Muestreo en Playa de Santa Elena 1

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Muestreo en playa de santa Elena

Cristhian Paguay Cindy QuindeHERRAMIENTAS

19/12/2015

TABLA DE CONTENIDO

ContenidoINTRODUCCION..................................................................................................................................0

CAPITULO 1........................................................................................................................................1

ORGANISMOS MARINOS................................................................................................................1

TEMPERATURA...............................................................................................................................3

EL ESTUDIO TOMA DE MUESTRAS..................................................................................................7

CAPITULO2.......................................................................................................................................11

ESTUDIOS DE MICROORGANISMO MARINOS...............................................................................11

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION.............................................................................................12

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS EPIBIONTAS DE INVERTEBRADOS..........................................................................................................................15

OBSERVACIONES DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA..................................................................16

PORCENTAJE DE CEPAS............................................................................................................18

CONSERVACIONDE DE LOS MICROORGANISMOS........................................................................20

VIABILIDAD...................................................................................................................................20

CAPITULO3.......................................................................................................................................22

RESULTADOS....................................................................................................................................22

DISCUSION.......................................................................................................................................24

CONCLUSION....................................................................................................................................25

BIBIOGRAFIA....................................................................................................................................26

TABLA DE IMÁGENES

IMAGEN 1 ZONA DEL MUESTREO.......................................................................................................1IMAGEN 2 ZONA COSTERA.................................................................................................................3IMAGEN 3 MUESTREO........................................................................................................................4IMAGEN 4 SEDIMENTO......................................................................................................................6IMAGEN 6 TOMA DE MUESTRA.........................................................................................................7IMAGEN 7 LIMPIEZA DE LA MUESTRA..............................................................................................11IMAGEN 8 AISLAMIENTO..................................................................................................................12IMAGEN 9 MUESTRA AISLADA.........................................................................................................15IMAGEN 10 COLORACION DE LAS BACTERIAS..................................................................................16

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IMAGEN 11 MICROOSCOPIA ELECTRONICA.....................................................................................16IMAGEN 12 CLASIFICACION DE LOS ORGANISMOS..........................................................................18

TABLAS

TABLA 1 PRESENCIA DE BACTERIAS....................................................................................................2TABLA 2 CONSTITUYENTES INORGANICOS.........................................................................................4TABLA 3 MUESTRAS DETECTADAS......................................................................................................5TABLA 4 CUERPOS DE AGUA EN FUNCION DE LA SALINIDAD.............................................................7TABLA 5 MICROORGANISMOS AISLADOS...........................................................................................8TABLA 6 GENEROS DE MICROORGANISMOS......................................................................................9TABLA 7 ELEMENTOS PARA CULTIVAR.............................................................................................12Tabla 8 COMPOSICION DE IONES PARA CUERPO DE AGUA..............................................................13TABLA 9 COMPOSICION TAXONOMICA............................................................................................17TABLA 10 MATRIZ DE CORRELACIONES............................................................................................19

TABLA DE ECUACIONES

ECUACIONES 1 LEY DE STOKES..........................................................................................................1ECUACIONES 2 TEMPERARURA DEL AGUA........................................................................................3ECUACIONES 4 MAS DE SAL..............................................................................................................5ECUACIONES 5 COEFICIENTE DE CORRELACION................................................................................8ECUACIONES 6 SALINIDAD ABSOLUTA............................................................................................11ECUACIONES 7 DETERMINACION DEL MUESTREO..........................................................................12ECUACIONES 8 DETERMINACION DE LA CLORINIDAD.....................................................................15ECUACIONES 9 PROBABILIDAD DE EFICIENCIA................................................................................16ECUACIONES 10 FRECUENCIA ACUMULADA...................................................................................18ECUACIONES 11 PROBABILIDAD INDEPENDIENTE DE LOS RESULTADOS.........................................22

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INTRODUCCION

La Provincia de Santa Elena tiene una extensión de 3.762,8 km2, con una población residente de 238,889 habitantes (1.97 % del total nacional) y una población flotante superior a 200,000 personas en época alta de turismo. Posee un clima muy agradable que puede ser disfrutado todo el año, el cual es influenciado por la corriente cálida de El Niño (Diciembre – Abril desde Panamá hacia la zona central del Ecuador) y la corriente fría de Humboldt (Mayo – Noviembre).

La temperatura promedio es de 24,5 °C, con una temperatura mínima de 15 °C entre Julio y Agosto, y una temperatura máxima de 39,5 °C entre Febrero y Marzo

La Provincia de Santa Elena es una de las zonas costeras más importante del Ecuador, rodeada de playas que posee una fauna y flora muy diversa. Su ecosistema marino es muy variado, en él podemos encontrar: fitoplancton, zooplancton, algas, esponjas, celentéreos, equinodermos y moluscos.

Posee una gran producción pesquera, debido a que en sus aguas se encuentran grandes cantidades de diatomeas y dinoflagelados. A continuación se procederá a describir el lugar que será tomado como punto de investigación para realizar el estudio de muestreo en sus playas.

La capacidad de los microorganismos para desarrollar tal variedad de funciones se debe a su gran versatilidad bioquímica, basada en la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de tipos de reacciones: oxidaciones, reducciones y precipitaciones, sobre los elementos componentes de lo que llamamos vida, y que de manera directa o indirecta gobiernan todos los procesos en la tierra.

