NUTRICION DEL PULPO ROJO Octopus maya (Voss y Solís, 1966) DE LA

PENÍNSULA DE YUCATÁN: REQUERIMIENTOS METABOLICOS Y FISIOLOGICOS INTRODUCCION El pulpo Octopus maya es uno de los recursos pesqueros más importantes de la Península de Yucatán. Su demanda en el extranjero, su alto valor comercial y el aumento de la población dedicada a la pesca, ha producido un gran aumento de la presión de pesca sobre esta especie. Lo anterior, aunado al aumento demográfico costero esperado en los próximos años en Yucatán, plantea la necesidad de desarrollar nuevas alternativas de producción de especies marinas, como lo es la acuacultura. Los estudios que demuestran la factibilidad del cultivo de O. maya no son abundantes. Sin embargo, dada su adaptación a condiciones de cautiverio, su de desarrollo directo (sin fases larvales), y crecimiento rápido, se considera una de las principales especies candidatas para la acuacultura. Así, es necesario determinar los parámetros ambientales y biológicos que determinan el éxito del cultivo, como los que determinan la reproducción en cautiverio, desoves de reproductores silvestres, así como los parámetros nutricionales óptimos para el crecimiento y la engorda de juveniles, y la producción de reproductores de laboratorio con desoves similares o mayores a los de las poblaciones silvestres. En la Unidad Multidisciplinaria de Investigación y Docencia (UMDI) de la UNAM en Sisal, ya se estan estudiando algunos de estos aspectos. En la nutrición, se han probado ciertas dietas experimentales con alimentos naturales (jaiba, mejillón y almeja). Sin embargo, para poder llevar el cultivo hasta una fase piloto con miras a implementarlo a una escala comercial, es necesario establecer los requerimientos nutricionales para esta especie, que a su vez permitirá la elaboración de dietas artificiales que permitan a futuro su cultivo a gran escala. Este trabajo propone determinar estos requerimientos a nivel de aminoácidos y plantear un modelo conceptual que permita explicar el metabolismo de proteínas en esta especie enfatizando el metabolismo de aminoácidos. ANTECEDENTES Pesquería Alrededor del 90% de la producción nacional de pulpo proviene de las capturas en los estados de Yucatán y Campeche (SEMARNAP, 1999). Este recurso se ubica en tercer lugar nacional en importancia, después del camarón y el atún (Hernández Flores et al., 2001). Tiene alta demanda en países orientales (Japón, Korea), Europa occidental (España, Portugal, Grecia, Italia), Marruecos, Mauritania y Argentina, por lo que presenta un elevado valor comercial (Vaz-Pires et al., 2004).

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En la Península de Yucatán, la pesquería la componen dos especies: Octopus vulgaris (Cuvier, 1797) y O. maya (Voss y Solís-Ramírez, 1966), siendo esta última la que contribuye con el 70% de la producción (SAGARPA, 2004). O. maya es una especie endémica que habita la plataforma continental de la península, desde Ciudad del Carmen hasta Isla Mujeres (Voss y Solís-Ramírez, 1966; Solís-Ramírez, 1994, 1997). Las actividades de captura (agosto-15 diciembre) están condicionadas por el clima, ya que la temporada de nortes (junio-noviembre) trae consigo tormentas tropicales y huracanes. En la temporada de pesca 2005 se estableció una cuota de 11,972 toneladas (Solana et al., 2005). De estas, solo se capturaron alrededor de 5,000t (Oficinas SAGARPA Yucatán, 2006) por restricciones a la navegación ante las condiciones climáticas. Al mismo tiempo, la captura de O. maya se ha incrementado debido al aumento de la población en la costa, aumentando los riesgos de la sobrepesca sobre el reclutamiento a corto plazo, que provocaría una disminución en la producción en los años siguientes. El status pesquero este recurso es que se encuentra aprovechado al máximo sustentable desde hace varios años (DOF, 28 de agosto 2000). La mayoría de los estudios sobre O. maya se refieren a evaluaciones poblacionales y pesqueras (Solís-Ramírez y Chávez, 1986; Solís-Ramírez 1988, 1994, 1997; Arreguín-Sánchez et al., 1994, 1996; Arreguín-Sanchéz, 2000; Solana et al., 2002; Pérez et al., 2004; Solana et al., 2005), y solo algunos sobre evaluación bioeconómica (Cabrera y Defeo, 2001) y biología reproductiva (Santos-Valencia y Re-Regis, 2000). Cultivo Ante la condición de la pesquería, el cultivo de O. maya se presenta como una opción de producción alternativa. Algunas de las ventajas que se obtendrían con la implementación de actividades acuícolas en esta especie son: 1) disminuir la presión de pesca que se ejerce actualmente sobre el recurso, 2) ayudar a preservar este valioso recurso, 3) eliminar la dependencia de las condiciones del medio para su captura, 4) tener existencias del recurso durante todo el año, 5) planear su producción y comercialización, y 6) aliviar un conflicto social en la zona limítrofe de los estados de Campeche y Yucatán, originado por el aumento en el número de pescadores capturando este recurso que a fin de cuentas es limitado pero de alto valor económico. En general, los estudios del ciclo de vida, parámetros ambientales, reproducción, fisiología, bioenergética, nutrición y crecimiento, todos necesarios para determinar la factibilidad de un cultivo, son escasos para O. maya. Varios aspectos acuaculturales se han estudiado extensamente en O. vulgaris (Mangold, 1983; Villanueva, 1995; Vaz-Pires et al., 2004; Petza et al., 2006), cultivado a pequeña escala en España, Portugal e Italia (Vaz-Pires et al., 2004). Es una especie con alta fecundidad y un estadio larvario denominado “paralarva” (Young y Harman, 1988). Sin

