New ACTIVIDAD LIPOLÍTICA EN CULTIVOS DE · 2011. 5. 11. · ACTIVIDAD LIPOLÍTICA EN CULTIVOS DE...
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ACTIVIDAD LIPOLÍTICA EN CULTIVOS DE
Kluyveromyces marxianusUniversidadede Vigo
M. A. Longo, B. Bouzas, M. Costas, F.J. Deive
Dpto. de Ingeniería Química, Universidad de VigoCampus Lagoas-Marcosende, 36200 Vigo
Tel.: 986 81 39 90, Fax: 986 81 23 80 E-mail: [email protected] http://bioprocesos.uvigo.es
Enzimas lipolíticas
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Reacciones hidrólisis y síntesisAmplio rango de especificidad de sustratoRegio- y enantioselectividadEstables a alta temperatura y medio orgánicoOperación en condiciones suaves de P y T
LIPASAS / ESTERASAS
Enzimas lipolíticas
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
APLICACIONES
ALIMENTARIA(margarinas, panadería)
DETERGENTES(eliminación de
manchas grasas)PAPEL
(eliminación depósitos resina)
TRATAMIENTOAGUAS RESIDUALES
FARMACÉUTICAQUIMICA FINACOSMÉTICA
CURTIDO(desengrasado
de pieles)
Tendencias
Importante esfuerzo investigador
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Optimización y escalado de la producciónPurificación y caracterizaciónAplicaciones (principalmente medio orgánico)Estabilidad: inmovilización, modificaciónClonación y expresión de genesScreening de nuevos organismos productores (mesófilos, extremófilos)
Objetivos
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Estudio de la producción de enzimas lipolíticas por Kluyveromyces marxianus
Condiciones de cultivo:
- Composición del medio
- Aireación / Agitación
Estudio preliminar de propiedades
Materiales y métodosMicroorganismo, medio y condiciones de cultivo
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Extracto levadura (3 g/L)Extracto malta (3 g/L)Glucosa (10 g/L)Peptona micológica (5 g/L)Agar (20 g/L)
Cultivo en placa (30ºC, pH 4,5)
Kluyveromyces marxianus CECT 1018Cepa
Detección actividad lipasa/esterasa: + tributirina (10 g/L)
Glucosa (20 g/L)Extracto levadura (3 g/L)Extracto malta (3 g/L)Peptona micológica (5 g/L)KH2PO4 (1 g/L)
Materiales y métodosMicroorganismo, medio y condiciones de cultivo
Cultivo en medio líquido (pH 4,5)
Matraces 250 mL / 150 mLmedio, tapones celulosa30ºC120 rpm (incubador orbital)
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Materiales y métodosDeterminaciones analíticas
Biomasa: turbidimetría 570 nmLipasa: valoración automática (pHstato), sustrato tributirina
Análisis
Centrifugado 10000 rpm, 10 min, 4ºCResuspensión biomasa, medida actividad sobrenadante
Tratamiento muestrasIntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Halos transparentes alrededor de las
colonias
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Detección de actividad lipolíticaScreening - Cultivo en placas agar/tributirina
Actividad lipasa/esterasa7 días de cultivoDilución 1:106
Cultivo en medio líquidoEfecto de la adición de inductores
Acido oleico (10 mM)Acido palmítico (10 mM)Aceite de oliva (10 g/L)Aceite de girasol (10 g/L)Aceite de maíz (10 g/L)Tributirina (10 g/L)Glicerol (10 g/L)
La producción de lipasas/esterasas suele verse favorecida por la presencia de compuestos
lipídicos en el medio (inductores)
Efecto variable según cepa
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Cultivo en medio líquidoEfecto de la adición de inductores
Biomasa: 2-4 g/L
Adición de tributirinapara producción de
lipasa
Tiempo (días)
0 2 4 6 8 10 12 14
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
Biom
asa
(mg/
mL)
0
4
8
12
16
20
24
28 Acido oleicoAcido palmíticoAceite olivaAceite girasolAceite maízGlicerolTributirina
Actividad: < 10 U/mL
x 4x 4--88
x 6x 6