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CAPITULO 1

IMAGEN 1 ZONA DEL MUESTREO

ORGANISMOS MARINOSuchos organismos marinos que incluyen bacterias, hongos, fitoplancton y algas mayores, así como algunos invertebrados son actualmente considerados como virtuales fuentes promisorias de substancias bioactivas. Hallazgos de nuevos microorganismos

marinos muestran la existencia de cepas nativas que producen una variedad de metabolitos secundarios química y biológicamente interesantes para el desarrollo y producción de nuevos compuestos de importancia en la industria farmacológica, cosmética, de suplementos nutricionales, biomoléculas, biocatalizadores, agroquímicos, química fina, entre otras. Tradicionalmente las algas han sido fuentes de aislamiento de metabolitos con principios activos útiles en medicina; sin embargo, las superficies y espacios internos de otros organismos como los invertebrados serían también en muchos casos únicos hábitat en los cuales ciertas bacterias y otros microorganismos son regularmente observados. Estos ambientes son ricos en nutrientes en comparación al agua y sedimentos; por lo tanto, podrían ser los únicos nichos de diversos microorganismos.

M

V t=29r2 g

(p−p)h

ECUACIONES 1 LEY DE STOKES

En los últimos años para enfrentar a los grandes problemas de salud pública y enfermedades hasta hoy considerados incurables como el SIDA o el cáncer se han explorado diversos ecosistemas marinos que representan uno del hábitat favorito en la búsqueda de nuevos metabolitos bioactivos. Por otro lado, el surgimiento de nuevas enfermedades en el mundo moderno (enfermedades emergentes y reemergentes) y la aparición cada vez mayor de patógenos antibiótico-resistentes, han generado la necesidad de evaluar diversos compuestos naturales con


actividad antimicrobiana como una alternativa en el tratamiento de enfermedades infectocontagiosas y, de esta manera, contrarrestar algunos de estos problemas de salud pública y veterinaria. Original breve 216 Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2010; 27(2): 215-21. En este sentido, se tiende a desarrollar diversas estrategias para investigar los componentes que actúen como agentes terapéuticos. Desde 1995 las investigaciones sobre nuevos metabolitos de origen marino incrementaron considerablemente gracias a los hallazgos de nuevos compuestos bioactivos en invertebrados, algas y microorganismos. Los estudios se realizaron principalmente en bacterias y hongos aislados de agua de mar, sedimentos, peces, algas y principalmente de invertebrados marinos como esponjas, moluscos, tunicados, celenterados, crustáceos y algunos protocordados. Además, diversos estudios han sugerido que algunos compuestos bioactivos aislados de invertebrados marinos son también producidos por microorganismos simbiontes (bacterias, hongos, microalgas, cianobacterias, dinoflagelados) o asociados a dichos invertebrados. En nuestro medio existe escasa literatura científica sobre la producción de metabolitos bioactivos de bacterias marinas asociadas con invertebrados y sus posibles aplicaciones biotecnológicas. Dada la importancia biotecnológica y ecológica que puedan poseer los microorganismos marinos de la costa peruana, se realizó un estudio prospectivo con el objetivo principal de realizar un tamizaje de las bacterias heterotróficas productoras de sustancias antibacterianas a partir de diversos invertebrados intermareales representativos colectados en una zona costera previamente fijada como lugar de muestreo. (Jimenez B., 2012)

Com

un

a

Nu

mer

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Bac

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s sp

Bac

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hyl

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Stap

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feca

lis

Stre

pto

coss

us

sp

Las condes 12 0 2 1 2 0 3 0 1 1 6 1 0Lo bamechea 6 0 0 0 3 1 1 1 0 1 0 0 1Vitacura 8 4 1 0 1 0 1 1 0 2 4 1 0total 26 4 3 1 6 1 5 2 1 4 10 2 1

TABLA 1 PRESENCIA DE BACTERIAS

El mar es el ecosistema más extenso del planeta (cubre aproximadamente el setenta por ciento de la superficie de la Tierra) y, al mismo tiempo, el más desconocido. Su concentración salina se considera en un promedio del 35/mil. Esta salinidad oscila muy poco en los océanos, entre un 32/mil y

un 38/mil, pero en la zona litoral puede bajar hasta el 1/mil o elevarse al 44/mil. La

Composición en sales del agua del mar es relativamente constante. Aunque los compuestos proporcionalmente más abundantes son el cloro y el sodio, nos encontraremos traza de cerca de la mitad de

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todos los elementos químicos conocidos. Esta salinidad es lo que hace del mar un biotopo especial y que la gran mayoría de animales y plantas marinos sólo puedan vivir en él. La intensidad de la luz disminuye de forma muy rápida al penetrar en el agua del

mar. Esto hace que la zona productiva real no sobrepase los 200 m. En las zonas costeras, a causa de la turbidez del agua, esta zona productiva alcanza menos profundidad. (OSPAR, 2008)

IMAGEN 2 ZONA COSTERA

TEMPERATURALa temperatura superficial del mar depende fundamentalmente de las condiciones climáticas ambientales. En la capa más superficial, hasta unos 100 m de profundidad, la temperatura suele ser bastante constante para descender rápidamente a medida que aumenta la profundidad.

Las zonas costeras o litorales suelen tener características muy especiales. Hay que pensar en fenómenos geográficos como bahías, rías o fiordos, en fenómenos físicos como las mareas y en las especiales zonas de desembocadura de los ríos, los estuarios, en los que se forman zonas de agua salobre absolutamente diferentes, en el sentido biológico, tanto de las aguas continentales como de las marinas. En las aguas litorales encontramos biotopos muy diversos y particulares y suelen ser zonas más ricas en nutrientes que las de alta mar, debido a la cercanía de tierra firme.