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embargo, este fase experimenta una mortalidad alta y requiere de 1.5 a 2.5 meses para asentarse, faltando establecer con éxito su alimentación en esta fase (Villanueva, 1995; Villanueva et al., 2002; Carrasco et al., 2003). La fase de paralarva representa un factor limitante en el cultivo de esta especie, y las actividades acuícolas están dirigidas al crecimiento de subadultos obtenidos de actividades pesqueras (Vaz-Pires et al., 2004). A diferencia de la mayoría de las especies de cefalópodos que presentan huevos pequeños y un desarrollo larvario complejo como O. vulgaris (Boletzky, 1974; Villanueva, 1995), las que presentan huevos grandes con desarrollo directo, y que aceptan dietas muertas después de las primeras fases de desarrollo son las mas atractivas para la acuacultura. Tal es el caso de O. maya, pues produce huevos grandes y de desarrollo directo (Voss y Solis-Ramírez, 1966), teniendo uno de los mayores huevos de entre todas las especies de pulpo, alcanzando 17 mm de largo. Esto hace que sea una de las especies con más alto potencial para la acuacultura. O. maya ha sido cultivado en el laboratorio (Solis, 1967; Van Heukelem, 1976; 1977; DeRusha et al., 1989). El desarrollo embrionario dura entre 50-65 días en el medio natural (Solís, 1967). Van Heukelem, (1983) menciona una duración de 45 días a temperaturas entre 24 y 26°C. El mismo autor obtuvo tasas de conversión de alimento de cerca de 40%, pudiendo alcanzar 1 kg en 4 meses, y hasta 3 kg en 9 meses cultivado a 25ºC. Hanlon y Forsythe (1985) citan que esta especie presenta un crecimiento rápido, debido a sus elevadas tasas de ingestión y de conversión de alimento, ubicadas entre 30 y 60%. Estos autores señalan que, de entre las especies de pulpo con huevos de desarrollo directo cultivadas en laboratorio, O. maya presentó el mayor crecimiento, llegando a los 5.7 Kg, con tasas de crecimiento promedio del 4.1%/día durante su ciclo de vida completo, por lo que es una de las especies mas apropiadas para el cultivo en gran escala en densidades elevadas, después de O. bimaculoidis y O. digueti. Hanlon y Forsythe (1985) reportaron mortalidades de 20-30% para la totalidad del ciclo de vida, mientras que Van Heukelem (1983) menciona que la mortalidad en tanques de cultivo es baja, y que O. maya cultivado en laboratorio crece más que los provenientes del medio natural. Esto se relaciona con la temperatura media del cultivo, más elevada en el laboratorio que en el medio natural, y con el alimento disponible. Nutrición Al nacer, los pequeños pulpos de O. maya tienen las características de un adulto, con brazos hábiles para reptar y atrapar alimentos, y adoptan la vida bentónica de inmediato (Solís y Chávez, 1985). Con relación a la alimentación, Hanlon y Forsythe (1985) establecen para O. maya que durante las primeras fases del ciclo de vida es esencial alimentarlos con presas vivas de tamaño adecuado, como los misidaceos. Van Heukelem (1983) propone como alimento a gamarideos, anfípodos e isópodos; los