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Acido oleico: 16 g/L (x 4-8)
Tributirina: 60-70 U/mL (x 6)
Cultivo en medio líquidoEfecto de la concentración de tributirina
Concentración tributirina (g/L)2.5 5 10 15 20 30
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
Biom
asa
(mg/
mL)
0
1
2
3
Biomasa: 1,5-2 g/L
Concentración de tributirina en el medio = 5 g/L
Actividad: 40-80 U/mL
30%30%
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
[TB] = 5 g/L: 30% superior
Peptona sojaPeptona micológicaPeptona caseínaExtracto carneExtracto levaduraMixta compleja
UreaAsparraginaGlicinaKNO3
(NH4)2SO4
Cultivo en medio líquidoSelección de fuentes de carbono y nitrógeno
Fuentes C
GlucosaFructosaGlicerolAlmidónGlucosa-Almidón (80:20)
SacarosaMaltosaLactosa
Fuentes N
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Cultivo en medio líquidoSelección de la fuente de carbono
Glucosa
Fructosa
Sacarosa
Maltosa
Lactosa
Glu-AlmAlmidón
Glicerol
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
Biom
asa
(mg/
mL)
0
1
2
3
Mono- y disacáridos (Glu, Fru, Lac, Sac)
Mayor crecimiento (1-2 g/L)Mayor actividad (65-80 U/mL)
Maltosa, glicerol, almidónBajo crecimiento (0,5 g/L) y
actividad (20 U/mL)
Fuente CGlucosa
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Cultivo en medio líquidoSelección de la fuente de nitrógeno
Mixta (L
M)
Extr. carne
Extr. levadura
Pept. caseína
Pept. mico
l.
Pept. soja
(NH4)2SO4KNO3
Glicina
Asparragina
Urea
Act
ivid
ad li
polít
ica
(U/m
L)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Bio
mas
a (m
g/m
L)
0
1
2
3
Fuentes complejasMayor crecimiento (0,6-2,2 g/L)
y actividad (50-160 U/mL)
Fuentes inorgánicas, aminoácidos
Baja biomasa y actividad
Fuente NPeptona de soja
30%30%
100%100%
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Peptona soja
Cultivo en medio líquidoConcentración fuentes C, N, P
• Actividad extracelular• Biomasa (Actividad intracelular)
• [Glucosa]• [Peptona soja]• [KH2PO4]
Diseño factorial rotable 23 (α =1,68)
Variables independientes
Variables objetivo
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos- α - 1 0 + 1 + α
Glucosa [C] 6 20 40 60 74
Peptona de soja [N] 6 20 40 60 74
KH2PO4 [P] 0 1 2,5 4 5
Valores reales (g/L) de las variables codificadas
Cultivo en medio líquidoConcentración fuentes C, N, P – Biomasa
1
2
3
4
5
6
010
2030
4050
6070
80
010
2030
4050
6070
Biom
asa
(mg/
mL)
Glucos
a (g/L
)
Peptona de soja (g/L)
Glucosa (g/L)10 20 30 40 50 60 70
Pept
ona
de s
oja
(g/L
)
10
20
30
40
50
60
70
1.8 2.0
2.0
2.22.4
2.62.8
3.03.2
3.43.6
3.84.0
4.24.4
4.64.8
Variables significativas (P < 0,1)[C], [N]
[Biomasa] (g/L) = 1,33 + 0,02 [C] – 0,0002 [C]2 + 0,02 [N] – 0.0003 [N]2 + 0,0006 [C][N]
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
[Glucosa] = 74 g/L[Peptona soja] = 74 g/L
Cultivo en medio líquidoConcentración fuentes C, N, P – Actividad extracelular
0
20
40
60
80
100
120
140
160
010
2030
4050
6070
80
010203040506070
Lipa
sa (U
/mL)
Glucos
a (g/
L)
Peptona de soja (g/L)
Glucosa (g/L)
10 20 30 40 50 60 70
Pept
ona
de s
oja
(g/L
)
10
20
30
40
50
60
70
80
60
45
65
50
70
55
75
6065
7075
80 85 90 95100
135130125120110115
105
[Lipasa] (U/mL) = 54,1 – 0,56 [C] + 0,02 [C]2 + 1,71 [N] – 0,02 [N]2
Variables significativas (P < 0,1)[C], [N]
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
[Glucosa] = 74 g/L[Peptona soja] = 35 g/L
Cultivo en medio líquidoEfecto aireación - agitación
Variación del volumen de carga en los matraces (aireación)
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Volumen de carga (mL)0 30 60 90 120 150
Activ
idad
lipo
lític
a (U
/mL)
0
20
40
60
80
Bio
mas
a (m
g/m
L)
0
1
2
3
4
Biomasa favorecida al aumentar la aireación
