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Obtención y evaluación de un preparado líquido como promotor del crecimiento de cultivos de tomate (Solanum lycopersicum L.) empleando la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus GLORIA MARÍA RESTREPO FRANCO Facultad de Ciencias Agropecuarias Doctorado en Ciencias Agrarias Universidad de Caldas Manizales, Colombia 2014
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Obtención y evaluación de un preparado líquido como
promotor del crecimiento de cultivos de tomate (Solanum
lycopersicum L.) empleando la bacteria
Gluconacetobacter diazotrophicus
GLORIA MARÍA RESTREPO FRANCO
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Doctorado en Ciencias Agrarias
Universidad de Caldas
Manizales, Colombia
2014
Obtención y evaluación de un preparado líquido como
promotor del crecimiento de cultivos de tomate (Solanum
lycopersicum L.) empleando la bacteria
Gluconacetobacter diazotrophicus
Tesis para optar el título de
Doctora en Ciencias Agrarias de:
GLORIA MARÍA RESTREPO FRANCO
Bajo la dirección del Doctor:
ÓSCAR JULIÁN SÁNCHEZ TORO
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Doctorado en Ciencias Agrarias
Manizales, Colombia
2014
Agradecimientos
Instituciones y oficinas
Al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (COLCIENCIAS),
por la financiación parcial de la tesis doctoral a través del proyecto: Obtención y evaluación de
un promotor para el crecimiento de cultivos de tomate y zanahoria a base de Gluconacetobacter
diazotrophicus.
Universidad de Caldas:
o Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados, por la cofinanciación de la Tesis Doctoral y
por el apoyo en las gestiones para su ejecución
o Instituto de Biotecnología Agropecuaria
o Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria
o Laboratorio de Química y Fertilidad de Suelos
o Laboratorio de Nutrición Animal y Vegetal
o Granja Tesorito, por el uso del semillero y terrenos para los ensayos de campo
Universidad Católica de Manizales:
o Rectoría, Vicerrectoría Académica y Vicerrectoría Administrativa
o Dirección Centro de Investigación, Proyección y Desarrollo, por la cofinanciación de la
Tesis Doctoral
o Instituto de Investigación en Microbiología y Biotecnología Agroindustrial, por el uso de
los laboratorios y sus instalaciones para el desarrollo de la Tesis
o Grupo de Investigaciones Biológicas, por el apoyo permanente durante el desarrollo de la
investigación
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária-EMBRAPA, Agrobiologia (Brasil), por la
realización de la pasantía.
Doctores e investigadores
o Dr. Óscar Julián Sánchez Toro, Director de la tesis Doctoral, por su apoyo y orientación
permanentes en cada uno de los procesos académicos durante el desarrollo de todo el
trabajo
o Dra. Graciela Chalela profesora de la Universidad Autónoma de Bucaramanga, Dr. Juan
Carlos Higuita profesor de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales,
integrantes del Comité Tutorial por su evaluación oportuna
o Dra. Veronica Massena Reis, investigadora de Embrapa-Agrobiología (Brasil), por
compartir sus conocimientos sobre G. diazotrophicus
o Dra. Annia Hernández, investigadora de la Universidad de la Habana, por su apoyo
permanente, su amistad incondicional y orientaciones pertinentes
o Dr. Nelson Ceballos Aguirre, docente de la Universidad de Caldas, por su apoyo
incondicional en la orientación de los experimentos en campo
o Dr. Francisco Javier Henao Uribe, Director Doctorado en Ciencias Agrarias
Estudiantes de Postgrados y Compañeros
o A Luis Felipe Valencia, Sandra Marulanda, Fernando Galeano, Karol González, Javier
Mantilla y Jorge Andrés Cuéllar, por ser simplemente incondicionales o Esp. Jennifer Gaviria
Agradecimientos personales
Especialmente a mi hijo y a mi familia por esperarme con paciencia.
1. Introducción
1.1. Contexto general
1.1.1. Campo de aplicación
La producción de biofertilizantes, especialmente de inoculantes microbianos formulados a
partir de bacterias diazótrofas, ha sido estudiada en diversos centros de investigación y
universidades en el mundo con múltiples resultados a escala de laboratorio, y algunos
desarrollos ya se han implementado a nivel industrial. En Colombia en el año 2013 se
encuentran registrados 13 bioinsumos en el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA)
declarados con actividad biológica para la fijación biológica de nitrógeno; entre estos productos
nueve son formulados a partir de microorganismos como Azotobacter chroococcum, Rhizobium
japonicum, Rhizobium leguminosarum y Bradyrhizobium japonicum, los cuales están presentes
de manera individual. Además se encuentran registrados cuatro productos en mezcla, entre los
que se resaltan las asociaciones entre Azotobacter chroococcum-Azospirillum, Azospirillum
brasilense-Azotobacter chroococcum-Lactobacillus acidophilus-Saccharomyces cerevisiae,
Azotobacter chroococcum-Pseudomonas aureofaciens-Bacillus subtilis-Bacillus licheniformis-
Bacillus megaterium y Azospirillum brasilense-Pseudomonas fluorescens.
El desarrollo de biofertilizantes se ha centrado tradicionalmente en la producción en turba
de Rhizobium, con aplicación en cultivos de leguminosas especialmente de soya. Actualmente
se están explorando otras alternativas a través del desarrollo de inoculantes a base de bacterias
fijadoras de nitrógeno como Herbaspirillum y Gluconacetobacter; para estos microorganismos
se requiere definir los medios de cultivo adecuados en la producción de altas concentraciones
de biomasa, conservando las características fisiológicas de interés como fijación biológica de
nitrógeno, producción de fitohormonas y solubilización de fósforo, entre otras.
Uno de los mayores obstáculos para la utilización de inoculantes microbianos es la
inconsistencia en la reproducibilidad de los datos, lo cual está relacionado con factores como
las condiciones edafo-climáticas, interacción con la biota del suelo, selección de cepas y
calidad de los inoculantes. En general, el potencial de los inoculantes no se ha explotado
adecuadamente ya que los productores no han realizado evaluaciones rigurosas en el diseño de
medios para su producción con el fin de garantizar la expresión de las características deseadas
en el cultivo de interés, siendo liberados al mercado con una evaluación parcial en este sentido.
Gluconacetobacter diazotrophicus es una bacteria fijadora de nitrógeno y fue la primera
bacteria acética aislada de caña de azúcar (Cavalcante y Dobereiner, 1988). G. diazotrophicus
es uno de los principales microorganismos endófitos estudiados como organismo modelo para
evaluar las interacciones planta-bacteria en plantas no leguminosas (Cocking, 2003). La
bacteria tiene características fisiológicas importantes que le permiten interactuar con la planta.
En primer lugar, la levanasacarasa (EC 2.4.1.10) es una exoenzima constitutiva, la cual fue
reconocida en 14 cepas de G. diazotrophicus recuperadas de diferentes plantas en diversas
regiones geográficas. Tiene la capacidad de colonizar caña de azúcar en condiciones normales
(sacarosa 10%). El estrés osmótico causado por la alta concentración de sacarosa puede inhibir
el crecimiento de otros microorganismos, pero favorece el crecimiento de esta bacteria. Estas
condiciones representan el nicho que G. diazotrophicus tiene que enfrentar cuando se da la
colonización de los tejidos de las plantas (especialmente en caña de azúcar); el estrés osmótico
puede jugar un papel importante en el proceso de fijación de nitrógeno en este cultivo.
Entre las bacterias fijadoras de nitrógeno el estudio de G. diazotrophicus es de mayor
interés porque lleva a cabo la fijación de nitrógeno en condiciones de crecimiento aerobias,
debido a que el oxígeno es el intermediario que permite la generación de una gran cantidad de
ATP requerida para la fijación de nitrógeno. Este proceso permite considerar a la bacteria G.
diazotrophicus como un endófito capaz de excretar casi la mitad del nitrógeno fijado, en una
forma que es potencialmente disponible para las plantas (Cohjo et al., 1993; Soto-Urzúa y
Baca, 2001). Por lo tanto es considerada una bacteria promotora de crecimiento debido a sus
características de fijación biológica de nitrógeno, producción de ácido indolacético y
solubilización de fósforo.
El tomate es una planta de la familia de las solanáceas originaria de México. Es una baya
coloreada que va desde tonalidades amarillas hasta el rojo debido a la presencia de pigmentos
como licopenos y carotenos. Es una hortaliza que se consume en todo el mundo tanto de
manera fresca como procesada en diferentes presentaciones (salsa, puré, zumo y deshidratado,
entre otras). El tomate es uno de los cultivos de hortalizas que, debido a su susceptibilidad al
ataque de diferentes patógenos y plagas, requiere del uso frecuente de plaguicidas y
fertilizantes, trayendo como consecuencia riesgos serios de salud por la exposición permanente
a los químicos, ocasionando además deterioro del medio ambiente. Por ello, el tomate es uno de
los cultivos que demanda el uso de insumos biológicos con el fin de mejorar su estado
fitosanitario mediante la implementación de Buenas Prácticas Agrícolas, y la búsqueda del
aumento de mayores estándares de productividad y rentabilidad del cultivo. Para dicho aumento
de la productividad, una importante alternativa es el uso eficiente de inoculantes microbianos
(Zambrano y Riaño, 2008).
1.1.2. Motivación
Varios fueron los motivos que llevaron a proponer este trabajo en el marco del Doctorado
en Ciencias Agrarias de la Universidad de Caldas, entre los que se destacan:
Búsqueda del aumento de mayores estándares de productividad y rentabilidad de los
cultivos de hortalizas a nivel nacional que permitan el desarrollo socio-económico de los
productores, especialmente del sector de las hortalizas, promoviendo la protección del empleo,
el desarrollo social y ambiental de la cadena productiva y la generación de conocimiento
innovador de aplicación social. Por ello, el uso eficiente de inoculantes microbianos se
constituye en una importante alternativa para el aumento de la productividad.
Necesidad de vincular las empresas nacientes en producción de inoculantes microbianos
con universidades y centros de investigación a fin de mejorar los procesos de producción para
que cumplan con las buenas prácticas de manufactura, asegurar la calidad de los inoculantes,
aumentar su estabilidad y vida útil, incrementar la efectividad de los productos en el campo y
desarrollar nuevos productos microbianos, entre otros aspectos tecnológicos.
Necesidad de llevar a cabo investigación y desarrollo con inoculantes microbianos
endófitos en cultivos diferentes a las leguminosas, a fin de ampliar el espectro de aplicaciones y
aumentar la efectividad de los mismos.
Desde el descubrimiento de la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus, y a pesar de
que ha sido encontrada en asociación endófita con diferentes plantas, son escasos los estudios
desarrollados para conocer su efecto sobre el crecimiento vegetal en hospederos diferentes a la
caña de azúcar.
En Colombia, según nuestro conocimiento, no se han realizado trabajos de
investigación en torno a la producción de inoculantes microbianos a base de G. diazotrophicus,
que tengan en cuenta la rigurosidad de los procesos de innovación y desarrollo, abarcando
aspectos como (i) evaluación de técnicas de screening para la selección de microorganismos
diazótrofos, (ii) evaluación de interacciones y ecología microbiana del microorganismo de
interés, (iii) producción masiva y formulación de productos estables- efectivos- seguros y
económicos, (iv) evaluación en campo y su interacción con otros productos biológicos como
opción para el manejo integrado de cultivos.
Este trabajo fue realizado entre agosto de 2009 y diciembre de 2013 en los laboratorios del
Instituto de Biotecnología Agropecuaria y la Granja Tesorito de la Universidad de Caldas y, en
los laboratorios del Instituto de Investigación en Microbiología y Biotecnología Agroindustrial
de la Universidad Católica de Manizales. La investigación contó con la financiación del
Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias), a través de la
Convocatoria 521–Proyectos de Investigación Científica o Tecnológica – año 2010. Igualmente
esta tesis tuvo financiación por parte de la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la
Universidad de Caldas, a través de la Convocatoria para la Financiación de Proyectos de
Investigación de Estudiantes de Postgrado 2009 y del Centro de Investigación, Proyección y
Desarrollo de la Universidad Católica de Manizales, a través de la Convocatoria para
Financiación de Proyectos de Investigación 2009. Para el desarrollo de la presente tesis
doctoral se han involucrado los recursos, especialmente talento humano e infraestructura
existente, del Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria y del Grupo en Análisis en
Sistemas de Producción Agropecuaria de la Universidad de Caldas, y del Grupo de
Investigaciones Biológicas de la Universidad Católica de Manizales (UCM).
La autora de esta tesis realizó una pasantía internacional en la Empresa Brasileira de
Pesquisa Agropecuária, EMBRAPA, Agrobiologia (Seropédica, estado de Río de Janeiro,
Brasil), la cual es una institución de reconocida trayectoria mundial en el campo de aplicación
que aborda el presente trabajo. En esta entidad se realizó el primer reporte de la bacteria
Gluconacetobacter diazotrophicus, por lo tanto se recibió entrenamiento en aspectos relevantes
como el aislamiento, la caracterización bioquímica y molecular y la biología y bioquímica de
los aislados de G. diazotrophicus, así como en los métodos para evaluar la fijación biológica de
nitrógeno y la producción de ácido indolacético en laboratorio (in vitro).
Durante el desarrollo de esta investigación se realizaron dos trabajos paralelos que
consideran las competencias adquiridas en la formación doctoral especialmente en la
organización de las actividades de investigación, los cuales son: i) Creación del Instituto de
Investigación en Microbiología y Biotecnología Agroindustrial de la UCM en el segundo
semestre del 2011, el cual consta de cuatro laboratorios (microbiología agroindustrial, análisis
microbiológico de alimentos y aguas, biología molecular y estudio y caracterización
microbiana), desde donde se ha promovido el desarrollo de la línea de investigación en
inoculantes microbianos, a través de la vinculación de estudiantes de pregrado y posgrado; y ii)
Creación del Programa de Maestría en Microbiología Agroindustrial de la UCM.
La importancia del trabajo reside en la necesidad de ampliar el conocimiento en Colombia
en torno a la producción de un inoculante microbiano a base de la bacteria Gluconacetobacter
diazotrophicus. Entre los aspectos importantes para desarrollar un inoculante se cuenta el
aislamiento, selección y caracterización de las cepas de interés, la identificación de condiciones
para su crecimiento y la producción masiva de biomasa en medio líquido para su aplicación en
el cultivo de tomate. Adicionalmente el conocimiento acerca de cómo estas bacterias producen
la enzima nitrogenasa y el ácido indolacético, permite profundizar en la comprensión del
funcionamiento de las bacterias diazótrofas, lo que permite incrementar la eficiencia de las
fermentaciones sumergidas para la producción de biomasa. De igual forma, este conocimiento
es valioso para establecer el potencial que presentan estas bacterias en la relación con las
plantas y su aporte al mejoramiento de las condiciones para el establecimiento de cultivos de
tomate más productivos
1.1.3. Estructura de la tesis
El documento de la tesis se desarrolló en ocho capítulos. En el capítulo uno se presenta el
estado del arte del campo temático de la tesis, el cual contiene una descripción acerca del
cultivo de tomate y las necesidades que tiene con relación a la fertilización y uso de
bioinsumos. Posteriormente se realiza la descripción de los bioinsumos con su clasificación e
importancia en la economía agrícola y por último la descripción de las características que hacen
de Gluconacetobacter diazotrophicus una bacteria promotora de crecimiento en plantas no
leguminosas (fijación biológica de nitrógeno, producción de compuestos indólicos y
solubilización de fósforo), los requerimientos de los medios de cultivo para el aislamiento,
cuantificación y producción de biomasa de la bacteria y la relación de G. diazotrophicus con
cultivos de importancia económica como caña de azúcar, café y hortalizas.
En el capítulo dos se incluye el primer artículo producto de esta tesis doctoral y el cual está
relacionado con el aislamiento del género Gluconacetobacter a partir de cultivos de caña,
publicado en la revista Suelos Ecuatoriales. Este artículo incluye resultados preliminares, donde
sólo se realiza una descripción morfológica macro y microscópica de los aislamientos
recuperados con base en el empleo de un medio de cultivo semisólido libre de nitrógeno y de
medios de cultivo en placa. Las características observadas fueron contrastadas con la cepa de
referencia PAL5. El capítulo tres contiene el artículo “Ocurrencia de Gluconacetobacter
diazotrophicus en cultivos tropicales de tomate y caña en el Centro Occidente de Colombia”
que incluye el primer reporte de G. diazotrophicus asociado a caña en Colombia, en el cual se
amplió la evaluación de los aislamientos obtenidos considerando características bioquímicas y
moleculares que permitieron identificar su potencial. En el capítulo cuatro se encuentra el
artículo relacionado con la obtención de bacterias promotoras de crecimiento asociadas a
tomate y caña de azúcar en Colombia, en el cual se identifican las bacterias diazótrofas con
potencial para la solubilización de fósforo y producción de compuestos indólicos asociadas a
estos cultivos en diferentes estados de desarrollo. A pesar de que en la propuesta de tesis no se
incluyó el estudio de otros géneros de bacterias promotoras de crecimiento, se consideró de
gran importancia optimizar los recursos utilizados en el muestreo realizado para la recuperación
de G. diazotrophicus y direccionarlos para el estudio de las bacterias diazótrofas que fueron
recuperadas a partir de los diferentes cultivos. Lo anterior ha permitido plantear un programa de
investigación liderado por las instituciones que respaldan el presente trabajo y que se focaliza
en la producción de bionsumos que apoyen el desarrollo de las cadenas productivas de interés.
En el capítulo cinco se relaciona el artículo: Cultivo por lotes para la producción de
biomasa de G. diazotrophicus a partir de sacarosa, en el cual se evaluaron los componentes del
medio de cultivo para producción de la bacteria, adicionalmente se evaluaron diferentes
concentraciones de sacarosa y su efecto en el crecimiento del microorganismo. En el capítulo
seis se encuentra el artículo relacionado con la evaluación de las propiedades de promoción de
crecimiento de G. diazotrophicus en tomate a nivel de semillero, donde se comprueba el efecto
de la cepa de referencia PAL5 en la germinación y crecimiento de semillas y plántulas de
tomate. Por último, en el capítulo siete se presenta la discusión general de la tesis, en la que se
condensan los resultados generales obtenidos, los impactos y las perspectivas futuras del
trabajo.
1.2. Hipótesis
La aplicación de una suspensión de células de Gluconacetobacter diazotrophicus promueve
el crecimiento de plántulas de tomate debido a sus propiedades de producción de
compuestos indólicos y solubilización de fósforo.
La modificación de la formulación del medio LGI-P aumenta la producción de biomasa
celular de G. diazotrophicus en cultivos sumergidos a nivel de banco.
1.3. Objetivos de la Tesis
Las principales características de promoción de crecimiento de G. diazotrophicus, que fueron
de interés en las evaluaciones realizadas en la presente tesis, corresponden a la producción de
ácido indolacético y la solubilización de fósforo
1.3.1. Objetivo general
Obtener y evaluar un preparado líquido como promotor de crecimiento para cultivos de tomate
(Solanum lycopersicum L.) empleando la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus
1.3.2. Objetivos específicos
Llevar a cabo el aislamiento y caracterización de la bacteria Gluconacetobacter
diazotrophicus a partir de cultivos de la región.
Realizar la optimización del medio de cultivo para la producción de biomasa celular de la
bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus.
Llevar a cabo el cultivo por lotes para la producción de biomasa de G. diazotrophicus por
fermentación sumergida a nivel de banco.
Evaluar la capacidad de la bacteria Gluconacetobacter diazotrophicus como promotora del
crecimiento de cultivos de tomate (Solanum lycopersicum L.).
Ocurrencia de Gluconacetobacter diazotrophicus en
cultivos tropicales de tomate (Solanum lycopersicum L.) y
caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) en el Centro
Occidente de Colombia
Resumen
En el presente trabajo se aislaron bacterias endófitas diazótrofas a partir de tejidos
provenientes de raíces, tallos y hojas de cultivos de caña y de tomate. Evaluaciones fenotípicas,
bioquímicas y ensayos de PCR permitieron la identificación de dos aislamientos de
Gluconacetobacter diazotrophicus provenientes de caña de azúcar (Saccharum officinarum). Se
evaluaron características de promoción de crecimiento como producción de compuestos
indólicos y solubilización de fósforo. Todos los aislamientos solubilizaron fósforo y produjeron
compuestos indólicos en presencia de triptófano. El presente es el primer reporte de G.
diazotrophicus en Colombia, lo cual permitirá adelantar investigaciones para identificar su
potencial en cultivos de la región.
2. Introducción
Las rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR, por sus siglas en inglés)
representan una amplia variedad de bacterias del suelo que, cuando crecen en asociación con
una planta hospedante, se da como resultado la estimulación del crecimiento en su huésped. Por
ello las bacterias promotoras de crecimiento se han empleado como insumo para el desarrollo
de biofertilizantes, los cuales tienen como propósito el aumento de la disponibilidad y toma de
nutrientes minerales por parte de las plantas (Vessey, 2003).
Se han aislado gran variedad de bacterias promotoras de crecimiento de la rizosfera
(Beijerinckia) y del tejido de caña de azúcar (Azospirillum, Bacillus, Klebsiella, Enterobacter,
Erwinia) (Muthukumarasamy et al., 2002). En 1988, Cavalcante y Döbereiner (1988) realizaron
el primer reporte de una bacteria ácido tolerante y fijadora de nitrógeno (bacteria diazótrofa)
asociada a la caña de azúcar en Brasil, la cual fue denominada inicialmente como
Saccharobacter nitrocaptans. Posteriormente, Gillis et al. (1989) mediante hibridación del
ácido desoxirribonucleico y ácido ribonucleico, complementado con análisis fenotípico y
quimiotaxonómico, revelaron que la bacteria obtenida de caña de azúcar pertenecía al género
Acetobacter, por lo que propuso el nombre de Acetobacter diazotrophicus para la bacteria
encontrada por Cavalcante y Döbereiner. Más recientemente se presentó el reordenamiento de
la familia a la que pertenecía la bacteria y se renombró como se conoce en la actualidad:
Gluconacetobacter diazotrophicus (Yamada y Yukphan, 2008).
La bacteria ha sido aislada de diferentes variedades de caña en diversos países como
Australia, México y Argentina (Li y Macrae, 1991; Fuentes et al., 1993; Bellone et al., 1997).
Sin embargo, en Colombia no se han adelantado estudios en este sentido a pesar del potencial
reportado por la bacteria en estudio relacionado con la fijación biológica de nitrógeno,
producción de compuestos indólicos y solubilización de fósforo. Por lo tanto, el objetivo del
presente trabajo fue el de identificar la ocurrencia de G. diazotrophicus en cultivos de caña de
azúcar y de tomate a fin de identificar aislamientos potenciales para el desarrollo de inoculantes
tipo biofertilizantes que promuevan el desarrollo de cultivos de interés económico.
3. Materiales y métodos
3.1. Localización de los lugares de muestreo y material vegetal evaluado
Para el desarrollo del estudio se recolectaron muestras provenientes de plantas de caña y de
tomate; en caña el muestreo se realizó en tres fincas dedicadas al cultivo en el departamento de
Caldas, referenciadas geográficamente así: Finca 1: 919 m, Latitud 5°23ˊ37.7˝ Norte,
Longitud 75°37ˊ48.1˝ Oeste; Finca 2: 1001 m, Latitud 5°24ˊ04.2˝ Norte, Longitud
75°38ˊ10.0˝ Oeste; Finca 3: 1121 m, Latitud 5°24́ 48.5˝ Norte, Longitud 75°38ˊ42.5 ̋Oeste.
Los cultivos tenían diferentes tiempos de siembra (270, 360 y 450 días); en cada uno se
recolectaron muestras de hojas, tallo y raíz a partir de 10 plantas.