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juveniles pueden ser alimentados con gasterópodos y almejas o cangrejos, entre otras presas naturales. De preferencia se deben ofrecer presas vivas, porque el canibalismo aumenta con dietas inertes. Uno de los factores que ha impedido el desarrollo de la acuacultura de cefalópodos a escala comercial es la dependencia de las dietas naturales para su alimentación (O’Dor & Wells, 1987; Lee et al., 1991). Vaz-Pires et al. (2004) citan que aunque O. vulgaris acepta alimentos naturales en cautiverio, desde el punto de vista nutricional, su potencial acuícola involucrará necesariamente cambios de los alimentos naturales a los comerciales deshidratados. Según Lee (1984), en el cultivo de cefalópodos, mas del 50% del trabajo está asociado a la captura, mantenimiento o cultivo de las presas naturales. Si se congelan las presas, el costo de mano de obra se reduce cerca de 30%. Inversamente, el costo asociado a producciones de dietas artificiales es bastante menor, y disminuyen significativamente si se producen estas dietas artificiales a gran escala. El desarrollo de dicha dieta es uno de los objetivos importantes para llegar a un cultivo a nivel comercial (Lee, 1994). Uno de los aspectos clave en este sentido es la obtención de dietas adecuadas y que tiendan a ser de bajo costo. En general, de entre los cefalópodos, los pulpos suelen aceptar más fácilmente dietas preparadas (Hanlon et al., 1991), aunque su sabor u olor no sean de buena calidad (Castro, 1991; Domínguez, 1999). Por las razones anteriores, es de vital importancia la determinación de los requerimientos nutricionales básicos para cefalópodos, a través del desarrollo de dietas artificiales equilibradas, con alta durabilidad y eficientes que promuevan un crecimiento aceptable y que sean atractivas para O. maya. Una dieta de composición conocida y determinada puede ayudar a entender la fisiología de la nutrición de la especie, así como ayudar a determinar los requisitos nutricionales de estos organismos (Domínguez et al., 2004). Una vez logrado esto será posible escalar los cultivos de laboratorio a una escala piloto experimental y posteriormente a la escala comercial, a costos razonables. Requerimientos nutricionales La dieta natural de O. maya esta constituida de crustáceos, moluscos bivalvos y algunos peces, siendo los decápodos su alimento preferido y con una elevada proporción en la misma, tales como cangrejos y jaibas. Estudios recientes en la UMDI-UNAM en Sisal, sugieren que O. maya tiene un alto requerimiento de proteínas al considerar el tipo de presas con las que se han obtenido los mayores crecimientos (cangrejos, almejas, camarones). Resultados preliminares demostraron que dietas balanceadas con niveles de proteínas (P), lípidos (L) y carbohidratos (CHO) de 40, 11, y 20%, respectivamente, podrían no ser apropiadas para el crecimiento de O. maya. Con esta dieta los pulpos no aumentaron de peso en 40 días. Sin embargo, con animales alimentados con jaibas

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congeladas (56% P, 4% L y 10% CHO) se obtuvieron incrementos superiores al 5%/día, al pasar de 400 a 1500g en solo 30 días (Domínguez et al., en prensa). Esos resultados permiten suponer que el metabolismo de estos pulpos es altamente dependiente de las proteínas, principal nutriente del cual están compuestas las jaibas y que, posiblemente, tengan requerimientos relativamente bajos de lípidos y carbohidratos. Lee (1994) propone que el balance de aa en la dieta de cefalópodos es el mejor indicador de una buena dieta, desalentando el uso de la relación proteína/energía (P/E) ya que no es fiable ni buena indicadora de una dieta apropiada para cefalópodos. Por lo tanto, es muy importante conocer la composición en aa de los cefalópodos, principalmente de los de elevado potencial para acuacultura como Sepia officinalis u O. maya (Domínguez et al., 2004). En este sentido, se deben incorporar las concentraciones de todos los aa esenciales y su correcto balance en las dietas para que estas puedan dar resultados satisfactorios en el cultivo. Además de los aa esenciales, la elaboración de dietas debe considerar la elevada necesidad de algunos aa que aunque no sean esenciales, por su intenso uso y requerimiento para la producción de energía, deben ser considerados como tales (Domínguez et al., 2004). Tal es el caso de la prolina y alanina, que en un estudio de Domínguez (1999) con S. officinalis fueron los aa más rápidamente utilizados para energía como substratos del ciclo TCA (Ballantyne et al., 1981). La prolina es el primer aa que se oxida a glutamato para producir energía (Lehninger et al., 1993), y por tanto el primero a ser usado si el cefalópodo no está bien alimentado o en buena condición. Domingues et al. (en prensa) lograron aceptación e ingestión de un alimento balanceado (base comercial de camarón y pasta de calamar) con O. maya, aunque con un crecimiento mínimo y una considerable producción de heces. Mencionan que estos resultados pueden deberse a deficiencias en algunos aa, lo que puede explicarse a partir del contenido energético de las heces y de la determinación de la composición de aa. En la futura elaboración de dietas, se debe tratar de obtener una composición similar a la de la composición de aa del manto de los pulpos analizados en dicho experimento. A partir de estos resultados, se probaron dos niveles de proteína (40 y 60%), con una dieta control de jaibas congeladas (todos con valores de contenido de energía similar) que resultó con el mayor crecimiento. Los resultados mostraron que las diferencias observadas se relacionan con la digestibilidad o con la composición de los nutrientes de las dietas (Aguila, 2006). Posteriormente, se probaron 5 dietas con diferentes niveles de hidrolizado de pescado (0, 5, 10, 15, 20%) procurando hacer disponibles más péptidos y aa a los organismos El mejor crecimiento se observó con un 15% de hidrolizado, que fue sin embargo mucho menor que la dieta control. Por lo cual, nuevamente se hace referencia a la composición de los nutrientes, en específico de los aa.

