Nueva Fase Para D-SPE (QuEChERS) Que Mejora La Retirada de Grasas

Nueva fase para d-SPE (QuEChERS) que mejora la retirada de grasas

•Angel Castro

•Analytical Sales Specialistsigma-aldrich.com

Introducción

• En estos años el uso de QuEChERS para la limpieza de muestras se ha aplicado con exito a otros alimentos mas alla de vegetales y frutas, por ejemplo leche, aceite ó pan. Asi el rango de compuestosanalizados por esta tecnica se ha agrandado a otros tipos de compuestos desde pesticidas a otros contaminantes (P. ej. Drogasveterinarias). Todos estos analisis se llevan a cabo por metodos en equipos LC-MS.

• Las fases de SPE que se han usado hasta ahora como sorbentes en el metodo QuEChERS son: amina primaria-secundaria (PSA) para la eliminación de ácidos, pigmentos polares y azúcares; Carbon grafitado (GCB) para la eliminación de pigmentos de color como la clorofila; y C18 para la eliminación de lipidos y componentes no polares.

• El sorbente tipo C18 era hasta ahora el unico disponible para la eliminación de grasas y compuestos no polares.

• En esta presentación presentamos el uso de un nuevo sorbente para la eliminación de lipidos (Z-Sep)

Agenda

• Que son Supel™ QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?

• Beneficios

• Posicionamiento Z-Sep/C18 and Z-Sep+

• Descripción del producto

• Caracteristicas clave

• Como trabaja el metodo QuEChERS?

• Datos y ejemplos

¿Que son Supel™ QuE Z-Sep/C18 y Z-Sep+?

Repaso del metodo: Lo que conocemos…

Supel QuE ( Dispersive SPE, dSPE, QuEChERS)

•Usamos sorbentes SPE en bulk

•Desarrollado para analisis de pesticidas, en multirresiduos (100)

•Diseñado para eliminarinterferencias en muestras de alimentos

•Analitos quedan sin retener

Diferentes metodos dSPE:

•EU Standard Method EN – 15662

•AOAC Method 2007.01

•Metodo original(extracción sin tampon)

Being applied to other compounds (e.g.,veterinary drugs) and samples!

5

Lo que sabemos…..

¿Que son Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+?

HybridSPE®-Phospholipid

• El atomo de Zirconio actua como un acido

de Lewis

• Los grupo fosfato en los fosfolipidos actua

como una base fuerte de Lewis y se une

fuertemente con los atomos de Zirconio.

• Los analitos se eluyen libres de fosfolipidos

PhospholipidsProprietary HybridSPEzirconia-coated silica

(conocido como Z-Sep)


¿Que ocurre cuando?

Se encuentra

PhospholipidsProprietary HybridSPEzirconia-coated silica

(now known as Z-Sep)


?


y….

Nacen Supel QuE Z-Sep/C18 and Z-Sep+

• Supel QuE Z-Sep/C18

• 50 mg de Discovery DSC-18 y 20 mg de Z-Sep (HybridSPE , Silica recubierta de zirconio)

• Envases de 2 mL en tubos de centrifuga; 100 tubos/pack (catalog # 55284-U)


Zr

Zr

Zr

Zr

Zr

Zr

Zr

Zr

+

C18

C18

C18

C18

C18

C18

C18

C18

Zr

C18

Zr

C18

Zr

C18

Zr

C18

• Supel QuE Z-Sep+

• Doble enlace C-18 y Z-Sep

• Envase de 2 mL tubo de centrifuga, 500 mg;

• 50 tubos/pack (catalog # 55296-U)

• Muestras 5 tubos/pack (catalog # 55297-U)

• Bulk, 20 g (catalog # 55299-U)

Beneficios

�Supel™ QuE Z-Sep/C18 mejora la limpieza de

muestras para matrices complejas, eliminando masgrasa y color del extracto que las fases tradicionales

de QuEChERS para metodos LC-MS.

�Eliminando las interferencias causadas por la

matriz, los productos Z-Sep proporcionan unosmetodos LC-MS mas robustos.

�Esta tecnologia propia puede Reemplazar las fases

C18 y PSA en los metodos actuales sin ningun

desarrollo adicional del metodo.