Adicionalmente se tomaron muestras provenientes de un cultivo de tomate (Solanum
lycopersicum) ubicado en un invernadero de la Granja Tesorito de la Universidad de Caldas
(Altitud 2344 msnm, Latitud 5°1,77 Norte, Longitud 75°26,147 Oeste). Se realizaron tres
muestreos en diferentes estados del ciclo productivo del cultivo (50, 100 y 150 días), y se
recolectaron muestras de tallo y raíz de 10 plantas en cada muestreo.
Los muestreos se realizaron en cultivos donde no se había realizado aplicación de
agroquímicos recientemente; la toma de las muestras se realizó al azar en zig-zag con una
distancia de 10 m entre plantas para un total de 10 plantas muestreadas por cultivo y por
muestreo; el muestreo consistió en la recolección de hojas, trozos de tallos y de raíces en caña y
de tallos y raíces en tomate. Las muestras se empacaron en bolsas plásticas y fueron
transportadas en neveras de icopor al Laboratorio de Microbiología Agroindustrial del Instituto
de Investigación en Microbiología y Biotecnología Agroindustrial (IMBA) de la Universidad
Católica de Manizales. Los suelos de los cultivos evaluados eran ricos en materia orgánica
(entre 13 y 20,43%), con pH entre 4,4 y 5,9 y con niveles de nitrógeno entre 0,4 y 0,68%
(Anexo 1), de acuerdo con los análisis realizados en el Laboratorio de Química y Fertilidad de
Suelos de la Universidad de Caldas.
3.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento
En la siembra inicial se empleó el medio semisólido LGI-P, el cual es un medio libre de
nitrógeno (Cavalcante y Döbereiner, 1988) que contiene los siguientes componentes (en g/L):
K2HPO4, 0,2; KH2PO4, 0,6; MgSO4·7H2O, 0,2; CaCl2·2H2O, 0,2; Na2MoO4·2H2O, 0,002;
FeCl3·6H2O, 0,01; solución al 0,5% de azul de bromotimol en KOH 0,2 N, 5 mL; agar, 1,8;
azúcar blanco, 100; pH final de 6,0. Para el aislamiento se empleó agar LGI-PNs (Cavalcante y
Döbereiner, 1988), el cual tiene la misma composición por litro que el medio semisólido LGI-
P, con la adición de 50 mg de extracto de levadura y 15 g de agar. Para la purificación de la
bacteria de interés, se empleó el agar papa dextrosa (Oxoid®, EUA). El caldo DYGS
modificado (Rodrigues Neto et al., 1986) se empleó para obtener la biomasa necesaria en la
realización de los ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), en la determinación
de compuestos indólicos y en la solubilización de fósforo. El medio tiene la siguiente
composición (en g/L): glucosa, 2; peptona bacteriológica, 1,5; extracto de levadura, 2; K2HPO4,
0,5; MgSO4·7H2O, 0,5; ácido glutámico, 1,5; pH final de 6,0. La solubilización de fósforo se
evaluó en el medio NBRIP (National Botanical Research Institute’s Phosphate), el cual tiene
los siguientes componentes (en g/L): glucosa, 10; MgCl2·6H2O, 5; MgSO4·7H2O, 0,25; KCl,
0.2; (NH4)2SO4, 0,1 y agar-agar, 15; suplementado individualmente con fosfato tricálcico
(Ca3(PO4)2), 2,5 y fosfato de aluminio (AlPO4), 2,5.
3.3. Aislamiento de G. diazotrophicus
Se recolectaron 150 muestras en total para su procesamiento; las muestras inicialmente se
lavaron con abundante agua de la llave para retirar el material no deseado, se desinfestaron con
Tween 80 al 0,1% y por último se lavaron con agua estéril (Dibut et al., 2004). Las muestras
fueron maceradas en solución de sacarosa al 1%, empleando una licuadora, la cual se utilizó a
bajas revoluciones y con tiempos de homogenización que no superaron los 30 segundos con el
fin de no alterar la muestra; con el homogenizado obtenido se realizaron diluciones desde 10-1
hasta 10-3, y se sembraron alícuotas de 100 µL por triplicado en viales de 6 mL que contenían 3
mL de medio semisólido LGI-P (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Madhaiyan et al., 2004). Los
cultivos se incubaron a 30°C durante 6-7 días; en este tiempo se verificó la producción de gas,
formación de película amarilla-naranja en la superficie del medio y viraje de color del mismo
(Cavalcante y Döbereiner, 1988). A las muestras que evidenciaron estas características, se les
realizó pase a medio LGI-P semisólido nuevamente. Una vez se verificó la recuperación de la
película con las mismas características a la del vial inicial, se realizó aislamiento en agar LGI-
PNs con purificación de colonias en agar papa dextrosa a fin de obtener las colonias en forma
individual y realizar la descripción macroscópica de las mismas. La morfología de las colonias
recuperadas fue comparada con la cepa de referencia G. diazotrophicus PAL5 (ATCC 49037).
3.4. Caracterización bioquímica de los aislamientos
En los aislamientos recuperados se evaluaron parámetros como coloración de Gram, y
pruebas bioquímicas como asimilación de carbohidratos, catalasa, oxidasa, licuefacción de
gelatina, movilidad, utilización de citrato y asimilación de carbohidratos (Cavalcante y
Döbereiner, 1988; Gillis et al., 1989; Dong et al., 1995), empleando el microsistema de
identificación bioquímica api® 20 NE (bioMerieux SA®, Francia). Los aislamientos fueron
preservados a -20°C empleando glicerol al 10% como crioprotector.
3.5. Identificación por PCR de las bacterias aisladas
Se realizó la recuperación de los aislamientos a partir de los viales criopreservados, para lo
cual se activó el cultivo mediante un choque térmico a 37°C con posterior siembra en superficie
sobre agar papa dextrosa. Los cultivos se incubaron a 30°C durante 24-48 horas y
posteriormente se verificó la pureza y presencia de colonias aisladas. Se tomó una colonia de
cada placa, y se transfirió a 5 mL de caldo DYGS modificado (Rodrigues Neto et al., 1986), el
cual se incubó a 30°C en agitación a 150 rpm hasta fase logarítmica. Para la recuperación de la
biomasa, se centrifugó el cultivo en medio líquido durante 10 minutos a 2500 rpm; el pellet
resultante se lavó dos veces con solución salina estéril al 0,85%, centrifugando cada vez para
decantar las células. Se llevó la biomasa obtenida a una concentración aproximada de 108
células/mL.
La extracción y purificación de ADN genómico se realizó mediante el Kit PureLink®
Genomic DNA (Invitrogen®, EUA), recomendado para la lisis de bacterias Gram negativas. La
eficiencia del proceso de extracción de ADN se verificó mediante la realización de
electroforesis en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio, usando como marcador de peso
molecular el fago λ/Hind III. Para la cuantificación se tomaron registros fotográficos de los
geles revelados a luz ultravioleta y se comparó la intensidad y la distancia migrada de cada
fragmento en particular frente al marcador de peso molecular.
La identificación molecular de los aislamientos se realizó mediante la amplificación por
PCR del ADNr de la subunidad pequeña (16S) a partir del ADN genómico previamente
extraído utilizando los primers universales RB (5’- AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3’) y
RM (5’- GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’) (Madhaiyan et al., 2004), con el fin de
amplificar un fragmento de aproximadamente 800 pb. Las reacciones de PCR se llevaron a
cabo en un volumen total de 25μL, se adicionó buffer de PCR 1X, dNTPs 0,2 mM, MgCl2 1
mM, primers 0,5 µM, taq ADN polimerasa recombinante (Invitrogen®) 1U, y
aproximadamente 100 ng de ADN bacteriano. Se utilizó el termociclador MS mini (Bio-Rad®,
EUA) en el cual se realizó una desnaturalización inicial a 95°C durante 10 minutos, 1 minuto
de desnaturalización adicional a 92°C, alineamiento a 53°C por 1 minuto seguido de 35 ciclos
de extensión a 72°C de 2 minutos cada uno. Los productos de la amplificación fueron
analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Una vez
amplificado el ADNr de la región 16S de cada aislamiento se realizó la secuenciación de los
productos de PCR en la compañía Macrogen® (Corea del Sur); para lo anterior se enviaron
viales que contenían aproximadamente 20μL de los productos de cada reacción de PCR.
3.6. Análisis bioinformático de las secuencias obtenidas
A las secuencias obtenidas con el cebador se les realizó un análisis de calidad usando el
programa CLC® Main Workbench (Qiagen Company, EUA), empleando como criterios de
aceptación un valor Phred mayor a 30 por base y como criterio de rechazo una ventana con 50
bases inferior al valor Phred, y un tamaño inferior a 600 bases. Se desarrolló la anotación de las
secuencias usando el programa BLASTN ver. 2.2.27+ (Altschul et al., 1990) contra la base de
datos nt del NCBI, con un valor-e de 1×10-5. Estos resultados fueron filtrados con el 80% de
similitud y 80% de cobertura de la región que se estaba amplificando con los primers descritos
en el numeral anterior. Una vez obtenidas las descripciones por BLAST se procedió a construir
la base de datos para los alineamientos de acuerdo con los taxones que cumplieron con las
características para ser considerados como un acierto (hit). Para el alineamiento se usó el
software Clustal W ver. 2.1 (Larkin et al., 2007) y el resultado se usó como entrada (input) al
programa de análisis filogenético Mega 5 ver. 5.2.2 (Tamura et al., 2011), utilizando el método
de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987), con base en las distancias medias, asumiendo una
tasa de mutación uniforme; la topología del árbol se evaluó utilizando bootstrap (Felsenstein,
1985) con 1000 submuestreos.
3.7. Evaluación de las características de promoción de crecimiento
2.7.1. Evaluación de compuestos indólicos
Los compuestos indólicos fueron determinados como ácido indolacético por
espectofotometría empleando el reactivo de Salkowski (Gordon y Weber, 1951; Glickmann y
Dessaux, 1995; Sarwar y Kremer, 1995). Para ello se partió de una colonia pura de la bacteria
recuperada en medio agar papa dextrosa, la cual se pasó a un medio DYGS, y se incubó en
agitación a 30°C a 150 rpm entre 24 y 48 horas, dependiendo del ciclo de crecimiento del
microorganismo; posteriormente se separó la biomasa mediante dos lavados sucesivos con agua
destilada estéril y se preparó el inóculo con una densidad óptica comprendida entre 0,9 y 1
(aproximadamente 108 células/mL). Luego se dio la inducción con L-triptófano (1,01%)
(Panreac®, EUA) en medio DYGS, durante 60 horas a 150 rpm y 30°C. La determinación de
compuestos indólicos se realizó en el sobrenadante mediante reacción con reactivo de
Salkowski y lectura de absorbancia a 540 nm; cada muestra se procesó por triplicado. Los
niveles producidos de compuestos indólicos fueron estimados a partir de una curva patrón de
150 ppm de ácido indolacético (MERCK®, EUA) y fueron expresados en µg/mL.
3.7.2. Solubilización de fósforo
La solubilización de fósforo se valoró empleando el medio NBRIP con verde de
bromocresol (Nautiyal, 1999) el cual fue suplementado individualmente con Ca3(PO4)2 y
AlPO4. En cada placa de medio se depositó un volumen de 20µL del mismo por triplicado,
proveniente del inóculo del aislamiento en estudio con una concentración aproximada de 108
células/mL. Se realizaron lecturas a las 24, 48 y 72 horas, en las cuales se determinó el
diámetro de la colonia y el diámetro de los halos de solubilización en caso de estar presentes,
con el fin de calcular el índice de solubilización (A/B) (Kumar y Narula, 1999) y el porcentaje
de eficiencia de solubilización ((A-B)/B*100) (Nguyen et al., 1992) (Figura 1). Adicionalmente
se evaluó la producción de ácidos orgánicos mediante el viraje del indicador de pH del medio
de cultivo.
Índice de solubilización= A/B %Eficiencia de solubilización= ((A-B)/B)*100
(a) (b)
Figura 1. Medición del diámetro de la colonia (B) y del halo de solubilización (A). (a) Esquema. (b)
Fotografía de imagen real.
Se realizó análisis de varianza mediante el procedimiento GLM de SAS (SAS Institute
Cary, EUA), para determinar la ocurrencia de diferencias significativas entre tratamientos para
el conjunto de variables evaluadas. Se hizo comparación de medias a través de la prueba de
partición de promedios o test de Duncan (P < 0,05).
4. Resultados
4.1. Aislamiento, caracterización bioquímica e identificación molecular de G.
diazotrophicus
En el aislamiento realizado se cuantificó la concentración de bacterias diazótrofas
asociadas a caña de azúcar y tomate, y en de las muestras positivas se seleccionaron los
aislamientos presuntivos de G. diazotrophicus. Para ello las muestras fueron sembradas en el
medio semisólido LGI-P, el cual ha sido empleado en el aislamiento de G. diazotrophicus por
ser un medio libre en fuente de nitrógeno y con alto contenido en sacarosa (Cavalcante y
Döbereiner, 1988). En este medio de cultivo se evaluó la formación de una película superficial
de color amarillo-naranja, con aclaramiento del medio de cultivo; éste fue el primer criterio que
se tuvo en cuenta para la selección de los aislamientos presuntivos de G. diazotrophicus, lo cual
fue complementado con la verificación de formación de colonias de color café en el agar papa
dextrosa (Figura 2). De los 21 aislamientos recuperados en caña de azúcar, 16 presentaron las
características descritas anteriormente y en los 35 aislamientos de tomate, solo cuatro
presentaron esta pigmentación en los medios de cultivo LGI-P y agar papa dextrosa.
(a) (b)
Figura 2. (a) Película superficial de color amarillo-naranja en medio LGI-P y aclaramiento del medio de
cultivo. (b) Colonias de color café en medio papa dextrosa con 8 días de incubación.
Los aislamientos presuntivos evaluados mediante PCR empleando el primer universal
RB/RM, dieron como resultado bandas del tamaño esperado (800 pb) (Figura 3). De un total de
56 aislamientos, solo dos pertenecieron al grupo de las acetobacterias. El análisis por BLASTN
de los 56 productos de PCR purificados a partir del ADN del gen que codifica por la subunidad
pequeña del ribosoma (16S) en bacterias (Tabla 1), permitió identificar dos aislamientos como
G. diazotrophicus asociados al cultivo de caña (provenientes de raíz y tallo), los cuales fueron
codificados como GIBI-000025-AG-B y GIBI-000029-AG-B, respectivamente; en tomate no
se identificó la bacteria en estudio. Para tener una mayor confiabilidad en la identificación, se
realizó un análisis filogenético con secuencias de referencia reportadas y respaldadas por la
literatura científica. El análisis filogenético se realizó con base en 543 pb, e incluyó las
secuencias obtenidas en esta investigación y 23 secuencias representativas de diferentes
especies del género Gluconacetobacter. El árbol fue enraizado utilizando la secuencia 16S de
Stenotrophomonas maltophilia (FR749877) (Figura 4).
Tabla 1. Identificación de bacterias del género Gluconacetobacter asociadas a caña de azúcar, a partir de
análisis BLASTN de secuencias del ADNr.
Aislamiento Tamaño de
secuencia
Descripción Similaridad Cobertura Valor-e
GIBI-000025-AG-B 750 Gluconacetobacter
diazotrophicus
99 86 0
GIBI-000029-AG-B 315 Gluconacetobacter
diazotrophicus
95 47 9,08×10-11
De acuerdo con los ensayos anteriores, la relación de la ocurrencia de aislamiento de
bacterias diazótrofas y el número de aislamientos de G. diazotrophicus obtenidos en caña y
tomate permitió evidenciar que el aislamiento de G. diazotrophicus solo se obtuvo en el cultivo
de caña de 270 días, con un porcentaje de ocurrencia del 16,66% (Tabla 2).
Figura 3. Resultados en electroforesis correspondientes a los aislamientos de G. diazotrophicus por
amplificación con PCR con primer universal RB/RM. 1. Marcador de peso molecular HypperLadder III; 2. G.
diazotrophicus GIBI-000025-AG-B; 3. G. diazotrophicus GIBI-000029-AG-B; 3. G. diazotrophicus PAL5.
Figura 4. Árbol filogenético del género Gluconacetobacter (GIBI-000025-AG-B y GIBI-000029-AG-B). El
árbol fue enraizado utilizando la secuencia 16S de Stenotrophomonas maltophilia (FR749877). Los números
de accesión corresponden a la nomenclatura del GenBank (Anexo 2).
Tabla 2. Porcentaje de ocurrencia de los aislamiento de G. diazotrophicus en caña de azúcar y tomate. Planta Edad de la
planta
pH del suelo Parte de la
planta
No.
aislamientos
bacterias
diazótrofasa
No.
aislamientos de
G.
diazotrophicus
% Ocurrencia
de G.
diazotrophicus
Caña de
azúcar
270 días 5,8 Hoja 4 0 16,66
Raíz 3 1
Tallo 5 1
360 días 5,9 Hoja 0 0 0
Raíz 3 0
Tallo 6 0
450 días 5,3 Hoja 0 0 0
Raíz 3 0
Tallo 0 0
Tomate 50 días 4,4 Raíz 10 0 0
Tallo 10 0
100 días 4,4 Raíz 1 0
Tallo 1 0 0
150 días 4,4 Raíz 8 0
Tallo 5 0 a Los valores son el resultado del procesamiento de 10 repeticiones por muestra.
Para conocer el comportamiento metabólico de los aislamientos de G. diazotrophicus
obtenidos, éstos fueron caracterizados bioquímicamente empleando el microsistema api®
20NE, en el cual se tuvo como referencia la cepa PAL5 (Tabla 3).
Tabla 3. Pruebas bioquímicas de los aislamientos de G. diazotrophicus obtenidos.
Característica Aislamientos de G. diazotrophicus
PAL 5 GIBI-000025-AG-B GIBI-000029-AG-B
Coloración de Gram
Colonias de color café en agar papa + + +
Colonias de color naranja en agar
LGI
+ + +
Película superficial de color amarillo
en medio LGI semisólido
+ + +
Catalasa + + +
Oxidasa
Reducción de nitratos a nitritos
Producción de indol + + +
Fermentación de glucosa
Arginina hidrolasa
Producción de ureasa
Hidrólisis de la esculina
Hidrólisis de la gelatina
ß-galactosidasa
Asimilación de D-glucosa + + +
Asimilación de L-arabinosa
Asimilación de D-manosa + +
Asimilación de D-manitol
Asimilación de N-acetil glucosamina
Asimilación de maltosa
Asimilación de gluconato de potasio
Asimilación de ácido cáprico
Asimilación de ácido adípico
Asimilación de ácido málico
Asimilación de citrato trisódico
Asimilación de ácido fenilacético
+: positivo : negativo
En cuanto a las características morfológicas de las colonias identificadas como G.
diazotrophicus, éstas se evaluaron y se compararon con la cepa de referencia PAL5. El
resultado de este procedimiento se describe a continuación.
Gluconacetobacter diazotrophicus cepa ATCC 49037- PAL 5
Las colonias de G. diazotrophicus se expresan a partir de 4±1 días de incubación a 30ºC, en
agar papa dextrosa, medio en el cual se evidencian diferentes etapas en la formación de la
colonia de la bacteria (Figura 5). Inicialmente se evidencian colonias diminutas de color beige
claro las cuales son redondas, de bordes definidos y brillantes; posteriormente, a los 5 días se
inicia la pigmentación de la colonia y se evidencia la formación de hexopolisacárido alrededor
de la misma, característica que le da una apariencia más brillante a la colonia. A los 10 días de
incubación, el color de la colonia se acentúa y se torna café oscuro y se evidenció disminución
del tamaño del hexopolisacárido que rodea la colonia. Entre las 15 y 30 días, se da la
deshidratación de la colonia la cual está asociada a la pérdida de viabilidad de la misma. En la
coloración de Gram se evidenciaron cocobacilos Gramnegativos, que se observan individuales,
en pares o cadenas cortas.
(a) (b) (c) (d) (e)
Figura 5. Evolución de las colonias de G. diazotrophicus ATCC 49037-PAL5, en agar papa dextrosa. (a)
Colonia pequeña de color beige claro, brillante, 72 horas (0,5 mm). (b) Formación de hexopolisacárido e
inicio de la pigmentación de la colonia, 1 mm de diámetro, 120 horas. (c) Colonia de color café oscuro y
disminución de hexopolisacárido, 240 horas. (d) y (e) Deshidratación de la colonia y pérdida de la viabilidad,
15 y 30 días.
GIBI-000025-AG-B
En agar papa dextrosa presenta colonias redondas, cremosas, brillantes, de color beige
claro, que a los siete días toma una pigmentación de color café hasta llegar al café oscuro a los
15 días de incubación. Con la coloración de Gram se evidencian cocobacilos Gramnegativos
(Figura 6).
(a) (b) (c) (d) (e)
Figura 6. Aislamiento GIBI-000025-AG-B; colonias en agar papa dextrosa, con diferentes tiempos de
incubación. (a) 72 horas (0,5 mm). (b) 144 horas (1 mm). (c) 240 horas. (d) 360 horas. (e) Coloración de
Gram (100x).
GIBI-000029-AG-B
En agar papa dextrosa presenta colonia redonda, cremosa, de color beige, brillante que a
los seis días empieza a tomar una pigmentación de color café hasta llegar al café oscuro a los
15 días de incubación. La colonia está rodeada por un hexopolisacárido que le da una
apariencia brillante y mucilaginosa (Figura 7).
(a) (b) (c) (d) (e)
Figura 7. Aislamiento GIBI-000029-AG-B; colonias en agar papa dextrosa, con diferentes tiempos de
incubación. (a) 48 horas. (b) 72 horas (0,5 mm). (c) 144 horas (1 mm). (d) 240 horas. (e) Coloración de
Gram (100x).
4.2. Características de promoción de crecimiento
Los aislamientos fueron evaluados en relación con sus características de promoción de
crecimiento como la producción de compuestos indólicos y la capacidad de solubilización de
fósforo, en estas pruebas se tuvo como patrón de referencia la cepa PAL5.
3.2.1. Producción de compuestos indólicos
La producción de compuestos indólicos como ácido indolacético (AIA) se evaluó luego de
60 horas de crecimiento en medio DYGS, suplementado con triptófano. De acuerdo con las
determinaciones realizadas, el aislamiento 29 obtuvo la mayor concentración de compuestos
indólicos (78,547 µg/mL), seguido de la cepa de referencia PAL5 (64,28 µg/mL) y por último
el menor valor se presentó en el aislamiento 25 (17,74 µg/mL), encontrándose diferencias
significativas estadísticamente entre el aislamiento 29 y PAL5 con el aislamiento 25 (p<0,05).
4.2.2. Capacidad de solubilización de fósforo
Se evaluó la solubilización de dos fuentes de fósforo (fosfato de aluminio y fosfato
tricálcico), a través de la determinación del diámetro de la colonia y del halo de solubilización
evidenciado alrededor de ésta. En las placas con fosfato de aluminio no se evidenció formación
del halo de solubilización, solo se apreció un halo de viraje de color del medio, el cual indicó la
producción de ácido; por lo tanto en esta prueba se reportó el índice de producción de ácido
teniendo en cuenta la relación entre el diámetro del halo formado por el viraje de color del
medio de cultivo y el diámetro de la colonia de la bacteria. En la determinación de fosfato
tricálcico se evaluó el índice y el porcentaje de eficiencia de solubilización.
En la evaluación de la solubilización de fósforo a las 72 horas no se evidenciaron
diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre los aislamientos de G. diazotrophicus
obtenidos en el presente estudio; sin embargo el aislamiento GIBI-000029-AG-B presentó los
valores más altos en las variables de respuesta (Tabla 4).
Tabla 4. Solubilización de fósforo.
a Valores obtenidos de la media de tres repeticiones. IPA: Índice de producción de ácido; IS: Índice de solubilización; ES:
Eficiencia de solubilización; Dev std: Desviación estándar.