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Se ha determinado la composición de aa en algunos cefalópodos, principalmente en órganos y tejidos de juveniles y adultos de O. vulgaris (Iwasaki y Arada, 1985, O’Dor y Wells, 1973; Villanueva et al., 2004; Seidou et al., 1988). Sin embargo, la información sobre la composición de aa en los estadios tempranos (paralarvas o juveniles) es escasa. Por lo tanto, los requerimientos de aa de dichos estadios es poco conocida (Villanueva et al. 2004). Diversos factores influyen en el crecimiento de cefalópodos (Forsythe y Van Heukelem, 1987), siendo muy probable que la variabilidad en cantidad y calidad del alimento afecte el crecimiento en los estadios tempranos. En general, no existen estudios cuantitativos sobre el efecto de la ración alimenticia en el crecimiento de las larvas planctónicas de cefalópodos (Villanueva et al., 2002). Lo anterior aplicaría también para los estadíos tempranos en O. maya. Villanueva et al. (2004) encontraron en estadios tempranos de O. vulgaris, Sepia officinalis y Loligo vulgaris que la leucina, lisina y arginina representan casi la mitad de los aa esenciales, indicativo de que pueden ser aa esenciales limitativos en sus dietas. En O. vulgaris, la arginina alcanzó altos niveles en forma libre, así como la taurina, involucrada en procesos de osmoregulación (Florkin y Bricteux-Grégoire, 1972). Cazares (2006) encontró en O. maya que la elevada presión osmótica de los huevos se reduce durante el desarrollo embrionario hasta alcanzar la presión osmótica del agua de mar justo antes de la eclosión. Esto puede estar relacionado con la presencia de aminoácidos libres en el líquido perivitelino, registrándose un aumento de peso y volumen de los huevos como parte de este mecanismo. A su vez, puede utilizar los aa como fuente de moléculas para su desarrollo y adquiere espacio para su crecimiento. También concluye que en general, diferentes dietas aplicadas a los reproductores afectan a la cantidad de huevos depositados, no a la calidad de los mismos en términos de contenido de proteínas, lípidos y presión osmótica presentes. Villanueva et al. (2004) encontraron que la cantidad total de aa aumentó con el peso seco en juveniles de O. vulgaris silvestres, indicando cambios bioquímicos asociados a fuertes cambios morfométricos en las proporciones corporales después del asentamiento, cuando desarrollan los tentáculos, abundantes en proteína. Cazares (2006) también cita que la reducción de lípidos en el tejido y cambios en las proporciones corporales (largo de los tentáculos con respecto al manto) demuestran que juveniles tempranos de O. maya en los primeros 10 días de vida pasan de una condición dependiente de reservas lipídicas a una conducta netamente depredadora, asociada con el uso de las proteínas. Por lo tanto, puede pensarse que a partir de cambios morfométricos y bioquímicos que presenta la especie conforme crece, sus necesidades nutricionales se modifiquen, en especial los requerimientos proteicos y por lo tanto de aa.