Q=mc(∆T )

ECUACIONES 2 TEMPERARURA DEL AGUA

El mar es único (en realidad existe un solo océano), pero no uniforme y hay regiones muy ricas en nutrientes con flora y fauna muy variadas frente a otras de gran escasez y bajas concentraciones de nutrientes. (MUNDO, 2012)

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https://docs.google.com/forms/d/1CKfvAW9XhlcpvMSpAH695Ij8zf5aO3ykCZb8aJ3Os5A/viewform


IMAGEN 3 MUESTREO

Por otra parte, este océano provee alimentos para más de la mitad de la población mundial, es la fuente principal del oxígeno que respiramos, regula el clima del planeta y se utiliza como una vía de transporte mundial. Es también un lugar para el esparcimiento y la meditación, cuyas riquezas no son infinitas y hemos de preservarlas para las futuras generaciones. Por eso, me gusta repetir que hace miles de años el océano cuida de nosotros y ha llegado el momento de invertir los papeles.

En sentido estricto, un microorganismos es todo ser vivo cuya observación resulte imposible al ojo humano desnudo. Si tenemos en cuenta que el poder de resolución de nuestro ojo es de 0,1 mm, cualquier ser vivo de dimensiones menores que éstas debe ser considerado un microorganismo. Por consiguiente los son todas las bacterias, los protistas (las algas unicelulares y los antiguamente llamados protozoos: flagelados y ciliados), las levaduras, los hongos filamentosos y, claro está, también los virus.

ELEMENTOS CONCENTRACION (ppm)

Br 65

C 28

Sr 8

B 4.6

Si 3

F 1

TABLA 2 CONSTITUYENTES INORGANICOS

En cada mililitro de agua de mar viven unos mil protistas, cerca de un millón de bacterias, y cerca de 10 millones de virus y, como veremos más adelantes, es posible que estos recuentos sean muy conservadores. Estos microorganismos planctónicos no son sólo responsables de la degradación de la basura del mar, sino que también llevan a cabo la mayor parte de la fotosíntesis y de la respiración en el mar y, por tanto, mantienen del equilibrio de CO2 entre el mar y la atmósfera.

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http://www.icm.csic.es/bio/outreach_s.htm

ms=mD+S+mD

ECUACIONES 3 MAS DE SAL

La rama de la Microbiología que estudia a los microorganismos que viven en los mares, su integración en los ciclos de transformación materia/energía y su relación con los demás seres vivos que comparten el biotopo marino, se denomina Microbiología marina, que es a su vez una rama de la ecología y por tanto se relaciona estrechamente con otras especialidades como la biología y la bioquímica marinas o con la oceanografía.

Se concede a un sencillo trabajo de tres páginas del biólogo francés A. Certes (1884) el honor de ser considerado el pionero de la biología marina, si bien fue el alemán B. Fischer quien hacia 1890 estudió por vez primera y de manera formal a las bacterias y a los otros microorganismos que viven en el mar, estudios que han sido generalmente muy aceptados por los científicos. En Francia, las investigaciones de microbiología marina fueron continuadas por P. Casedebat, en1894, a lo largo del puerto de Orán, en Argelia y, hacia 1905, por J. Portier en el transcurso de las campañas oceanográficas del príncipe de Mónaco.

Desde fines del siglo XIX se han multiplicado los estudios en el campo de la microbiología, y también, como es lógico de la microbiología marina, gracias al avance de las técnicas de cultivo de estos diminutos seres vivos y al adelanto en los microscopios, que son los aparatos que hacen posible su observación.

MUESTRAS (NMP/100gr)

No detectados(¿200¿

(200 y 300) (231 y 1000) (1001 y 3000)

(mayor e igual a 3000)

Tripia Perla (princtada imbricata) (n=87)

42.6 2.3 17.2 24.1 13.8

Pepitona o Pata (arca zebr)(N=30)

30 10 20 20 20

Mejillon (Perna perna)(n=14)

35.8 7.1 7.1 14.3 35.7

Vaeiras (amusium papyraceum)(n=9)

0 0 0 55.6 44.4

Guacuco (tivela mactroides)(n=5)

40 0 20 0 40

Chipi-chipi (donax spp)(n=2)

0 0 0 100 0

Caracoles marinos (diferentes especies)(n=14)

9.1 9.1 9.1 27.3 45.4

TABLA 3 MUESTRAS DETECTADAS

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Más recientemente,, en el campo de la microbiología marina se cuenta con una serie de investigadores de muy diversas nacionalidades, entre los que destaca Waksman, conocido del gran público por haber descubierto el antibiótico llamado estreptomicina, y Zobell, que ha realizado estudios para demostrar el papel esencial de las bacterias en el ciclo de la materia viviente en el agua del mar, así como los responsables de varios descubrimientos recientes, los que referiré al final y que nos hacen dudar de que realmente conozcamos los límites de la vida en la tierra.

La distribución microbiana en el agua del mar tampoco es uniforme. Amplias zonas del mar abierto padecen una escasez crónica de sustancias nutritivas lo que hace que, mayoritariamente, nos encontremos con las formas más diminutas de microorganismos. Como consecuencia, es difícil cuantificar su presencia. La microscopía de fluorescencia ha sido uno de los métodos que ha permitido la obtención de datos fiables.