5. Discusión
Las bacterias diazótrofas tienen un gran potencial debido a que usan el N2 como única
fuente de nitrógeno para su crecimiento, sin embargo hasta la década de los 70 solo se conocían
miembros de los géneros Azotobacter, Azomonas, Beijerinkia y Derxia (Döbereiner, 1988). El
reconocimiento de los mecanismos de funcionamiento de la enzima nitrogenasa apoyó el
desarrollo de nuevos métodos de aislamiento de bacterias diazótrofas que no poseen
mecanismos de protección contra el oxígeno atmosférico, y que por lo tanto son más eficientes
en relación con el uso de fuentes de carbono para la fijación del nitrógeno. Estas bacterias
fueron identificadas como las que viven en asociación principalmente con las gramíneas. A este
grupo pertenecen las bacterias de los géneros Azospirillum, Herbaspirillum, Azoarcus y
Gluconacetobacter (Döbereiner et al., 1995). En la primera etapa del presente trabajo se realizó
el aislamiento de bacterias endófitas diazótrofas asociadas a caña de azúcar y a tomate, a través
del empleo del medio de cultivo semisólido LGI-P, con el fin de verificar la ocurrencia de
Gluconacetobacter diazotrophicus y evaluar las características de promoción de crecimiento
como fijación biológica de nitrógeno, producción de compuestos indólicos y solubilización de
fósforo. Particularmente esta bacteria no ha sido aislada ni trabajada en Colombia.
G. diazotrophicus fue reportada inicialmente en Brasil por Cavalcante y Döbereiner (1988)
asociada a caña de azúcar (Saccharum officinarum L); sin embargo ha sido encontrada en otros
países del mundo, asociada a cultivos de café, piña y zanahoria (Tabla 5). En el presente
estudio los aislamientos de G. diazotrophicus se encontraron asociados a la raíz (GIBI-000025-
AG-B) y al tallo (GIBI-000029-AG-B) de plantas de caña de azúcar, provenientes de un cultivo
de 270 días a diferencia de los resultados obtenidos en tomate donde no se logró la
recuperación de la bacteria de interés. Lo anterior coincide con los estudios realizados hasta el
momento en los cuales G. diazotrophicus se ha recuperado de caña de azúcar en Brasil,
Australia, México y Argentina (Tabla 5). Igualmente, hasta el momento no se han encontrado
reportes de la recuperación de la bacteria a partir del cultivo de tomate, a pesar de que se ha
demostrado el establecimiento de G. diazotrophicus en la planta y su efecto en la promoción de
crecimiento (Luna et al., 2012; Botta et al., 2013).
Gluconacetobacter diazotrophicus se encuentra relacionada con cultivos de alto contenido
en azúcares asimilables. Lo anterior se evidencia con el comportamiento in vitro de la bacteria
al crecer en medios de cultivo con sacarosa al 10% con un pH de 5,5, condiciones que son
similares a las del jugo de caña de azúcar (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Boddey et al.,
1991). En ambientes naturales la bacteria utiliza como fuentes de energía los ácidos orgánicos
presentes en el jugo de caña, y los azúcares como la glucosa libre, presentes en la parte aérea de
la planta.
G. diazotrophicus tiene la capacidad de penetrar el interior de la planta siendo encontrada
en la estela, vasos del xilema, así como en las capas de la corteza externa del cultivo (Reinhold
y Hurek, 1998). En el proceso de colonización de la bacteria, se evidencia un establecimiento
inicial en la raíz y en la superficie del tallo bajo; en las raíces, la colonización se inicia en las
Media Dev std Media Dev std Media Dev std Media Dev std Media Dev std Media Dev std Media Dev std Media Dev std Media Dev std
25 24 1,960 0,0693 95,833 7,2169 5,713 0,4965 48 2,877 0,214 187,500 21,6506 13,333 1,1547 72 3,333 0,2970 233,333 29,7374 13,333 1,1547
29 24 2,213 0,2579 121,430 25,7533 7,243 1,0562 48 3,023 0,420 202,380 41,8536 14,933 1,6166 72 3,620 0,3576 261,903 35,9524 14,933 1,6166
248 24 2,430 0,1400 142,857 14,2850 5,277 0,2542 48 2,430 0,140 142,857 14,2850 14,000 0,0000 72 3,097 0,2183 209,523 21,8240 14,000 0,0000
Tiempo
AlPO4 AlPO4
IPAa Tiempo ISa ESa
Ca3(PO4)2 Ca3(PO4)2
ISa ESa IPAa Aislam
Ca3(PO4)2 AlPO4
ISa ESa IPAa Tiempo
puntas y en las uniones de las raíces laterales como vía de entrada a la planta de caña de azúcar,
desde donde la bacteria es distribuida a toda la planta, mediante la corriente de transpiración.
En los vasos del xilema de los brotes densos de plantas maduras, es posible la fijación de
nitrógeno por bacterias diazótrofas debido a que se proporciona una presión baja de oxígeno y
una fuente de energía como la sacarosa necesaria para soportar la actividad de la nitrogenasa
(James et al., 1994). G. diazotrophicus también ha sido encontrada en el fluido del apoplasto
del tejido de caña de azúcar, antecedente que confirma su carácter de bacteria endófita (Dong et
al., 1994).
Tabla 5. Procedencia de aislamientos de G. diazotrophicus
Cultivo Ubicación en la
planta
País Referencia
Nombre común Nombre científico
Caña de azúcar Saccharum officinarum Raíz
Tallo
Brasil Cavalcante y Döbereiner (1988)
Raíz Australia Li y Macrae (1991)
Raíz
Tallo
México Fuentes et al. (1993)
Raíz Tallo
Argentina Bellone et al. (1997)
Raíz
Tallo
Colombia Este trabajo
Café Coffea arabica Rizosfera Raíz
Tallo
México Jimenez et al. (1997)
Raíz India Madhaiyan et al. (2004)
Mijo africano Eleusine coracana Rizosfera Raíz
Tallo
India Loganathan et al. (1999)
Piña Ananas comosus Hojas Raíz
Tallo
México Tapia et al. (2000)
Zanahoria Daucus carota Raíz India Madhaiyan et al. (2004)
Rábano Rhapanus sativus Raíz
Remolacha Beta vulgaris Raíz
Arroz Oryza sativa Rizosfera
Raíz
Tallo
India Muthukumarasamy et al. (2005)
Calabaza Curcubita maxima Hoja Raíz
Tallo
Cuba Dibut et al. (2005)
Yuca Manihot esculenta
Malanga Colocasia esculenta
Papaya Carica papaya
Los anteriores argumentos justifican la obtención de dos aislamientos G. diazotrophicus
provenientes de raíces y tallo de caña de azúcar, debido a que son los primeros sitios de
colonización de la bacteria en la planta. Adicionalmente los aislamientos se obtuvieron de un
cultivo de 270 días, el cual tiene menos porcentaje de lignificación en raíces y tallos con
respecto a las demás muestras recolectadas, lo cual facilita el procesamiento de las muestras
para la homogenización y liberación de las bacterias endófitas asociadas a los tejidos. Este
aspecto pudo influir en la no obtención de la bacteria proveniente de los cultivos de 360 y 450
días en caña de azúcar. Esta misma condición se observó en la investigación realizada por
Jiménez et al., (1997) en plantas de café.
En tomate no se recuperó G. diazotrophicus probablemente porque la bacteria no
predominó en el cultivo en condiciones naturales, existiendo competencia con las demás
bacterias asociadas a la planta las cuales se expresaron con mayor facilidad en los muestreos
realizados. Sin embargo, en un experimento ejecutado en el marco del presente trabajo, se
realizó aislamiento de G. diazotrophicus PAL5 proveniente de plántulas de tomate inoculadas
con la bacteria durante 30 días en semillero, en el cual se realizó un muestreo al azar y se logró
la recuperación de la bacteria en el medio semisólido LGI-P. Lo anterior indica que a pesar de
no recuperarse el microorganismo a partir de un cultivo en condiciones naturales (no
inoculado), la bacteria se puede inocular en el cultivo de interés en el cual se puede establecer
(siempre y cuando cuente con las variables favorables para su crecimiento) y a partir del cual se
puede aislar con los protocolos que se ajustaron en nuestro laboratorio para tal fin.
Lo anterior se puede contrastar con el primer reporte de colonización de G. diazotrophicus
en tomate en condiciones gnotobióticas y en invernadero, donde se identificó un patrón de
colonización similar al reportado en caña de azúcar. Sin embargo se evidenció un aspecto
diferencial en tomate y fue la colonización de la cámara subestomatal (Luna et al., 2012), la
cual no es de colonización frecuente por las bacterias benéficas (Compant et al., 2005). Lo
anterior permite considerar un punto de entrada adicional de G. diazotrophicus a través de los
estomas de las hojas, desde donde se extiende a los demás tejidos (Luna et al., 2012).
Los aislamientos de G. diazotrophicus obtenidos, presentaron en el medio semisólido LGI-
P la formación de una película superficial de color amarillo-naranja, con aclaramiento del
medio de cultivo. Adicionalmente se verificó su crecimiento en presencia de sacarosa con
producción de colonias de color café en agar papa suplementado con azúcar al 10% (Figura 2),
características que fueron descritas por Cavalcante y Döbereiner (1988) y por Reis (1994) en
las primeras descripciones realizadas de la bacteria.
De acuerdo con el Manual Bergey’s de Bacteriología Sistemática (Sievers y Swings, 2005),
las características bioquímicas de los dos aislamientos recuperados, son similares a los de la
cepa de referencia. G. diazotrophicus tiene un metabolismo estrictamente respiratorio debido a
que el oxígeno es el aceptor final de electrones, presenta catalasa positiva y oxidasa negativa,
ausencia de licuefacción de la gelatina y producción de indol. Las mejores fuentes de carbono
para el crecimiento son etanol, glucosa y acetato; en las pruebas realizadas con los aislamientos
obtenidos se evidenció la capacidad que tienen de asimilar la glucosa (Tabla 3).
Adicionalmente, el pH óptimo de crecimiento de G. diazotrophicus está comprendido en el
rango de 2,5 a 6 y una temperatura de 30°C; lo anterior se evidenció al obtener la recuperación
de la bacteria en las condiciones descritas, ya que el medio LGI-P se trabajó a un pH de 5,5 y la
temperatura de incubación de las placas y los medios semisólidos fue de 30°C.
En los aislamientos recuperados en este trabajo se evidenció la formación de
exopolisacáridos (EPS) debido a que las colonias presentaron una apariencia mucoide y
brillante; igualmente en medio líquido se observó aumento de la viscosidad luego de 60 horas
de incubación. Lo anterior coincide con lo descrito por Sutherland (1988), quien menciona que
la presencia de EPS asociados a las células bacterianas es reconocida por la formación de
colonias mucoides, en el crecimiento en medio sólido y con aumento de la viscosidad, y
algunas veces con formación de geles en medio líquido. Stephan et al. (1988) evidenciaron la
formación de polihidroxibutirato (PHB) por primera vez en G. diazotrophicus luego de 9 horas
de incubación en medio líquido en fermentador. La producción de EPS es un rasgo importante
de rizobacterias, debido a que protegen a la célula bacteriana contra la desecación, fagocitosis y
el ataque de fagos, también contribuye en la fijación biológica de nitrógeno mediante la
prevención de la alta tensión ejercida por el oxígeno (Tank y Saraf, 2003). Diversos estudios
han demostrado que la producción de EPS puede estar relacionada con la interacción de ciertas
bacterias con plantas; los EPS son moléculas involucradas en la interacción célula-célula de
varios organismos que promueven la adhesión de las bacterias a la superficie de los vasos
vasculares de la planta; igualmente pueden estar involucrados en el reconocimiento y en la
determinación de la naturaleza de la asociación planta-bacteria (Danhord y Fuqua, 2007;
Meneses et al., 2009).
El análisis comparativo de secuencias permite construir árboles filogenéticos que reflejan
gráficamente la genealogía molecular de la bacteria, demostrando la posición evolutiva en el
contexto de los organismos comparados. Sin embargo, hay que tener en cuenta que es la
comparación de genomas completos y no la comparación de ADNr 16S, la que aporta una
indicación exacta de las relaciones evolutivas. Por ello, en taxonomía se recomienda
actualmente la aplicación de la taxonomía polifásica, que utiliza criterios fenotípicos, junto con
los datos de la secuenciación (Rodicio y Mendoza, 2004). En el presente trabajo el estudio
filogenético mostró concordancia con los resultados de las pruebas bioquímicas y con los
caracteres macroscópicos y microscópicos de la bacteria mostrando en el árbol un
agrupamiento soportado por el valor bootstrap con el género Gluconacetobacter sp. (datos no
mostrados) y luego, en el árbol correspondiente del género, mostró un fuerte agrupamiento con
los Gluconacetobacter sp. que están relacionados con G. diazotrophicus soportados por el valor
de boostrap mayor a 50 donde se encuentran G. azotocaptans y G. johannae. Es importante
aclarar que para esta clasificación se utilizó el gen ADNr 16S y, por lo tanto, es difícil resolver
el taxón de especie debido a que este gen presenta una tasa de mutación lenta, que lo ha
convertido en un gen estándar para construir el árbol de la vida en el dominio Bacteria (Tree of
Life Web Project, 2006). Como el objeto del estudio era tener una identificación certera, se
utilizaron, junto a la secuenciación, la caracterización macroscópica y microscópica de los
aislamientos. Debido a que la mayoría de los aislamientos del estudio fueron bacterias
pertenecientes a diversidad de géneros y familias diferentes a Acetobactereaceae, se decidió
correr únicamente estos primers para facilitar la identificación de los microorganismos desde
una perspectiva más amplia.
A pesar que la cepa GIBI-000029-AG-B no presentó una buena cobertura en el momento
de la secuenciación debido al tamaño de la secuencia obtenida después de la filtración de
nucleótidos llamados de baja calidad (tamaño esperado del producto de PCR concordante), se
decidió incluirla como un acierto exitoso debido a los resultados de las pruebas bioquímicas y
de la caracterización microscópica y macroscópica acompañante.
En el primer reporte de G. diazotrophicus (Cavalcante y Döbereiner, 1988), se reconoció la
capacidad de promoción de crecimiento asociada a su establecimiento en los tejidos del cultivo
de caña y a la fijación de nitrógeno atmosférico (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Stephan et
al., 1991; Reis et al., 1994). Posteriormente se han identificado en esta bacteria otras
características de promoción de crecimiento como la producción de compuestos indólicos tipo
ácido indolacético (AIA) (Fuentes et al., 1993); en este sentido se ha determinado la capacidad
de la bacteria de producir auxinas durante todo el ciclo de crecimiento, principalmente en
medios suplementados con triptófano, lo cual demuestra que éste es el principal precursor para
la producción de auxinas en G. diazotrophicus (Rodrigues et al., 2007).
Rodriguez et al, (2007) observaron al inicio de la fase de crecimiento de la cepa G.
diazotrophicus PAL5 gran producción de compuestos indólicos. La mayor producción se
evidenció a las 24, 48 y 72 horas de incubación con valores de 103,71, 92,67 y 12,26 µg/mL
respectivamente. Posteriormente, estos autores evidenciaron la disminución de la producción de
estos compuestos luego de 168 horas hasta valores de 17,51 µg/mL. Los valores obtenidos en
este trabajo empleando el método de Salkowski permiten evidenciar un mejor comportamiento
en la producción de compuestos indólicos por parte del aislamiento GIBI-000029-AG-B
(78,547 µg/mL), seguido de la cepa PAL5 (64,28 µg/mL) y por último del aislamiento GIBI-
000025-AG-B (17,74 µg/mL). Las concentraciones obtenidas se encuentran dentro del rango de
los reportes obtenidos en estudios similares con G. diazotrophicus (Tabla 6). Es importante
tener en cuenta que la promoción de crecimiento en plantas se puede dar con valores tan bajos
como de 5 µg/mL (Gravel et al., 2007). Sin embargo, es muy importante considerar las
condiciones experimentales de cada investigación, ya que el alcance de los resultados depende
notoriamente de las mismas (Tabla 6). Igualmente es importante evaluar la producción de
compuestos indólicos en diferentes etapas de crecimiento de la bacteria con el fin de identificar
el tiempo óptimo de producción del metabolito.
Rodriguez et al., (2009) adelantaron la identificación y cuantificación de compuestos
indólicos producidos por G. diazotrophicus mediante HPLC, en el cual se determinó la
presencia de ácido indolpirúvico en el sobrenadante de la bacteria, sugiriendo que la ruta
utilizada para la síntesis de AIA es la del ácido indol-3-piruvato (IPyA) en las condiciones
evaluadas. La biosíntesis de AIA ocurre a partir de la inducción con el aminoácido L-
triptófano, siendo descritas en bacterias por lo menos cinco rutas de biosíntesis que emplean
este precursor: indol-3-acetamida (IAM), indol-3-acetonitrila (IAN), indol-3-piruvato (IPyA),
triptamina (TAM) y oxidación de la cadena lateral del triptófano (TSO) (Spaepen et al., 2007).
La presencia de la ruta de biosíntesis de AIA por IPyA en G.diazotrophicus fue sugerida por
Fuentes et al. (1993) y por Lee et al.(2004). La producción de AIA en G. diazotrophicus es
dependiente de la presencia de L-triptófano en el medio de cultivo con producciones de AIA
por la cepa PAL5 de 6 µg/mL y de 13 µg/mL a las 16 y 60 horas de crecimiento
respectivamente y determinadas por HPLC (Rodrigues et al., 2009).
Tabla 6. Condiciones experimentales utilizadas en diferentes investigaciones para la cuantificación de
compuestos indólicos a partir de G. diazotrophicus. Condición Fuentes et al.
(1993)
Fuentes et al.
(1993)
Madhaiyan et al.
(2004)
Rodrigues et al.
(2007)
Presente estudio
Medio para
producción de biomasa
Caldo GYC Caldo GYC Medio LGI
suplementado con cloruro de
amonio 1mM
Caldo DYGS Caldo DYGS
Condiciones de
incubación para
producción de
biomasa
220 rpm
36 h
30ºC
220 rpm
36 h
30ºC
No menciona No menciona 150 rpm
48 h
30ºC
Reconstituyente de células lavadas
KH2PO4 50mM (pH 6,0)
KH2PO4 50mM (pH 6,0)
No menciona No menciona Agua destilada estéril
Concentración de
biomasa
1x108 UFC/mL 1x108 UFC/mL No menciona No menciona 1x108 UFC/mL
Medio para
inducción
LGI líquido con
1% sacarosa
(grado analítico) y suplementado
con NH4Cl
LGI líquido con
1% sacarosa
(grado analítico) y suplementado
con NH4Cl
Medio LGI
suplementado
con cloruro de amonio 1mM
Medio LGI-P
modificado (sin
azul de bromotimol) y
suplementado
con (NH4)2SO4
10 mM
Caldo DYGS
Precursor empleado Triptófano 100
µg/mL
Triptófano 100
µg/mL
Triptófano 100
µg/mL
Triptófano 100
µg/mL
L-triptófano
10,1 mg/mL
Condiciones para determinación de
compuestos
indólicos
200 rpm 24 h
30ºC
200 rpm 24 h
30ºC
Agitación (no relaciona
velocidad)
48 h 30ºC
200 rpm 24-48 y 72 h
30ºC
150 rpm 60 h
30ºC
Método aplicado Salkowski HPLC HPLC Salkowski Salkowski
Concentración de
compuestos indólicos
Aislamientos
nativos: 19-65 µg/mL
NA NA PAL 5:
24 h: 103,71 µg/mL
48 h: 92,67
µg/mL 72 h: 12,26
µg/mL
Aislamientos
nativos: 17,47-78,54
µg/mL
PAL5:
64,28 µg/mL
Concentración de
AIA
N/A Aislamiento
nativo: 1 µg/mL
PAL5:
2,42 µg/mL
Aislamiento
nativo de café: 1,25 -1,55
µg/mL
Aislamiento
nativo de zanahoria:
N/A N/A
0,14-0,25 µg/mL
N/A: No aplica
La solubilización de fósforo es considerada otra característica de promoción de crecimiento
expresada por bacterias rizosféricas; sin embargo esta propiedad cuando se manifiesta en una
bacteria endófita cobra importancia, debido al papel que puede jugar en la contribución de la
disponibilidad de fósforo en la planta durante la colonización inicial, y posteriormente en la
promoción del crecimiento vegetal (Saravanan et al., 2008). La solubilización de fósforo, ha
sido observada en varios aislamientos de G. diazotrophicus recuperados de caña de azúcar.
Maheshkumar et al. (1999) evaluaron tres cepas de G. diazotrophicus (PAL5, Ppe4 y PaP5),
empleando el agar Pikovskaya, las cuales mostraron amplias zonas de solubilización de 17, 21
y 24 mm, respectivamente a los 10 días de incubación, demostrando de esta manera su
habilidad de solubilizar fosfato insoluble y asociado al fosfato tricálcico. En la presente
investigación, la evaluación de solubilización de fósforo se realizó a través del empleo del
medio NBRIP con verde de bromocresol con el fin de mejorar la visualización de la prueba; a
las 72 horas, se evidenció solubilización de fosfato tricálcico en todos los aislamientos de G.
diazotrophicus evaluados, demostrando el potencial que tienen las bacterias recuperadas para
aumentar el fósforo disponible en el suelo y de esta manera poder mejorar el rendimiento en las
plantas (Fernández et al., 2005). Sin embargo, es importante realizar pruebas de laboratorio en
medio líquido con el empleo de otras fuentes de fósforo antes de realizar evaluaciones en
campo (Bashan et al., 2013).
De manera general los resultados muestran que las bacterias aisladas pueden ser
promisorias promotoras de crecimiento en cultivos de interés en la región, por lo tanto se
recomienda profundizar en la identificación de los compuestos indólicos producidos, así como
la capacidad de solubilizar diferentes fuentes de fósforo orgánico en medio líquido para su
posterior evaluación a nivel de semillero.
6. Conclusiones
El presente estudio es el primer reporte de G. diazotrophicus en Colombia, la cual es una
bacteria promotora de crecimiento de gran importancia a nivel agrícola. Los aislamientos
encontrados en este estudio asociados a caña de azúcar, mostraron propiedades de promoción
de crecimiento como producción de compuestos indólicos y solubilización de fósforo con
valores por encima o cercanos a los de la cepa de referencia PAL5, lo cual permite
identificarlos como aislamientos promisorios para el desarrollo de inoculantes a nivel
comercial.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e
Innovación (Colciencias), a la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados de la Universidad
de Caldas y a la Dirección de Investigación, Proyección y Desarrollo de la Universidad
Católica de Manizales por la financiación del presente trabajo.
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Anexo 1. Características químicas de los suelos asociados a los cultivos evaluados (Análisis
realizados por el Laboratorio de química y fertilidad de suelos, Universidad de Caldas).