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Estos antecedentes indican la importancia de determinar los requerimientos de aa desde el desarrollo embrionario continuando hasta la etapa inicial del ciclo de vida de O. maya. La etapa de juvenil temprano (duración de 30 días) en O. maya es parte de una división artificial propuesta en función de las características observadas durante el primer mes de vida. Los juveniles tempranos pesan en promedio al nacer 0.1 g, con las características de un adulto con brazos hábiles para reptar y atrapar alimento. La mayoría nace con el saco vitelino reabsorbido y los que lo hace prematuramente, lo absorben parcialmente y se desprende a los pocos minutos de haber emergido del huevo. Metabolismo de proteínas En general, el metabolismo de los cefalópodos es casi totalmente dependiente de proteínas (Lee, 1994), por lo que el requerimiento de aminoácidos (aa) para la producción de las mismas es elevado (Houlihan et al., 1990). En cefalópodos adultos, la movilización directa de las proteínas musculares proporciona la energía metabólica durante periodos de inanición o de hambre y el uso directo de proteína como reserva energética puede explicar la ausencia de las reservas principales de glicógeno o lípidos en los tejidos de los cefalópodos (Storey y Storey, 1978, 1983; O´Dor et al., 1984). Digestión de proteínas. La formulación de dietas para los estadíos tempranos de cefalópodos debe considerar los requerimientos mencionados, así como sus capacidades digestivas en forma similar a la enzimología larval de peces carnívoros cultivados (Caruso et al., 1993; Kuz´mina, 1996). Se conoce que las enzimas digestivas de larvas de peces muestran diferente nivel de actividad cuando las larvas son alimentadas con dietas compuestas o con presas vivas (Abi-Ayad y Kestemont, 1994), por lo que en el caso de cefalópodos, es necesario el conocer las necesidades alimenticias en sus estadíos tempranos y la determinación de sus capacidades digestivas, a través de la determinación de la actividad proteolítica. Enzimas digestivas. En pulpos, los principales órganos que segregan enzimas digestivas son las glándulas intermedias, la glándula digestiva, el ciego y los canales digestivos. Ni el estomago, ni el esófago segregan enzimas. Por lo tanto, las enzimas digestivas que degradan los alimentos en estos dos órganos provienen de otros órganos, principalmente de las glándulas salivares o digestiva (Boucaud-Camou y Boucher-Rodoni, 1983). Existe actividad proteolítica en el lumen del aparato digestivo, desde el esófago hasta el intestino (Boucaud-Camou, 1973). Esta actividad se origina en varias secreciones de distintos órganos: las glándulas salivares y digestiva, el ciego y el intestino. Sawano (1935), Guiretti (1950) y Morishita (1974, 1978) han encontrado fuerte actividad

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proteolítica en las glándulas salivares posteriores de Octopus, probablemente involucrada con la digestión externa. Morishita (1978) concluye que las glándulas salivares posteriores juegan un papel muy importante en la digestión de proteínas, mientras que Best (1981) presentó fuerte evidencia de tal función en Octopus. Koslovskaya and Vaskovsky (1970) mostraron una actividad proteolítica importante en la glándula digestiva de cefalópodos. Sawano (1935) y Takahashi (1960) encontraron actividad proteolítica también en los canales digestivos de pulpos y calamares. Boucaud-Camou y Boucher-Rodoni (1983) han señalado que al estudiar la composición de las enzimas proteolíticas en cefalópodos, las diferencias encontradas por diferentes autores puede ser resultado de diferentes estados de la digestión o del ciclo de vida al momento del muestreo. En cuanto al ciclo de vida, Sakaguchi (1968) reportó una fuerte actividad en la glándula digestiva y en las glándulas salivares posteriores de Octopus. Después del desove en hembras, la actividad enzimática descendió considerablemente en ambos órganos. El conocimiento de la actividad de las enzimas proteolíticas contribuirá también a elucidar las capacidades digestivas, que a su vez se relacionan con los requerimientos nutricionales de O. maya bajo condiciones de cultivo. Fisiología energética Los estudios de fisiología energética son de gran utilidad para establecer las necesidades de energía de los organismos cultivados. Se puede establecer como la energía ingerida del alimento (I) es absorbida (Ab) en la glándula digestiva al conocer a cantidad de heces producidas (H) y la energía contenida en estas (Ab = I – H). De la energía absorbida una parte es perdida en los productos de excreción nitrogenada (U) y otra es dirigida a los procesos metabólicos (R) y al crecimiento (P) integrándose así en la energía asimilada (AS), por lo que As = (Ab – U) = R + P (Lucas, 1989). En general la utilización del análisis del balance energético en cefalópodos son escasos (Petza et al., 2006). Van Heukelem (1976) realizó una aproximación del balance energético en O. maya. Sin embargo, los fines para los que se experimentó con la especie fueron biomédicos y no para su aplicación en acuacultura. Por lo tanto, es necesario obtener y formalizar el balance energético en O. maya bajo diferentes tratamientos alimenticios conocidos que defina las proporciones de la energía que son ingerida, absorbida, perdida como heces y en procesos metabólicos, y finalmente la asimilada dirigida al crecimiento-reproducción. En este sentido, es importante la determinación de los requerimientos nutricionales ya mencionados. PREGUNTAS E HIPOTESIS

