (en agua) mezclando en vortex cada 5 minutos durante 30 minutos, después
se centrifugó a 9,800 g´s durante cinco minutos, el sobrenadante se separó y
guardó en tubos Eppendorf a 4 ºC hasta su análisis. Las gluteninas solubles en
SDS se extrajeron resuspendiendo el precipitado en 0.4 mL de buffer-SDS (5 %
SDS (p/v), 0.05 M fosfato, pH 6.9) mezclando en vortex cada 5 minutos durante 30
23
minutos, después se centrifugó a 9,800 g´s durante cinco minutos, el
sobrenadante se separó y guardó en tubos Eppendorf a 4 ºC hasta su análisis.
8.4.- EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
Las proteínas totales del grano se obtuvieron siguiendo el protocolo de
Shewry (1995) para la extracción de proteínas de los tejidos de semillas, el cual se
basa en el método de Laemmeli. Se molieron granos de trigo con mortero y pistilo,
hasta obtener de dos a tres gramos de harina. Después se colocaron en tubos
falcon de 50 mL, al cual se le agregó 25 mL de buffer de extracción, en relación
1:10, peso de muestra por volumen de buffer respectivamente. El buffer de
extracción contiene Tris-HCl 0.0625 M, pH 6.8, SDS 2 % (p/v), DTT 1.5 % (p/v). Se
dejó incubar por 2 horas a temperatura ambiente agitando cada 15 minutos.
Posteriormente se centrifugó a 8,000 g´s durante dos minutos, el sobrenadante
rico en proteínas se separó y guardó a 4ºC, hasta que se dializó.
8.4.1.- DIÁLISIS
Preparación de las membranas para la diálisis. Las membranas de diálisis
contienen varios químicos, tales como glicerol (humectante) y compuestos
azufrados que deben ser eliminados antes de su uso. Primero se hierve la
membrana de diálisis en NaHCO3 10 mM, EDTA 1.0 mM, por 30 minutos. Se deja
enfriar y enseguida las membranas de diálisis hervidas son lavadas profusamente
con agua destilada por dentro. Posteriormente se almacenan las membranas a
4ºC para que estén listas para ser usadas, en H2O destilada con EDTA 1.0 mM y
azida de sodio 0.02%. El tiempo de almacenamiento de las membranas
preparadas puede ser de hasta 6 meses. Se utilizó tubo de membrana de celulosa
para diálisis de Sigma-Aldrich®, que tiene de ancho 33 mm ( 1.3 pulgadas )
desinflada. Esta membrana tiene una capacidad de retención de proteínas
mayores a 12 kDa. Se cortaron dos tubos de unos 15 cm, se prepararon como se
señaló antes y posteriormente se llenaron con aproximadamente 20 mL de
24
muestra. Se dializaron contra 5 litros de agua destilada por 4 horas, en agitación
lenta con una bala magnética y agitador, dentro de una camara fría que se
encuentra a 4 ºC. Posteriormente se cambió el agua y se dejo por 20 horas sin
agitación, también a 4ºC. Finalmente se sacaron las muestras y se guardaron en
tubos falcon® de 50 mL a 4 ºC, hasta su análisis. El principio fundamental de esta
técnica es separar las especies que difieren apreciablemente en tamaño, gracias a
sus diferentes velocidades de difusión a través de una membrana semipermeable.
Por lo que los flujos de soluto dependen del gradiente de concentraciones en la
membrana, caracterizándose por bajos flujos, en comparación a la ultrafiltración.
8.4.2.- ULTRAFILTRACIÓN
Cuando fue necesario concentrar pequeñas cantidades de muestra (1-2
mL) se realizó la ultrafiltración, utilizando tubos de Centricon (Millipore’s Ultracel®),
con membrana de celulosa regenerada, YM-10, para retener las proteínas con un
peso molecular mayor a 10,000 NMWL (Nominal Molecular Weight Limit in Daltons
Proteins). Se ensambló el microcontenedor y añadió 2 ml de muestra, luego se
centrifugó a 3000 g´s durante 1 hora, utilizando una centrifuga Eppendorf (mod.
5403) de ángulo fijo. Posteriormente se invirtió la unidad centricon para recuperar
toda la proteína concentrada, centrifugando a 1000 g’s por 2 minutos. Este
procedimiento se repitió tres veces agregando buffer Tris-HCl 0,0625 M, pH 6.8,
para lavar y concentrar la muestra. El principio fundamental de este método es
una filtración aplicando presión en forma de fuerza centrifuga en términos de la
fuerza de gravedad.
8.4.3.- LIOFILIZACIÓN
La mezcla liquida de proteínas se liofilizó para concentrar algunas muestras
relativamente grandes (40-50 mL), se utilizó un aparato liofilizador (modelo 77530,
Labconco corporation Zwitzerland). Este paso se realizó manteniendo la
temperatura a -40ºC y la presión de vacío a 133 x 10-3 mbar durante un tiempo de
25
aproximadamente 20 horas. El principio fundamental de este método es la
sublimación de la muestra en estado sólido, a -40 ºC, logrando extraer el agua con
el vacío.
8.5.- ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA EN SOLUCIÓN
Para llevar a cabo los experimentos de actividad enzimática, se pusieron a
reaccionar cada uno de los extractos con diferentes sustratos, proteínas totales
(PT), gelatina (G), azogelatina (AzoG) y gliadinas (Gd).
8.5.1.- CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
La concentración de las proteínas se midió con el método de Bradford; en
algunas ocasiones se cuantificó la concentración directamente, utilizando una
técnica espectrofotométrica, en la cual se mide la absorbancia en la región UV, a
una longitud de onda de 280 nm. De esta forma, en los siguientes experimentos se
utilizará cualquiera de estos métodos para calcular la concentración de proteínas.
Método Bradford Existen tres formas de color en solución del azul de Coomassie (CBG-250):
Forma.
Rojo-café → catiónica
Verde → neutral
Azul → aniónica (λmax 595 nm)
El CBG-250 se une a los grupos sulfato y amino de la proteína,
reaccionando principalmente con los residuos de arginina y débilmente con
residuos de histidina, lisina, tirosina y fenilalanina. El bajo pH de la mezcla de
reactivos causa que se reduzcan ó desdoblen las proteínas permitiendo que los
residuos no polares básicos interactúen con el colorante a través de las fuerzas de
Van Der Waals e interacciones hidrofóbicas. Aproximadamente 1.5 a 3 moléculas
de colorante se unen a cada molécula de proteína con carga positiva. Esta
26
imprecisa estequeometría se refleja en las variaciones de una a otra proteína. Sin
embargo este método es usado ampliamente como semicuantitativo.