Característica Unidades Caña-
Finca 1
Caña-
Finca 2
Caña-
Finca 3
Tomate Niveles de referencia
Bajo Medio Alto
pH 5,8 5,9 5,3 4,4
Nitrógeno % 0,50 0,54 0,40 0,68
Materia
orgánica
% 13,00 14,64 9,83 20,43 <3,0 3,0-5,0 >5,0
Fósforo mg/Kg 32 126 19 89 <20,0 20,0-
40,0
>40,0
Potasio cmol(+)/Kg 0,60 1,03 0,26 0,38 <0,2 0,2-0,4 >0,4
Calcio cmol(+)/Kg 7,07 13,38 6,32 3,29 <3,0 3,0-6,0 >6,0
Magnesio cmol(+)/Kg 6,53 5,7 4,55 0,86 <1,5 1,5-2,5 >2,5
Sodio cmol(+)/Kg 0,099 0,439 0,143 0,240 <0,5 0,5-1,0 >1,0
Hierro mg/Kg 230 401 346 400 <25,0 25,0-
50,0
>50,0
Manganeso mg/Kg 171,75 37,55 14,98 14,64 <5,0 5,0-
10,0
>10,0
Zinc mg/Kg 6,41 5,58 2,99 21,90 <1,5 1,5-3,0 >3,0
Cobre mg/Kg 14,29 12,13 9,17 4,73 <1,5 1,5-3,0 >3,0
Azufre mg/Kg 0,00 7,68 0,00 0,0 <10,0 10,0-
20,0
>20,0
Boro mg/Kg 1,0 1,1 0,8 1,1 <0,2 0,2-4,0 >4,0
Arena % 53 43 39 82
Limo % 23 33 23 2
Arcilla % 24 24 38 16
Textura F-Ar-A F F-Ar F-A
F: Franco
F-A: Franco Arenoso
F-Ar: Franco Arcilloso
F-Ar-A: Franco Arcilloso Arenoso
Anexo 2. Números de accesión correspondientes a la nomenclatura del GenBank
Microorganismo Abrev. Accesión Tamaño (pb) Fecha entrada
Gluconacetobacter
sucrofermentans G_suc AJ007698 1463 14-jul-11
Gluconacetobacter persimmonis G_per AB095100 1444 28-jul-07
Gluconacetobacter hansenii G_han AB166734 1453 09-feb-10
Gluconacetobacter azotocaptans G_azo AY958232 1706 22-ago-06
Gluconacetobacter rhaeticus G_rha EU096235 1450 25-abr-08
Gluconacetobacter liquefaciens G_liq NR_026132 1483 09-ene-09
Gluconacetobacter intermedius G_int NR_026435 1481 09-ene-09
Gluconacetobacter johannae G_joh NR_024959 1447 09-ene-09
Gluconacetobacter entanii G_ent NR_028909 1484 10-nov-09
Gluconacetobacter kakiaceti G_kak AB607834 1444 27-jul-12
Stenotrophomonas maltophilia S_mal FR749877 1393 13-feb-11
Gluconacetobacter kombuchae G_kom NR_043112 1442 10-ago-11
Gluconacetobacter nataicola G_nat NR_041012 1452 10-ago-11
Gluconacetobacter oboediens G_obo NR_041295 1449 10-ago-11
Gluconacetobacter sacchari G_sac NR_041747 1427 10-ago-11
Gluconacetobacter tumulicola G_tum AB627119 1418 29-ago-12
Gluconacetobacter xylinus G_xyl AB681097 1414 28-ene-12
Gluconacetobacter saccharivorans G_sac AB645734 1411 27-jul-12
Gluconacetobacter maltaceti G_mal HE861938 1441 05-sep-13
Gluconacetobacter diazotrophicus G_dia NR_074292 1486 30-ene-13
Gluconacetobacter aggeris G_agg AB778529 1414 14-nov-13
Gluconacetobacter
takamatsuzukensis G_tak AB778532 1416 14-nov-13
Gluconacetobacter asukensis G_asu AB778535 1418 14-nov-13
Gluconacetobacter europaeus G_eur AB818453 1493 12-oct-13
Bacterias promotoras de crecimiento asociadas a tomate (Solanum lycopersicum L.) y
caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) en Colombia
Resumen
Para lograr la producción sostenible de cultivos se han empleado microorganismos
asociados a las plantas, constituyendo el uso de bacterias promotoras de crecimiento una
alternativa prometedora para la disminución del empleo de fertilizantes químicos. Este trabajo
tiene como objetivo caracterizar los grupos microbianos asociados a los cultivos de caña de
azúcar (Saccharum officinarum L.) y tomate (Solanum lycopersicum L.) e identificar sus
potencialidades en la estimulación del crecimiento vegetal. Para el aislamiento se emplearon
muestras de raíz, tallo y hojas y el medio semisólido libre en nitrógeno LGI-P. Se obtuvieron
54 aislamientos, de los cuales el 100% producen compuestos indólicos (0,947 y 260,7 µg/mL).
Los aislados solubilizan fosfato tricálcico destacándose los aislamientos 22 y 31, por los
mayores índices de solubilización. Serratia marcescens (C31, T127, T146) y Pantoea dispersa
(C1) mostraron las mayores potencialidades en la promoción del crecimiento vegetal, por lo
que representan una fuente interesante a utilizar en la elaboración de biopreparados eficientes
en cultivos de importancia económica y específicamente en cultivos de caña de azúcar y
tomate.
1. Introducción
La caña de azúcar y el tomate son cultivos de gran importancia económica en Colombia,
debido a que hacen parte del sustento de la economía del país. En torno a la caña de azúcar se
encuentra toda una cadena productiva que no solo involucra la producción de azúcar y panela
principalmente, sino que está incursionando en la producción de bioetanol, importante por la
disminución del impacto ambiental a través de su uso. El tomate es originario de la Región
Andina de Chile, Bolivia, Perú, Ecuador y Colombia y se caracteriza por tener alto contenido
de antioxidantes como vitamina C, licopeno y ß caroteno, por lo que se considera una hortaliza
de gran importancia dentro de la canasta alimenticia de la población. El mercado nacional e
internacional cada vez es más exigente en productos libres de contaminantes y de alto valor
nutritivo, aspectos que impactan su calidad. Los microorganismos promotores del crecimiento
vegetal y en particular, las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB, según sus
siglas en inglés), juegan un papel clave en la toma de nutrientes, la tolerancia al estrés
ambiental y, en general, en el mantenimiento del buen desarrollo radicular, favoreciendo así el
aumento del rendimiento de los cultivos (Matiru y Dakora, 2004). Las PGPB están asociadas a
muchas de las especies de plantas que están presentes en la mayoría de los ambientes (Compant
et al., 2010). Se encuentran ampliamente representadas en diversidad de géneros microbianos,
permitiendo aumentar la disponibilidad de nutrientes, transformarlos a formas asimilables por
la planta, producir sustancias promotoras del crecimiento (fitohormonas) (Beneduzi et al.,
2013) o servir como control biológico de fitopatógenos (Yin et al., 2013). Se han aislado una
gran variedad de promotoras de crecimiento de la rizosfera y del tejido de caña de azúcar
(Muthukumarasamy et al., 2002) y de tomate (Hammami et al., 2013), con el fin de identificar
su potencial en la producción de compuestos indólicos y solubilización de fósforo. El
aislamiento inicial en medios de cultivo semisólidos libres en nitrógeno, permite realizar una
primera selección de bacterias diazótrofas (bacterias que utilizan el N2 como fuente de
nitrógeno) (Döbereiner et al., 1995) a las cuales posteriormente se les realiza evaluación de la
producción de compuestos indólicos y solubilización de fósforo. Estos bioensayos permiten
identificar las bacterias que tienen potencial como promotoras del crecimiento en plantas. El
objetivo del presente trabajo fue reconocer las bacterias promotoras de crecimiento asociadas a
cultivos de caña y tomate en la región centro occidental de Colombia, e identificar entre éstos
los aislamientos de interés que puedan ser potenciales insumos para el desarrollo de inoculantes
en el país.
2. Materiales y métodos
2.1. Localización de los lugares de muestreo y material vegetal evaluado
Para el desarrollo del estudio se recolectaron muestras provenientes de plantas de caña y de
tomate. En caña el muestreo se realizó en tres fincas dedicadas al cultivo en el departamento de
Caldas, referenciadas geográficamente así: Finca 1: 919 m, Latitud 5°23ˊ37.7˝ Norte,
Longitud 75°37ˊ48.1˝ Oeste; Finca 2: 1001 m, Latitud 5°24ˊ04.2˝ Norte, Longitud
75°38ˊ10.0˝ Oeste; Finca 3: 1121 m, Latitud 5°24ˊ48.5˝ Norte, Longitud 75°38ˊ42.5˝ Oeste.
Los cultivos tenían diferentes tiempos de siembra (270, 360 y 450 días), en los cuales se
recolectaron muestras de hojas, tallo y raíz de 10 plantas en cada uno.
Adicionalmente se tomaron muestras provenientes de un cultivo de tomate (Solanum
lycopersicum) ubicado en un invernadero de la Granja Tesorito, de la Universidad de Caldas
(Altitud 2344 msnm, Latitud 5°1,77Norte, Longitud 75°26,147 Oeste). Se realizaron tres
muestreos en diferentes estados del ciclo productivo del cultivo (50, 100 y 150 días), y se
recolectaron muestras de tallo y raíz de 10 plantas en cada muestreo.
Los muestreos se realizaron en cultivos donde no se había realizado aplicación de
agroquímicos recientemente. La toma de las muestras se realizó al azar en zig-zag con una
distancia de 10 m entre plantas para un total de 10 plantas muestreadas por cultivo y por
muestreo; el muestreo consistió en la recolección de hojas, trozos de tallos y de raíces en caña y
de tallos y raíces en tomate. Las muestras se empacaron en bolsas plásticas y fueron
transportadas en neveras de icopor al Laboratorio de Microbiología Agroindustrial del Instituto
de Investigación en Microbiología y Biotecnología Agroindustrial (IMBA) de la Universidad
Católica de Manizales. Los suelos de los cultivos evaluados eran ricos en materia orgánica
(entre 13 y 20,43%), con pH entre 4,4 y 5,9 y con niveles de nitrógeno entre 0,4 y 0,68%
(Anexo 1), de acuerdo con los análisis realizados en el Laboratorio de Química y Fertilidad de
Suelos de la Universidad de Caldas.
2.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento
En la siembra inicial se empleó el medio semisólido LGI-P, el cual es un medio libre de
nitrógeno (Cavalcante y Döbereiner, 1988) el cual contiene los siguientes componentes (en
g/L): K2HPO4, 0,2; KH2PO4, 0,6; MgSO4·7H2O, 0,2; CaCl2·2H2O, 0,2; Na2MoO4·2H2O, 0,002;
FeCl3·6H2O, 0,01; solución al 0,5% de azul de bromotimol en KOH 0,2 N, 5 mL; agar, 1,8;
azúcar blanco, 100; pH final de 6,0. Para el aislamiento se empleó agar LGI-PNs (Cavalcante y
Döbereiner, 1988), el cual tiene la misma composición por litro que el medio semisólido LGI-
P, con la adición de 50 mg de extracto de levadura y 15 g de agar. Para la purificación de la
bacteria de interés, se empleó el agar papa dextrosa (Oxoid®, EUA). El caldo DYGS
modificado (Rodrigues Neto et al., 1986) se empleó para obtener la biomasa necesaria en la
realización de los ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), en la determinación
de compuestos indólicos y en la solubilización de fósforo. El medio tiene la siguiente
composición (en g/L): glucosa, 2; peptona bacteriológica, 1,5; extracto de levadura, 2; K2HPO4,
0,5; MgSO4·7H2O, 0,5; ácido glutámico, 1,5; pH final de 6,0. La solubilización de fósforo se
evaluó en el medio NBRIP (National Botanical Research Institute’s Phosphate), el cual tiene
los siguientes componentes (en g/L): glucosa, 10; MgCl2·6H2O, 5; MgSO4·7H2O, 0,25; KCl,
0.2 y (NH4)2SO4, 0,1; suplementado individualmente con fosfato tricálcico (Ca3(PO4)2), 2,5 y
fosfato de aluminio (AlPO4), 2,5.
2.3. Aislamiento y cuantificación de bacterias diazótrofas
Se recolectaron 150 muestras en total; para su procesamiento, las muestras inicialmente se
lavaron con abundante agua de la llave para retirar el material no deseado, se desinfestaron con
Tween 80 al 0,1% y por último se lavaron con agua estéril (Dibut et al., 2004). Las muestras
fueron maceradas en solución de sacarosa al 1% empleando una licuadora, la cual se utilizó a
bajas revoluciones y con tiempos de homogenización que no superaron los 30 segundos con el
fin de no alterar la muestra. Con el homogenizado obtenido se realizaron diluciones desde 10-1
hasta 10-3, y se sembraron alícuotas de 100 µL por triplicado en viales de 6 mL que contenían 3
mL de medio semisólido LGI-P (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Madhaiyan et al., 2004). Los
cultivos se incubaron a 30°C durante 6-7 días. En este tiempo se verificó la formación de
película en la superficie del medio y el viraje de color del mismo, lo que se cuantificó mediante
el método del Número Más Probable (NMP) para determinar el número de células por mililitro
(Cavalcante y Döbereiner, 1988; Döbereiner et al., 1995). A las muestras que se evidenciaron
estas características se les realizó pase a medio LGI-P semisólido nuevamente; una vez se
verificó la recuperación de la película con las mismas características a la del vial inicial, se
realizó aislamiento en agar LGI-PNs y purificación de colonias en agar papa dextrosa, con el
fin de obtener las colonias en forma individual y realizar la descripción macroscópica de las
mismas.
En los aislamientos recuperados se evaluaron parámetros como coloración de Gram,
determinación de catalasa y oxidasa y fermentación de carbohidratos (Dong et al., 1995). Los
aislamientos fueron preservados a -20°C, empleando glicerol al 10% como crioprotector. Con
este fin se inoculó en caldo DYGS una colonia de la bacteria a preservar y se llevó a agitación a
150 rpm a una temperatura de 30°C por un periodo entre 24 y 48 horas, de acuerdo con el
tiempo de crecimiento del microorganismo. Luego del periodo de crecimiento las células se
lavaron empleando como diluyente agua destilada estéril y finalmente la concentración de la
bacteria se ajustó a una absorbancia comprendida entre 0,9 y 1, empleando como diluyente
glicerol al 10%. La solución se dispensó en microtubos de 1,5 mL los cuales se llevaron
congelación gradual hasta -20°C.
2.4. Identificación por PCR de las bacterias aisladas
Se realizó la recuperación de los aislamientos a partir de los viales criopreservados para lo
cual se activó el cultivo mediante un choque térmico a 37°C, con posterior siembra en
superficie sobre agar papa dextrosa (Oxoid, EUA). Los cultivos se incubaron a 30°C durante
24-48 horas y posteriormente se verificó la pureza y presencia de colonias aisladas. Se tomó
una colonia de cada placa, y se transfirió a 5 ml de caldo DYGS modificado (Rodrigues Neto et
al., 1986), el cual se incubó a 30°C en agitación a 150 rpm hasta fase logarítmica. Para la
recuperación de la biomasa, se centrifugó el cultivo en medio líquido durante 10 minutos a
2500 rpm; el pellet obtenido se lavó por dos veces con solución salina estéril al 0,85%,
centrifugando cada vez para decantar las células. Se llevó la biomasa resultante a una
concentración aproximada de 109 células/mL.
La extracción y purificación de ADN genómico se realizó mediante el Kit PureLink®
Genomic DNA (Invitrogen, EUA), recomendado para la lisis de bacterias Gram negativas. La
eficiencia del proceso de extracción de ADN se verificó mediante la realización de
electroforesis en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio, usando como marcador de peso
molecular el fago λ/Hind III. Para la cuantificación se tomaron registros fotográficos de los
geles revelados a luz ultravioleta y se comparó la intensidad y la distancia migrada de cada
fragmento en particular frente al marcador de peso molecular.
La identificación molecular de los aislamientos se realizó mediante la amplificación por
PCR del ADNr de la subunidad pequeña (16S) a partir del ADN genómico previamente
extraído utilizando los primers universales RB (5’- AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3’) y
RM (5’- GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’) (Madhaiyan et al., 2004), con el fin de
amplificar un fragmento de aproximadamente 800 pb. Las reacciones de PCR se llevaron a
cabo en un volumen total de 25μL, se adicionó buffer de PCR 1X, dNTPs 0,2 mM, MgCl2 1
mM, primers 0,5 µM, taq ADN polimerasa recombinante (Invitrogen®) 1U, y
aproximadamente 100 ng de ADN bacteriano. Se utilizó el termociclador MS mini (Bio-Rad®,
EUA) en el cual se realizó una desnaturalización inicial a 95°C durante 10 minutos, 1 minuto
de desnaturalización adicional a 92°C, alineamiento a 53°C por 1 minuto seguido de 35 ciclos
de extensión a 72°C de 2 minutos cada uno. Los productos de la amplificación fueron
analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Una vez
amplificado el ADN de la región 16S de cada aislamiento se realizó la secuenciación de los
productos de PCR en la compañía Macrogen® (Corea del Sur); para lo anterior se enviaron
viales que contenían ~20μL de los productos de cada reacción de PCR.
2.5. Análisis bioinformático de las secuencias obtenidas
A las secuencias obtenidas con el cebador se les realizó un análisis de calidad usando el
programa CLC® Main Workbench (Qiagen Company, EUA), empleando como criterios de
aceptación un valor Phred mayor a 30 por base y como criterio de rechazo una ventana con 50
bases inferior al valor Phred, y un tamaño inferior a 600 bases. Se desarrolló la anotación de las
secuencias usando el programa BLASTN ver. 2.2.27+ (Altschul et al., 1990) contra la base de
datos nt del NCBI, con un valor-e de 1×10-5. Estos resultados fueron filtrados con el 80% de
similitud y 80% de cobertura de la región que estaba amplificando con los primers descritos en
el numeral anterior. Una vez obtenidas las descripciones por BLAST se procedió a construir la
base de datos para los alineamientos de acuerdo con los taxones que cumplieron con las
características para ser considerados como un acierto (hit). Para el alineamiento se usó el
software Clustal W ver. 2.1 (Larkin et al., 2007) y el resultado se usó como entrada (input) al
programa de análisis filogenético Mega 5 ver. 5.2.2 (Tamura et al., 2011), utilizando el método
de Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987), con base en las distancias medias, asumiendo una
tasa de mutación uniforme; la topología del árbol se evaluó utilizando bootstrap (Felsenstein,
1985) con 1000 submuestreos.
2.6. Evaluación de las características de promoción de crecimiento
En las pruebas de promoción de crecimiento se empleó como patrón la cepa de referencia
de Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC 49037 (PAL5), con el fin de valorar la actividad
de los aislamientos recuperados.
2.6.1. Evaluación de compuestos indólicos
Los compuestos indólicos fueron determinados como ácido indolacético por
espectofotometría empleando el reactivo de Salkowski (Gordon y Weber, 1951; Glickmann y
Dessaux, 1995; Sarwar y Kremer, 1995). Para ello se partió de una colonia pura de la bacteria
recuperada en medio agar papa dextrosa, la cual se pasó a un medio DYGS, y se incubó en
agitación a 30°C a 150 rpm entre 24 y 48 horas, dependiendo del ciclo de crecimiento del
microorganismo; posteriormente se separó la biomasa mediante dos lavados sucesivos con agua
destilada estéril y se preparó el inóculo con una densidad óptica comprendida entre 0,9 y 1
(aproximadamente 108 células/mL). Luego se dio la inducción con L-triptófano (1,01%)
(Panreac®, EUA) en medio DYGS, durante 60 horas a 150 rpm y 30°C. La determinación de
compuestos indólicos se realizó en el sobrenadante mediante reacción con reactivo de
Salkowski y lectura de absorbancia a 540 nm; cada muestra se procesó por triplicado. Los
niveles producidos de compuestos indólicos fueron estimados a partir de una curva patrón de
150 ppm de ácido indolacético (MERCK®, EUA) y fueron expresados en µg/mL.
2.6.2. Solubilización de fósforo
La solubilización de fósforo se valoró empleando el medio NBRIP con verde de
bromocresol (Nautiyal, 1999) el cual fue suplementado individualmente con Ca3(PO4)2 y
AlPO4. En cada placa de medio se depositó un volumen de 20µL por triplicado proveniente del
inóculo del aislamiento en estudio con una concentración aproximada de 108 células/mL. Se
realizaron lecturas a las 24, 48 y 72 horas, en las cuales se determinó el diámetro de la colonia y
el diámetro de los halos de solubilización en caso de estar presentes, con el fin de calcular el
índice de solubilización (Kumar y Narula, 1999) y el porcentaje de eficiencia de solubilización
(Nguyen et al., 1992). Adicionalmente se evaluó la producción de ácidos orgánicos mediante el
viraje del indicador de pH del medio de cultivo.
Se realizó análisis de varianza mediante el procedimiento GLM de SAS (SAS Institute
Cary, EUA), para determinar la ocurrencia de diferencias significativas entre tratamientos para
el conjunto de variables evaluadas. Se hizo comparación de medias a través de prueba de
partición de promedios o test de Duncan (p < 0,05).
3. Resultados
3.1. Aislamiento y cuantificación de bacterias diazótrofas asociadas a caña de azúcar y
tomate
La identificación de las bacterias promotoras de crecimiento asociadas a los cultivos de
caña de azúcar y tomate se realizó empleando, como primer bioensayo, la siembra de las
muestras en el medio de cultivo semisólido LGI-P el cual permite la selección de bacterias
diazótrofas que utilizan el N2 atmosférico como fuente de nitrógeno (Döbereiner, 1988). En los
tres cultivos de caña de azúcar evaluados se evidenció un comportamiento diferente en la
concentración de bacterias diazótrofas determinada. En caña se evidenció una mayor
concentración en el cultivo de 270 días de edad, seguido del cultivo de 360 días y por último
del cultivo de 450 días. En el cultivo de 270 días, se evidenció mayor concentración de
diazótrofas en orden descendente en hojas, tallo y por último en raíz, en contraste con lo
evidenciado en los cultivos de 360 y 450 días de edad, en los cuales se evidenció mayor
recuperación de bacterias en tallo y raíz respectivamente (Tabla 7).
En tomate se evaluó el mismo cultivo en diferentes tiempos de producción, evidenciándose
que el número de bacterias diazótrofas fue estable en raíz en las evaluaciones realizadas,
mientras que en tallo se evidenció una mayor concentración a los 50 días, valor que disminuyó
a los 100 y 150 días del cultivo (Tabla 8).
Tabla 7. Cuantificación de bacterias diazótrofas asociadas a caña de azúcar
Cultivo Edad Órgano No. No. cel/mLa Órgano No. No. cel/mLa Órgano No. No. cel/mLa
Caña 270 días Hoja 10 410 Raíz 10 185 Tallo 10 265
Caña 360 días Hoja 10 0 Raíz 10 110 Tallo 10 230
Caña 450 días Hoja 10 0 Raíz 10 75 Tallo 10 0
aValores obtenidos de la media de 10 repeticiones
Tabla 8. Cuantificación de bacterias diazótrofas asociadas a tomate
Cultivo Edad Órgano No. No. cel/mLa Órgano No. No. cel/mLa
Tomate 50 días Raíz 10 320 Tallo 10 3011
Tomate 100 días Raíz 10 279 Tallo 10 280
Tomate 150 días Raíz 10 249 Tallo 10 590
aValores obtenidos de la media de 10 repeticiones
En el análisis de varianza se identificaron diferencias estadísticamente significativas
(p<0,05), entre la concentración de diazótrofas recuperadas en caña y tomate, siendo mayor el
promedio en el cultivo de tomate (829,8 cel/mL). En cuanto a los tiempos de aislamiento, se
obtuvo mayor concentración de bacterias diazótrofas (838,2 cel/mL) en los cultivos con menor
tiempo del cultivo (50 días para tomate y 90 días para caña) con diferencias estadísticamente
significativas con los demás tiempos de evaluación. La expresión de diazótrofas fue mayor en
tallo con diferencias estadísticamente significativas en raíz y hojas. Finalmente se obtuvo en
caña 1 aislamiento asociado a hojas, 8 a raíces y 10 a tallos. En tomate se recuperaron 19
aislamientos asociados a raíz y 16 a tallos.
3.2. Identificación molecular de las bacterias diazótrofas
Los aislamientos evaluados mediante PCR, empleando el primer universal RB/RM, dieron
como resultado las bandas del tamaño esperado (800 pb). El análisis por BLASTN de los 54
productos de PCR purificados a partir del ADNr de la región 16S de bacterias se presenta en la
Tabla 9. Para tener una mayor confiabilidad en la identificación se realizó un análisis
filogenético con secuencias de referencia reportadas y respaldadas por la literatura científica
(Figura 8), confirmando los resultados obtenidos por el BLASTN en la identificación de las
bacterias usando el ADNr de la región 16S, que aunque no permite resolver especies o géneros
muy relacionados, permite asegurar que la identificación obtenida con BLASTN es coherente,
así como con las diferentes pruebas bioquímicas y la caracterización macro y microscópica.