IMAGEN 4 SEDIMENTO

En líneas generales, las cifras más elevadas de microorganismos suelen darse en la zona más superficial, disminuyendo, en mayor o menor cantidad, al aumentar la profundidad, aunque sobre los sedimentos suele observarse un incremento. Según Rheinheimer, en la parte occidental del golfo de Vizcaya, el número total de bacterias desciende desde 804.300 en la superficie hasta 100.900 a mil metros de profundidad, reduciéndose la biomasa bacteriana de forma similar (de 14,21 microgramos de C por litro a 0,73). Asimismo, la concentración de microorganismos es más alta en las zonas cercanas a las costas, para ir disminuyendo de forma drástica a medida que la costa va quedando más alejada.

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SALINIDAD (000

) TIPO DE AGUA

0 – 0.5 Agua dulce

0.5 – 3 Agua salobre oligohalina

3 – 10 Agua salobre mesohalina

10 – 17 Agua salobre Polihalina

17 – 30 Agua de mar oligohalina

30 – 34 agua de mar mesohalina

34 – 38 Agua de mar polihalina

38 – 150 Salmuera

¿150 HipersalinaTABLA 4 CUERPOS DE AGUA EN FUNCION DE LA SALINIDAD

En cuanto a las oscilaciones estacionales de los microorganismos que viven en el mar, se ha detectado que son relativamente escasas en las zonas lejanas de tierra firme, a pesar de lo cual, en primavera, verano y otoño suelen encontrarse valores algo más altos que en los meses de invierno. En los mares con acusadas diferencias de densidad, las más altas concentraciones de bacterias suelen darse en las capas límite entre masas de agua de diferente temperatura y concentración salina. Esto se debe a que en estas zonas, las diferencias de densidad representan un obstáculo para la precipitación, tanto de bacterias como de partículas en suspensión. Por ello, además, se dan también aquí unas más favorables condiciones de alimentación y las bacterias, no sólo aumentan de número de forma pasiva sino que pueden reproducirse con mayor facilidad. Los vientos y las mareas pueden alterar estas estratificaciones del agua de forma más o menos temporal, variando por ello la distribución de los microorganismos. De acuerdo con todo esto, aunque no hay aun demasiados datos sobre el número total de bacterias, el recuento de bacterias saprofitas, mucho mejor estudiadas, es básicamente más elevado en las aguas costeras que en mar abierto y, generalmente, desciende bruscamente a medida que aumenta la distancia a la costa.

EL ESTUDIO TOMA DE MUESTRAS

IMAGEN 5 TOMA DE MUESTRA

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Los invertebrados marinos fueron recolectados en Santa .Se colectaron un total de 40 muestras de invertebrados marinos entre intermareales y algunos bentónicos. Se transportaron mantenidas en refrigeración a 4 °C al Laboratorio de Microbiología Ambiental y Biotecnología de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) para su procesamiento inmediato. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS EPIBIONTAS DE INVERTEBRADOS Las muestras fueron procesadas según la técnica descrita por León et al.

Px, y=σxyσx σy

=E( ( x−μx ) ( y−μx ))

σxσy

ECUACIONES 4 COEFICIENTE DE CORRELACION

El aislamiento de bacterias marinas se realizó en agar marino según ZoBell (AM) y agar Czapeck, ambos preparados con agua de mar. Luego de una incubación a 20 ºC por 7 a 10 días con observaciones diarias, se procedió a recolectar todas las colonias

heterotróficas tomando como criterio el buen crecimiento en el medio de aislamiento. Las colonias se conservaron en ceparios preparados con agar marino semisólido más glicerina al 20% (v/v).

Adicionalmente, las muestras fueron también procesadas bajo las mismas condiciones para el aislamiento de hongos marinos, utilizando para ello el agar Sabouraud glucosado preparado con agua de mar. SELECCIÓN DE BACTERIAS CON ACTIVIDAD ANTAGÓNICA Para una selección primaria de bacterias marinas productoras de sustancias inhibitorias se aplicó el método de “doble capa” según Dopazo et al. (6) utilizando como controles a bacterias de laboratorio Gram positivas como Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Micrococcus luteus. Las colonias que presentaron halos de inhibición al menos a una de las cepas controles fueron resembradas y conservadas en medio marino semisólido para pruebas posteriores. (R.,Olembo, 1991)

Microorganismos no Si

Enterococo 13 37,14

Estafilococo coagulasa negativa

7 20

Estafilococo aureo 5 14,29

Enterobacter 3 8,57

Estreptococo b hemolítico 3 8,57

klebsiella 2 5,71

TABLA 5 MICROORGANISMOS AISLADOS

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CLOROPHYTAS RODOPHYTAS PHAEOPHYTAS

Enteromorpha Hypnea Sargassum

Cladophora Gracilaria Padina

Chaetomorpha Gelidium Colpomenia

Melosyra Ahnfeltia Spatoglossum

Ulva Carollina

Menostroma Amphiroa

Boodlea Pterosiphonia

TABLA 6 GENEROS DE MICROORGANISMOS

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CAPITULO2ESTUDIOS DE MICROORGANISMO MARINOS

IMAGEN 6 LIMPIEZA DE LA MUESTRA

esde los primeros estudios, se ha podido constatar que la mayoría de las bacterias de origen marino son Gram- negativas y que las Gram- positivas corresponden a menos del 10% del total de la población microbiana en el ecosistema, planteándose que la pared

celular de las bacterias Gram- negativas está mejor adaptada para sobrevivir en este medio. Estos estudios, sin embargo, están basados en muestras tomadas de la columna de agua y existen evidencias de que las bacterias Gram- positivas se encuentran en mayor porcentaje del total de la microflora marina, en sedimentos o sobre superficies. Desgraciadamente, la mayoría de las investigaciones sobre las bacterias de origen marino han sido enfocadas a las variedades Gram- negativas, y por ello, poco es conocido acerca de la distribución y el papel ecológico de las bacterias Gram- positivas en los hábitats marinos (Fenical y Jensen, 1993).