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Tomando en consideración que en general el metabolismo de los cefalópodos es esencialmente proteico, es posible pensar que este tipo de organismos tienen un requerimiento de proteínas elevado. En este contexto el requerimiento de aa en términos de cantidad y calidad debe ser un factor clave para establecer sus requerimientos nutricionales. La presencia de aa en el líquido perivitelino puede representar una función relevante desde el punto de vista nutricional. Cabe preguntarse si estos aa son movilizados, metabolizados almacenados e incluso utilizados entre el líquido perivitelino y el vitelo (y por ende al embrión) durante el desarrollo ontogénico, en función de las necesidades osmóticas y nutricionales del embrión. De existir una dinámica definida de aa al interior del huevo, es posible que no todos los aa participen, sino probablemente solo aquellos que tengan una alta concentración, por ejemplo. Puede suponerse que la composición proteica y aminoacídica de las presas naturales (Callinectes sp.) de O. maya, con las que se han obtenido los mejores crecimientos, sean un indicativo de los principales requerimientos nutricionales necesarios para el desarrollo de los pulpos. Es de pensarse que las composiciones de aa tanto del alimento natural como del obtenido en el desarrollo ontogénico tienen una alta correspondencia. Dietas experimentales, basadas en los requerimientos de aa obtenidos a partir de los perfiles en los embriones y del alimento natural, pueden satisfacer las necesidades nutricionales de los juveniles tempranos de O. maya. Dados los cambios morfológicos, conductuales y posiblemente bioquímicos durante la etapa de juvenil temprano, los requerimientos proteicos y en especial de aa se modifican durante esta etapa. A partir de la hipótesis anterior, es de suponerse que la actividad proteolítica de los pulpos, así como de las enzimas involucradas, sea diferente conforme el animal crece en concordancia con los cambios morfológicos y bioquímicos señalados. OBJETIVO GENERAL Generar un modelo conceptual que explique el funcionamiento del metabolismo de proteínas en Octopus maya con particular énfasis en el metabolismo de aminoácidos. OBJETIVOS ESPECIFICOS

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• Evaluar la forma en que los aminoácidos modulan el metabolismo de las proteínas durante el desarrollo ontogénico del pulpo O. maya.

• Determinar los requerimientos de aminoácidos de los juveniles tempranos de O.

maya en función de la composición aminoacídica establecida en el desarrollo ontogénico.

• Determinar la forma en que la composición aminoacídica de la dieta afecta la

sobrevivencia, el crecimiento y el balance energético de juveniles tempranos de O. maya.

METAS • Determinar la composición de aa durante el desarrollo ontogénico de O. maya en el

líquido perivitelino, en el vitelo y en el embrión. • Determinar el perfil de aa de las presas naturales de O. maya, en este caso jaibas

(Callinectes sp.). • Diseñar dietas experimentales con una composición conocida, basadas en la

determinación de los requerimientos de aa. • Aplicar las dietas elaboradas y determinar el perfil de aa en juveniles tempranos de

O. maya. • Determinar la actividad de las enzimas digestivas de juveniles tempranos de O.

maya sometidos a las dietas elaboradas. • Determinar los componentes del balance energético: tasa de crecimiento (TC), tasa

de respiración (VO2), tasa de excreción nitrogenada (N), tasa de ingestión de alimento (energía ingerida, I), heces (H) y eficiencia de asimilación (EA), en juveniles tempranos de O. maya sometidos a los diferentes tratamientos alimenticios.

• Integrar la información proveniente de los perfiles de aminoácidos, del metabolismo

nitrogenado y de la actividad enzimática, con el fin de generar el modelo conceptual. METODOLOGIA