El análisis por BLASTN de los 54 productos de PCR purificados para la región 16S del
ADNr de bacterias (Anexo 2), indicó que 33 de las cepas corresponden a Serratia marcescens,
8 a Stenotrophomonas maltophilia, 2 a Pseudomonas fluorescens, 2 a Serratia liquefaciens, 2 a
Pantoea dispersa, 1 a Bacillus cereus, 1 a Burkholderia cepacia, 1 a Bacillus subtilis, 1 a
Luteibacter sp., 1 a Serratia plymuthica, 1 a Burkholderia tropica y 1 a Stenotrophomonas sp.
En caña se evidenció en el cultivo de 270 días la asociación de Stenotrophomonas
maltophilia a hojas; Serratia marcescens se encontró relacionada con raíz y tallo y
Burkholderia tropica se encontró vinculada con la raíz. En el cultivo de 360 días, se encontró
Stenotrophomonas maltophilia asociada a raíz y tallo como Pantoea dispersa y Serratia
marcescens asociadas a tallo. Por último en el cultivo de 450 días se encontró
Stenotrophomonas maltophilia y Serratia marcescens asociadas a raíz (Tabla 10). Tabla 9. Identificación de bacterias asociadas a caña de azúcar y tomate, a partir de análisis BLASTN de
secuencias del ADNr.
Aislamiento Tamaño de la
secuencia
Descripción Similaridad Cobertura Valor-e
C1 779 Pantoea dispersa 99 86 0
C2 779 Pantoea dispersa 99 92 0
C3 799 Stenotrophomonas maltophilia 98 87 0
C4 806 Stenotrophomonas maltophilia 97 87 0
C5 775 Serratia marcescens 99 91 0
C6 866 Stenotrophomonas maltophilia 98 80 0
C7 786 Stenotrophomonas maltophilia 96 87 0
C8 790 Stenotrophomonas maltophilia 95 87 0
C9 785 Stenotrophomonas maltophilia 99 89 0
C12 782 Stenotrophomonas maltophilia 97 84 0
C13 783 Burkholderia tropica 99 86 0
C17 797 Serratia marcescens 99 91 0
C21 781 Serratia marcescens 99 90 0
C22 791 Serratia marcescens 99 87 0
C23 785 Serratia marcescens 99 92 0
C24 773 Serratia marcescens 99 94 0
C28 803 Stenotrophomonas sp. 98 79 0
C31 792 Serratia marcescens 98 92 0
C32 768 Stenotrophomonas maltophilia 91 87 0
T116 790 Serratia marcescens 99 87 0
T117 778 Serratia marcescens 100 88 0
T118 782 Bacillus cereus 99 90 0
T119 790 Serratia marcescens 99 89 0
T120 779 Serratia marcescens 99 87 0
T121 776 Serratia marcescens 99 90 0
T122 798 Serratia marcescens 99 92 0
T123 781 Serratia marcescens 100 88 0
T124 787 Serratia marcescens 99 88 0
T125 782 Serratia marcescens 99 89 0
T126 1013 Serratia marcescens 98 69 0
T127 780 Serratia marcescens 99 87 0
T128 777 Serratia marcescens 99 87 0
T130 776 Serratia marcescens 99 89 0
T131 773 Serratia marcescens 99 93 0
T132 781 Serratia marcescens 99 89 0
T133 777 Serratia marcescens 99 86 0
T134 773 Burkholderia cepacia 99 88 0
T135 781 Serratia marcescens 99 88 0
T136 773 Pseudomonas fluorescens 99 90 0
T137 857 Serratia marcescens 99 78 0
T140 784 Serratia marcescens 99 89 0
T141 776 Pseudomonas fluorescens 99 100 0
T142 767 Serratia liquefaciens 87 93 0
T143 785 Bacillus subtilis 99 91 0
T144 777 Serratia liquefaciens 89 85 0
T146 798 Serratia marcescens 99 90 0
T147 774 Serratia marcescens 98 89 0
T148 774 Serratia marcescens 99 88 0
T149 793 Serratia marcescens 99 90 0
T151 793 Serratia plymuthica 99 88 0
T152 780 Serratia marcescens 99 90 0
T153 781 Serratia marcescens 99 88 0
T154 787 Serratia marcescens 99 91 0
T155 787 Luteibacter sp 99 90 0
Figura 8. Árbol filogenético de bacterias recuperadas a partir de caña de azúcar y tomate. Los números de
accesión corresponden a la nomenclatura del GenBank (Anexo 2).
Tabla 10. Distribución de la población bacteriana de raíces, tallos, hojas de los cultivos de caña evaluados
Género/Especie Cultivoa Total Cultivoa Total Cultivoa Total
1 2 3 1 2 3 1 2 3
Bacterias asociadas a raíz
Bacterias asociadas a tallo
Bacterias asociadas a hoja
Burkholderia tropica 1 1 0 0
Serratia marcences 1 2 3 3 1 4 0
Stenotrophomonas maltophilia 3 1 4 3 3 1 1
Stenotrophomonas sp. 0 1 1 0
Pantoea dispersa 0 2 2 0
Total 8 10 1
: No encontrado. a Edad de los cultivos de muestreo: 1: 270 días; 2: 360 días; 3: 450 días.
En tomate, a los 50 días del cultivo se asoció Serratia marcescens a tallo y raíz;
Burkholderia cepacia y Pseudomonas fluorescens a raíz y Bacillus cereus a tallo. A los 100
días del cultivo solo se recuperó Serratia marcescens de tallo y raíz. A los 150 días se recuperó
Serratia marcescens a partir de tallo y raíz; Serratia plymuthica y Luteibacter sp. se
encontraron asociados a raíz y Pseudomonas fluorescens, Serratia liquefaciens y Bacillus
subtilis asociadas a tallo (Tabla 11).
Tabla 11. Distribución de la población bacteriana de raíces y tallos del cultivo de tomate evaluado
Género/Especie Cultivoa Total Cultivoa Total
1 2 3 1 2 3
Bacterias
asociadas a raíz
Bacterias
asociadas a tallo
Bacillus cereus 0 1 1
Burkholderia cepacia 1 1 0
Pseudomonas fluorescens 1 1 1 1
Serratia marcences 8 1 6 15 9 1 1 11
Bacillus subtilis 0 1 1
Luteibacter sp. 1 1 0
Serratia liquefaciens 0 2 2
Serratia plymuthica 1 1 0
Total 19 16
: No encontrado. a Tiempos de muestreo: 1: 50 días. 2: 100 días. 3. 150 días.
3.3. Características de promoción de crecimiento
3.3.1. Producción de compuestos indólicos
El 100% de los aislamientos demostraron producción de compuestos indólicos en menor o
mayor concentración. De acuerdo con las determinaciones realizadas, los aislamientos
estudiados producen entre 0,947 y 260,7 µg/mL de compuestos indólicos (Tabla 12). Los
mayores niveles de producción en orden descendente se obtuvieron con los aislamientos T146,
T127, C1, cepa de referencia de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5 y C31;
encontrándose diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre éstos.
Tabla 12. Características de promoción de crecimiento de los aislamientos recuperados a partir de caña y
tomate.
Aislamiento Bacteria Cultivo/órgano Compuestos
indólicos
[µg/mL]a
Solubilización de fósforo a las 72 h a
Ca3(PO4)2 AlPO4
IS ES IPA
C1 Pantoea dispersa Caña/tallo 84,413 1,933 93,333 12,000
C2 Pantoea dispersa Caña/tallo 26,813 1,670 66,670 14,000
C3 Stenotrophomonas maltophilia Caña/tallo 12,847 1,847 84,920 3,070
C4 Stenotrophomonas maltophilia Caña/tallo 23,280 1,323 3,259 4,280
C5 Serratia marcescens Caña/tallo 12,236 0,000 0,000 4,553
C6 Stenotrophomonas maltophilia Caña/raíz 12,591 2,380 137,500 7,000
C7 Stenotrophomonas maltophilia Caña/raíz 10,813 2,210 120,833 7,667
C8 Stenotrophomonas maltophilia Caña/raíz 6,013 2,483 148,213 6,143
C9 Stenotrophomonas maltophilia Caña/tallo 9,547 1,850 84,723 5,71
C12 Stenotrophomonas maltophilia Caña/hoja 26,147 1,000 0,000 4,793
C13 Burkholderia tropica Caña/raíz 13,347 2,193 119,047 10,500
C17 Serratia marcescens Caña/tallo 8,591 1,880 87,500 3,857
C21 Serratia marcescens Caña/raíz 22,947 1,000 0,000 5,167
C22 Serratia marcescens Caña/tallo 12,058 2,880 187,500 11,000
C23 Serratia marcescens Caña/raíz 0,947 1,587 58,333 3,380
C24 Serratia marcescens Caña/raíz 2,680 2,617 161,903 6,573
C28 Stenotrophomonas sp Caña/tallo 4,013 1,750 75,000 4,297
C31 Serratia marcescens Caña/tallo 46,680 3,547 254,167 15,867
C32 Stenotrophomonas maltophilia Caña/raíz 7,569 1,710 71,430 4,613
T116 Serratia marcescens Tomate/tallo 5,258 2,447 144,643 7,190
T117 Serratia marcescens Tomate/tallo 3,147 2,087 108,333 7,167
T118 Bacillus cereus Tomate/tallo 3,547 2,070 107,037 6,703
T119 Serratia marcescens Tomate/tallo 9,880 1,683 68,057 3,800
T120 Serratia marcescens Tomate/tallo 26,547 2,027 102,527 13,333
T121 Serratia marcescens Tomate/tallo 3,969 2,413 141,070 5,287
T122 Serratia marcescens Tomate/tallo 8,013 2,157 115,740 5,427
T123 Serratia marcescens Tomate/tallo 12,080 2,190 119,050 6,507
T124 Serratia marcescens Tomate/tallo 15,658 1,857 85,480 6,683
T125 Serratia marcescens Tomate/tallo 13,836 1,633 62,967 8,277
T126 Serratia marcescens Tomate/raíz 13,613 2,460 145,833 5,283
T127 Serratia marcescens Tomate/raíz 223,747 1,630 62,500 13,100
T128 Serratia marcescens Tomate/raíz 3,100 2,160 116,060 6,237
T130 Serratia marcescens Tomate/raíz 49,569 1,927 92,527 5,760
T131 Serratia marcescens Tomate/raíz 4,058 2,007 100,463 5,767
T132 Serratia marcescens Tomate/raíz 10,413 2,247 124,537 7,510
T133 Serratia marcescens Tomate/raíz 10,813 2,037 103,703 6,537
T134 Burkholderia cepacia Tomate/raíz 13,969 2,507 150,593 6,807
T135 Serratia marcescens Tomate/raíz 15,169 2,140 113,690 6,637
T136 Pseudomonas fluorescens Tomate/raíz 5,413 2,037 103,703 7,763
T137 Serratia marcescens Tomate/tallo 23,222 1,487 48,610 6,083
T140 Serratia marcescens Tomate/raíz 10,369 2,257 125,923 6,717
T141 Pseudomonas fluorescens Tomate/tallo 7,747 1,613 61,310 5,477
T142 Serratia liquefaciens Tomate/tallo 9,680 2,337 133,333 13,333
T143 Bacillus subtilis Tomate/tallo 24,502 1,810 80,950 6,983
T144 Serratia liquefaciens Tomate/tallo 21,258 1,723 72,223 4,047
T146 Serratia marcescens Tomate/tallo 260,769 1,453 45,370 12,000
T147 Serratia marcescens Tomate/raíz 13,147 2,170 116,667 5,673
T148 Serratia marcescens Tomate/raíz 19,547 2,407 140,740 7,333
T149 Serratia marcescens Tomate/raíz 19,924 2,240 123,810 6,330
T151 Serratia plymuthica Tomate/raíz 2,660 2,460 145,833 7,477
T152 Serratia marcescens Tomate/raíz 6,636 2,320 132,220 6,487
T153 Serratia marcescens Tomate/raíz 11,680 2,047 104,763 5,963
T154 Serratia marcescens Tomate/raíz 18,213 1,567 56,480 5,393
T155 Luteibacter sp. Tomate/raíz 8,102 2,600 160,120 6,057
PAL5 Gluconacetobacter diazotrophicus Cepa de referencia 64,280 3,097 209,523 14,000 a Valores obtenidos de la media de tres repeticiones. IPA: Índice de producción de ácido. IS: Índice de solubilización. ES:
Eficiencia de solubilización.
3.3.2. Capacidad de solubilización de fósforo
Se evaluó la solubilización de dos fuentes de fósforo como fosfato de aluminio y fosfato
tricálcico a través de la determinación del diámetro de la colonia y del halo de solubilización.
En las placas de fosfato de aluminio no se evidenció formación de halo de solubilización, solo
se apreció un halo de viraje de color del medio que indica la producción de ácidos orgánicos
(Figura 9), por lo tanto en esta prueba se reportó el índice de producción de ácido. En la
determinación de fosfato tricálcico se evaluó el índice y el porcentaje de eficiencia de
solubilización.
En el índice de producción de ácido (IPA) evaluado en las placas con fosfato de aluminio,
se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05%) entre los valores
obtenidos, donde el mejor IPA fue el del aislamiento C31 (15,86) seguido de la cepa de
referencia PAL5 (14,0). Igualmente en la prueba con fosfato tricálcico, durante la evaluación
del índice y eficiencia de solubilización, se encontraron diferencias estadísticas (p<0,05%)
entre los diferentes aislamientos evaluados. Los mejores resultados se obtuvieron con los
aislamientos C31 (IS: 3,54 y ES: 254,16), PAL5 (IS: 3,097 y ES: 209,52) y C22 (IS: 2,88 y ES:
187,5) (Tabla 12).
(a) (b)
Figura 9. Características de los halos obtenidos en el medio NBRIP. (a) Medio NBRIP con fosfato tricálcico.
Nótese el halo de solubilización alrededor de la colonia (zona transparente). (b) Medio NBRIP con fosfato de
aluminio. Se aprecia un halo con viraje de color del medio alrededor de la colonia, atribuido a la producción
de ácidos orgánicos por la bacteria en estudio. No se evidencia halo de solubilización.
4. Discusión
Tanto en los ecosistemas intervenidos como en los ecosistemas naturales, las asociaciones
bacteria-planta juegan un papel importante soportando o mejorando la sanidad de la planta y su
nutrición (Compant et al., 2010). La mayoría de las bacterias que se asocian a las plantas,
provienen del suelo; éstas pueden migrar a la rizosfera y posteriormente al rizoplano de su
hospedante antes de tener la capacidad de demostrar sus beneficios. Algunas bacterias que se
encuentran en el rizoplano también pueden penetrar las raíces de las plantas y algunas cepas se
pueden movilizar hasta la parte aérea (Bashan y Holguin, 1998).
En el presente trabajo se realizó el aislamiento de bacterias promotoras del crecimiento
asociadas a los cultivos de caña de azúcar y tomate, para lo cual se empleó como prueba de
selección inicial la siembra de las muestras en medios de cultivo semisólidos libres de
nitrógeno, con el fin de estimular el crecimiento de bacterias diazótrofas a partir de la
utilización del N2 atmosférico. El crecimiento de las bacterias diazótrofas se evidencia a través
de la formación de una película superficial en el medio de cultivo, a partir de la cual se realiza
su aislamiento. Esta metodología se ha utilizado en diferentes investigaciones no solo para
identificar a este grupo funcional de bacterias, sino también para cuantificar la concentración de
éstas en diferentes cultivos o suelos (Döbereiner, 1988). En las diazótrofas evaluadas
posteriormente se aplican bioensayos para la determinación de la producción de compuestos
indólicos y de solubilización de fósforo, con el fin de determinar su potencial como promotoras
del crecimiento.
En caña de azúcar este trabajo ha realizado la evaluación de bacterias promotoras de
crecimiento con el fin de valorar el potencial de los diferentes aislamientos con miras al
desarrollo de alternativas biológicas promisorias, que permitan la expansión del cultivo en
Colombia. Estudios similares en Brasil han identificado bacterias del género Achromobacter,
Agrobacterium, Burkholderia, Gluconacetobacter y Stenotrophomonas, como las de mayor
predominio en este cultivo. Varias de estas bacterias tienen la capacidad de producir
compuestos indólicos y sideróforos, solubilizar fosfato y fijar nitrógeno (Beneduzi et al., 2013).
En tomate se ha encontrado asociación del cultivo con especies de Pseudomonas las cuales han
sido valoradas in vitro para identificar su potencial en el control de Sclerotinia sclerotum,
Fusarium solani y Alternaria alternata (Hammami et al., 2013); igualmente se han realizado
diferentes estudios con el fin de determinar la interacción con bacterias promotoras de
crecimiento como Burkholderia (Caballero et al., 2007), Psedomonas (Gamalero et al., 2004;
Gravel et al., 2007) y Methylobacterium suomiense (Poonguzhali et al., 2008).
Las concentraciones de microorganismos aisladas de cada cultivo en este estudio se pueden
correlacionar con las características del suelo de donde provienen los mismos. El suelo
rizosférico de los cultivos (tomate y caña) se caracterizó por tener un alto contenido de materia
orgánica, siendo mayor en tomate, lo cual se aprecia en el número y diversidad de aislamientos
recuperados a partir de esta planta. Además los suelos presentaron un pH entre 4,4 en el cultivo
de tomate y entre 5,3 y 5,9 para el de caña (Anexo 1). Diversos autores han demostrado la
importancia de algunas propiedades de la fertilidad del suelo como el pH y la materia orgánica
en la supervivencia y establecimiento de los microorganismos en la rizosfera (Hernández et al.,
2000; Vazquez et al., 2000), condición que se vio reflejada en este estudio.
Otro aspecto que se debe considerar y que puede influir en la aparición de bacterias
asociativas encontradas en este estudio, es la composición de los exudados radicales excretados
por la planta; éstos sirven como principal factor activador de la colonización de la raíz
(Lugtenberg et al., 2002) y de las asociaciones microbianas (Walker et al., 2011). Sin embargo,
no se conoce específicamente cuál es el compuesto orgánico secretado por la raíz que
determina la estructura de la comunidad (Pérez y Casas, 2005), lo cual es fundamental para
comprender adecuadamente la interacción de los microorganismos con la planta (Rojas et al.,
2011).
Tradicionalmente los principales mecanismos empleados para explicar los efectos de
promoción de crecimiento de las bacterias en las plantas involucran la producción de
fitohormonas (Patten y Glick, 1996). En este sentido el ácido indolacético (AIA) es una de las
principales fitohormonas que promueve el desarrollo en las plantas (Spaepen y Vanderleyden,
2011), ya que se ha demostrado estimula la formación de pelos radicales y el número y
elongación de raíces laterales. Lo anterior permite una mayor absorción de agua y nutrientes
por la planta, así como un mayor intercambio con el medio ambiente de la rizosfera (Javed y
Arshad, 1999).
La mayoría de bacterias aisladas en el presente estudio demostraron el potencial en la
síntesis de diferentes niveles de compuestos indólicos, en presencia del precursor L-triptófano
(Tabla 12). La mayoría de las concentraciones obtenidas se pueden considerar como bajas, de
acuerdo con la cepa de referencia PAL5 y los valores reportados para otras bacterias
promotoras de crecimiento (Beneduzi et al., 2013; Guglielmetti et al., 2013) (Tabla 13). Es
importante resaltar que en los bioensayos de determinación de compuestos indólicos y
solubilización de fósforo, se empleó como cepa de referencia G. diazotrophicus PAL5, debido a
que ha sido reportada como una bacteria promotora de crecimiento de gran potencial por las
características que ha expresado in vitro (Fuentes et al., 1993; Crespo et al., 2011), e in vivo en
diferentes cultivos de leguminosas y no leguminosas (Boddey et al., 1991; Li y Macrae, 1991;
Luna et al., 2012). Lo anterior permite disponer de un patrón de comparación, que permite
valorar el comportamiento de los aislamientos obtenidos en este estudio.
Las concentraciones obtenidas de compuestos indólicos de los aislamientos promisorios de
este estudio pueden ser suficientes para tener una influencia directa en el crecimiento vegetal,
teniendo en cuenta que los reguladores de crecimiento vegetal cumplen su función en el
crecimiento de las plantas en bajas concentraciones (Hernández et al., 2004). En este sentido
Gravel et al.(2007) demostraron la estimulación de plantas de tomate inoculadas con
Pseudomonas sp., donde valores tan bajos como de 5 µg/mL fueron capaces de promover el
crecimiento de las plantas en condiciones de invernadero.
Tabla 13. Concentración de compuestos indólicos determinados por el método de Salkowski, inducidos con
L-triptófano
Género Compuestos
indólicos
[µg/mL]
Referencia
Gluconacetobacter sp. 121,78 Beneduzi et al., (2013)
Achromobacter sp. 79,89
Gluconacetobacter diazotrophicus 109,35
Burkholderia sp. 50,16
Azoshizobium sp. 38,27
Luteibacter rhizovicinus 127,3 Guglielmetti et al., (2013)
Pseudomonas chlororaphis 24,9
Paenibacillus kribbensis (HS-P01) 24 Ji et al., (2014)
Paenibacillus kribbensis (HS-R14) 24,6
Bacillus aryabhattai (HS-S05) 21,6
Klebsiella pneumoniae (KW7-S06) 18,2
Klebsiella pneumoniae (KW7-S22) 21,4
Bacillus subtilis (CB-R05) 3,7
Serratia marcescens 19,6 Badawi et al., (2011)
Bradyrhizobium 11,8
Bacillus sp. (RFNB2) 2,1 Islam et al., (2013)
Pseudomonas sp. (RFNB3) 2,3
Serratia sp. (RFNB8) 1,4
Burkholderia sp. (RFNB13) 1,4
Serratia sp. (RFNB14) 1,6
La comunidad microbiana del suelo influye en el estado de fertilidad a través de procesos
de descomposición, mineralización y almacenamiento/liberación de nutrientes. Hay evidencias
que demuestran que algunas bacterias tienen la capacidad de transformar el fósforo a formas
disponibles para la planta. Además al aumentar el fósforo disponible en el suelo, las plantas
pueden aumentar su rendimiento, por lo que se consideran los microorganismos solubilizadores
de fosfato como promotores del crecimiento vegetal (Fernández et al., 2005).
Según los resultados obtenidos en esta investigación, el 98% de los aislados solubilizan
fosfatos, lo cual permite evidenciar el enorme potencial de los microorganismos recuperados.
Sin embargo es muy importante valorar en medio líquido otras fuentes de fósforo y estimar la
cinética de los mejores aislados, antes de iniciar valoraciones en campo (Bashan et al., 2013).
La utilización de microorganismos con la capacidad de solubilizar fosfato se relaciona
fundamentalmente con un efecto promotor del crecimiento en cultivos de importancia
económica (Pandey et al., 2006; Hameeda et al., 2008). En este sentido, la evaluación en
campo de las rizobacterias seleccionadas en este estudio, representará a futuro una solución
ecológica y económica factible para disminuir la aplicación de fertilizantes fosfatados, ya que
se ha podido observar una movilización efectiva del fosfato en plantas que han sido
previamente inoculadas con estos microorganismos (Zhu et al., 2007).