•Supel QuE Z-Sep/C18

• Util para matrices con contenido en fosfolipidos <15%

– Frutas

– Vegetales

• Ejemplo:

– Analisis de residuos de pesticidas

Posicionamiento Supel QuE Z-Sep/C18 y Z-Sep+

•Supel QuE Z-Sep+

• Util para matrices con contenido

en fosfolipidos >15%

– Tejido animal

• Ejemplo:

• Analisis de drogas veterinarias

Posicionamiento Supel QuE Z-Sep/C18 y Z-Sep+

• Z-Sep tiene un grupointercambiador ionico con caracter acido

• Z-Sep+ tiene ambasfuncionalides en su superficie intercambiador ionico y funcionalidad hidrofobica

• La interación entre la parte hidrofobica de las grasas y el grupo hidrofilico de estas con las 2 funcionalidades del Z-Sep+ tiene un efecto de sinergia para la retención de grasas

Z-Sep & ZirconioO

Zr Zr

O

OO

O

O

. .

O

Zr Zr

O

OO

O

O

O

Zr Zr

O

OO

O

O

. .

Descripción de producto

• Plataforma simple y generica para la preparación de muestra.

•

• Diseñado para la eliminación de interferencias hidrofobicas (a nivel bruto) de las muestras, antes del analisis por LC-MS ó LC-MS-MS.

• El mecanismo de retención de lipidos basado en dos interaccionessinergicas –

• Entre el grupo polar de los lipidos y el grupo enlazado de intercambioionico

• Entre las cadenas hidrofobicas de lipidos y el grupo hidrofobicoenlazado a la superficie del Z-Sep.

• La limpieza tiene mas exito en un formato dispersive SPE, cuando la faselibre se mezcla con el extracto, y el tubo es centrifugado para separar el sorbente y el sobrenadante que luego recogemos.

Caracteristicas clave

• Disminuye las interferencias grasas de la matriz

• Elimina los colores, especialmente pigmentos verdes

• Emplea “Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe” metodologíaasociada al metodo QuEChERS.

• Util para el analisis de residuos de pesticidas

• Util para el analisis de residuos veterinarios en tejido animal (Z-Sep+)

Datos

• Se probo la eliminación de oleinas por diferentes sorbentes. La mezcla incluye

1mL solucion de mono-, di- y tri-oleinas en 90% acetonitrilo-10% agua y 25 mg

de sorbente. Las oleinas se mantienen en solución al medir mediante HPLC-

ELSD. Mas del 75% de las oleinas se retuvieron por Z-Sep/C18 mientras cerca

del 100% se retuvo con Z-Sep+, dando los mejores resultados de todos los

sorbentes analizados en el experimento. Aqui se muestra la retención de oleinas

en diferentes sorbentes.

¿Como funciona el metodo QuEChERS?

Homogeneizar

Adición de CO2

Solido (dry ice)


Pesar 10 g de muestra en un tubo de centrifuga

de 50 mL con tapa roscada

Añadir 10 mL de Acetonitrilo & 100 µL

Internal Standard

Extracción

Agitar fuertemene 1 min

19


Añadir sulfato de magnesio, y tampon salino

Tampon tipo EN :

Trisodium citrate dihydrate; disodiumhydrogencitrate sesquihydrate, sodium chloride Tampo tipo AOAC:Na Acetate

Importante: Primero añadir la muestra en el vial y despues añadir la sal para prevenir la formación de „grumos“

Agitar fuertemente 1 min


5 min centrifugación

Sales

Agua de la muestra

Precipitado

Fase Acetonitrilo (para

usar en un analisis posterior)

Si es necesario : tomar 1 ml extracto para pesticidas acidos


Transferir la fase de acetonitrilo al tubo de centrifuga con sulfato de magnesio y el sorbente (en este caso Z-Sep/C18 or Z-Sep+ para muestras con alto contenido en

grasas)

Si es necesario: añadir GCB para muestras con alto

contenido en pigmentos

Purificación

agitar!

22


Usa el sobrenadante

incoloro para la cromatografia

Acidificar con 5 % de acido formico a pH 5

5 min centrifugación

Experimental: Comparación de C18/PSA y Z-Sep+ para la extracción y recuperación de analitos de aguacate

•Objectivo: Comparar la recuperación de analito en acetonitrilocon extractos de guacamole despues de la limpieza con C18/PSA

•and Z-Sep+

•Experimental:

• Extracción con acetonitrilo

• Limpieza con una mezcla de Z-Sep+ ó C18/PSA

• Nivel de pesticidas 100 ng/g

• Usando un Agilent 7890 GC-MS LVI at 5 uL

Extracción de aguacate usando acetonitrilo

•Conclusión

• Las mejores recuperacions se

dan siempre con el Z-Sep+

• Z-Sep+ es mas efectivo en eliminar las interferencias

causadas por la matriz para la lista de pesticidas

Name Z-Sep+ C18

trifluralin 87% 71%

alpha-BHC 84% 91%

Hexachlorobenzene 39% 44%

dimethoate 91% 84%

simazine 85% 74%

quintozene 71% 62%

gama-BHC 78% 75%

heptachlor 78% 58%

malathion 89% 74%

metolachlor 86% 74%

chlorpyrifos 102% 72%

endosulfan 94% 68%

DDT 69% 60%

methoxychlor 82% 42%

coumaphos 95% 68%

cyfluthrin 88% 0%

cypermethrin 85% 0%

deltamethrin 42% 0%

% Recuperación

Queda un

poco de color

Resultados:

No se puede detectar porlas interferencias de matriz

Pesticidas en manzanas y naranjas con QuEChERS

Green Apple

Pesticides from green apples at 50 ppb

0%

50%

100%

150%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 33 11 34 12 35 13 14 15

compound number

rec

ov

ery

Z-Sep/C18

PSA

Pesticides from green apples at 10 ppb

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

140%

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

compound number

rec

ov

ery

Z-Sep/C18

PSA

Indica mejores recuperacione con Z-Sep/C18

Comparación entre limpieza con Z-Sep/C18 ó PSA

2 sets de compuestos

• Conclusión

• La mejor eliminación de pigmentos

se da con Z-Sep/C18 PSA

• Recuperación comparable en

muchos casos.

Z-Sep/C18PSA

Problemas y preguntas frecuentes

¿Por que se usa acetonitrilo y formico en el metodo de limpieza de algunas drogas veterinarias?

�El Acetonitrilo es un agente precipitante de proteinas muy comun cuando se

preparan muestras biologicas para analisis por LC-MS. El precipitado de proteinas

resultante se separa facilmente por centrifugación.

�Se usa un mayor porcentage de acetonitrilo al usar Z-Sep+ para evitar la retención de los compuestos mas hidrofobicos, dada la presencia the grupos

hidrofobicos en la superficie.

�La adición de formico al 1-2% al extracto de acetonitrilo antes de la etapa de

limpieza, es critica por que el formico es una base de Lewis mas fuerte que

muchos grupos carboxilo (-COOH) que se encuentran en compuestos acidos

(inhibiendo la retención del analito en la fase Z-Sep+); pero no tan fuerte como los

restos fosfatos encontrados en los fosfolipidos; y 2) el bajo pH neutraliza la actividad del silanol residual en la superficie de la silica, eliminando la

interacción secundaria de intercambio cationico con los compuestos basicos de

interes.


Puedo incrementar la sesibilidad de mi ensayo, incrementando la cantidad de muestra ó concentrando(evaporación y reconstitución) el sobrenadante del Z-Sep+?

La concentratión/evaporación del sobrenadante puede ser una buena opción si el

procedimiento no afecta la estabilidad de los compuestos. Incrementar el tamaño

de muestra es posible siempre que el extracto resultante este suficientemenete

limpio para el analisis por equipos de LC-MS.


¿Puede la fase Z-Sep+ usarse como cartuchos de SPE ó 96-well plates?

La fas eZ-Sep+ puede usar en cartuchos tipo SPE y 96-well plates para

compuestos no acidos y que no formen quelatos.


Precaución: Baja recuperación por quelatos acidos y compuestos quelato:

Algunos quelatos acidos y compuestos quelato pueden dar bajas recuperaciones

cuando se usa el metodo primario(1% de formico y Acetonitrilo).

Grupos funcionales tipo quelato que pueden dar bajar recuperaciónes: Beta-

hydroxy caroboxylic acids, 1,3-Diketone type compounds, Beta-hydroxy ketones,

1,3-Diol type compounds.

Sumario

• Supel QuE Z-Sep/C18 y Z-Sep+ combinan la quimica del C18 y la silica recubierta de Zirconio para la eliminación de interferenciashidrofobicas en nuestras muestras.

• Supel QuE Z-Sep/C18 Z-Sep+ eliminan de forma efectiva mas grasa y

color de las muestras que las tradicionales fases tipo QuEChERSpara metodos LC-MS, y pueden reemplazar a las fases C18 y PSA en los metodos actuales sin un desarrolo de metodo adicional.

• La tecnologia Z-Sep es util para el analisis de residuos de pesticidasen alimentos y residuos de drogas veterinarias en tejido animal.

• En un estudio buscando la retención de mono-, di- y tri-oleinas, mas del 75% de las oleinas fueron retenidas por Z-Sep/C18 mientrasque cerca del 100% fueron retenidas por Z-Sep+, dando los mejoresresultados de todos los sorbentes comparados en el experimento.

• La técnica Z-Sep emplea “Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe”metodologia asociada al QuEChERS.

Gracias por vuestra atención

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