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Brechas de información cubiertas en relación al

patógeno P. salmonis :

Cepario, caracterización genómica, ubicación geográfica, ciclos, patogenicidad

Ideas y recomendaciones para vigilancia y control.

Diciembre, 2018Alvaro Labra M. MV., MSc.Pontificia Universidad Católica de Valparaí[email protected]

mailto:[email protected]

“BASES TÉCNICAS PARA LA CONSOLIDACIÓN DE

UN CEPARIO NACIONAL DE Piscirickettsia

salmonis DEBIDAMENTE CARACTERIZADO”

“ESTUDIO INTEGRAL DE LAS BASES BIOLÓGICAS

Y MOLECULARES DEL CICLO DE VIDA DE

Piscirickettsia salmonis EN EL CONTEXTO DE

UNA APROXIMACIÓN EPIDEMIOLÓGICA PARA

DESARROLLAR ESTRATEGIAS QUE PERMITAN SU

CONTROL”

2015 2016 2017 2018 Mayo 2018 Junio 2018 Diciembre 2018 Junio 2019

AGENDA

Programa Cepario

Estructura administrativa y temporal

Principales logros

Preguntas respondidas

Ciclo de Vida

Objetivos

Principales resultados obtenidos a la fecha y sus proyecciones por WP

5

Definición de un procedimiento para el aislamiento de Piscirickettsia salmonis para el establecimiento de un cepario

oficial de la bacteria

Establecimiento de un cepario nacional de Piscirickettsia salmonis

debidamente caracterizado

Bases técnicas para el establecimiento de un cepario

nacional de Piscirickettsia salmonis debidamente caracterizado

Bases técnicas para la consolidación de un cepario nacional de

Piscirickettsia salmonisdebidamente caracterizado

•Dic 2015 - Jun 2016

•Sistema reproducible de aislamiento

•Aislamientos del año y recuperación de aislados del pasado

•Convenio con DSMZ para secuenciación y cierre de genomas

•Nov - Dic 2016

•Piloto para evaluar “in vivo” el rol de la salinidad en la virulencia

•Impacto de diferentes formas bacterianas en la patogenicidad

•Nov - Dic 2016 y Ene - Jun 2017

•Condiciones optimas de crecimiento “in vitro”

•Aislamientos del año y recuperación de aislados del pasado

•Caracterización genética de aislados mediante NGS

•Evaluación “in vivo” del rol de la salinidad en la patogenicidad

•Screening de potenciales vectores

•Screening de mecanismos de transmisión vertical

•Manual Operativo para el muestreo y manejo de P. salmonis

•Abril 2018 - Dic 2018

•Aislamientos del año

•Inicio de operación del cepario

•Caracterización genética mediante NGS

PROGRAMA CEPARIO

6

PROGRAMA CEPARIO

Principales Logros:

• Infraestructura y equipamiento adecuado para mantener el Cepario

• Sinergia operacional entre las dos unidades espejo (PUCV – UACh)

• Adecuadas capacidades profesionales y técnicas del personal

• 186 aislados provenientes de diferentes años, zonas geográficas, genogrupos yespecies con un significativo porcentaje de caracterización

• Eficiente sistema de transferencia de material (aislados) e informaciónrespectiva

7

PROGRAMA CEPARIO

Diferentes Especies / Cepas / Genogrupos o Aislados de Piscirickettsia?

Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de Piscirickettsia?

Adaptación a la salinidad

Adaptación a diferentes zonas geográficas? ¿Origen u Orígenes?

Adaptación a las diferentes especies de huéspedes?

Adaptación temporal?

Resistencia a antibióticos

¿Cómo podemos usar esta información para hacer un diagnóstico rápido y mejorarel manejo de la Piscirickettsiosis?


ESTATUS NUMERO

Genomas cerrados 22

Genomas en proceso de cierre 22

Genomas en proceso de secuenciación 14

Total 58

12

PROGRAMA CEPARIO









Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de

Piscirickettsia?

Condiciones experimentales:• Técnica de citometría de flujo.,• Cultivo en medio liquido de P. salmonis• Análisis de las poblaciones de P. salmonis tanto en fase

exponencial de crecimiento como en fase estacionaria tardía (11 días de cultivo).