Preparación del Reactivo Bradford
Se preparó la solución Bradford utilizando los siguientes reactivos:
-Serva blue G Dye (sinónimos: Brillante blue G y azúl brillante de
Cuumassie® G-250).
-Albúmina de Suero Bovino (BSA)
-Etanol al 95%
-Ácido fosfórico al 88%
1.-Solución stock Bradford.
100 mL de etanol al 95%
200 mL de ácido fosfórico al 88%
350 mg de Serva blue G
Esta solución es estable indefinidamente a temperatura ambiente.
2.-Buffer de trabajo Bradford
425 mL de agua destilada
15 mL de etanol al 95%
30 mL de ácido fosfórico al 88%
30 mL de solución stock Bradford
Filtrar la solución con papel Whatman #1 y guardar a temperatura ambiente
en botella de vidrio ámbar. De esta manera dura varias semanas pero debe ser
refiltrado.
3.- Soluciones de BSA para realizar la curva estándar.
Preparar 100 mL de BSA a una concentración de 1 mg/mL. Se pesan 100
mg de BSA, se diluyen en aproximadamente 80 mL de buffer de NaAc 50 mM, pH
4.7, posteriormente se afora a 100 mL.
Para realizar la curva estándar, se deben preparar soluciones a diferentes
concentraciones, para ello se realizan diluciones de BSA a partir de la solución
original.
27
DILUCIONES
conc. (mg/mL) mL de la sol. BSA mL de buffer NaAcVol. Final
0.9 22.5 2.5 25 0.7 17.7 7.3 25 0.5 12.5 12.5 25 0.3 7.5 17.5 25 0.1 2.5 22.5 25 0.05 1.25 23.75 25
Procedimiento:
Se toman 20 µL de solución muestra y 1 mL de Buffer de trabajo Bradford
(también se puede escalar el volumen, por ejemplo, 100 µL de solución muestra y
5 mL de buffer de trabajo Bradford), se agita uno par de segundos en vortex y se
deja reaccionar por 5 minutos (precaución: si se pasa de 10 ó 15 minutos las
proteínas pueden precipitar). Se mide la absorbancia de cada una de las
diluciones a una longitud de onda de 595 nm. Se hace por triplicado. Calcular la
absortividad con la ley de Lambert-Beer. Ésta curva servirá para medir la
concentración de proteínas (enzimas o no enzimas), que se encuentran en los
extractos crudos del germinado de trigo.
También se utilizó otro método de apoyo, para medir la concentración de
proteínas, en el cual se midió directamente la muestra en el espectrofotómetro,
pero a una longitud de onda de 280 nm. La curva estándar se realizó con las
mismas diluciones que con el método Bradford, pero sin llevar a cabo la reacción
colorimétrica. Para ello se utilizó una celda de cuarzo. Ésta técnica se basa en la
absorbancia a 280 nm de las proteínas, lo cual puede ser considerado como la
suma de las contribuciones de las cadenas laterales de dos constituyentes:
triptófano y tirosina. Las proteínas que contienen pocos aminoácidos aromáticos
exhiben poca absorción en 280 nm (por ejemplo la gelatina).
8.5.2.- IDENTIFICACIÓN DE ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA CON GELATINA
Se tomaron 100 µL del extracto y mezclaron con 100 µL de buffer de NaAc
(0.1 M, pH 4.7), mas 10 µL de solución de cisteína (0.1 M) para proteger los
grupos tiol, después de 5 minutos, se inició la incubación agregando 550 µL de la
28
solución de gelatina (gelatina tipo A de piel de porcino, de Sigma-Aldrich®) (al
1%). Incubando la mezcla de reacción, usando un thermomier marca Eppendorf®
manteniendo la temperatura en 37 ºC a 300 rpm. A cada cierto tiempo (0, 20, 40 y
60 minutos) se paró la reacción agregando 1 mL de isopropanol para precipitar las
proteínas no hidrolizadas. Se Incubó en hielo por lo menos 15 minutos.
Inmediatamente después se centrifugó a 4ºC en 12,400 g´s durante 10 minutos
(microcentrifuga Hermle Z 360K, Labnet®). Se midió A280 del sobrenadante. El
volumen y concentraciones utilizadas en este experimento están en el siguiente
cuadro.
Cuadro 1. Mezcla de reacción con enzima y sustrato
conc.
Volumen
(µL) Conc. f. (mg/mL)
Extracto
1.5
mg/mL 100 0.197
Sustrato 1% p/v 550 7.236
Buffer 0.1 M 100
Cisteína 0.1 M 10
Final 760 7.434
La reacción se paró con un volumen final de 57% de isopropanol, como lo reporta
Jones et. al (1998), ya que de esta forma se puede precipitar mejor la gelatina que
no se hidrolizó. Los volúmenes utilizados están en el cuadro 2.
Cuadro 2. Volumen y concentración final del isopropanol.
Volumen (µL)
Conc. final. de isopr
(% v/v)
Mezcla Rx. 760
Isopropanol 1000
Final 1760 57
29
8.5.3.- IDENTIFICACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CON AZOGELATINA
Se utilizaron 16 tubos Eppendorf de 2 mL, rotulados con una “M” para las
muestras y una “B” para los blancos, el tiempo de incubación y el día del extracto.
En cada uno se colocaron los diferentes componentes, en el siguiente orden:
•50 µL de extracto crudo de enzimas (aproximadamente 45 µg de proteína
enzima y no enzima).
•100 µL de buffer NaAc 50 mM, pH 4.7, cisteína 11 mM.
•100 µL de TCA al 50%, únicamente para los blancos.
•100 µL de buffer NaAc 50 mM, pH 4.7, únicamente para las muestras.
Después de 5 minutos se agregaron 300 µL de azogelatina al 1% en buffer de
NaAc 50 mM, pH 4.7, luego se incubó en thermomixer a 40°C y 400 rpm. La
reacción se paro agregando:
•500 µL de buffer NaAc 50 mM, pH 4.7.