(< volumen carga)
Escasa variación en actividad lipolítica, en
el rango ensayado
150 rpm
Cultivo en medio líquidoEfecto aireación - agitación
Variación de la velocidad de agitaciónIntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Biomasa y actividad favorecidas a120-150 rpm
Descenso a agitación elevada (180 rpm),
posible estrés celular
Agitación (rpm)60 120 150 180
Act
ivid
ad li
polít
ica
(U/m
L)0
20
40
60
80
Bio
mas
a (m
g/m
L)
0
1
2
150 mL
Propiedades de la enzima obtenida
Propiedades de interés
Estabilidad térmica
Estabilidad pH
Tolerancia a disolventes orgánicos
Estudio del crudo enzimático
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Propiedades de la enzima obtenidaEstabilidad térmica en medio acuoso
Tiempo (días)0 2 4 6 8 10
Activ
idad
resi
dual
(a/a
0)
0.20
0.40
0.60
0.80
0.10
1.00
Actividad residual del 80% durante 9 días a 50ºC
80%80%
50ºC, pH 4.0IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Propiedades de la enzima obtenidaEstabilidad térmica en medio acuoso
Tiempo (min)0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Act
ivid
ad re
sidu
al (a
/a0)
0.20
0.400.500.60
0.80
0.10
1.00
tt1/21/2 = 16 = 16 minmin
100ºC, pH 4.0
Tiempo de vida media superior a otras lipasas mesofílicas (p.ej. C. rugosa) y
similar a algunas termofílicas
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Propiedades de la enzima obtenidaEstabilidad térmica en medio acuoso
Ek
E k
E 22
21
1 αα ⎯→⎯⎯→⎯ 1
( ) ( ) ( ) 221 +−−
−−
−−
+= ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡ ααααα tk-exp kk
ktk-exp kk
kkk
k1a 2
12
11
12
22
12
11
Ajuste a modelo de desactivación en serie (2 etapas)
Posible existencia de varias especies con actividad lipolítica
k1 = 0,11 min-1
k2 = 0,01 min-1
α1 = 0,43α2 = 0
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
pH2 3 4 5 6
Act
ivid
ad re
sidu
al (%
)
0
20
40
60
80
100
120
Propiedades de la enzima obtenidaEstabilidad relativa a pH
24 h, 25ºC
Actividad residual 80-100% a pHinferior a 6,0
(poco común en lipasas conocidas)
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Propiedades de la enzima obtenidaTolerancia a disolventes orgánicos
Tiempo (días)0 1 2 3 4 5 6 7
Act
ivid
ad r
esid
ual (
a/a 0
)
0.20
0.40
0.60
0.80
0.10
1.00
25ºC, agitación
Disolventes (80%):n-hexanon-heptanociclohexano
> 70%> 70%
Actividad residual superior al 70% durante 6 días en presencia de
disolventes orgánicos
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Conclusiones
Actividad lipolítica en K. marxianus
Presenta propiedades prometedoras: termoestable, resistente a pH ácido y disolventes orgánicos
Medio de cultivo (enzima extracelular): tributirina (5 g/L), glucosa (74 g/L), peptona de soja (35 g/L)
Aireación y agitación (enzima extracelular): favorables niveles medio-altos
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Perspectivas futuras
Protocolo purificación ⇒ Secuenciación
Caracterización: PM, pI, pH y T óptimos, estabilidad, especificidad
Aplicaciones: reacciones de hidrólisis y de síntesis
Escalado de la producción
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Agradecimientos
IntroducciónIntroducción
ObjetivosObjetivos
MétodosMétodos
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
PerspectivasPerspectivas
AgradecimientosAgradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por la Xunta de Galicia
(PGIDT03PXIB30103PR)
ACTIVIDAD LIPOLÍTICA EN CULTIVOS DE
Kluyveromyces marxianusUniversidadede Vigo
M. A. Longo, B. Bouzas, M. Costas, F.J. Deive
Dpto. de Ingeniería Química, Universidad de VigoCampus Lagoas-Marcosende, 36200 Vigo
Tel.: 986 81 39 90, Fax: 986 81 23 80 E-mail: [email protected] http://bioprocesos.uvigo.es