• Para cada condición se analizó la población bacteriana sin filtrar y aquella filtrada por un filtro de 0,22 µm.

Resultados:• Fase exponencial de crecimiento se observa una sola población

bacteriana, la que es retenida al ser filtrada a 0,22µm. • Fase estacionaria tardía heterogeneidad en la población al

menos 3 subpoblaciones de distinto tamaño y complejidad • Post-filtración permitió identificar a la población de

microcélulas la que fue enriquecida por la filtración a 0,22µm.

Infecciones únicas o Coinfecciones por diferentes tipos de

Piscirickettsia?

Condiciones experimentales:• Reactivación desde -80 en medio sin sangre (UACh)• Reactivación desde -80 en medio con sangre (PUCV)• Secuenciación por Pac-Bio, corrección por Ilumina y ensamble en DSMZ• Secuenciación directa desde el pez

Resultados pendientes:• Resecuenciaciones para comprobar• Amplificaciones de genes únicos por Grupo

IDs Psal IDs AUS Draft DSMZ

Genoma Completo

Psal-010* AUS-007 LF EM

Psal-069 AUS-023 EM


Psal-005 AUS-040 EM

Psal-011 AUS-041 LF EM


Psal-013 AUS-044 LF

Psal-014 AUS-045 EM

Psal-018 AUS-072 LF

Psal-070 AUS-100 EM

Psal-025 AUS-005 LF (NCBI) EM

Psal-008* AUS-008 En proceso En proceso

Psal-105 5265 (Noruega)

LF/EM

15

PROGRAMA CEPARIO









Evaluación de Patogenicidad in vivo y efecto de la

salinidad

Condiciones experimentales:

• Determinación de DL-50, previo al experimento de desafío.• Infección por cohabitación con peces Troyanos.• Dos aislados de P. salmonis previamente animalizadas• Dos salinidades (una correspondiente a agua estuarina y otra

equivalente a agua de mar)• Recuperación de peces enfermos y análisis anatomo-

patológicos.• Análisis de mortalidad y evaluación de resultados.• Peces: Salmón del Atlántico (S. salar) no vacunados y sanos

Cepa: desove nacional Rango de peso: parr SO de 60-70 g Densidad de cultivo: 12 kg/m3

Estuario Mar Estuario Mar




Cepa “EM-90” Cepa “EM-90” Cepa “LF-89” Cepa “LF-89”

Triplicados(Análisis de Mortalidad)

Muestreos

(Análisis génico)

35 peces x estanque

Adaptación a diferentes zonas geográficas?

¿Origen u Orígenes?

Se necesitan mas aislados de otros orígenes para evaluar este punto

Adaptación a las diferentes especies de

huéspedes?

20

PROGRAMA CEPARIO









Resistencia antibióticos

Florfenicol Oxytretracycline Polymyxin Kanamycin Streptomycin Chloramphenicol Tetracycline

P sal 103 (8465) 0,4 µg/ml 0,4 µg/ml 128 µg/ml 128 µg/ml 64 µg/ml 1 µg/ml 1 µg/ml

P sal 104 (8670) 0,4 µg/ml 0,4 µg/ml 128 µg/ml 128 µg/ml 64 µg/ml 1 µg/ml 1 µg/ml

P sal 008 0,8 µg/ml 0,4 µg/ml 16 µg/ml 4 µg/ml 8 µg/ml 3,2 µg/ml 0,8 µg/ml

P sal 025 1,6 µg/ml 0,4 µg/ml 16 µg/ml 4 µg/ml 16 µg/ml 3,2 µg/ml <0,4 µg/ml








P sal LF ATCC <0,1 µg/ml <0,1 µg/ml Repeat Repeat <2 µg/ml Repeat <0,05 µg/ml

P sal 03 <0,1 µg/ml 0,4 µg/ml 256 µg/ml 64 µg/ml 256 µg/ml 0,4 µg/ml 0,8 µg/ml


P sal 02 0,8 µg/ml 0,4 µg/ml 512 µg/ml 128 µg/ml >1024 µg/ml 25,6 µg/ml <0,1 µg/ml

P sal 027 0,2 µg/ml 0,2 µg/ml Repeat Repeat 16 µg/ml Repeat 0,1 µg/ml


CMI a diferentes antibióticos de P. salmonis (Medio IFOP 7 días)