El IS depende de diferentes factores, entre los que sobresalen el tipo de microorganismo
aislado (Beltrán et al., 2005), la producción de ácidos orgánicos (Paredes y Espinosa, 2010), el
sustrato empleado como fuente de fósforo (Lemke et al., 1995), el medio de cultivo y la fuente
de carbono empleada. Lo anterior se evidenció en el presente estudio, al observar con fosfato
tricálcico la formación de halos de solubilización, mientras que con fosfato de aluminio se
observó acidificación del medio pero no solubilización (Figura 9). Se conoce que el consumo
de fuentes de carbono como sacarosa o glucosa da como resultado la producción de ácidos
orgánicos que acidifican el pH del medio, lo cual está relacionado con los mecanismos
empleados por la bacteria para solubilizar fósforo. En ese sentido, Kucey et al.(1989) y Bashan
et al. (2013) demostraron que la solubilización del fósforo presente en suelos se debe en
algunos casos a la producción de ácidos orgánicos como el ácido oxálico, cítrico, láctico y
glucónico entre otros, productos del metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, es importante
identificar el tipo de ácidos producidos por las bacterias en estudio y determinar su efecto en la
solubilización de fósforo.
Las bacterias aisladas en este estudio han sido reportadas a nivel mundial en
investigaciones donde se resaltan sus diferentes propiedades promotoras de crecimiento, lo cual
permite visualizar un potencial enorme en la aplicación que pueden tener. No obstante, se
deben realizar otros bioensayos a escala de laboratorio y campo para seleccionar los aislados
más eficientes.
Serratia marcescens predominó en los cultivos de tomate y caña de esta investigación,
aislamientos que demostraron los mejores valores de producción de compuestos indólicos
(260,76 µg/mL) y solubilización de fósforo (IS: 3,54 y ES: 254,16), los cuales estuvieron por
encima de los obtenidos con la cepa de referencia de G. diazotrophicus PAL5 (64,28 µg/mL;
IS: 3,097 y ES: 209,52). S. marcescens es una bacteria Gramnegativa, que ha sido asociada al
deterioro de alimentos (Abdour, 2003), al control de insectos (Bahar y Demirbag, 2007) y de
patógenos de plantas como Botrytis cinerea, Cryphonectria parasitica, Rhizoctonia cerealis y
Valsa sordida, a través de la producción de antimicrobianos como quitinasas, proteasas y de
antibióticos como la pirrolnitrina y sideróforos (Badawi et al., 2011). Como bacteria promotora
de crecimiento tiene la capacidad de producir ácido 3-indolacético (Liu et al., 2010) y de
solubilizar fósforo, permitiendo incrementar la producción de biomasa en plantas de maíz, en
un 99% en condiciones de invernadero (Hameeda et al., 2008). Igualmente se ha comprobado
el efecto promotor de crecimiento de Serratia marcescens en plantas de tomate, donde se
obtuvo aumento en el peso seco de la planta, incremento en la producción de frutos y control de
la reproducción de nematodos (Almaghrabi et al., 2013). En plantas de maní se demostró la
habilidad de S. marcescens para producir compuestos indólicos, sideróforos y promover la
nodulación de Bradyrhizobium cuando se inocularon en forma conjunta (Badawi et al., 2011).
Lo anterior permite identificar el gran potencial de esta bacteria como promotora de
crecimiento, estudios que deben ser complementados con la evaluación de la actividad
nitrogenasa, solubilización de fósforo en medio líquido y determinación de compuestos con
actividad antimicrobiana.
Stenotrophomonas maltophilia fue la bacteria que se aisló con más frecuencia a partir de
plantas de caña de azúcar en esta investigación. Los valores obtenidos en producción de
compuestos indólicos (6,013 µg/mL) y solubilización de fósforo (IS: 1,0 y ES: 0,0) estuvieron
por debajo de los obtenidos con la cepa de referencia PAL5 (64,28 µg/mL; IS: 3,097 y ES:
209,52). Tradicionalmente S. maltophilia se ha encontrado asociada a patologías nosocomiales
(Senol, 2004), sin embargo actualmente se ha reconocido el potencial de especies del género
Stenotrophomonas en otros roles, como su importante participación en el ciclo del nitrógeno y
del azufre (Banerjee y Yesmin, 2002; Park et al., 2005) y, en el caso de S. maltophilia, con la
capacidad de establecer interacciones benéficas con las plantas (Ryan et al., 2009). La bacteria
se ha encontrado asociada a trigo y a lechuga, aislamientos que fueron valorados en la
capacidad de producción de AIA, demostrando valores superiores a los obtenidos en estudios
anteriores (Park et al., 2005).
En el presente estudio Pantoea dispersa se aisló únicamente del cultivo de caña de azúcar,
lo cual concuerda con el trabajo realizado por Loiret et al. (2004) quienes recuperaron la
bacteria del interior de tallos de plantas de este cultivo. P. dispersa ha sido reportada como
agente de biocontrol (Maisuria et al., 2008) y como promotora de crecimiento (Fernández et
al., 2008; Loiret et al., 2009), efecto que se ha demostrado en el incremento de la biomasa de
plantas de pimienta cuando la bacteria es adicionada con bajos niveles de amonio (Flores et al.,
2010). Igualmente P. dispersa ha sido reconocida con capacidad de solubilizar fósforo con
formación de halos de hasta 6 mm en el medio NBRIP a 7 días de incubación a 30ºC (Elvia et
al., 2008), valor inferior al obtenido con los aislamientos de este estudio en los que se
observaron halos de solubilización de 19 mm (aislamiento C1) y de 15 mm (aislamiento C2) a
los tres días de incubación a 30ºC, con valores de índice y eficiencia de solubilización de
1,93/93,33 y 1,67/66,67 respectivamente. En otros estudios se ha identificado la capacidad de la
bacteria de producir AIA (3,7 µg mL/día) a 15ºC (Selvakumar et al., 2008), en contraste con lo
presentado en este estudio donde el aislamiento C1 presentó una producción de compuestos
indólicos de 84,41 µg/mL luego de tres días de incubación a 30ºC (Tabla 12).
De manera general los resultados confirmaron la capacidad de las bacterias aisladas para
producir compuestos indólicos y solubilizar fósforo que pueden influir en la estimulación del
crecimiento vegetal en diferentes cultivos de importancia económica. Se recomienda continuar
la investigación identificando los compuestos indólicos producidos por las bacterias más
promisorias, así como la capacidad de solubilizar diferentes fuentes de fósforo orgánico en
medio líquido para su posterior evaluación a nivel de semillero.
5. Conclusiones
La bacteria que predominó en caña y tomate fue Serratia marcescens demostrando muy
buenas características de promoción de crecimiento en cuanto a la producción de compuestos
indólicos y solubilización de fósforo. Serratia marcescens (C31, T127, T146) y Pantoea
dispersa (C1) mostraron las mayores potencialidades en la promoción del crecimiento vegetal,
por lo que representan una fuente interesante a utilizar en la elaboración de biopreparados
eficientes en cultivos de importancia económica y específicamente en cultivos de caña de
azúcar y tomate. Es importante valorar la capacidad de solubilización de fósforo en medio
líquido de los aislamientos con mayor potencial y posteriormente, identificar el tipo de ácido
producido, con el fin de identificar los mecanismos de acción para determinar el potencial de
aplicación en campo.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e
Innovación (Colciencias), a la Vicerrectoría de Investigaciones y Posgrados de la Universidad
de Caldas y a la Dirección de Investigación, Proyección y Desarrollo de la Universidad
Católica de Manizales por la financiación del presente trabajo.
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Anexo 1. Características químicas de los suelos asociados a los cultivos evaluados (Análisis
realizados por el Laboratorio de química y fertilidad de suelos, Universidad de Caldas).
Característica Unidades Caña-
Finca 1
Caña-
Finca 2
Caña-
Finca 3
Tomate Niveles de referencia
Bajo Medio Alto
pH 5,8 5,9 5,3 4,4
Nitrógeno % en base
seca
0,50 0,54 0,40 0,68
Materia
orgánica
% en base
seca
13,00 14,64 9,83 20,43 <3,0 3,0-5,0 >5,0
Fósforo mg/kg 32 126 19 89 <20,0 20,0-
40,0
>40,0
Potasio cmol(+)/kg 0,60 1,03 0,26 0,38 <0,2 0,2-0,4 >0,4
Calcio cmol(+)/kg 7,07 13,38 6,32 3,29 <3,0 3,0-6,0 >6,0
Magnesio cmol(+)/kg 6,53 5,7 4,55 0,86 <1,5 1,5-2,5 >2,5
Sodio cmol(+)/kg 0,099 0,439 0,143 0,240 <0,5 0,5-1,0 >1,0
Hierro mg/kg 230 401 346 400 <25,0 25,0-
50,0
>50,0
Manganeso mg/kg 171,75 37,55 14,98 14,64 <5,0 5,0-
10,0
>10,0
Zinc mg/kg 6,41 5,58 2,99 21,90 <1,5 1,5-3,0 >3,0
Cobre mg/kg 14,29 12,13 9,17 4,73 <1,5 1,5-3,0 >3,0
Azufre mg/kg 0,00 7,68 0,00 0,0 <10,0 10,0-
20,0
>20,0
Boro mg/kg 1,0 1,1 0,8 1,1 <0,2 0,2-4,0 >4,0
Arena % 53 43 39 82
Limo % 23 33 23 2
Arcilla % 24 24 38 16
Textura F-Ar-A F F-Ar F-A
F: Franco
F-A: Franco Arenoso
F-Ar: Franco Arcilloso
F-Ar-A: Franco Arcilloso Arenoso
Anexo 2. Números de accesión correspondientes a la nomenclatura del GenBank Microorganismo Abrev. Accesión Tamaño (pb) Fecha entrada
Afipia felis A_fel AF003937 1387 14-dic-99
Bdellovibrio bacteriovorus B_bac AF263832 1382 13-jun-00
Agrobacterium tumefaciens A_tum AF406664 847 06-may-02
Pseudomonas fluorescens P_flu AY092072 1370 06-ene-04
Bacillus thermantarcticus B_the AJ493665 1173 12-jul-02
Burkholderia gladioli B_gla AY500138 1383 11-ene-04
Bacillus pumilus B_pum AM183958 808 11-jun-07
Pantoea ananatis P_ana DQ517335 1546 24-may-06
Stenotrophomonas rhizophila S_rhi EF143432 1350 13-dic-06
Pantoea agglomerans P_agg EF569226 912 24-ene-11
Microbacterium testaceum M_tes EF602568 1241 03-dic-07
Serratia marcescens S_mar AM765993 834 22-sep-09
Brevundimonas diminuta B_dim EU024139 1260 18-abr-08
Stenotrophomonas maltophilia S_mal EU239142 1201 02-nov-08
Bacillus macroides B_mac EU693508 841 21-abr-11
Luteibacter rhizovicinus L_rhi FJ796463 1392 31-mar-09
Burkholderia heleia B_hel AB495125 1400 19-may-10
Burkholderia cepacia B_cep FJ907190 1036 17-may-09
Pseudomonas fluorescens P_flu FJ966203 1341 03-jun-09
Bacillus cereus B_cer GU011952 1400 25-oct-09
Burkholderia cepacia B_cep GU048852 1061 27-oct-10
Bacillus subtilis B_sub HM565141 1377 12-jul-10
Bacillus subtilis B_sub HM565144 1398 12-jul-10
Bacillus licheniformis B_lic FN999941 1233 08-sep-10
Propionibacterium freudenreichii P_fre EU418709 1395 14-oct-10
Serratia proteamaculans S_pro AB539812 1476 25-ene-11
Stenotrophomonas maltophilia S_mal FR749877 1393 13-feb-11
Serratia plymuthica S_ply HQ238869 800 25-mar-11
Serratia liquefaciens S_liq JF819697 749 12-jun-11
Bacillus thuringiensis B_thu JN315886 1398 25-may-12
Bacillus flexus B_fle JN660078 1342 17-sep-11
Microbacterium esteraromaticum M_est AB646580 1374 25-nov-11
Pantoea stewartii P_ste JN835570 777 27-feb-12
Bacteroidetes bacterium B_bac JQ229619 1032 25-oct-12
Serratia marcescens S_mar AB647207 970 19-dic-12
Pseudomonas aeruginosa P_aer JQ900536 1391 01-sep-12
Bacillus mojavensis B_moj JQ420906 965 01-dic-12
Micrococcus luteus M_lut JX415537 956 13-mar-13
Bacillus tequilensis B_teq JX473585 1388 26-sep-12
Stenotrophomonas maltophilia S_mal JX646629 1390 27-oct-12
Bacterium BM0497 S_ure* JQ680874 1376 17-dic-13
Bacterium BM0620 S_fon* JQ680957 1341 17-dic-13
Pseudomonas fluorescens P_flu JX627618 943 13-nov-12
Bacillus badius B_bad KC113129 1391 15-nov-12
Stenotrophomonas rhizophila S_rhi JX827240 1368 18-dic-12
Enterobacter cloacae E_clo KC703974 1260 07-abr-13
Bacillus amyloliquefaciens B_amy KC790453 1400 06-may-13
Pseudomonas putida P_put HF952685 1399 08-may-13
Pseudomonas aeruginosa P_aer KC914624 1000 12-jun-13
Curtobacterium flaccumfaciens C_fla KF003412 1361 26-jun-13
Pseudomonas alcaligenes P_alc KF364948 1400 24-jul-13
* Nom
Diseño del medio de cultivo para producción de
biomasa de Gluconacetobacter diazotrophicus
Diseño del medio de cultivo para producción de biomasa de Gluconacetobacter
diazotrophicus
Resumen
Los objetivos del presente trabajo fueron obtener biomasa a partir de la bacteria
Gluconacetobacter diazotrophicus y evaluar diferentes concentraciones de sacarosa para su
producción y posible empleo del preparado obtenido en la fertilización del cultivo de tomate.
Para ello se definió la curva de crecimiento y la producción de biomasa de G. diazotrophicus
cepa PAL5 en erlenmeyer, empleando el medio de cultivo LGI-PN. El crecimiento se
monitoreó por peso seco y evaluación de pureza del cultivo líquido. Se pudo identificar que en
el medio LGI-PN se produce biomasa a partir de las 48 horas del cultivo, con un máximo a las
240 horas; la fase estacionaria de crecimiento inició a las 264h con un posterior descenso a las
360h. La evaluación de las diferentes concentraciones de sacarosa para la producción de
biomasa de la bacteria en estudio, mostró los mejores resultados empleando 30 g/L;
composición que será empleada en fermentación líquida para la valoración de la cinética de la
bacteria.
Palabras clave: biomasa, Gluconacetobacter diazotrophicus, medio de cultivo, sacarosa
1. Introducción
La necesidad de sustituir la agricultura convencional por una agricultura sostenible, más
equilibrada con el medio ambiente ha generado la necesidad de promover la investigación y
desarrollo de nuevos productos agrícolas elaborados a partir de microorganismos. Las bacterias
promotoras del crecimiento vegetal (PGPB por sus siglas en inglés: Plant Growth Promoting
Bacteria) han demostrado su capacidad para estimular el crecimiento de los cultivos, a través
de metabolitos entre los que se encuentran los reguladores del crecimiento vegetal (Ona et al.,
2005) por lo que su estudio es de interés en función del mejoramiento de los cultivos agrícolas
(Rojas et al., 2012). Por lo tanto la utilización de bacterias promotoras de crecimiento vegetal
es una práctica que toma auge en las últimas décadas (Bashan, 1998).
En Colombia se han desarrollado diferentes investigaciones asociadas al aislamiento,
selección y aplicación de microorganismos rizosféricos con características de promoción de
crecimiento, con el fin de desarrollar biopreparados efectivos en cultivos de interés económico
(Becerra, 2007; Rivera, 2008). Para cumplir con este objetivo, se requiere el desarrollo de
medios de cultivo que permitan la producción de biomasa de los microorganismos promisorios
previamente seleccionados en condiciones in vitro e in vivo.
La bacteria G. diazotrophicus es una bacteria endófita, asociada comúnmente al cultivo de
caña de azúcar (Cavalcante y Döbereiner, 1988), que tiene la capacidad de fijar nitrógeno,
solubilizar fósforo, producir compuestos indólicos y controlar algunos patógenos (Blanco et al.,
2005; Reis et al., 2009), de acuerdo con lo anterior se considera una bacteria de gran potencial
como promotora del crecimiento vegetal.
Por lo tanto el objetivo del presente trabajo se basó en la evaluación de diferentes
concentraciones de los componentes del medio de cultivo LGI-PN, y su efecto en la producción
de biomasa de G. diazotrophicus.
2. Materiales y métodos
2.1. Microorganismo
La cepa de Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5, fue reactivada en caldo nutritivo y
mantenida en agar papa dextrosa; paralelamente se realizó la preservación de la cepa
empleando como crioprotector glicerol al 10% a una concentración de 108 células/mL,
suspensión que fue dosificada en microtubos que fueron llevados a -80°C, con el fin de
disponer de material para los diferentes ensayos.
2.2. Curva de crecimiento de G. diazotrophicus
Para la realización de la curva de crecimiento de la cepa de referencia G. diazotrophicus
PAL5, se empleó un frasco erlenmeyer de 500 mL de capacidad, con 300 mL de medio LGI-
PN (Tabla 14) y 30 mL de un inóculo en fase exponencial de crecimiento (con una densidad
óptica entre 0,9 y 1 correspondiente a aproximadamente 108 células/mL). La suspensión de
trabajo se llevó a agitación a 150 rpm a 30°C. Para el seguimiento de la evolución del
crecimiento bacteriano, se realizaron muestreos cada 24 horas (periodo de tiempo definido en
ensayos previos), tomando muestras de 10 mL, en los cuales se determinó la variable de
producción de biomasa por densidad óptica y peso seco.
Tabla 14. Formulación del medio de cultivo LGI-PN líquido.
N. Reactivo Cantidad
L-1
Concentración
g L-1
1 Azúcar cristal (azúcar blanco) 100 g 100
2 K2HPO4 (Solución al 10%) 2 mL 0,02
3 KH2PO4 (Solución al 10%) 6 mL 0,06
4 MgSO47H2O (Solución al 10%) 2 mL 0,02
5 CaCl22H2O (Solución al 1%) 2 mL 0,002
6 Na2MoO42H2O (Solución al 0,1%) 2 mL 0,0002
7 FeCl36H2O (Solución al 1%) 1 mL 0,001
8 (NH4)2SO4 1 g 1
9 Solución de vitaminas para medio de
cultivo
1 mL
2.3. Activación y producción del inóculo de la bacteria G. diazotrophicus
La preparación del inóculo se realizó en dos etapas. Primero (etapa de activación), se tomó
un microtubo del cultivo de reserva congelado a -80°C y se trasfirió a 25 mL de medio LGI-PN
contenido en erlenmeyer de 125 mL; éste fue incubado durante 24 h aplicando las mismas
condiciones empleadas en la preparación del cultivo de reserva. En segundo lugar (etapa de
producción de inóculo) una cantidad de este cultivo (5% v/v) se empleó para inocular 50 mL de
medio fresco LGI-PN en un erlenmeyer de 250 mL de capacidad, el cual se llevó a incubación
durante 24 h. Este cultivo activo fue usado para inocular el medio de fermentación (Siqueira et
al., 2009).
2.4. Condiciones del medio de cultivo
Con el fin de determinar las condiciones del medio de cultivo como pH, temperatura y
agitación, que influyen en la producción de la bacteria G. diazotrophicus, se tuvieron en cuenta
las investigaciones descritas en la literatura (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Attwood et al.,
1991; Dong et al., 1995; Ureta y Nordlund, 2001; Ahmad et al., 2004; Madhaiyan et al., 2004;
Rodríguez et al., 2005; Luna et al., 2006). Las condiciones seleccionadas se describen en la
Tabla 15.
Tabla 15. Condiciones del medio de cultivo.
pH Temperatura (°C) Agitación (rpm)
5,5 30 150
2.5. Identificación de los componentes más relevantes del medio de cultivo
2.6. Para la identificación de los componentes más relevantes del medio en cuanto a producción
de biomasa celular de la bacteria G. diazotrophicus se empleó el diseño experimental de
Plackett-Burman, el cual es una herramienta útil a la hora de identificar rápidamente los
factores clave en un sistema multivariable (Plackett y Burman, 1946). Se tomó como
referencia la formulación del medio de cultivo LGI-PN (Tabla 1), empleado para la
multiplicación de G. diazotrophicus (Cavalcante y Döbereiner, 1988). A partir de la
formulación del medio se definieron los rangos bajos y altos de la cantidad a evaluar de
cada uno de los primeros ocho nutrientes, diseño experimental que se muestra en la Diseño
a una vía
Se realizó evaluación de la producción de biomasa de G. diazotrophicus en el medio LGI-
PN con diferentes concentraciones de sacarosa así: 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 y 150
g. De cada tratamiento se realizaron 10 repeticiones, los medios se llevaron a agitación a 150
rpm, 30ºC y se les determinó la concentración de biomasa a las 160 horas por peso seco. Las
cantidades de sacarosa empleadas se determinaron de acuerdo con los reportes de los estudios
realizados con la bacteria.
Tabla 16, dejando como valor fijo la solución de vitaminas; como variable de respuesta se
evaluó la concentración de biomasa expresada en g/L de peso seco. La Tabla 17 presenta el
detalle del diseño de la matriz; se seleccionaron ocho factores incluyendo la fuente de carbono
y nitrógeno y elementos esenciales para el crecimiento. En el diseño se incluyeron tres
variables dummy para calcular el error estándar.
El procedimiento se llevó a cabo en erlenmeyers de 250 mL que contenían 50 mL del
medio de cultivo los cuales fueron sembrados con el inóculo, en una relación del 5% (v/v); se
realizaron tres repeticiones de cada tratamiento. Los cultivos se mantuvieron bajo agitación
durante 160 horas.
A las 72 y 160 horas de incubación se realizó evaluación de la pureza del cultivo,
empleando un método de siembra por agotamiento en medio de cultivo LGI-PNs y agar papa
dextrosa (Oxoid, USA). A las 160 horas se evaluó la biomasa producida, por determinación de
peso seco (g/L) y por densidad óptica la cual se determinó a una longitud de onda de 600 nm
en un espectofotómetro Thermo Spectronic Biomate 5 (Herbert et al., 1971).
En este experimento se examinó la magnitud y dirección de los efectos de los factores a fin
de determinar las variables de mayor importancia; lo anterior se realizó mediante análisis de
varianza empleando el software estadístico statgraphics®.
2.7. Diseño a una vía
Se realizó evaluación de la producción de biomasa de G. diazotrophicus en el medio LGI-
PN con diferentes concentraciones de sacarosa así: 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135 y 150
g. De cada tratamiento se realizaron 10 repeticiones, los medios se llevaron a agitación a 150
rpm, 30ºC y se les determinó la concentración de biomasa a las 160 horas por peso seco. Las
cantidades de sacarosa empleadas se determinaron de acuerdo con los reportes de los estudios
realizados con la bacteria.
Tabla 16. Rangos altos y bajos de los nutrientes que hacen parte de la formulación del medio líquido LGI-PN.
Factor
codificado
(g/L)
Factor Valores experimentales
Valor bajo (-1) Valor alto (1)
Z1 Sacarosa 70 130
Z2 K2HPO4 0,005 0,035
Z3 KH2PO4 0,045 0,075
Z4 MgSO47H2O 0,005 0,035
Z5 CaCl22H2O 0,0005 0,0035
Z6 Na2MoO42H2O 0,00005 0,00035
Z7 FeCl36H2O 0,0001 0,0019
Z8 (NH4)2SO4 0,1 1,9
Z9 – Z11 Factores dummy - -
Tabla 17. Matriz de diseño de dos niveles con ocho variables.