D

S=mS

mSW

×1000( gkg

)

ECUACIONES 5 SALINIDAD ABSOLUTA

Los resultados demostraron que sólo se detectó la presencia de estos microorganismos hasta la dilución 105. No obstante teniendo en cuenta que la abundancia de microorganismos en los sedimentos marinos se encuentra en el orden de 109 y que, según Amann y cols., (1995), el por ciento de microorganismos cultivables en este ecosistema es alrededor de 0.25 %, pudieran estudiarse otras variantes de medios de cultivo y temperaturas de incubación, entre otros factores, que garanticen una mayor frecuencia de aislamientos. Debemos señalar que los niveles de contaminación por hidrocarburos, metales y otros elementos existentes en el área de muestreo, pudieron influir notablemente en esta baja frecuencia de aislamientos. Además, los resultados evidencian que el 50 % de los cultivos aislados eran degradadores de hidrocarburos, lo cual corresponde con el estado de la zona de muestreo fuertemente impactada por hidrocarburos.


Elementos Numero de muestras ConcentraciónValor medio intervalo

As (mg.kg-1) 32 506 6 – 7287

Ca (%) 32 0.31 0.01 – 6.32

Fe (%) 32 3.89 0.84 – 32.13

Hg (mg.kg-1) 32 54 2 – 1118

Mg(%) 32 0.10 0.02 – 1.21

Pb (mg.kg-1) 32 34 8 – 131

Zn(mg.kg-1) 32 68 11 – 472

TABLA 7 ELEMENTOS PARA CULTIVAR

Todas las cepas recién aisladas fueron incorporadas físicamente a la Colección de bacterias marinas y mantenidas en el medio No. 6 por el método de subcultivos bajo aceite mineral estéril, considerándose como Banco maestro para este grupo; además se creó un Banco de trabajo, mantenido en cuñas de agar nutriente, para viabilizar la evaluación de su bioactividad. Selección de bacterias productoras de sustancias bioactivas De las 126 cepas evaluadas, 34 fueron capaces de inhibir el crecimiento de al menos una de las cepas indicadoras. De estos microorganismos 22 presentaron actividad antibacteriana, 7 mostraron actividad antifúngica y 6 fueron capaces de inhibir el crecimiento de bacterias y hongos. (Krupa, S.V., 2012)

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION

IMAGEN 7 AISLAMIENTO

Las bacterias marinas en las Zonas de Muestreo para el aislamiento de bacterias marinas heterótrofas se tomaron muestras de agua y sedimentos en diferentes estaciones de Santa Elena.

F (x)= n !x ! (n−x ) !

(P)x (q)n− x

ECUACIONES 6 DETERMINACION DEL MUESTREO

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Estaciones de muestreo para el aislamiento de bacterias marinas heterótrofas en la playa de Santa Elena. Los muestreos se realizaron en el mes de enero de los años 2001 y 2002. El procesamiento de las muestras se realizó durante las primeras horas de la colecta. Procesamiento de las muestras En el caso de los sedimentos, bajo condiciones asépticas se tomaron 50g de muestra en Erlenmeyers estériles a los que se añadió agua de mar estéril (450 mL), posteriormente fueron incubados durante 15 min. a 30 °C y 125 r m-1 en zaranda orbital rotatoria. Luego se realizaron diluciones seriadas en agua de mar estéril Para las muestras de agua se realizaron diluciones seriadas en agua de mar estéril.

IONES AGUA DULCE (mg/L) AGUA DE MAR (mg/L)

Aniones

co3=¿¿ 58.4 14O

co4=¿ 12.2 271

cr❑ 7.8 19,440

TOLAL 77.4 22,290

Cationes

ca++¿¿ 15 410

Mg++¿¿ 4.1 1,300

Na+¿¿ 6.3 10,810

K+¿ ¿ 2.3 390

TOTAL 27.7 12,910

Tabla 8 COMPOSICION DE IONES PARA CUERPO DE AGUA

Aislamiento de microorganismos marinos Las diluciones seleccionadas se inocularon a razón de 100µL por placa con medios específicos para bacterias marinas. Las placas fueron incubadas a 30 °C por 24 horas. Para el aislamiento de bacterias marinas degradadoras de petróleo se utilizó la técnica de Enriquecimiento (Zobell, 1973; Solanás, 1985) en medio salino descrito por Vela y Ralston (1978) y se emplearon como fuente de carbono el petróleo venezolano Santa Bárbara de 34 API. Las diluciones de los cultivos de 21 días de incubación se inocularon a profundidad en medio agarizado No. 6 (Gorvienko, 1961). La selección de las colonias se realizó teniendo en cuenta las características culturales de las mismas en cada medio de cultivo. Estas colonias se aislaron por agotamiento en placas con medio de aislamiento para cada grupo fisiológico de interés. Se realizó la verificación de la pureza basándose en criterios morfológicos-culturales y observaciones al microscopio óptico. Conservación de las cepas de la colección La conservación de las bacterias heterótrofas aisladas se llevó a cabo en el medio No. 6 (Gorvienko, 1961), a través del método de subcultivos bajo aceite mineral estéril, almacenados en refrigeración, por triplicado. Los microorganismos aislados fueron depositados en la Colección de Microorganismos Marinos del Instituto de Oceanología. Búsqueda de sustancias de interés biotecnológico A partir de cultivos puros obtenidos en medio No. 6 agarizado, se prepararon suspensiones de células para las