Erythromycin Carbenicillin Imipenem Ceftazidime Gentamicin Ciprofloxacin Ampicillin

P sal 103 (8465) 32 µg/ml 1024 µg/ml 128 µg/ml 4 µg/ml 64 µg/ml <1 µg/ml <4 µg/ml

P sal 104 (8670) 16 µg/ml 1024 µg/ml 256 µg/ml 8 µg/ml 64 µg/ml <1 µg/ml <4 µg/ml

P sal 008 16 µg/ml 2 µg/ml 128 µg/ml <1 µg/ml 4 µg/ml 0,4 µg/ml <4 µg/ml

P sal 025 32 µg/ml 32 µg/ml 512 µg/ml <1 µg/ml 4 µg/ml 0,4 µg/ml 1024 µg/ml

P sal 005 8 µg/ml 2048 µg/ml >128 µg/ml 512 µg/ml 4 µg/ml <1 µg/ml 2048 µg/ml

P sal 006 8 µg/ml 2048 µg/ml >128 µg/ml 512 µg/ml 4 µg/ml <1 µg/ml 2048 µg/ml

P sal 013 32 µg/ml <4 µg/ml <2 µg/ml Repeat 2 µg/ml <0,1 µg/ml <4 µg/ml

P sal 018 32 µg/ml <4 µg/ml <2 µg/ml Repeat 2 µg/ml 0,4 µg/ml <4 µg/ml

P sal 010 4 µg/ml <4 µg/ml <2 µg/ml <1 µg/ml 8 µg/ml <0,05 µg/ml <4 µg/ml

P sal 069 4 µg/ml <4 µg/ml <2 µg/ml <1 µg/ml 8 µg/ml <0,05 µg/ml <4 µg/ml

P sal 002 8 µg/ml 2048 µg/ml 512 µg/ml 512 µg/ml 8 µg/ml <0,05 µg/ml 1024 µg/ml

P sal LF ATCC Repeat <2 µg/ml Repeat <1 µg/ml 4 µg/ml <0,05 µg/ml <2 µg/ml

P sal 03 16 µg/ml 128 µg/ml >512 µg/ml >512 µg/ml 32 µg/ml 0,8 µg/ml 2048 µg/ml

P sal 051 8 µg/ml <4 µg/ml <1 µg/ml 32 µg/ml 8 µg/ml Repeat <4 µg/ml

P sal 02 32 µg/ml 8 µg/ml 16 µg/ml >512 µg/ml 16 µg/ml 0,4 µg/ml 16 µg/ml

P sal 027 Repeat <4 µg/ml <1 µg/ml Repeat 8 µg/ml Repeat <4 µg/ml

P sal 003 16 µg/ml <4 µg/ml <1 µg/ml 64 µg/ml 16 µg/ml 12,8 µg/ml <4 µg/ml

CMI a diferentes antibióticos de P. salmonis (Medio IFOP 7 días)


24

PROGRAMA CEPARIO









¿Cómo podemos usar esta información para hacer un

diagnóstico rápido y mejorar el manejo de la

Piscirickettsiosis?

Centro de cultivo (+)

Diagnóstico y Aislamiento

Cepario Nacional

Evaluación fenotípica

Opciones de Tratamiento



Piscirickettsiosis?



Cepario Nacional


Opciones de Tratamiento

Base de Datos de genomas

Predicción de origen,

resistencia ATB, virulencia



Piscirickettsiosis?



Cepario Nacional


Base de Datos de genomas

Predicción de origen,

resistencia ATB, virulencia

Extracción de ADN y secuenciación directa

Rápida mejora de las opciones de tratamiento

Prevención de la enfermedad

Mejora de la Base de datos

Ciclo de vida de Piscirickettsia salmonis

WP 1 WP 2 WP 3 WP 4

Variables ambientales de

supervivencia y viabilidad.

(Microcosmos).

Mecanismos de mantención y

propagación de la bacteria en el

mar.

Bancos y vectores de la bacteria

en el ambiente marino.

Asociación molecular y

epidemiológica entre potenciales

fuentes de infección y la

enfermedad.