•230 µL de TCA al 50%, únicamente para las muestras.
•230 µL de TCA al 28.6%, únicamente para los blancos.
Se enfrió en hielo por al menos 5 minutos, se centrifugó a 9,800 g´s durante 10
minutos, a temperatura ambiente; inmediatamente después se tomó 1 mL del
sobrenadante y se leyó la absorbancia a 440 nm. Para calibrar el equipo en una
absorbancia de cero se preparó la siguiente mezcla:
•300 µL de azogelatina al 1% en buffer de NaAc 50 mM, pH4.7.
•750 µL de buffer NaAc 50 mM, pH 4.7.
•230 µL de TCA al 50%.
Se enfrió en hielo por al menos 5 minutos, se centrifugó a 9,800 g´s durante 10
minutos, a temperatura ambiente; inmediatamente después se tomó 1 mL del
sobrenadante y se calibró la absorbancia a cero en 440 nm.
8.5.4.- IDENTIFICACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CON NINHIDRINA Otro métodos que se utilizó, para cuantificar los aminoácidos liberados en
las reacciones de hidrólisis, es el de Moore y Stein (1954) modificado (Yocoyama
30
S. y Hiramutsu J., 2003). El color purpura de “Ruhemann´s”, que se forma por la
reacción de los aminoácidos, en solución ácida con la ninhidrina se atribuye a el
anión de diketohidrindilideno-diketohidrindamina. Los reactivos necesarios para
llevar a cabo el método son los siguientes:
Preparación de la solución de ninhidrina
•0.5 g de ninhidrina
•15 mg de ácido ascórbico
•60 mL de 2-metoxietanol
Una vez mezclados se guarda la solución de ninhidrina a -20°C hasta por 1 mes.
Posteriormente se procede a realizar la curva estándar empleando algún
aminoácido disponible; en éste caso se utilizó la glicina. Protocolo para la curva
estándar:
1.- Tomar 1 mL de la solución de aminoácido que se encuentra alrededor de 0.1
mM (Se preparó una solución 5mM de glicina y se hicieron diluciones).
2.- Tomar 2 mL de buffer de citrato de sodio 0.5 M, pH 5.0.
3.- Tomar 1 mL de la solución de ninhidrina.
4.- Mezclar suavemente los 4 mL y calentar a 100°C por 15 minutos, e
inmediatamente enfriar en hielo a 0°C.
5.- Añadir 1 mL de etanol al 60 % (hacer esto solamente si es necesario diluir la
muestra)
6.- Medir la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm.
8.6.- IDENTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN SDS-PAGE
Las proteínas extraídas y las hidrolizadas en las pruebas de actividad
proteolítica, se analizaron con el sistema desnaturalizante de SDS-PAGE al 12%,
empleando el sistema Laemmli de 1970 (Shewry et. al 1995). Se utilizaron las
cámaras de electroforesis mini-protean II de Bio-Rad, y se corrieron a 70 volts por
un tiempo de aproximadamente 4 horas (hasta que los marcadores salieran del
gel). La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-
PAGE) es un método de bajo costo y reproducible, para comparar, cuantificar y
31
caracterizar proteínas, basado en la separación por sus pesos moleculares. El
SDS se une a las partes hidrofóbicas de la proteína, “desdobla su estructura” y
estabiliza una conformación extendida. El porcentaje de acrilamida va a depender
de la resolución que se quiera tener, es decir el tamaño de proteínas a separar. De
esta forma se eligió el gel al 12% para tener una resolución de separación entre
15-60 kDa.
Relación para una optima resolución (Bollag et. al. 1996)
Porcentaje de acrilamida (%)
Resolución en la separación
(kDa) 15 15-45 12 15-60 10 18-75 7.5 30-120 5 60-212
Para teñir el gel después de la electroforesis, se utilizó Azul de Coomassie, el cual
puede detectar bandas de proteínas tan pequeñas como de 1 µg. La tinción con
nitrato de plata es más sensible, pudiendo detectar bandas de hasta 2 ng.
Protocolo para SDS-PAGE desnaturalisante. Los reactivos, soluciones y concentraciones que se utilizaron para preparar los
geles se encuentran en los cuadros siguientes. El stock de
acrilamida/bisacrilamida se preparo al 30% (29.2% de acrilamida más 0.8% de
bisacrilamida). Cabe subrayar que estos dos reactivos son neurotóxicas, es por
ello que se manipularon con estricta seguridad, usando: guantes, bata, cubre
bocas y lentes de protección.
32
# de geles [acrilamida]% 2 12
GEL SEPARADOR concentraciónVolúmen
(mL) Agua destilada 6.70 Tris-HCl pH 8.8 1.5M 5.00 SDS 10% 0.20 Stock de acrilamida/bis 30% 8.00 PSA 10% 0.20 TEMED 0.04
Volumen final 20.14
# de geles [acrilamida]% 2 3.8
GEL CONCENTRADOR concentración
Volúmen (mL)
Agua destilada 6.10 Tris-HCl pH 6.8 0.5M 2.50 SDS 10% 0.10 Stock de acrilamida/bis 30% 1.30 PSA 10% 0.10 TEMED 0.02
Volumen final 10.12
Primero se prepara el gel separador que va en la parte inferior del cristal,
para ello se utiliza un tubo falcon de 50 mL se mezclan los componentes en el
orden del cuadro de arriba. El PSA y el TEMED, (se deben agregar suavemente),
ya que éstos dos últimos reactivos son los que catalizan la polimerización, por lo
cual, una vez agregados, se debe colocar inmediatamente la mezcla dentro de los
cristales; utilizando una pipeta de transferencia, hasta una altura que permita
posteriormente colocar el gel concentrador; es importante que se rellene de agua
el cristal para evitar que el gel entre en contacto con el aire mientras polimeriza
(entre 5 a 10 minutos). Enseguida se prepara el gel concentrador: en un tubo
falcon de 50 mL se mezclan en el mismo orden del cuadro. Posteriormente se
coloca la mezcla dentro de los cristales con una pipeta de transferencia hasta que
se derrame un poco fuera de los cristales, procurando desplazar el agua residual
hacia afuera, inmediatamente después se coloca el peine que formará los posillos.