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I. Determinación de los perfiles de aa en embriones de O. maya y en jaiba Callinectes. Disponibilidad de pulpos hembras y huevos A partir de hembras maduras provenientes del laboratorio, alimentadas con una dieta estándar de jaiba-mejillón elaborada y probada en la UMDI-UNAM en Sisal, se obtendrán los huevos respectivos. La disponibilidad de estas hembras en el laboratorio no representa inconveniente ya que se posee al momento con una infraestructura que permite el cuidado y la maduración de estas hembras, hasta la puesta de huevos, incluyendo un sistema de incubación diseñado en la misma UMDI-UNAM de Sisal. Presión osmótica Se realizarán muestreos periódicos cada 10 días hasta llegar a los 50 días, edad a la cual se tiene la seguridad de haber sucedido la liberación de los embriones de los huevos. Se determinará la presión osmótica de una muestra de 10 huevos, realizando cuidadosamente una disección para obtener muestras provenientes del líquido perivitelino, el vitelo y el mismo embrión. Se utilizará un micro-osmómetro Mod. 3 MO plus que reporta los resultados como mosm / Kg. de agua (American Advanced Instruments). Composición de aa Las mismas muestras del líquido perivitelino, vitelo y embrión servirán para determinar, mediante la técnica de cromatografía líquida de alta precisión (HPLC), la composición de aa en cada uno. Para la determinación de la composición de aa, las muestras se tratarán previamente liofilizándolas y procediendo a la hidrolización, reconstitución y derivatización de las mismas para finalmente correr los análisis y obtener el cromatograma respectivo. Se utilizará un HPLC marca Waters con detector de fluorescencia y dual (absorbancia). A partir del día 20, edad a la cual el embrión muestra una diferenciación evidente en su morfología, se muestreará el tejido muscular de los tentáculos y de ser posible la glándula digestiva por separado, en 5 embriones, para la misma determinación de la composición de aa. Para el muestreo en las jaibas, se procederá a diseccionar 5 organismos, extrayando muestras de: músculo (a nivel de quelas mayores e interior del caparazón), las branquias y el ovario. Cada muestra se almacenará en nitrógeno líquido hasta su análisis, el cual consistirá del mismo procedimiento que para las muestras de embriones. Tomando en cuenta la duración del desarrollo embrionario (45 días aproximadamente), el tiempo para la toma de muestras de los huevos y embriones y análisis de las muestras, se espera consumir 3 meses de trabajo en esta etapa. Este tiempo puede

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variar dependiendo de la sobrevivencia de los embriones y de la disponibilidad inmediata de los huevos. II. Formulación de dietas artificiales En el laboratorio, se elaborarán las dietas experimentales (tratamientos) basadas en la determinación de los requerimientos de aa obtenidos a partir de las composiciones de aa de los embriones y de las jaibas. Estudios previos (Villanueva et al., 2004 con O. vulgaris; Domínguez et al., en prensa con O. maya) coinciden en señalar que lisina, leucina y arginina representan la mitad de los aa esenciales, mientras que ácido aspártico y el ácido glutámico representan casi la mitad de los aa no esenciales. Por lo tanto, como punto inicial se elaborarán 5 dietas, correspondientes con niveles diferentes de estos aminoácidos. Se utilizará una dieta base ya elaborada en la UMDI, complementada con una mezcla de aa cristalinos, similares a los requerimientos determinados, excepto para el aa bajo prueba. Tomando la metodología seguida por Millanema et al. (1996), las dietas se elaborarán incrementando los niveles de el aa correspondiente, que serán en función de un porcentaje de la dieta proteica. Los niveles del aa estarán por debajo y por arriba de los niveles de aa determinados en los requerimientos previos. De ser necesario, se modificarán los niveles de ácido aspártico y ácido glutámico con el fin de mantener, en base de nitrógeno, las dietas isonitrogenadas. Se mezclarán todos los ingredientes hasta obtener una consistencia en forma de pasta conteniendo un 5% de humedad. Estas dietas serán almacenadas en frío hasta su aplicación. Para los organismos marcados como control se utilizará una dieta estándar que consiste en una mezcla de jaiba-mejillón (70% y 30%), la cual en experimentos previos con dietas naturales ha demostrado ser bien aceptada por los organismos y que produce un crecimiento significativo. III. Aplicación de las dietas Cada una de las dietas serán probadas de la siguiente manera: 10 organismos juveniles serán colocados en estanques experimentales de 0.5 lt de capacidad, de forma individualizada. Los estanques serán acondicionados con aireación constante y flujo de agua de mar equivalente a un recambio de 300% diario. Con esto se aseguran niveles de nitrógeno amoniacal y nitrito por debajo de 0.1 mg/l, y nitrato de menos de 50 mg/l, así como un pH entre 7.7. y 8.2 (Rosas et al, 1997). Estos parámetros se citan como los