Secuenciación masiva de nuevos

aislados

Analizar el core genoma y

pangenoma en el contexto de

patogenicidad y virulencia.

Ampliar el sistema de clasificación

de cepas por virulencia, y

patogenicidad..

Expresión de genes asociados a

patogenicidad y virulencia por

transcriptoma de “cepas tipo»

Elementos genéticos en la

resistencia a antibióticos s en el

core y pangenoma

Análisis transcriptómico, para

diferenciar resistencia fenotípica

de adquirida.

Rol l de los plásmidos en el

fenómeno de resistencia en

diferentes cepas

Predecir en los aislados la

selección de nuevos elementos

genéticos involucrados en la

resistencia a los dos antibióticos

tipo.

Establecer condiciones de edición

genética de marcadores putativos

de patogenicidad.

Consolidar el sistema

CRISPR/Cas9 como mecanismo

de edición génica en P. salmonis

Exosomas de sangre y sueros de

peces natural y artificialmente

infectados

RNAs pequeños (sRNA y

miRNAs) como bio marcadores

del progreso de la enfermedad .

Estudiar el ciclo de vida de Piscirickettsia salmonis de manera integral, estableciendo aspectos claves involucrados

en su transmisión vectorial y su supervivencia.

Asimismo, conocer las bases moleculares de la virulencia bacteriana, evaluando el impacto de factores ambientales en la

aparición de variantes genéticas involucradas en el desarrollo de la enfermedad, para establecer modelos predictivos y

estrategias alternativas que favorezcan su control.

WP1: Vectores y bancos de Piscirickettsia salmonis

Piscirickettsia salmonis es capaz mantenerse en el mucus de salmón del Atlántico.

Las pseudoheces podrían ser un vehículo de P. salmonis soló en peces con signos clínicos infecciosos

severos. ∞ P. salmonis es capaz de infectar y multiplicarse en el protozoo A. castellani.

P. samonis evade la fusión fagosoma-lisosoma para mantenerse en el protozoo A. castellani. ∞ P. salmonis no crece por si sola en medio de cultivo para microalgas.

P. salmonis crece en presencia de microalgas, posiblemente éstas entregan algún factor decrecimiento requerido por la bacteria.

La bacteria no infecta células de microalgas, solamente crece adherida a la pared o a su alrededor. ∞ P. salmonis produce biofilms en condiciones in vitro y se mantiene viva al menos por 15 días en

condiciones in vitro.

Se detectó el ADN de P. salmonis en el biofilm de algunas superficies inertes de estructuras de cultivo.

∞

GRUPOS DE TRABAJO (WPs) Logros Destacables

WP 1: Vectores y fuentes de mantención del patógeno

P.sal se replica en amebas del ámbito acuícola Sobrevive en comensalismo con algas marinas Sobrevive, se replica, mantiene viabilidad en agua pura

WP 2: Definición del core y pangenoma de la bacteria

Alta complejidad genómica Hasta hoy, se mantiene estables los dos genogrupos Dinamismo genético hace difícil definir cepa

WP 3: Establecer el resistoma de P. salmonis

Hay inducción de resistencia a antibióticos generalizada No es evidente para florfenicol y oxitetraciclina Los dos antibióticos NO llegan a la bacteria intra pez

WP 4: Marcadores de patogenicidad y virulencia

Promisorios marcadores de la evolución de la enfermedad miRNAs, fuente de diagnóstico precoz no invasivo (sueros) Edición génica como segura alternativa de eficientes vacunas vivas

WP2: Definición de Core y Pangenoma de Piscirickettsia salmonis

Pan-genoma

Core-genoma

Genoma variable

Familias de genes compartidas por todos los genomas

Genes específicos del genoma

WP3: Resistoma de Piscirickettsia salmonis

Son todos los genes de resistencia a los antibióticos o sus precurcores tanto en bacterias patógenas como ambientales.

Descifrar el resistoma de P. salmonis a los antibióticos florfenicol y oxitetraciclina permitirá determinar las variantes genéticas que

podrían tornarse resistentes con los suscesivos tratamientos

Resistencia Genotípica Resistencia Fenotípica

1. MIC’s de cada aislado obtenido desde el pez y

desde el cultivo

2. Experimento evolución en concentraciones

crecientes de antibióticos en P. salmonis.