No Factores codificados Biomasa
g/La Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z7 Z8 Z9 Z10 Z11
1 1 -1 1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 0,83
2 1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1 -1 1,08
3 -1 1 1 -1 -1 1 1 1 -1 -1 1 1,10
4 -1 1 1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 1 1,17
5 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 1,10
6 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 1,42
7 1 -1 1 1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 1,11
8 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1 -1 -1 1,28
9 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1,32
10 1 1 -1 -1 1 1 -1 -1 1 -1 1 1,35
11 1 1 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1,15
12 1 -1 -1 -1 1 -1 1 1 -1 1 1 1,19 a Promedio de tres repeticiones
3. Resultados
3.1. Crecimiento de la bacteria G. diazotrophicus
La caracterización del crecimiento de G. diazotrophicus se efectuó en el medio LGI-PN
con sacarosa como única fuente de carbono, sobre en el cual se realizaron determinaciones de
densidad óptica y biomasa seca para estimar el crecimiento celular. En la gráfica de evolución
de estos parámetros a través del tiempo transcurrido luego de la inoculación de la bacteria
(Figura 10), se observan notables diferencias como el marcado incremento de la densidad
óptica a lo largo del cultivo comparado con el moderado aumento del peso seco del mismo. Lo
anterior se puede atribuir a la formación de exopolisacáridos que interfirieron en la
determinación de la absorbancia, lo cual limita la utilización de estos valores como un
parámetro absoluto de la evaluación del crecimiento. Sin embargo la determinación de la
densidad óptica, se empleó como una estimación rápida del desarrollo de los cultivos.
En la Figura 10, se presenta la curva de crecimiento de la bacteria obtenida en las
condiciones experimentales evaluadas, en la cual la fase de latencia se extendió hasta
aproximadamente las 24 horas de iniciado el cultivo, posteriormente se evidenció el
crecimiento exponencial entre las 48 horas y las 240 horas. A partir de este tiempo el
crecimiento se empezó a estabilizar y entró en una fase estacionaria después de las 264 horas.
La identificación de las fases de crecimiento de la cepa de referencia permitió establecer
los tiempos en que deben ser preparados los preinóculos e inóculos, para las evaluaciones
bioquímicas realizadas a la bacteria, la evaluación de los componentes más relevantes del
medio de cultivo y las evaluaciones en bioreactor.
Figura 10. Curva de crecimiento de G. diazotrophicus PAL 5. Las células se desarrollaron en medio LGI-PN
en erlenmeyer de 500 mL, los cuales se llevaron a agitación a 150 rpm a 30ºC. La densidad óptica del inóculo
inicial fue de 1, correspondiente a un número aproximado de 108 células/mL.
3.2. Componentes más relevantes del medio de cultivo
La evaluación del efecto de los componentes más relevantes del medio LGI-PN sobre la
producción de biomasa, se realizó en 12 experimentos (por triplicado) resultado de la
asociación de valores altos y bajos de los 8 factores más importantes en la formulación del
medio de cultivo. El tiempo de evaluación fue definido teniendo en cuenta la curva de
crecimiento del microorganismo (160 horas).
Con base en los resultados obtenidos y relacionados en la Tabla 17, la variabilidad de las
concentraciones de los componentes del medio de cultivo no influyó sobre la producción de
biomasa de G. diazotrophicus, debido a que no se evidenciaron diferencias significativas al
análisis estadístico (p<0,05); indicando que todos los componentes del medio fueron relevantes
en el crecimiento de la bacteria, en las condiciones experimentales evaluadas.
Con base en lo anterior se decidió realizar un diseño a una vía, en el cual se valoró el
comportamiento de la producción de biomasa, con diferentes concentraciones de la fuente de
carbono (sacarosa), en el medio de cultivo LGI-PN.
3.3. Identificación de la concentración de sacarosa adecuada para promover la
producción de biomasa de G. diazotrophicus
La figura 2 muestra el comportamiento en la producción de biomasa de G. diazotrophicus,
luego de la evaluación de las diferentes concentraciones de sacarosa. Se evidencia que el valor
superior se dio cuando se empleó 30 g de sacarosa en el medio de cultivo.
Figura 2. Producción de biomasa de G. diazotrophicus PAL 5, empleando diferentes concentraciones de
sacarosa.
La Tabla 18 muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias, en la cual los pares
relacionados presentan diferencias estadísticamente significativas con un nivel de confianza del
95%. Se encontraron diferencias estadísticas significativas (p<0,05) entre las concentraciones
de 30, 45 y 60, con las de 15, 75, 90, 105, 120, 135 y 150 g de sacarosa/L.
La selección de la concentración para realizar la cinética de la bacteria, se realizó teniendo
en cuenta criterios económicos, por lo tanto se seleccionó la concentración de 30 g de sacarosa
para su evaluación.
Tabla 18. Diferencias estimadas entre tratamientos.
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites Límite
inferior
Límite
superior
15 - 30 * -0,22601 0,132147 -0,358157 -0,093863
15 - 60 * -0,14268 0,132147 -0,274827 -0,010533
30 - 75 * 0,32433 0,132147 0,192183 0,456477
30 - 90 * 0,13634 0,132147 0,004193 0,268487
30 - 105 * 0,31333 0,132147 0,181183 0,445477
30 - 120 * 0,35267 0,132147 0,220523 0,484817
30 - 135 * 0,29701 0,132147 0,164863 0,429157
30 - 150 * 0,187 0,132147 0,054853 0,319147
45 - 75 * 0,20699 0,132147 0,074843 0,339137
45 - 105 * 0,19599 0,132147 0,063843 0,328137
45 - 120 * 0,23533 0,132147 0,103183 0,367477
45 - 135 * 0,17967 0,132147 0,047523 0,311817
60 - 75 * 0,241 0,132147 0,108853 0,373147
60 - 105 * 0,23 0,132147 0,097853 0,362147
60 - 120 * 0,26934 0,132147 0,137193 0,401487
60 - 135 * 0,21368 0,132147 0,081533 0,345827
75 - 90 * -0,18799 0,132147 -0,320137 -0,055843
75 - 150 * -0,13733 0,132147 -0,269477 -0,005183
90 - 105 * 0,17699 0,132147 0,044843 0,309137
90 - 120 * 0,21633 0,132147 0,084183 0,348477
90 - 135 * 0,16067 0,132147 0,028523 0,292817
120 - 150 * -0,16567 0,132147 -0,297817 -0,033523
4. Discusión
En el estudio de crecimiento a nivel de laboratorio de la cepa de referencia G.
diazotrophicus PAL5, se identificaron las diferentes fases de crecimiento de la bacteria,
empleando el medio LGI-PN con sacarosa (10%) como fuente de carbono. Este tipo de ensayos
han sido fundamentales para determinar el comportamiento de los microorganismos en la
producción de biomasa, como respuesta a diferentes condiciones del medio de cultivo, con
valoración de fuentes de carbono, de nitrógeno y pH entre otros.
En el presente trabajo se observaron tres fases de crecimiento (latencia, exponencial y
estacionaria) en G. diazotrophicus empleando sacarosa como fuente de carbono, a diferencia de
los resultados obtenidos por Attwood et al (1991) y Flores-Encarnación et al. (1999) quienes
observaron un crecimiento en dos fases de G. diazotrophicus en presencia de glucosa, debido a
que el microorganismo asimila más rápido esta fuente de carbono y la fase de latencia es casi
imperceptible.
La curva de crecimiento de G. diazotrophicus en este trabajo se determinó en medio líquido
en agitación, sin embargo Cojho et al., (1993) realizaron determinación de la curva de
crecimiento de G. diazotrophicus (cepa Psp32), en el medio LGI-P semisólido con sacarosa al
2,5 y 10% con lecturas realizadas hasta las 142 horas. En estas condiciones se identificó un
mejor comportamiento en la producción de biomasa empleando sacarosa al 10%, evidenciando
la fase exponencial entre las 40 y las 85 horas aproximadamente (14,78 células/mL); a las 142
horas se observó un leve incremento en la concentración con tendencia a la estabilización
(15,86 células/mL). Los resultados anteriores solo coinciden con el presente estudio en el
tiempo de inicio de la fase exponencial (48 horas), pero no con su finalización, debido a que la
fase exponencial tuvo mayor duración en las condiciones evaluadas en el presente trabajo.
El medio de cultivo LGI-PN incluye la formulación de componentes que favorecen el
crecimiento de G. diazotrophicus (Cavalcante y Döbereiner, 1988; Stephan et al., 1988; Reis et
al., 1994). El medio tiene como fuente de carbono la sacarosa en una concentración del 10%,
(NH4)2SO4 como fuente de nitrógeno para promover en el medio líquido la activación de la
reproducción de la bacteria, además posee sales que favorecen su desarrollo; de acuerdo con los
resultados obtenidos en la valoración de los principales ocho componentes del medio (niveles
bajos y altos), y su efecto en la producción de biomasa, no se detectaron diferencias estadísticas
significativas (p<0,05). Es importante mencionar que las concentraciones bajas y altas de cada
uno de los componentes se seleccionaron teniendo en cuenta el valor central de cada uno, al
cual se le aplicó un delta constante por encima y por debajo del mismo.
De acuerdo con el anterior resultado se tomó la decisión de realizar un diseño a una vía,
evaluando diferentes concentraciones de la fuente de carbono (sacarosa). El análisis estadístico
realizado permitió identificar los tres tratamientos con mayor producción de biomasa, los cuales
fueron 30, 45 y 60 g/L de sacarosa (3, 4,5 y 6% respectivamente). Desde el primer reporte de la
bacteria Cavalcante y Döbereiner (1988) identificaron que el mejor crecimiento de la bacteria,
se evidenciaba con una concentración de sacarosa del 10%, inclusive el crecimiento se observó
empleando hasta el 30% del carbohidrato, lo cual no se evidenció al 35%. Lo anterior
demuestra la capacidad de la bacteria de crecer en condiciones osmófilas.
Los resultados obtenidos en este estudio, luego de haber valorado 10 repeticiones en cada
tratamiento, permiten visualizar la posibilidad de diseñar un medio de cultivo para la
producción de biomasa de G. diazotrophicus, con una menor concentración de sacarosa y de
esta manera disminuir el costo del mismo.
5. Conclusiones
Agradecimientos
Los autores agradecen al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e
Innovación (Colciencias), a la Vicerrectoría de Investigaciones y Posgrados de la Universidad
de Caldas y a la Dirección de Investigación, Proyección y Desarrollo de la Universidad
Católica de Manizales por la financiación del presente trabajo.
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Promoción de crecimiento de Gluconacetobacter
diazotrophicus en plántulas de tomate (Solanum
lycopersicum L.)
Promoción de crecimiento de Gluconacetobacter diazotrophicus en plánulas de tomate
(Solanum lycopersicum L.)
Resumen
En el presente ensayo se evaluó el efecto de Gluconacetobacter diazotrophicus en el
crecimiento de dos materiales comerciales de plantas de tomate chonto (Torrano® y Santa
Clara®), considerando diferentes dosis y tiempos de inoculación. Adicionalmente se valoró el
efecto de la aplicación de fósforo y su interacción con la bacteria en la expresión del
crecimiento de las plántulas de tomate. Tanto en las variables de crecimiento como en el peso
seco de las plántulas, se observó el efecto benéfico de la bacteria G. diazotrophicus, en las dosis
de 2,5 y 5 mL L-1, los cuales tuvieron una interacción positiva con la aplicación de fósforo en
suelo. La dosis de 20 mL L-1 de la bacteria, tuvo un efecto negativo en las variables de
crecimiento y en el peso seco de las plántulas.
1. Introducción
El tomate es un miembro de las solanáceas, originario de la llanura costera occidental de
Sur América, la cual se extiende de Ecuador a Chile (Kinet y Peet, 1997). En los tiempos
precolombinos aparentemente no era conocido por los indios, ya que no se relaciona en los
relatos de sus tradiciones, ni de su arqueología en la zona andina (Harlan, 1992). Actualmente
tiene gran importancia, y de éste se cultivan principalmente dos tipos de acuerdo con la
finalidad: el tomate determinado, el cual se utiliza en alimentos procesados y es el tipo
comercial más importante en Estados Unidos; y el tomate indeterminado, que se utiliza para la
producción de frutos frescos en invernaderos y huertos familiares. Adicionalmente el tomate es
un material ideal para las investigaciones genéticas, fisiológicas, celulares, bioquímicas y
moleculares. Es fácil de cultivar, debido a que tiene un ciclo de vida corto y es susceptible a
variadas manipulaciones hortícolas, incluyendo el injerto o el corte (Kinet y Peet, 1997).
Gluconacetobacter diazotrophicus es una bacteria fijadora de nitrógeno, y es la primera
bacteria acética aislada de caña de azúcar (Cavalcante y Döbereiner, 1988); tiene características
muy particulares que la permiten clasificar como una bacteria promotora de crecimiento de
gran potencial, debido a la capacidad no solo de fijar nitrógeno, sino de solubilizar fósforo y
producir compuestos indólicos.
El presente ensayo tuvo como objetivo evaluar el efecto Gluconacetobacter diazotrophicus
como promotor de crecimiento en plántulas de tomate, con el fin de definir su respuesta e
interacción con dos dosis de fósforo, e identificar el potencial de la bacteria en el crecimiento y
desarrollo del tomate.
2. Materiales y métodos
2.1. Localización
La evaluación se llevó a cabo en la Granja Tesorito de la Universidad de Caldas, ubicada
en la vereda Maltería (municipio de Manizales) a una altura de 2280 msnm, precipitación anual
de 1800 mm, humedad relativa de 78% y temperatura promedio de 17.5°C (Universidad de
Caldas, 2010).
2.2. Descripción de tratamientos
El material vegetal estuvo constituido por los genotipos comerciales tipo chonto Santa
Clara® y Torrano® (Anexo 1). Los materiales fueron sembrados en bandejas de 72 lóculos
empleando como sustratos: Turba Sphagnum grado 3 o suelo estéril proveniente de la Granja
Tesorito de acuerdo con los tratamientos (Figura 11). El diseño experimental fue
completamente al azar (CAA), con un arreglo factorial en 5 vías o factores (Genotipo, sustrato,
dosis de G. diazotrophicus, tiempo de aplicación y dosis de fósforo), donde la unidad
experimental fue la semilla; cada tratamiento estuvo conformado por 36 semillas al momento
de la siembra. Las bandejas fueron incubadas bajo condiciones semicontrolas a 23 ±3°C en un
germinador con cubierta plástica con filtro UV 380 nm., tipo Agroclear X®.
La inoculación se realizó por inmersión de las bandejas de siembra, en la suspensión de la
bacteria, de acuerdo con las diferentes dosis descritas en los tratamientos, igualmente se
evaluaron tres tiempos de aplicación de la bacteria (Figura 11). La respuesta de los tratamientos
a la aplicación o no de fósforo se realizó adicionando una concentración de 15 ppm (1/4 de full)
de fósforo a partir de una solución de ácido fosfórico (Rodríguez et al., 2001), la cual se aplicó
por inmersión de cada bandeja día por medio, durante la etapa de semillero; la aplicación se
realizó después de la aparición de los cotiledones (aproximadamente a los ocho días después de
siembra).
Figura 11. Descripción de tratamientos evaluados. dds: Días después de siembra
2.3. Preparado microbiano evaluado
Se empleó como inoculante la cepa de referencia de Gluconacetobacter diazotrophicus
PAL5, la cual se multiplicó en medio LGI-PN, siguiendo los pasos descritos a continuación:
Pre-inóculo: Se partió de un vial de G. diazotrophicus (1,5 mL) preservado a -80ºC, el cual
se descongeló a 37ºC durante 5 minutos y se adicionó a 15 mL de medio LGI-PN; éste se llevó
a agitación a 150 rpm, 30ºC durante 24 horas.
Inóculo: Se emplearon 150 mL del medio LGI-PN con 15 mL del pre-inóculo, se llevó a
las condiciones de incubación descritas anteriormente por 24 horas. Se verificó la pureza del
inóculo, mediante siembra en medio LGI-PN.
Material de siembra: A 400 mL del medio LGI-PN, se le adicionaron 40 mL del inóculo, y
fue incubado en las mismas condiciones descritas por 10 días. A partir de este material se
realizó la preparación de las diferentes dosis evaluadas y propuestas para los tratamientos
(Figura 1). Del respectivo inóculo preparado, se realizó cuantificación de biomasa por
Unidades Formadoras de Colonia (UFC mL-1) y peso seco para identificar la concentración de
la bacteria.
2.4. Variables evaluadas
Las variables seleccionadas en el ensayo incluyeron caracteres fisiológicos de seguimiento
diario, así como la estimación de variables fisiológicas al finalizar el experimento; para la toma
de variables finales se realizó un muestreo destructivo de 10 plántulas por tratamiento, descritas
en la Tabla 19.
Tabla 19. Variables fisiológicas evaluadas en plántulas de tomate.
Tipo de variable Descripción Momento de
evaluación
Variables
fisiológicas I
Porcentaje de germinación
Diaria
Días a cotiledones
Días a primera hoja
verdadera
Días a segunda hoja
verdadera
Días a tercera hoja
verdadera
Variables
fisiológicas II
Peso seco de parte aérea Al final del
semillero
Peso seco de raíz
2.5. Análisis de la información
El análisis de la información, se realizó mediante análisis de varianza (ANAVA) a través del
procedimiento GLM de SAS (SAS Institute Cary N.C), para determinar la ocurrencia o no de
diferencias estadísticas entre tratamientos para el conjunto de variables evaluadas,
posteriormente se realizaron pruebas de comparación de medias a través de prueba de partición
de promedios o test de Duncan (P<0,05). Adicionalmente se estimaron correlaciones
individuales para las variables que marcaron diferencias estadísticas en el ANAVA.
3. Resultados
En las evaluaciones realizadas, las siete variables consideradas en el estudio mostraron
diferencias significativas (P<0,05), entre las cuales se incluyen las variables fisiológicas de
crecimiento desde porcentaje de germinación hasta el peso seco de raíz y parte aérea, dentro de
las fuentes de variación incluidas, se realizaron análisis para efectos principales (Genotipo,
sustrato, dosis de G. diazotrophicus, tiempo de aplicación, dosis de fósforo), e interacción entre
los mismo, en los cuales, en la mayoría de los casos se encontraron diferencias altamente
significativas y significativas ( P<0,01 y P<0,05 respectivamente).
3.1. Variables de crecimiento
Para la variable porcentaje de germinación, se evidenciaron diferencias estadísticas
significativas (P<0,05) en los factores: genotipo, dosis de G. diazotrophicus (GD) y tipo de
sustrato. El genotipo de mejor respuesta fue el híbrido Torrano® con 94,58% frente al híbrido
Santa Clara® con 92,73%; en cuanto a la dosis de G. diazotrophicus la aplicación de 5 mL L-1
permitió obtener un porcentaje de germinación de 95,25 el cual fue significativamente diferente
con respecto al blanco (92,59%) y a la dosis de 2,5 mL L-1 (91,44%). Respecto al tipo de
sustrato, la turba arrojó el valor más alto de germinación (95,74%), en comparación con el
sustrato suelo (91,57%) (Figura 12). A pesar de estas diferencias el 95,83% de los tratamientos
tuvieron porcentajes de germinación superiores al 85%, el cual es apropiado para la producción
en semillero de especies hortícolas como el tomate.
a B
C
Figura 12. Porcentaje de germinación en semillas de tomate chonto. (a) Genotipo; (b) Dosis de G.
diazotrophicus; (c) Tipo de sustrato.
En el tiempo de germinación se detectaron diferencias estadísticas significativas (P<0,05),
entre genotipos, la dosis GD, el tipo de sustrato y la dosis de fósforo (Figura 13). Se encontró
una interacción genotipo-ambiente, dado que los híbridos evaluados se incubaron en iguales
condiciones ambientales para su desarrollo, sin embargo, la respuesta al número de días a
germinación fue diferente, lo cual es explicado por su constitución genotípica diferencial; las
casas comerciales recomiendan el genotipo Santa Clara® para condiciones tropicales y cálidas
con temperaturas que oscilan entre 20 a 22 °C y el genotipo Torrano®, para condiciones más
frías que permiten su establecimiento y producción hasta los 2600 msnm con temperaturas
entre 17 a 20 °C, combinando sistemas de producción protegidos. El tiempo que tardó la
semilla en germinar fue mayor en los tratamientos donde no se aplicó la bacteria (11,86 días), y
menor con su aplicación, el efecto más evidente se presentó con la dosis de 5 mL L-1 (11,26
días) lo cual es concordante con la mejor dosis para porcentaje de germinación, encontrándose
diferencias estadísticas significativas (P<0,05) entre tratamientos. En los sustratos evaluados, el
porcentaje de germinación fue mayor en turba, siendo el sustrato más recomendado
técnicamente para el establecimiento de semilleros en tomate (Jaramillo et al., 2007); sin
embargo al analizar el tiempo de germinación, el menor tiempo se evidenció en suelo (10,95
días), con diferencias estadísticas significativas (P<0,05) entre los sustratos empleados (Figura
13), esto puede indicar un efecto de interacción entre factores que permite disminuir el tiempo
de germinación en el suelo. El análisis de interacción entre factores, permitió identificar una
relación ideal de factores como dosis de GD, tipo de sustrato y dosis de fósforo, la cual indicó
que la dosis 2,5 mL L-1 de GD en suelo adicionando fósforo al semillero, permite a las plantas
un tiempo de germinación de 9 días, lo cual marca diferencia significativa contra el mejor
tiempo alcanzado por la dosis 5 mL L-1 en el análisis individual, también se pudo deducir que
existen factores que son indiferentes a la interacción como lo fue el genotipo (que no cambia su
tendencia con la interacción).
a B
c D
Figura 13. Tiempo de germinación de semillas de tomate chonto. (a) Material vegetal; (d) Dosis de G.
diazotrophicus; (c) Sustrato; (d) Aplicación o no de fósforo.
En las variables de crecimiento: días a cotiledones, días a primera, segunda y tercera hoja
verdadera, se encontraron diferencias estadísticas significativas (P<0,05). Las mejores dosis de
la bacteria a través del tiempo fueron 5 y 2,5 mL L-1 sin diferencias significativas entre ellas,
seguidas por las dosis 10 mL L-1, 0 mL L-1 (blanco) y 20 mL L-1; esta última dosis estuvo por
debajo del blanco indicando un efecto negativo de la bacteria sobre el crecimiento y desarrollo
en plántulas de tomate; indicando, que no siempre dosis más altas de un promotor de
crecimiento generan respuestas positivas para inducción de germinación. Los resultados
también mostraron una diferencia más marcada de las dosis de GD sobre los días a formación
de cotiledones y primera hoja verdadera con respecto a los días a segunda y tercera hoja
verdadera, en los cuales los tratamientos tienden a equilibrarse alcanzando un número de días
semejante en la mayoría de los tratamientos, en este caso sólo se encontró diferencia estadística
(P<0.05) entre la dosis 0 mL L-1 (blanco) y las demás dosis. Estos resultados pueden ser
combinados con el sistema de producción en el cual se vaya a realizar el ciclo de producción
del cultivo de tomate, debido a que entre más controlado sea el sistema de producción, las
plántulas a trasplantar se pueden llevar en una etapa más temprana, es decir con un menor
número de hojas a campo (desde las dos hojas verdaderas), lo cual permitiría ganar en el tiempo
de trasplante, llevando las plántulas 10 días antes del tiempo convencional promedio estimado
(35 días). Este factor podría ser positivamente acumulativo en la reducción del ciclo total de
producción del cultivo en campo, lo cual podría traducirse en un sistema de producción más
rentable y sostenible para los agricultores y usuarios de esta tecnología.