33
Después de unos cinco minutos polimeriza, se quita el peine y se transfieren los
geles al interior de la cámara de electroforesis; La cámara se llena cubriendo los
electrodos, con buffer de corrida, el cual se prepara de la siguiente manera:
BUFFER DE CORRIDA Tris base 3 g Glicina 14.4 g SDS 1 g Aforar a 1000 mL con agua destilada
El pH debe estar alrededor de 8, pero no se debe ajustar con ningún reactivo.
Para la preparación de las muestras se utilizaron tubos Eppendorf de 2 mL.
Se mezcla el buffer de carga con la muestra de proteínas, la relación debe ser 2:1,
(buffer/muestra), se agitan en thermomixer® a 95°C, en 1000 rpm durante 5
minutos.
Buffer de carga:
•SDS al 10%
•DTT 10mM
•Glicerol al 40%
•Azul de Bromofenol al 0.05% (en alcohol etílico).
•Tris-HCl 0.2M, pH 6.8
Se guardo en un frasco de vidrio bien cerrado, cubierto con aluminio a temperatura
ambiente y correctamente rotulado.
Después se sacan los tubos del thermomixer® y se cargan 15 µL por
pocillo. Cuando se utilizó marcador de pesos moleculares se cargaron 8 µL
únicamente de éste sin calentar. Se corre a 80 volts, en el rango de selección bajo
aproximadamente durante tres horas ó hasta que se observó salir el colorante por
debajo del cristal. Al terminar se apaga la fuente de poder, y los geles se
despegan del cristal cuidadosamente. Los geles se colocan en platos planos
(Tupperware®) con tapadera y se les agrega solución de teñido, lo suficiente para
que cubra el gel. Se en un mezclador de cama plana a 100 rpm durante 12 horas
ó por toda la noche. Posteriormente se retira esta solución, se enjuagan los geles
con agua destilada y se les coloca solución de desteñido, de igual forma se
colocan en un mezclador a 100 rpm durante 30 minutos. Los geles se pueden
guardar por tiempo indefinido deshidratados en medio de papel celofán.
34
Solución pata teñir: •Solución stock 4%
•TCA 16%
•Agua 80%
La solución stock es azul de Coomassi al 1% en etanol puro.
Solución para desteñir: TCA al 10%.
8.7.-IDENTIFICACIÓN DEL PATRÓN DIFERENCIAL CON ZIMOGRAMAS
Los zimogramas son una herramienta importante en el análisis de enzimas,
ya que podemos comprobar visualmente la presencia de actividad, en condiciones
diferentes de incubación, variando por ejemplo pH, temperatura, agentes
inhibidores, ó cualquier otro cambio en el medio de incubación.
8.7.1.-DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD EN ZIMOGRAMAS 1-D
Los extractos de enzimas se analizaron utilizando el sistema SDS-PAGE al
11%, Laemmli de 1970 (Shewry et. al 1995) con algunas modificaciones. Se
utilizaron las cámaras de electroforesis mini-protean II de Bio-Rad, y se corrieron a
70 volts por un tiempo de aproximadamente 4 horas (hasta que las bandas
salieran del gel) En éste caso se corrieron SDS-PAGE co-polimerizados con
gelatina al 0.1%. Las cantidades de cada reactivo y las concentraciones utilizadas
se escriben en el cuadro siguiente:
35
# de geles [acrilamida]% 1 11 GEL SEPARADOR (conc.) Vol. (mL) Peso (g) Agua destilada 3.35 Tris-HCl pH 8.8 1.5M 2.50 SDS 10% 0.10 Stock de acrilamida/bis 30% 3.69 PSA 10% 0.10 TEMED 0.02 Gelatina 0.01 9.76 Volumen final 10.07 Agregar mas agua destilada 0.31
GEL CONCENTRADOR (conc.)
Vol. (mL)
Agua destilada 6.10 Tris-HCl pH 6.8 0.5M 2.50 SDS 10% 0.10 Stock de acrilamida/bis 30% 1.30 PSA 10% 0.10 TEMED 0.02 Volumen final 10.12
Una vez preparadas las soluciones, se procede a montar el equipo de
electroforesis. En primer lugar los cristales donde polimerizará el gel deben estar
perfectamente limpios y bien ensamblados en el portacristal. Se deben llenar de
agua para verificar que no haya fuga. Para preparar un gel de 1.5 mm de espesor,
se procede de la siguiente manera: en un matraz de 50 mL se disuelve 0.01 g de
gelatina en 3.6 mL de agua destilada, luego se calienta a 54 °C, para disolver la
gelatina. Posteriormente se transfiere a un tubo falcon de 50 mL, se le agregan 2.5
mL de la solución de Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8; 100 µL de SDS al 10%; 3.69 mL del
stock de acrilamida/bis; 150 µL de PSA y 20 µL de TEMED, (se debe mezclar
suavemente) estos dos últimos reactivos son los que catalizan la polimerización,
por lo cual, una vez agregados, se debe colocar inmediatamente dentro de los
cristales, utilizando una pipeta de transferencia, hasta una altura que permita
posteriormente colocar el gel concentrador, es importante que se rellene de agua
el cristal para evitar que el gel entre en contacto con el aire mientras polimeriza
36
(entre 5 a 10 minutos). Enseguida se prepara el gel concentrador: en un tubo
falcon de 50 mL se colocan 6.1 mL de agua destilada, 2.5 mL de Tris-HCl 0.5 M,
pH 6.8, 100 µL de SDS al 10 %, 1.3 mL del stock de acrilamida/bis, 150 µL de
PSA y 20 µL de TEMED (se debe mezclar suavemente). Se coloca dentro de los
cristales con una pipeta de transferencia hasta que se derrame un poco fuera de
los cristales, procurando desplazar el agua residual hacia afuera, inmediatamente
después se coloca el peine que formará los posillos. Después de unos minutos
polimeriza, se quita el peine y se transfieren los geles al interior de la cámara de
electroforesis, ésta se llena cubriendo los electrodos, con buffer de corrida, el cual
se prepara de la siguiente manera:
BUFFER DE CORRIDA Tris base 3 g Glicina 14.4 g SDS 1 g Aforar a 1000 mL con agua destilada
El pH debe estar alrededor de 8, pero no se debe ajustar con ningún reactivo.