WP4: Marcadores asociados a patogenicidad y virulencia de

Piscirickettsia salmonis

• Condiciones de edición genética (CRISP/Cas9)• Purificación de exosomas desde sangre• Evaluación de (sRNA) como biomarcadores de la enfermedad y diseño de estrategias terapéuticas

Resultados:

Se diseñó un mecanismo funcional y eficiente de edición génica para P. salmonis basado en el sistema

CRISP/CAS

Proyección: Edición genética inactivación de genes de virulencia Vacunas vivas

Identificación de sRNA desde suero de peces como marcadores para diagnóstico temprano de infección

con P. salmonis.

Proyección: diagnóstico no invasivo/seguimiento del desarrollo de la enfermedad a nivel pre-clínico.

Equipo de TrabajoPUCV UACH UNAB DSMZ

• Sergio Marshall• Fernando Gomez• Jorge Olivares• Alvaro Labra• Luis Mercado• Vitalia Henriquez• Marisela Carmona• Carolina Salazar• Nicolás Ojeda• Ninoska Delagado• Bruno Milesi• Oscar Arredondo• Cristian Muñoz• Omar Luna • Martin Galaz• Felipe Vasquez

• Jaime Figueroa• Denise Haussmann• Guillermo Nourdin• Fernando Lagos• Camila Solis• Jose Blanco

• Rubén Avendaño• Cristian Valenzuela• Hector Levipan• Diana Tapia• Rute Irgang• Astrid Zamorano• Eloisa Arias

• Jörg Overmann• Isabel Schober• Boyke Bunk• Sixing Huang

Gracias

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Ab

sorv

anci

a [6

20

nm

]

Horas

P. Salmonis en Mucus J1

LF89

Ps103

Ps104

M+M

MEDIO

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

0 50 100 150 200Li

ve/D

ead

[b

ac/m

L]

Horas

LIVE/DEAD BacLight

LF89-J1-V

LF89-J1-M

Ps103-J1-V

Ps103-J1-M

Ps104-J1-V

Ps104-J1-M

Cinética de ingreso de P. salmonis a A. castellanii.

La flecha negra indica a P. salmonis teñidacon R18 (membrana).

A-E: fagocitos de P. salmonis mediada porseudópodos.

F-J: Ingreso de P. salmonis a la vacuoladigestiva de A. castellanii.

Agrupaciones de P. salmonis en elinterior de A. castellanii

Microscopía Confocal: P. salmonisen verde (SRS Fouorotest) y laameba en rojo (R18)

P. salmonis no se multiplica por si sola en medios de cultivo paramicroalgas.

Co-cultivos líquidos de P. salmonis a microalgas.

Cultivos por 10 días.

P. salmonis sembrada en medios para microalgas

No se observó crecimiento

P. salmonis crece en co-cultivo con las microalgas C. vulgaris, C.protothecoides, C. reinhardtii y T. suecica

P. salmonis en co-cultivo con C. vulgarisVerde: P. salmonis; Rojo: cloroplasto microalga

P. salmonis en co-cultivo con C. protothecoidesVerde: P. salmonis; Rojo: cloroplasto microalga

Determinar en condiciones in vitro el rol del biofilm en la supervivencia de P. salmonis

Figura 3 Visualización en eltiempo de la formación debiopelículas en medio AUSTRAL-SRS mediante tinción con el kitLIVE/DEAD en placas de 96pocillos para P. salmonis Psal-103y Psal-104. Cada imagenrepresenta un pocilloindependiente en la microplaca yla barra blanca de escala(esquina inferior derecha sobrecada imagen) es de 100 μm. Lasimágenes son representativas decuatro experimentos conducidosindependientemente.

Determinar en condiciones in vitro el rol del biofilm en la supervivencia de P. salmonis

Figura 4 Visualización en el tiempo dela formación de biopelículas en aguade mar mediante tinción con el kitLIVE/DEAD en placas de 96 pocillospara P. salmonis Psal-103 y Psal-104.Cada imagen representa un pocilloindependiente en la microplaca y labarra blanca de escala (esquina inferiorderecha sobre cada imagen) es de 100μm. Las imágenes son representativasde cuatro experimentos conducidosindependientemente.

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