En concordancia con los resultados alcanzados en las variables porcentaje de germinación
y tiempo de emergencia, el tomate híbrido Santa Clara®, mostró un mejor comportamiento en
las variables de crecimiento con respecto al material Torrano®, es decir que en general la
acumulación del número de días en diferentes fases de crecimiento en semillero fue más
temprana que las que alcanzó el híbrido Torrano; de igual forma el tipo de sustrato arrojó
diferencias significativas (P<0,05) en el número de días acumulado para las diferentes variables
de número de días a emisión de hojas verdaderas, siendo el mejor tratamiento el suelo en
contraste con el sustrato turba. El desarrollo de las plántulas a través del tiempo se vio
favorecido desde la emisión de hojas cotiledonares en el suelo, sin embargo la diferencia más
evidente se deja ver a partir de la emisión de la segunda hoja verdadera, en donde, el número de
días entre los sustratos pasa de dos días de diferencia a 10 días cuando alcanza la segunda hoja
verdadera y hasta más de 25 días cuando alcanza la tercera hoja verdadera, este fenómeno
podría ser explicado por el complejo químico, físico y biológico del suelo, los cuales
acumulativamente ejercen un efecto diferencial como el descrito anteriormente (Lora, 2010;
Valenzuela y Torrente, 2010; Varela y Rueda, 2010). A diferencia del sustrato turba que por ser
un sustrato inerte en general se limita al soporte físico de la planta “eliminando” la interacción
con los otros dos componentes, lo cual se traduce en las respuestas obtenidas en las variables en
mención. En general las personas encargadas de la plantulización, suplen estos dos
componentes (nutricionales y biológicos) de acuerdo con su experiencia, por lo que es común
ver respuestas diferentes en sistemas similares. Lo cual se puede solventar con
recomendaciones técnico-científicas que permitan homogenizar estas fases de producción. Es
evidente que esta respuesta es totalmente dependiente o está correlacionada con los niveles de
fósforo aplicados al sustrato; por lo cual una tendencia similar a la descrita anteriormente se
observó en los tratamientos donde se aplicó fósforo en el cual se pasó de 13,10 a 30,30 días
desde la formación de cotiledones hasta la emisión de la tercera hoja verdadera, en contraste
con los tratamientos sin fósforo pasando de 13,31 días desde la formación de cotiledones a
38,14 días en emisión de tercera hoja verdadera (Figura 14).
a b
c d
Figura 14. Comportamiento de las variables de crecimiento en semillas de tomate chonto, considerando la
dosis aplicada de G. diazotrophicus (a), el material vegetal empleado (b), el sustrato (c) y la aplicación o no
de fósforo (d). *: Días a cotiledones; **: Días a primera hoja verdadera; ***: Días a segunda hoja verdadera;
****: Días a tercera hoja verdadera
3.2. Peso seco total
En la variable peso seco total, se observaron diferencias estadísticas significativas (P<0,05)
en respuesta a los factores tipo de sustrato, dosis de GD, tiempo de aplicación de la bacteria y
la dosis de fósforo. Los mejores promedios de peso seco se obtuvieron en las plántulas crecidas
en suelo alcanzando un valor de 0,065 g por plántula en contraste con el sustrato turba, el cual
alcanzó un valor de 0,040 g por plántula. La concentración de G.diazotrophicus más efectiva
para este caso fue de 2,5 mL L-1, la cual permitió alcanzar un peso seco de 0,075 g por plántula,
seguida por la dosis de 5 mL L-1 (0,057 g por plántula) y en el extremo inferior se encontró la
dosis de 20 mL L-1, junto al blanco con valores de 0,038 g y 0,045 g por plántula
respectivamente. Se recalca con esta variable la promoción de crecimiento positiva alcanzada
con las dosis bajas de la bacteria (2,5 y 5 mL L-1) y como el efecto, pasa de ser positivo a
negativo con el aumento de dosis iguales o superiores a 10 mL L-1. Igualmente, se encontró que
la aplicación de la bacteria al momento de la siembra y la adición de fósforo, promueven las
mejores respuestas en peso seco por plántula, en los cuales se alcanzaron valores de 0,062 g y
0,081 g por plántula respectivamente (Figura 15). De acuerdo con Aristizabal (2003) el
crecimiento efectivo de una planta es medido a través de la ganancia en peso seco y no
necesariamente por el cambio de la altura a través del tiempo, este reporte concuerda con los
resultados alcanzados en este estudio indicando un mejor crecimiento de las plántulas, cuando
fueron encontrados los mejores valores en peso seco por plántula.
a b
c d
Figura 15. Comportamiento del peso seco en plántulas de tomate, de acuerdo con el sustrato (a), la dosis de G.
diazotrophicus (b), el momento de aplicación de la bacteria (c) y la aplicación o no de fósforo (d).
A pesar que el genotipo como factor independiente no arrojó diferencias estadísticas, la
interacción del mismo con otros factores como tipo de sustrato, tiempo de aplicación y dosis de
GD, mostró diferencias significativas. Para el caso de la interacción genotipo x dosis de GD se
observó un mejor comportamiento en el peso seco de plántulas de tomate Santa Clara® con una
dosis de 2,5 mL L-1 (0,09 g por plántula), seguido de Torrano® con 5 y 2,5 mL L-1 (0,06 g por
plántula) respectivamente. En todos los casos de la interacción se conserva la tendencia de un
efecto negativo sobre la variable de peso seco a dosis altas de GD, junto al blanco. El efecto de
la bacteria fue mayor en Santa Clara® que en Torrano®, debido a que el peso seco en
Torrano® aumentó en menor proporción con la adición de la misma dosis de la bacteria, en este
caso el material Santa Clara®, con la aplicación de la bacteria a una dosis de 2,5 mL L-1 de G.
diazotrophicus aumentó en un 125% el peso seco de la plántula, respecto a los controles
negativos (Figura 16). El análisis de la interacción de los factores es de suma importancia dado
que los valores alcanzados con los factores individuales analizados anteriormente (Figura 15),
en general fueron más bajos que los alcanzados por la interacción (Figura 16), lo cual ratifica
en las variables anteriormente descritas, que una combinación adecuada de factores en estudio
puede promover una acción sinérgica logrando mejores respuestas que las alcanzadas
individualmente.
l
Figura 16. Interacción material vegetal y dosis de G. diazotrophicus, y su efecto en el peso seco de plántulas
de tomate chonto. Las líneas verdes indican los valores mínimos y máximos alcanzados en los factores
analizados independientemente.
El fósforo influye en el crecimiento (Rodríguez y Fraga, 1999) y expresión de la bacteria
en la planta (Richardson y Simpson, 2011), lo cual concuerda con los resultados obtenidos en la
interacción dosis de GD y dosis de fósforo, debido a que se observa un mejor comportamiento
en el peso seco de los materiales a los que se les aplicó fósforo independiente de la dosis de la
bacteria, sin embargo, el blanco con fósforo, que equivale al testigo comercial o tratamiento
convencional del agricultor, indica que cuando es adicionada una dosis óptima de la bacteria se
promueven mejores respuesta en el peso seco y por ende en el crecimiento de las plántulas, lo
cual debe traducirse en un mejor desarrollo y producción en su ciclo productivo; para este caso
la dosis que mostró el mejor comportamiento fue 2,5 mL L-1 con un valor de 0,123 g por
plántula respecto al blanco con fósforo de 0,065 g por plántula, lo cual se traduce en un
incremento del 189% en el peso seco de las plántulas, si el agricultor adicionara la bacteria G.
diazotrophicus en la mejor dosis obtenida (Figura 17).
Figura 17. Interacción entre la aplicación o no de fósforo y las dosis de G. diazotrophicus.
4. Discusión
Las variables de crecimiento evaluadas en el presente estudio incluyen: porcentaje y
tiempo de germinación, días a formación de cotiledones y días a formación de primera, segunda
y tercera hoja verdadera, las cuales permiten encontrar el efecto de los factores descritos en este
estudio, sobre las condiciones del proceso de germinación y desarrollo de las plántulas en sus
diferentes fases en semillero. La germinación es el periodo de transición entre el estado de
reposo de la semilla y el tiempo de emergencia visible de la radícula (Heuvelink, 2005); incluso
Bewley y Black, (1994) mencionan que este estado inicia en el momento que la semilla
empieza a tomar agua del medio externo, la finalización de este periodo, es valorado cuando en
las semillas se evidencia la emisión de la radícula (Bewley y Black, 1994). La germinación se
da en condiciones adecuadas a través de la interacción de diferentes factores como el contenido
de agua, oxígeno, temperatura, disponibilidad de nutrientes, calidad de la semilla, entre otros
(Taylor, 1997); algunos de estos aspectos se consideraron en el diseño del presente
experimento, con el fin de evaluar el efecto de los mismos sobre la expresión de la bacteria, y la
respuesta de las semillas hasta alcanzar el estado de plántula.
En el presente ensayo se evidenció un efecto positivo de G. diazotrophicus en las
concentraciones de 5 y 20 mL L-1 en suelo, con aplicación de fósforo sobre la germinación de
las semillas de tomate, tratamientos que fueron mejores que el blanco el cual no tenía la
bacteria. En estas primeras fases ya se empezaba a apreciar la respuesta diferencial, entre los
tratamientos con aplicación y sin aplicación de G. diazotrophicus.
Luego de la emergencia, la planta de tomate se desarrolla con un solo tallo, produciendo un
número variable de hojas (5-10), antes de que la yema apical se transforme en una
inflorescencia terminal tipo racimo (Heuvelink, 2005). En este proceso se da la formación de
cotiledones, y de la primera hasta la cuarta hoja verdadera, momento en el cual las plántulas
están listas para ser trasplantadas.
En tomate se han realizado diferentes estudios con el fin de determinar la interacción con
bacterias promotoras de crecimiento como Burkholderia (Caballero et al., 2007), Pseudomonas
(Gamalero et al., 2004; Gravel et al., 2007) y Methylobacterium suomiense (Poonguzhali et al.,
2008); recientemente se valoró el efecto de G.diazotrophicus PAL5, identificando el gran
potencial del microorganismo debido a la capacidad que demostró de colonizar la planta a nivel
de raíz y tallo, así como su efecto en el incremento de la producción de frutos a nivel de
invernadero (Luna et al., 2012).
Igualmente Botta et al., (2013) evaluaron la bacteria en tomate in vitro e in vivo, de manera
individual y en asociación con Azospirillum brasilense, Bacillus ambifaria y Herbaspirillum
seropedicae. Se evidenció la capacidad de colonización de las bacterias en estudio, en raíces,
tallos y hojas y el aumento de tamaño de plántulas de L. esculentum cv. Guadelete. El
comportamiento de G. diazotrophicus fue benéfico en condiciones in vitro, pero el experimento
in vivo, no fue consecuente debido a que se observó una respuesta de promoción de crecimiento
inferior a la evidenciada en los controles negativos.
El crecimiento de las plantas mejora con la producción de hormonas, como auxinas tipo
ácido indolacético (AIA) el cual es sintetizado por rizobacterias promotoras de crecimiento
afectando muchas actividades fisiológicas de la planta, como el alargamiento celular, división
celular, iniciación del desarrollo de raíces, tasa de crecimiento, fototropismo, geotropismo,
entre otros aspectos (Khan et al., 2009).
G. diazotrophicus produce compuestos indólicos del tipo auxinas las cuales hacen parte del
grupo de compuestos reguladores del desarrollo de las plantas, los cuales influyen en el
crecimiento, la división celular y la formación de raíces (Castillo et al., 2005). G.
diazotrophicus produce de 0,14 a 2,42 µg de AIA mL-1 en medio de cultivo, de acuerdo con
determinaciones realizadas con HPLC, lo cual ha demostrado que la bacteria puede promover
el crecimiento de las plantas, como complemento a la característica de fijación biológica de
nitrógeno (Fuentes et al., 1993). La concentración de sacarosa influye en la expresión de la
concentración de AIA sintetizada por la bacteria (Bastián et al., 1998); en este caso100 g de la
parte comestible del tomate contienen 3,3 g de carbohidratos (FAO, 2006), lo cual pudo influir
en crear condiciones para el establecimiento de la G. diazotrophicus en el cultivo.
G. diazotrophicus también tiene la capacidad de solubilizar fósforo (Maheshkumar et al.,
1999; Intorne et al., 2009); el fósforo es un macroelemento esencial en la nutrición de la planta,
debido a que su deficiencia es considerada como el principal factor limitante en el desarrollo de
la planta en diversos suelos agrícolas. Por esto la liberación de formas insolubles y fijadas de
fósforo, es una de las estrategias más importantes para incrementar la disponibilidad de este
elemento (Nautiyal, 1999).
5. Conclusiones
Se evidenció efecto benéfico de la bacteria G. diazotrophicus en el crecimiento de semillas y
plántulas de tomate; este efecto fue influenciado por la aplicación de fósforo y por el material
vegetal empleado.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e
Innovación (Colciencias), a la Vicerrectoría de Investigaciones y Posgrados de la Universidad
de Caldas y a la Dirección de Investigación, Proyección y Desarrollo de la Universidad
Católica de Manizales por la financiación del presente trabajo.
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Valenzuela I., Torrente A. (2010). Física de suelos. En: Ciencia del suelo. Principios básicos.
Burbano H., Silva F. (Eds.). Sociedad Colombiana de la Ciencia del Suelo: Bogotá.
Varela A., Rueda D.M. (2010). Organismos del suelo. En: Ciencia del suelo. Principios
básicos. Burbano H., Silva F. (Eds.). Sociedad Colombiana de la Ciencia del Suelo:
Bogotá. p. 397-438.
Anexo 1. Ficha técnica tomate híbrido Torrano y Santa Clara híbrido (Semillas Arroyave,
2014)
El híbrido Torrano se caracteriza por su gran vigor y tamaño, con tallo fuerte y entrenudos
medios que permite una formación de racimos más concentrada y muy bien ventilados. El fruto
es del tipo chonto, de muy buen tamaño y peso. Al madurar su color es rojo, de textura firme.
Presenta buena precocidad y adaptabilidad a distintas zonas de producción de climas fríos
(1500 – 2600 m.s.n.m.), además de rendimiento y resistencia a enfermedades como Alternaría
y nematodos.
Santa Clara híbrido se caracteriza por ser una planta indeterminada con frutos de color
uniforme, grande (150 – 180 gramos), ideal para zonas tropicales y cálidas, resistente al aborto
floral. Presenta resistencias/tolerancias a: Verticilium raza 1 (V1), Fusarium raza 2(F2),
Nematodos, Wilt Bacterial (BW), Bacterial Speck raza 0 (Bsp) y Stemphilium (St).
Anexo 2. Caracterización del suelo empleado en los ensayos.
Característica Unidades Suelo
Granja
Tesorito
Niveles de referencia
Bajo Medio Alto
pH 4,4
Nitrógeno % 0,68
Materia
orgánica
% 20,43 <3,0 3,0-5,0 >5,0
Fósforo mg/Kg 89 <20,0 20,0-
40,0
>40,0
Potasio cmol(+)/Kg 0,38 <0,2 0,2-0,4 >0,4
Calcio cmol(+)/Kg 3,29 <3,0 3,0-6,0 >6,0
Magnesio cmol(+)/Kg 0,86 <1,5 1,5-2,5 >2,5
Sodio cmol(+)/Kg 0,240 <0,5 0,5-1,0 >1,0
Hierro mg/Kg 400 <25,0 25,0-
50,0
>50,0
Manganeso mg/Kg 14,64 <5,0 5,0-
10,0
>10,0
Zinc mg/Kg 21,90 <1,5 1,5-3,0 >3,0
Cobre mg/Kg 4,73 <1,5 1,5-3,0 >3,0
Azufre mg/Kg 0,0 <10,0 10,0-
20,0
>20,0
Boro mg/Kg 1,1 <0,2 0,2-4,0 >4,0
Arena % 82
Limo % 2
Arcilla % 16
Textura F-A
F-A: Franco Arenoso
Anrco 3.
GENOTIPO DOSIS SUSTRATO NFOSF Tiempo N Media Dev std
Sclara GD2.5 suelo B 0_10_20 35 9.0000 1.21268
Sclara GD2.5 suelo A 0_10 31 9.0968 1.51338
Sclara GD5 suelo A 0_10 31 9.0968 1.51338
Sclara GD5 Turba B 0_10_20 35 9.4286 1.26690
Sclara GD5 suelo B 0_10 36 9.5278 1.53969
Sclara GD20 suelo B 0_10_20 34 9.5294 1.10742
Sclara GD20 suelo A 0_10_20 35 9.5429 1.57821
Sclara Blanco suelo B 0 30 9.6000 1.40443
Sclara Blanco suelo B 0_10_20 33 9.6061 1.74892
Sclara GD2.5 suelo B 0_10 32 9.6875 1.28107
Sclara GD10 suelo B 0_10_20 32 9.8438 1.37041
Torrano GD20 suelo A 0_10 34 9.8824 1.24960
Sclara GD2.5 Turba B 0_10_20 34 9.9706 1.21818
Sclara GD5 Turba A 0 34 10.1176 0.64030
Sclara GD10 suelo B 0_10 34 10.2059 2.47141
Sclara GD20 suelo B 0_10 32 10.2188 2.12108
Torrano GD2.5 suelo B 0_10 33 10.2424 1.09059
Sclara GD20 Turba B 0_10 36 10.3333 1.37321
Sclara Blanco Turba A 0_10_20 35 10.3429 0.93755
Sclara GD5 suelo A 0 34 10.4118 2.16190
Sclara Blanco suelo A 0 31 10.4194 3.64942
Sclara GD10 suelo A 0_10 35 10.4286 1.85164
Sclara GD2.5 suelo B 0 35 10.4286 1.83569
Torrano GD2.5 suelo A 0_10 35 10.6000 1.76901
Sclara GD5 Turba A 0_10_20 33 10.6364 0.82228
Sclara GD10 Turba B 0 34 10.6765 1.96516
Torrano GD5 suelo B 0_10_20 34 10.6765 1.31933
Sclara Blanco suelo B 0_10 31 10.6774 2.68809
Sclara GD5 Turba B 0 36 10.6944 2.13568
Torrano GD5 suelo B 0_10 34 10.7059 2.44366
Sclara Blanco Turba B 0 35 10.7143 1.75853
Sclara GD20 suelo A 0_10 35 10.7143 2.03746
Sclara Blanco Turba B 0_10_20 35 10.7429 1.22097
Sclara GD20 Turba B 0_10_20 35 10.7429 2.07709
Sclara GD20 Turba B 0 34 10.7647 1.70665
Torrano GD20 suelo B 0_10_20 33 10.7879 1.38649
Sclara GD20 Turba A 0_10_20 35 10.8000 1.25558
Sclara GD20 suelo B 0 34 10.8235 2.13869
Torrano Blanco suelo B 0 33 10.8485 0.97215
Torrano GD10 suelo A 0_10_20 32 10.8750 1.26364
Sclara GD10 suelo A 0 35 10.8857 2.51784
Sclara GD5 Turba B 0_10 36 10.8889 1.14087
Torrano GD2.5 suelo B 0_10_20 36 10.8889 1.95343
Torrano Blanco suelo A 0_10_20 35 10.9143 2.16077
Sclara GD2.5 Turba A 0 33 10.9697 1.61022
Sclara GD5 Turba A 0_10 34 10.9706 2.02238
Sclara GD10 Turba A 0_10 35 10.9714 1.52404
Sclara GD5 suelo B 0_10_20 33 11.0000 2.00000
Torrano GD10 suelo B 0_10_20 34 11.0000 1.59545
Torrano GD20 suelo B 0 35 11.0286 2.28146
Sclara Blanco suelo A 0_10 33 11.0606 2.29046
Sclara GD10 suelo B 0 32 11.0625 2.03101
Sclara GD20 suelo A 0 35 11.1429 2.00210
Sclara GD20 Turba A 0 31 11.1613 2.39578
Torrano GD10 suelo A 0_10 36 11.1667 2.27408
Sclara Blanco Turba B 0_10 34 11.1765 2.46762
Torrano Blanco suelo A 0 34 11.1765 2.08124
Sclara GD2.5 suelo A 0 33 11.1818 2.29748
Sclara GD5 suelo A 0_10_20 35 11.2286 1.86430
Sclara GD10 Turba B 0_10 35 11.2571 2.22741
Sclara GD20 Turba A 0_10 34 11.2647 1.91183
Torrano GD5 suelo A 0_10 33 11.2727 2.33550
Sclara GD2.5 Turba B 0 36 11.3056 2.35214
Torrano GD5 suelo A 0_10_20 34 11.3235 1.80438
Torrano GD20 suelo A 0_10_20 35 11.4000 3.11731
Sclara GD10 Turba B 0_10_20 34 11.4118 1.10420
Sclara Blanco suelo A 0_10_20 36 11.4444 3.04673
Sclara GD10 suelo A 0_10_20 35 11.4571 2.29248
Sclara Blanco Turba A 0 32 11.4688 2.21410
Torrano GD5 suelo B 0 33 11.5152 2.58748
Sclara GD10 Turba A 0 34 11.5294 2.50134
Torrano GD10 suelo B 0_10 35 11.5429 2.20084
Sclara GD10 Turba A 0_10_20 34 11.5882 1.43796
Torrano GD2.5 suelo A 0 35 11.6000 1.83431
Sclara GD5 suelo B 0 35 11.6571 3.69374
Torrano GD5 Turba A 0_10_20 36 11.6667 1.28730
Torrano GD20 suelo B 0_10 32 11.7500 2.03200
Torrano GD2.5 Turba B 0_10 34 11.8529 1.32876
Sclara Blanco Turba A 0_10 36 12.0000 2.09762
Sclara GD2.5 Turba B 0_10 34 12.0882 1.52490
Torrano GD2.5 suelo B 0 33 12.1212 1.79857
Torrano GD5 Turba B 0_10_20 34 12.1765 3.16678
Torrano Blanco suelo B 0_10_20 25 12.2000 5.05800
Torrano GD2.5 suelo A 0_10_20 35 12.2000 3.65256
Torrano GD5 Turba A 0 35 12.2000 2.85739
Torrano GD5 Turba B 0_10 35 12.2571 2.04857
Torrano GD20 suelo A 0 33 12.2727 2.21180
Torrano GD10 suelo A 0 35 12.2857 2.50378
Torrano GD10 Turba A 0_10_20 34 12.3235 1.78751
Torrano GD10 suelo B 0 34 12.3235 2.49509
Torrano GD10 Turba B 0_10_20 33 12.3939 2.37091
Torrano Blanco Turba A 0 36 12.5000 2.03540
Torrano Blanco Turba B 0 33 12.5152 1.52318
Sclara GD2.5 Turba A 0_10 34 12.5882 2.20355
Torrano GD20 Turba B 0_10 34 12.6471 1.75607
Torrano GD10 Turba B 0_10 36 12.7500 2.28504
Torrano GD20 Turba A 0_10_20 32 12.8438 1.96927
Torrano GD20 Turba B 0_10_20 33 12.8788 2.21864
Sclara GD2.5 Turba A 0_10_20 34 12.9706 4.82723
Torrano GD2.5 Turba A 0_10_20 35 13.0286 2.12112
Torrano GD5 suelo A 0 35 13.1143 4.06398
Torrano GD10 Turba A 0 35 13.1429 2.81950
Torrano GD20 Turba A 0_10 31 13.1935 2.46873
Torrano GD20 Turba B 0 34 13.2941 2.13952
Torrano GD10 Turba B 0 36 13.4167 3.26343
Torrano GD5 Turba A 0_10 34 13.4706 2.85227
Torrano Blanco Turba B 0_10_20 36 13.5000 2.78260
Torrano Blanco suelo A 0_10 31 13.5484 3.98195
Torrano GD2.5 Turba B 0 36 13.6944 4.53444
Torrano GD10 Turba A 0_10 33 13.8182 2.00709
Torrano Blanco Turba A 0_10 35 14.0571 2.88956
Torrano GD2.5 Turba A 0_10 36 14.1389 2.12674
Torrano Blanco Turba A 0_10_20 36 14.1944 3.27606
Torrano GD5 Turba B 0 34 14.2647 3.87931
Torrano Blanco suelo B 0_10 30 14.3667 4.39814
Torrano GD20 Turba A 0 35 15.1429 2.40273
Torrano GD2.5 Turba A 0 36 15.2500 4.89533
Torrano Blanco Turba B 0_10 35 15.3714 3.04945
Torrano GD2.5 Turba B 0_10_20 35 16.1143 3.24283