Para la preparación de las muestras se asegurará que el buffer de carga no
contenga agentes reductores, tampoco se debe calentar la muestra, además debe
de contener una mínima cantidad de azul de bromofenol (al 0.02% en alcohol
etílico). BUFFER DE CARGA
Glicerina 40% SDS 2% En tris-HCl 0.08 M, pH 8
Los extractos de enzimas se centrifugaron por 5 minutos a 4°C para
eliminar los componentes turbios. En un tubo Eppendorf se mezcla el buffer de
carga con la muestra, la relación debe ser 2:1, (buffer/extracto). Se cargan 15 µL
por pocillo. Se corre a 80 volts, hasta que se observe salir el colorante por debajo
del cristal. Al terminar se apaga la fuente de poder, y los geles se despegan del
cristal cuidadosamente, para no romperlos ó tirarlos. Los geles se colocan en
platos planos (Tupperware®) con tapadera, se agitan por 30 minutos con una
solución de Tritón X-100 al 2% a temperatura ambiente. Luego se enjuaga con
37
agua destilada. Posteriormente se incuba por toda la noche en diferentes
condiciones de pH. Para ello se utiliza el buffer de acetatos 100 mM, pH3; buffer
de acetatos 100 mM, pH 4.7; buffer de fosfatos 100 mM, pH 7; buffer de
carbonatos 100 mM, pH 8.5; todos complementados con cisteína 2mM, esto
protegerá la funcionalidad de las enzimas, ya que protege los puentes disulfuro.
En seguida se tiñen los geles agitándolos durante dos horas aproximadamente,
con una solución de Amido Black (Naphthol blue Black) al 0.1 % (p/v) y ácido
acético al 7% (p/v), en agua destilada. Posteriormente se deben desteñir los geles
con una solución de ácido acético al 7% (v/v), en agua destilada.
8.7.2.-DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD EN ZIMOGRAMAS 2-D
Las tiras de Gradiente en pH Inmovilizado (IPG) se ponen a hidratar con
125 µL del buffer con la muestra, 100 µL de buffer y 25 µL de muestra (la muestra
es el extracto de enzimas del día X previamente dializado contra 2 L de buffer de
NaAc 5 mM, pH 4.7, y centrifugado por 2 min a 11,000 g´s) de la siguiente
manera:
Se coloca primero 125 µL del buffer con la muestra por el canal de la placa, la caja
debe estar un poco inclinada para colocar la proteína en una de las esquinas del
canal. Luego se colocan las tiras de IPG (de 7 cm) con los números frente a ti (con
el gel hacia abajo), evitando hacer burbuja. Por ultimo se coloca 0.7 mL de aceite
mineral encima de la tira, con el fin de no dejar escapar el buffer con la muestra.
Posteriormente se coloca la tapadera de la caja y se deja rehidratando a 4 ºC por
14-16 horas.
Primera dimensión. Isoelectroenfoque de proteínas
Se colocan las mechas (son los pequeños rectángulos de papel filtro Whatman #1,
que mide 1 cm de largo por 0.5 cm de ancho), dos mechas por canal, una en cada
extremo exactamente a la mitad de cada electrodo. Se agrega 8 µL de agua
nanopura a cada mecha, la cual ya debe estar en los canales. Se coloca la tira
rehidratada, con el gel hacia abajo, con mucho cuidado en la placa de IEF,
38
tomando en cuenta la carga de la tira con respecto a señalada en la placa. Se
agregan 0.7 mL de aceite mineral por tira. Luego de tapar la placa se coloca en el
equipo de Protean IEF Cell de acuerdo con su respectiva carga. Posteriormente se
abre el programa en el equipo de portean IEF Cell de la siguiente manera: se
prende el equipo de impresión, después se prende el equipo de protean IEF Cell,
luego se selecciona “stored method”, se elige el programa que se va a correr,
según sea el tratamiento que se le va a dar al gel, en este caso es el “FCQ”,
posteriormente se selecciona “Run method”, después se presiona “Enter # de
gels” e indica el numero de geles (2 o más), Luego se presiona el botón “star”,
para de esta forma comenzar a contar el tiempo durante el cual correrán los geles,
aproximadamente 5 horas (ó hasta que termine de correr el programa). Una hora
antes de terminar el programa se tiene que preparar el gel SDS-PAGE para correr
la segunda dimensión. Concluidas las cinco horas (más o menos) que dura el
isoelectroenfoque, se apaga el equipo y se retira la charola del equipo, el papel
impreso se tiene que jalar un centímetro para que salga toda la información, y así
cortarlo, de esta forma obtenemos la información detallada de la corrida del
programa. Las tiras de IPG se limpian levemente con papel húmedo Whatman
previamente humedecido, por el lado del gel, para quitar el exceso de aceite. Las
tiras se ponen en una charola limpia con el gel hacia arriba y se agrega 0.5 mL de
buffer de equilibrio (en este caso es SDS al 2%) y se agita levemente por 10
minutos, luego se tira el primer buffer por el lado plano de la placa, tratando de
quitar lo más que se pueda. Posteriormente se coloca el buffer de equilibrio II (en
este caso también es SDS al 2%) y se agita suavemente por 10 minutos. Al
terminar se sacan las tiras y se procede a montar el sistema SDS-PAGE
Segunda dimensión. SDS-PAGE al 11%, de 1mm de espesor
Para obtener una concentración final de acrilamida al 11%, el gel de electroforesis
se prepara de la siguiente manera.
H2O destilada * 2.75 mL
Tris-HCl 2 M pH 8.8 1.86 mL
SDS al 10 % 75 µL
39
Stock de acrilamida al 30 % 2.75 mL
PSA al 10 % 38 µL
TEMED 14 µL
*(Para que el porcentaje de gelatina sea del 0.1 %, se pesan 0.0075 g de gelatina
para electroforesis en un vaso de precipitados pequeño, y se le agrega el H2O
destilada (2.75 mL) caliente para que se disuelva bien, todo esto en un agitador
con bala magnética en agitación lenta, también agregarle ahí mismo el Tris-HCl, el
SDS y la acrilamida. Se pueden poner unos minutos a 4 ºC para que polimerice
rápido).