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determinaciones de antibióticos, sustancias intercalantes de ADN, hemólisis y degradación de petróleo, así como caldos fermentados para la producción de biotensioactivos. Ensayo de susceptibilidad antibiótica Para la detección de bacterias productoras de metabolitos antimicrobianos se emplearon cepas Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae y Serratia marcescens Candida albicans, Cryptoccocus neoformans y Aspergillus Níger. Las bacterias patógenas utilizadas en el ensayo de susceptibilidad se inocularon en caldo Mueller-Hinton. Todos los cultivos fueron incubados a 37 °C durante 24 horas. Los cultivos fermentados se ajustaron entre 0.08-0.1 de absorbancia a una longitud de onda de 650 nm. Seguidamente se tomaron 100 µL como inóculo para placas con medio agar nutriente. Los caldos inoculados con las suspensiones de células de levaduras se leyeron en espectrofotómetro a una longitud de onda de 650 nm y se ajustaron a 40% de tramitancia. Se tomaron 100 µL de las suspensiones ajustadas y se inocularon en 25 mL de medio agarizado Sabouraud-Dextrosa y fue vertido en placas Petri. Las suspensiones fúngicas (esporas o talos fragmentados) se inocularon a profundidad (50 µL) en placas Petri con medio Agar Papa-Dextrosa fundido. La detección de la actividad antibiótica para actinomicetos se determinó por el método de difusión en placas Petri con agar. Se emplearon discos de papel de filtro (Whatman # 3) de 6 mm de diámetro con los cultivos a evaluar, dispuestos equidistantes en una placa con una capa de agar y el microorganismo sensible inoculado a profundidad (Peña, 1997). Para el caso de las bacterias heterótrofas estas determinaciones se realizaron por el método de réplica en placa, a partir de suspensiones de células en caldo nutriente. Se dejó difundir durante 1 hora el caldo o suspensión de células en refrigeración y posteriormente las placas fueron incubadas según los requerimientos de cada microorganismo revelador para realizar las lecturas del tamaño del halo de inhibición de éstos. Los ensayos se realizaron por duplicado y se evaluaron con respecto al medio de cultivo estéril. Búsqueda de sustancias intercalantes de ADN Para determinar la producción de sustancias intercalantes de ADN como posibles agentes antitumorales de bajo peso molecular se siguió el método descrito por Steinberg y cols., (1985) modificado por Miravet y cols.,(1994). En el caso de los actinomicetos se realizó por el método de difusión en placas y para las bacterias heterótrofas por réplica en placas. Degradación de petróleo La selección de cepas degradadoras de petróleo en agua de mar y dulce se realizó, utilizando el medio salino agarizado con petróleo venezolano Santa Bárbara de 34 API como fuente de carbono y energía. La evaluación de la actividad se realizó utilizando el método de réplica en placa descrito por Ortiz y cols., (2002). Producción de tensioactivos La producción de tensioactivos se evaluó en cultivos fermentados libres de células, obtenidos por centrifugación a 7000xg y 4 oC durante 30 minutos, en una centrífuga Beckman J2-H5 (USA). El medio de cultivo utilizado incluye sales inorgánicas y sacarosa como única fuente de carbono y energía (Villaverde, 1997). Las determinaciones de tensión superficial e interfacial vs Diesel se realizaron por el método de anillo de Du Noüy (Duvjak y cols., 1985) en un tensiómetro Krüss K 10 T de fabricación alemana. Actividad hemolitica Esta actividad se determinó por el método de réplica en placa en medio Agar Sangre. Las placas se incubaron a 30 °C por 24 horas y se evaluó la formación o no de halo de lisis alrededor de la colonia. Clasificación taxonómica Para la identificación de las cepas de bacterias seleccionadas se realizaron las pruebas morfológicas, culturales, fisiológicas y bioquímicas sugeridas en el Manual de Bergey del 1994. Actualización de la Base de Datos de la Colección La Base de Datos de la

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Colección de Microorganismos Marinos contempla los registros de los cultivos. Ésta se creó desde Visual Basic 6.0 con formato de Access del paquete Microsoft Office´97. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aislamiento de bacterias marinas En nuestro estudio fueron aisladas 51 cepas de bacterias heterótrofas a partir de muestras de agua y sedimento marino, las cuales presentaron una gran variedad de formas, textura, tamaño y color, con predominio de bacilos Gram- positivas.

S( 000

)=0.03+¿

ECUACIONES 7 DETERMINACION DE LA CLORINIDAD

Las cepas recién aisladas, después de la purificación, fueron clasificadas por sus características morfológicas y bioquímicas, encontrándose que el 55% se clasificaron como Bacillus sp. Es importante señalar que en sedimentos se aisló el 80.4 % de las bacterias encontradas en estos muestreos, posiblemente determinado por una mayor concentración de nutrientes en comparación con la columna de agua (Núñez y cols., 2002). Además, numerosos autores afirman que los sedimentos presentan gran abundancia de microorganismos. (MUNDO, 2012)

IMAGEN 8 MUESTRA AISLADA

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS EPIBIONTAS DE INVERTEBRADOS Las muestras fueron procesadas según la técnica descrita por León et al. (5) El aislamiento de bacterias marinas se realizó en agar marino según ZoBell (AM) y agar Czapeck, ambos preparados con agua de mar. Luego de una incubación a 20 ºC por 7 a 10 días con observaciones diarias, se procedió a recolectar todas las colonias heterotróficas tomando como criterio el buen crecimiento en el medio de aislamiento. Las colonias se conservaron en ceparios preparados con agar marino semisólido más glicerina al 20% (v/v).