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recomendados como los más adecuados para el mantenimiento y cultivo de diferentes especies de Octopus, incluyendo a O. maya (Hanlon y Forsythe, 1985). Los organismos serán alimentados diariamente a las 9:00 horas, ofreciendo en un principio 20% de su biomasa corporal, acomodando el alimento en conchas de bivalvos vacías y colocándolas en los tanques experimentales. Después de 4 horas de la aplicación del alimento, se retirarán las heces y el resto de la materia orgánica producto del alimento no ingerido. Cada una de las dietas se aplicarán durante 30 días. Tomando en cuenta el tiempo invertido en la preparación del sistema, la aplicación de la dieta y la toma de muestras y análisis de las mismas. Se espera consumir un tiempo de mínimo 40-45 días para probar cada dieta (correspondiente a cada aminoácido), multiplicado por 5 dietas, arrojan un estimado de al menos 225 días de trabajo en esta etapa. Este tiempo puede aumentar en caso de determinarse el análisis de un número mayor de aa que representen más dietas a probar. Determinación de proteasas y proteínas totales De forma individualizada, se obtendrán las proteasas totales y las proteínas totales mediante la técnica siguiente: En un tubo Eppendorf de 1.5 ml se colocaron 125 μl de AZOCOLL (Sigma A4341), (diluido en buffer sodio fosfato 10mM, ph 7) como sustrato, 75 μl de agua libre de pirógenos, y 25 μl de extracto (dilución 1:100) se agitó en el vórtex, incubando la reacción a 37 °C por 30 minutos, posteriormente se adiciona 1 mL de TCA al 5% (ácido tricloroacético) para parar la reacción haciendo que las proteínas se precipiten. Después se centrifugan las muestras a 10,000 rpm durante 10 min. Se lee el sobrenadante a 520 nm en el espectrofotómetro (Spectronic modelo 21D), en la función de absorbancia de luz visible en sensibilidad media (Todd, 1949). Para la medición de la proteinas totales, se utilizará una prueba comercial para micro-determinaciones según la técnica de Bradford (1976). Se utilizarán 10 μl de plasma diluido (5μl de plasma en 3000 μl de agua inyectable libre de pirógenos) en una micro placa de lector de ELISA (Fig.9) y se añadirán 200 μL de solución reactiva. Las muestras se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos registrándose la absorbancia a 595 nm. La concentración de proteínas (mg/ml) se calcula con una curva patrón utilizando el estándar comercial de albúmina bovina. Efecto de la dieta en juveniles tempranos

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Determinación de proteínas y aminoácidos. Se realizarán muestreos de los juveniles cada 2 días durante un periodo de 30 días, lo que hace un total de 15 muestreos. Se procederá a determinar tanto las proteínas como los aminoácidos iniciales, así como las proteínas al momento del muestreo en el tiempo t (días) hasta finalizar el periodo de experimentación (t=0, t=2, t=4, … t=30). Se aplicarán las mismas técnicas para determinación de proteínas y composición de aminoácidos ya descritas para los embriones. Balance energético Crecimiento y sobrevivencia. En cada muestreo se determinará el crecimiento y la sobrevivencia. La tasa de crecimiento específica (TCE) se calculará utilizando la ecuación TC=[(ln P2 – lnP1)/T2 – T1] x 100 , donde P1 y P2 sopn el peso humedo inicial y final (g), respectivamente, y T1 y T2 son el tiempo inicial y final del periodo experimental respectivo. La sobrevivencia se obtendrá de la diferencia de los animales al inicio y al final del periodo de crecimiento. Consumo de oxígeno y excreción de amonio. Al final de cada periodo experimental (30 días), se procederá a determinar en los organismos sometidos en cada dieta el consumo de oxígeno y la excreción de amonio. Para el consumo de oxígeno se utilizarán 5 organismos de cada tratamiento, colocándolos individualmente en cámaras respirométricas conectadas a un sistema cerrado de circulación de agua de mar donde se controle la temperatura y se detecte la concentración de oxígeno con un oxímetro con precisión de 0.1 mg02/ml. Se aplicará la ecuación: V02 = (Oxie – Oxis) x F , donde Oxie y Oxis son las concentraciones de oxígeno a al entrada y a la salida de la cámara, respectivamente y F es el flujo de agua. Para evaluar la tasa de excreción de amonio, se analizarán muestras de agua antes y después de su paso por cada cámara tanto en animales en ayuno (Nrut= N de rutina) como alimentados (NENPA). El valor del amonio excretado se transforma a su equivalente energético utilizando el factor de 20.5 joules/mg de amonio excretado, el cual se utiliza para evaluar la energía perdida en los productos de excreción nitrogenada (U). Cronograma propuesto

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Meses Actividad 1 5 1

0

1

5

2

0

2

5

3

0

3

5

Protocolo completo (proyecto)

Obtención huevos

Desarrollo embrionar

Muestras embriones y análisis aa

Elaborar dietas

Aplicar dietas

Enzimas digestivas

Balance energético

Estancia investigac España

Integrar información

Modelo conceptual

Documento final

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