Posteriormente se recortan los extremos de la tira IPG para que entre en el
posillo, solamente si se va a polimerizar con peine; primero se debe llenar con
buffer de corrida, luego introducir la tira, después la muestra en el pocillo, la cual
debe tener buffer de muestra, y al ultimo la cubierta de agarosa, una vez hecho
esto se coloca en la cámara de electroforesis. Luego se vierte lentamente el buffer
de corrida y se hecha a andar a 70 volts hasta que salga el colorante por debajo
de los geles. Se sacan los geles con cuidado y se agitan a temperatura ambiente
por 30 minutos con Triton X-100 al 2%. Posteriormente se incuba en buffer de
NaAc 50mM, pH 4.7, cisteína 2 mM por toda la noche. Posteriormente se tiñe el
gel con una solución de Amido Black (Naplthol blue black al 0.1 % (p/v), Acido
acético al 7 % (p/v) en agua destilada), por toda la noche. Después se destiñe con
ácido acético al 7% (v/v).
40
9.- RESULTADOS, FOTOS, GRÁFICAS Y DISCUSIÓN
9.1 SELECCIÓN DEL GERMINADO
Se encontró que durante el tiempo de germinación, las semillas de trigo no
presentan diferencia significativa, ni en el tamaño, ni en la morfología de la
plántula. Las dos diferentes condiciones fueron: i) ausencia de luz a 20°C y ii)
temperatura ambiente, aproximadamente 25°C, con 18 horas de luz y 6 de
oscuridad. Solamente se notó la falta de color verde en las plántulas de semillas
que germinaron en ausencia de luz. Esto se debe a la ausencia de clorofila, ya
que por no tener luz, la plántula no activa su sistema de captación, en el cual los
cloroplastos son los encargados de llevar a cabo esta reacción. La clorofila
absorbe la luz de longitud de roja violeta y azul y refleja la verde. Sin embargo la
germinación de las semillas se llevó a cabo bajo las dos condiciones. En los
siguientes experimentos se utilizarán las semillas de trigo germinado a
temperatura ambiente (25ºC), con 18 horas de luz y 6 horas de oscuridad. En la
foto 1 se muestra una de las cajas petri, con semillas de trigo germinadas en el día
5 después de la imbibición.
Figura 1. Germinación del trigo en el laboratorio. Semillas de trigo en el quinto día después de comenzada la germinación.
41
9.2.- ANÁLISIS DE ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA EN SOLUCIÓN
La hidrólisis de proteínas por endoproteinasas, en solución, se lleva a cabo
mezclando un sustrato proteínico con éstas enzimas, las cuales remueven
fracciones del sustrato en tiempos determinados, el sustrato sin hidrolizar se
precipita con TCA, y se lee la absorbancia del sobrenadante a 280 nm. En teoría,
los aminoácidos y péptidos pequeños no son precipitados por el TCA, por ello son
detectados en el sobrenadante, ya que los residuos de tirosina, triptófano y
fenilalanina absorben la energía en esa longitud de onda.
9.2.1.- ANÁLISIS DE ACTIVIDAD CON GELATINA
Cuando se utilizó la gelatina como sustrato, la hidrólisis de ésta, pareció no
haberse llevado a cabo normalmente (gráfica 1). Este hecho fue debido al tipo de
sustrato. Un hecho evidente es que se detectó mayor absorbancia cuando no se
utilizó gelatina, probablemente se debe tanto a la selectividad de las enzimas,
como al poco contenido de triptófano y tirosina de la gelatina. Por lo tanto, cuando
se midió la absorbancia (en 280 nm) durante el tiempo que se mantuvo la cinética,
la curva de extracto crudo de enzimas con gelatina, siempre quedó por debajo de
la otra curva, en la que la hidrólisis se llevó a cabo únicamente con extracto crudo
de enzimas en si mismo. Otro punto importante, es la forma en que se detuvo la
reacción, para lo cual se utilizaron dos reactivos diferentes (Jones B. L. et al,
1998); en primer lugar TCA, sin embargo, la gelatina no precipita bien con este
reactivo; posteriormente se utilizó isopropanol, sin embargo algunas proteínas de
los extractos de enzimas (por ejemplo las gliadinas del gluten) no precipitan,
incluso se disuelven en éste alcohol. Lo cual obligó a buscar otras formas para
cuantificar la actividad enzimática.
42
Gráfica de actividad enzimática del extracto 1 con gelatina a 280 nm
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0 20 40
tiempo (min)
Abs
60
Grafica 1.- Hidrólisis de la gelatina. La línea roja muestra la hidrólisis de la gelatina con el extracto de enzimas. La línea verde muestra la hidrólisis del mismo extracto, sin gelatina. La línea negra muestra la ausencia de hidrólisis por no contener extracto de enzimas.
9.2.2.- ANÁLISIS DE ACTIVIDAD CON AZOGELATINA
La hidrólisis de la azogelatina en solución, aparentemente resolvió el dilema
que se tuvo con la gelatina. Empleando la azogelatina como sustrato, se notó que
precipita con TCA. Además los péptidos y residuos de aminoácidos liberados
durante la hidrólisis enzimática, se pueden diferenciar de los que se liberan de
otras proteínas, que pudieran estar contaminando el extracto crudo de enzimas, ya
que los residuos y péptidos liberados de la azogelatina, se detectan
exclusivamente a 440 nm. Otra característica importante de la azogelatina es la
solubilidad, de pH 3.0 a 9.0 (Jones B. L. et al 1998), porque nos da un amplio
rango de manipulación.
43
cinetica de extracto crudo "dia 4" con azogelatina
-0.100
-0.050
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
tiempo (min)
Abs
orba
ncia
a 4
40
e+s
e+s desn.
Gráfica 2. Actividad enzimática del extracto del día 4 con azogelatina. La línea negra es el tratamiento con enzima más azogelatina (e + s). La línea roja es enzima desnaturalizada más azogelatina (e + s desn.).
En la gráfica 2 se puede observar la cinética del extracto crudo de enzimas
del día 4. A lo largo de 180 minutos se registró la absorbancia en una longitud de
onda de 440 nm. Realmente la cinética del extracto 4 y la del extracto 6 (gráfica 3)
tiene un comportamiento muy parecido, por lo que se puede deducir algunos
puntos importantes: En primera lugar, la habilidad de éstos extractos por hidrolizar
la azogelatina, Segundo, que ambos extractos (del día 4 y día 6), tienen la misma
cantidad de proteasas y presentan actividad a pH bajo, alrededor de 4.7, puesto
que todos los experimentos se hicieron en buffer de NaAc 50 mM, pH 4.7. El tercer
punto es, que se puede tratar de la misma clase de enzimas, y como se puede
observar en la gráfica 3, no ha perdido actividad alguna, desde el cuarto día hasta
el sexto. Otra cuestión importante es, que no se afecta la selectividad del sustrato,
ya que es mayor la concentración inicial, en este caso de azogelatina, que el
sustrato contenido en el mismo extracto, es decir las proteínas del gluten.