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IMAGEN 9 COLORACION DE LAS BACTERIAS

P( NC )=P(N ∩C )P(C )

ECUACIONES 8 PROBABILIDAD DE EFICIENCIA

OBSERVACIONES DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

IMAGEN 10 MICROOSCOPIA ELECTRONICA

Se realizaron estudios complementarios de morfología celular y presencia o ausencia de flagelos de tres cepas seleccionadas por su amplia actividad inhibitoria, mediante observaciones de microscopía electrónica de transmisión (Zeiss – EM 900). El procesamiento de las muestras y las observaciones se realizaron en la sala de servicios de microscopía electrónica de la Facultad de

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Ciencias de la Universidad de Valparaíso en Chile. HALLAZGOS Los invertebrados que sirvieron como fuentes de aislamiento de bacterias inhibitorias fueron de origen intermareal del lugar conocido como Playa San Francisco – Ancón. Inicialmente fueron aisladas un total de 102 cepas de bacterias marinas, de las cuales, previa selección de antibiosis frente a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Micrococcus luteus, (cepas indicadoras), resultaron diez cepas con propiedades inhibitorias. Asimismo, se logró aislar 15 cepas fúngicas de origen marino, sin embargo, ninguna mostró tener actividad antibacteriana, por lo que no fue tomada en cuenta en estudios posteriores. La mayor cantidad de cepas inhibitorias se logró recuperar a partir de Heliaster helianthus “estrella de mar” .Las investigaciones en torno al espectro inhibitorio frente a principales bacterias potencialmente patógenas de humanos.

Phylum Clase Orden S1 S2 S3

Arthropoda Insecta Coleóptera x x X

Dermáptera X

Lepidóptera x X x

Arachnida Areneae x x X

Chilopoda Geophilomorpha X

Diplopoda Spirobolida x

Malacostraca Isópoda x x X

Mollusca Gastropoda Archeogastropoda X

Annelida Oligochaeta Haplotaxida x x x

TABLA 9 COMPOSICION TAXONOMICA

Se destaca las cepas EM–10, An–13, E-12 y E-20 por su mayor actividad inhibitoria tanto a Gram positivas como Gram negativas, siendo el patógeno Staphylococcus aureus 6832 (cepa proporcionada por un centro hospitalario) y una cepa ambiental de Micrococcus sp. los que mostraron mayor sensibilidad frente a esta acción . La cepa marina EM-10 proveniente de Heliaster helianthus “estrella de mar” e identificada como un actinomiceto inhibió a ocho indicadoras de un total de nueve, mostrando su mayor actividad antibiótica frente a Staphylococcus aureus y a los patógenos Gram negativos Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus y Pseudomonas aeruginosa . Según la metodología convencional se1 logró identificar, a nivel de género, las cepas marinas con mayor actividad inhibitoria de patógenos humanos .La mayoría resultó ser Gram negativa, con excepción de dos actinomicetos (Gram positivos). El género Vibrio sp. ha sido considerado el predominante de los aislados (50%). Bacterias marinas aisladas de invertebrados intermareales de la Bahía de Ancón y su actividad antimicrobiana contra potenciales patógenos de humanos. (Brock T.D, 2001)

1 CEPAS

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IMAGEN 11 CLASIFICACION DE LOS ORGANISMOS

PORCENTAJE DE CEPASPorcentajes de cepas evaluadas con actividad antimicrobiana De los resultados obtenidos en esta investigación se pudo constatar que para los actinomicetos la actividad antifúngica fue ligeramente superior que la antibacteriana. Sin embargo, esto difiere de lo reportado por otros autores (Mendoza 1997, Cárdenas 1998 y Pérez 1998). Estas diferencias podrían estar dadas a que en sus investigaciones fueron analizados otros grupos bacterianos y no actinomicetos. De las 86 bacterias heterótrofas evaluadas sólo un 12.7 % presentó actividad antimicrobiana. Estos resultados pudieran estar determinados por el uso de suspensiones de células en caldo nutriente estéril para las evaluaciones y no caldos fermentados en un medio de producción de estos compuestos. No obstante, estas evaluaciones se realizaron anteriormente para el resto de las bacterias de la colección en las mismas condiciones.

Los microorganismos representan un papel esencial para el mantenimiento y funcionamiento de los ecosistemas globales y como fuente de nuevos recursos para el desarrollo de la medicina, la industria, la agricultura y la biotecnología. Por eso es necesario conservar toda esta fuente microbiana y esto se garantiza mediante las colecciones de cultivos.2-6 En la última década, se ha visto un marcado aumento en la concientización del valor de las colecciones de cultivos. Actualmente, existen en el mundo alrededor de 488 colecciones de 65 países registradas en el Centro de Datos Mundial de Microorganismos de Japón. Además, se han establecido organizaciones mundiales, regionales y nacionales.

QK=Li−1+

K .N4

−fi−1

fi. ai

ECUACIONES 9 FRECUENCIA ACUMULADA

El acelerado desarrollo de la industria farmacéutica y biotecnológica, así como el potencial uso de los microorganismos, obligan cada vez más a promover actividades de aseguramiento de la calidad

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para su conservación, de manera que puedan ser utilizados en diversos ensayos analíticos en los laboratorios de control microbiológico.