44
cinética del extracto de enzimas "dia 6" con azogelatina
-0.100
-0.050
0.000
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
0.350
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
tiempo (min)
Abso
rban
cia
a 4
40
e+s(e+s) desn.s
Gráfica 3. Actividad enzimática del extracto del día 6 con azogelatina. La línea azul es el tratamiento con enzima más azogelatina (e + s). La línea roja es enzima desnaturalizada más azogelatina (e + s desn.). La línea amarilla es el sustrato sin enzimas.
9.2.3.- ANÁLISIS DE ACTIVIDAD CON NINHIDRINA
Los experimentos con ninhidrina no se llevaron a cabo, sin embargo el
protocolo esta listo para trabajar. La curva estándar se llevó a cabo glicina, sin
embargo se pudo haber realizado con algún otro aminoácido. Se midió
absorbancia en 570 nm. En éste caso se utilizó buffer de acetatos 50 mM, pH 3.0,
para las diluciones de glicina. Realmente se deberían preparar varias curvas
estándar, en función de las pruebas de actividad y selección del pH óptimo.
45
curva estandar con ninhidrina a 570 nm, a pH 3
y = 2.5022x + 0.0137R2 = 0.9921
0.0000.100
0.2000.3000.400
0.5000.6000.700
0.8000.900
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350
conc. (mM)
Abs
Gráfica 4.- Curva estándar con ninhidrina y glicina. Se midió absorbancia en 570 nm. Se utilizó buffer de acetatos 50 mM, pH 3.0 para las diluciones de glicina.
9.3.- ANÁLISIS DE ACTIVIDAD CON SDS-PAGE DESNATURALIZANTE
El grado de separación de las gliadinas y gluteninas en los SDS-PAGE es
suficientemente bueno, para comprobar que las cuatro variedades presentan un
patrón de proteínas similares (figura 2); sin embargo es difícil identificar las
variantes de los alelos, que sirven como marcadores genéticos de parámetros en
la calidad del trigo. Una alternativa es emplear cámaras de electroforesis de mayor
longitud, que las que se manejaron en este trabajo. De esta manera las gluteninas
se separan con más claridad; además se podría utilizar la vinilpiridina en el buffer
de carga, con el fin de aumentar la resolución de cada banda. En el caso de las
gliadinas, se pueden estudiar mediante geles de electroforesis ácida (A-PAGE), es
el sistema más empleado para éste tipo de proteínas, porque se mejora la
resolución y separación de las bandas (no se muestran resultados). En la figura
dos se puede observar el patrón de proteínas extraídas con el sistema Laemmeli
(Shewry et. al. 1995), Las gluteninas y gliadinas están separadas entre los
corchetes. Se pueden ver la separación en función a su desplazamiento por su
peso molecular, las de menor peso, α/β-gliadinas, en la parte de abajo, las γ-
46
gliadinas un poco más arriba y las de mayor peso, ω-gliadinas, hasta arriba. De
igual forma las gluteninas de mayor peso molecular (HMW) en la parte de arriba y
las de bajo peso molecular (LMW) abajo. Las cuatro variedades de trigo son:
Bimbo-1 (B-1), Bimbo-4 (B-4), Bimbo-5 (B-5) y Snowbird (Sb). En los último dos
carriles se cargó nuevamente la variedad Bimbo-1 (X) y la Bimbo-4 (Y). Se utilizó
un marcador de pesos moleculares en el primer carril de la izquierda.
Figura 2.- Gliadinas y Gluteninas en SDS-PAGE desnaturalizante. Proteínas totales extraídas de cuatro variedades de trigo, Bimbo-1 (B-1), Bimbo-4 (B-4), Bimbo-5 (B-5) y Snowbird (Sb). La X es B-1 y la Y es B-4. kD son Kilodalton.
Las proteínas hidrolizadas con los extractos enzimáticos de los días 2, 4, 5
y 8 se cargaron en un gel de SDS-PAGE desnaturalizante (figura-3), para observar
el patrón de reducción de proteínas. La reacción se llevo acabo por una hora, en la
cual se incubó a 37 ºC en un thermomixer a 300 rpm. También se cargó un
marcador de pesos moleculares. El último carril de la derecha se cargó con
proteínas totales. En los carriles 2, 4 y 8 (figura 3), se observa la desaparición de
proteínas de mayor peso molecular, pero es más evidente en el carril 5; de igual
manera aparecen nuevas bandas a la altura de menor peso molecular en éstos
cuatro carriles, lo que da la pauta para confirmar que existe actividad
endoproteasa en el germinado de trigo en esos días, pero es mayor alrededor del
día 5. El color azul que se observa a lo largo de cada carril se pudo deber a la falta
47
de SDS ó algún agente reductor (mercaptoetanol, DTT, u otro), los cuales
mejorarían la carga y la conformación extendida de las proteínas en su migración
al polo positivo (ánodo), durante la electroforesis.
Figura 3.- En éste gel de SDS-PAGE se observa la degradación enzimática de las proteínas extraídas de los granos de trigo. Después de 1 hora de reacción con el extracto proteolítico del segundo día de germinado, cuarto día de germinado, quinto día de germinado, octavo día de germinado y en el último carril derecho se observan las proteínas totales.
9.4.- ANÁLISIS DE ACTIVIDAD CON ZIMOGRAMAS 1-D Y 2-D
Un método específico para el análisis de actividad proteolítica, se realiza
sobre gel de poliacrilamida, co-polimerizado con gelatina, estos sistemas son
llamados zimogramas.
Cada pocillo del gel se cargó con la misma cantidad de proteína (5 µg). Los
extractos analizados son de los días 2, 4 y 6. Se cargaron los extractos en forma
nativa y desnaturalizada (figuras 4, 5, 6 y 7). Es por ello que se preparó un buffer
de carga libre de agentes reductores y de cualquier otro compuesto que altere la
funcionalidad de las proteasas. Por el contrario en los carriles con enzimas
desnaturalizadas, se utilizó calor y agente reductor (95°C, y β-mercaptoetanol)
para confirmar la existencia de proteínas en el extracto. El gel de la figura 4, se
48
incubó con buffer de acetatos 100 mM, pH 3, en el podemos observar la hidrólisis
de la gelatina (las zonas claras) en la parte superior de los carriles, lo que confirma
la presencia de proteasas, con pesos moleculares más altos que en los geles
incubados a pH 4.7, pH 7.02 y pH 8.5 (figuras 5, 6 y 7 respectivamente).
Figura 4.- Análisis de actividad proteolítica sobre gel de poliacrilamida co-polimerizado con gelatina. Se cargo la misma cantidad de proteína (5 µg) por pocillo. Después de finalizar la electroforesis se incubó toda la noche con Buffer de acetatos 100 mM, pH 3. Los extractos analizados son de los días 2, 4 y 6, nativas y desnaturalizadas (95°C, más β-mercaptoetanol).
En ningún zimogramas se detecto hidrólisis alguna para los carriles de las
enzimas desnaturalizadas. El patrón de hidrólisis es similar al publicado por
Domínguez y Cejudo (1995). La mayor cantidad de actividad se detectó en el gel
incubado a pH 4.7, específicamente en el carril del extracto 6. Es por ello que en
los próximos experimentos se trabajará principalmente con él. Los experimentos
se repitieron 2 veces, y se obtuvieron los mismos resultados.
49
Figura 5.- Análisis de actividad proteolítica sobre gel de poliacrilamida co-polimerizado con gelatina. Se cargo la misma cantidad de proteína (5 µg) por pocillo. Después de finalizar la electroforesis se incubó toda la noche con Buffer de acetatos 100 mM, pH 4.7. Los extractos analizados son de los días 2, 4 y 6, nativos y desnaturalizados.
Figura 6.- Análisis de actividad proteolítica sobre gel de poliacrilamida co-polimerizado con gelatina. Se cargo la misma cantidad de proteína (5 µg) por pocillo. Después de finalizar la electroforesis se incubó toda la noche con Buffer de fosfatos 100 mM, pH 7.02. Los extractos analizados son de los días 2, 4 y 6, nativos y desnaturalizados.
50
Figura 7.- Análisis de actividad proteolítica sobre gel de poliacrilamida co-polimerizado con gelatina. Se cargo la misma cantidad de proteína (5 µg) por pocillo. Después de finalizar la electroforesis se incubó toda la noche con Buffer de carbonatos 100 mM, pH 8.5. Los extractos analizados son de los días 2, 4 y 6, nativos y desnaturalizados.
La separación de proteínas en segunda dimensión (figura 8) es otro método
importante para estudiar las enzimas. Ésta se llevó a cabo en dos fases. En la
primera separación, llamada isoelectroenfoque (IEF), las proteínas se acomodan
en su carga neta cero. A este pH se le conoce como pH isoeléctrico, o punto
isoeléctrico. La muestra, que en éste caso es el extracto de enzimas del día 1, se
coloca sobre una tira, que contiene el gel en una gradiente de pH inmobilizado
(IPG), a ésta se le colocan dos electrodos en los extremos y se le aplica un
potencial de varios cientos de volts. Las proteínas con cargas positivas
(catiónicas) son atraídas al electrodo negativo (cátodo) y las proteínas con cargas
negativas (aniónicas) al electrodo con carga positiva (ánodo). En la segunda
separación, la tira se coloca en un sistema SDS-PAGE, para resolverlas en
función a su peso molecular. En la figura 8 se señala con una flecha el lugar en
donde se detectó actividad proteolítica en un zimogramas 2-D (no se muestra la
figura), la enzima presenta un pI de 6.8 y peso molecular de 23 kD
aproximadamente. Aparentemente no se observa alguna proteína en el lugar
51
señalado. Es por esto que para los próximos experimentos, los geles se teñirán
con un colorante que aumente la resolución, como por ejemplo el nitrato de plata.
Figura 8.- Patrón del extracto de enzimas del día 1 en un sistema 2-D SDS-PAGE.
10.- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
De las cuatro variedades de trigo que se comenzaron a utilizar, se eligió la
variedad Bimbo-1 para realizar las pruebas enzimáticas en este trabajo. Porque es
la que muestra mayor variedad en el patrón de proteínas.
En términos de aplicación industrial, el extracto de enzimas podría utilizarse
en la producción de pan. Durante la elaboración del pan, un paso importante es la
fermentación de la masa la cual dura alrededor de 3 a 4 horas, dependiendo de la
temperatura. Este paso es crucial, puesto que la contribución de levaduras al
acidificar gradualmente el medio, proporcionaría un pH dinámico, que favorece la
activación de diferentes enzimas. Al comienzo de la fermentación el pH se
encuentra arriba de 6, el cual favorecería a las neutro-proteasas, mientras que el
pH alrededor de 5, a la mitad de el tiempo de fermentación favorecería a las
ácido-proteasas (Domínguez y Cejudo, 1995).
52
Para solucionar el problema de la contaminación de proteínas, que están
contenidas en los extractos crudos de enzimas, se realizaran los experimentos de
actividad alternativos, utilizando sustratos como la azogelatina, la cual, al ser
hidrolizada, sus residuos serán absorbidos a 440 nm en lugar de 280 nm.
Sería de gran importancia analizar el efecto de diferente clase de
inhibidores de proteasas, para caracterizar la gran variedad de enzimas, que
podemos observar en las diferentes bandas. De esta manera clasificaríamos de
acuerdo a la nomenclatura de la Comisión de Enzimas (CE). También
comprenderíamos mejor la relación entre la estructura y funcionalidad. Con estos
zimogramas queda demostrado el amplio margen de actividad que presentan las
enzimas del germinado. Sobre todo las enzimas del extracto 6. Cabe señalar que
aún falta repetir varios experimentos y realizar nuevos, con el fin de confirmar
absolutamente todos los resultados.
Las pruebas inmunológicas se realizarán posteriormente, tanto en el
laboratorio de la Universidad de Colima, así como, en la UNAM.
53
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