La necesidad de mantener y disponer de cultivos de calidad impuso la introducción de métodos de conservación de microorganismos que reducen al mínimo la posibilidad de contaminación y garantizan al menos la supervivencia del 70 % de las células por un periodo determinado de tiempo. La liofilización es el método de elección debido a sus numerosas ventajas, entre las que se puede resaltar la posibilidad de minimizar al máximo el riesgo de cambio genético en las células y las mantienen viables por 10 años o más. Además es recomendable por su comodidad en almacenamiento y transporte de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden almacenarse a una temperatura ambiente de 18 a 20 ºC o bien de 4 a 6 ºC .

N C pH C/N Arena Li + Ar

CE Ca Mg Na K Ped

N 1000

C 949 1000

pH 804 834 1000

C/N 101 401 273 1000

Arena -763 -732 -477 -140 1000

Li + Ar

763 732 477 140 -1000 1000

CE 894 865 847 148 -635 635 1000

Ca 593 568 524 101 -488 488 636 1000

Mg 751 771 735 234 -664 664 599 508 1000

Na 859 804 838 70 -662 662 933 675 689 1000

K 750 743 852 132 -404 404 764 457 766 856 1000 1000

Ped 782 699 770 -59 -435 435 885 433 521 805 743

TABLA 10 MATRIZ DE CORRELACIONES

El laboratorio de control microbiológico de Laboratorios Liorad disponía de una colección de cepas procedentes de subcultivos de cepas de referencia de la American Type Culture Collection (ATCC). El método de conservación empleado era la congelación a – 70 0C, metodología que no resulta la más conveniente para la conservación por largos periodos de tiempo, por tal motivo surgió la necesidad de evaluar otra estrategia de conservación para estos microorganismos. La metodología propuesta fue emplear el Caldo Triptona. Soy (CTS) como medio de crecimiento, la leche descremada y el glicerol al 20% (sustancias lioprotectoras), la liofilización como método de conservación y ensayos de calidad: viabilidad, pureza e identidad.

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CONSERVACIONDE DE LOS MICROORGANISMOSLa conservación de las cepas de microorganismos que forman el lote Maestro se realizó por el método de liofilización. Se empleó como sustancias lioprotectoras: leche descremada y glicerol al 20 %.

VIABILIDADDespués de la liofilización, se realizó el recuento de UFC/mL por diluciones seriadas hasta 10-8 y siembra en superficie en TSA. Cada dilución se sembró por triplicado. Se consideró satisfactoria una concentración celular igual o superior a 105 UFC/mL, valor establecido en las especificaciones de calidad del lote Maestro.

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CAPITULO3

RESULTADOS Los resultados arrojaron que de 335 cepas aisladas de fuentes marinas cubanas, 185 (55%) mostraron actividad antimicrobiana ante Bacillus subtilis ATCC 6633; Escherichia coli ATCC 8739; Candida albicansATCC 10231 y Aspergillus niger. En comparación con otros estudios, en esta investigación presentaron actividad antimicrobiana un mayor número de cepas (27%), con excepción del estudio realizado por Pérez (1998). En ambos casos, todas las bacterias evaluadas fueron aisladas de fuentes marinas cubanas, lo cual evidencia el alto potencial biotecnológico de nuestra diversidad microbiana marina. De las levaduras y hongos utilizados, el más resistente fue Aspergillus niger. La gran mayoría de las cepas que mostraron actividad antifúngica, la desarrollaron contra las 3 cepas sensibles ensayadas. Este resultado concuerda con el obtenido por Pérez y cols., (1999), donde se enfrentaron bacterias heterótrofas marinas con 4 especies de hongos fitopatógenos y el 100% de las cepas evaluadas fueron capaces de inhibir el crecimiento de al menos 3 de ellos. Los resultados de este estudio sugieren que las cepas marinas productoras de sustancias antimicrobianas detectadas o sus compuestos antimicrobianos, podrían ser de interés para la biomedicina y la agricultura. No obstante, el verdadero valor de estos microorganismos debe esperar por una identificación precisa de la naturaleza de los compuestos responsables de las actividades detectadas.

P (R∩ A )=P (R ) P(A)

ECUACIONES 10 PROBABILIDAD INDEPENDIENTE DE LOS RESULTADOS

El 4.8% de las cepas estudiadas tienen la capacidad de producir sustancias intercalantes de ADN como posibles agentes antitumorales de bajo peso molecular. Steinberg y cols., (1985) aseguraron que los compuestos con actividad intercalante de ADN pueden presentar actividad antibiótica, de manera que además del halo de fluorescencia alrededor de las muestras se observe un halo de inhibición en el crecimiento de la bacteria luminiscente. Los resultados demostraron que las cepas evaluadas no presentaron actividad antibiótica contra Photobacterium leiognathi. Existe información acerca de la producción de agentes antitumorales a partir de microorganismos marinos. Tapiolas y cols., (1991), aislaron de Streptomyces sp. marino, las octalactinas A y B. Estos y otros estudios realizados en dicha temática, han sido recogidos en los estudios de Fenical y Jensen (1993). En cuanto al arsenal de sustancias antitumorales de origen microbiano marino, la literatura especializada es bastante reducida, a pesar de que en los últimos años, la producción de compuestos antitumorales por microorganismos ha cobrado mayor interés por el bajo costo de su producción, por las ventajas del proceso fermentativo y además, por las posibilidades actuales de la genética microbiana (Pérez y cols., 1995). Los resultados de la actividad hemolítica de las cepas evaluadas arrojaron que el 14 % presentó esta propiedad. El ensayo facilita la diferenciación de especies del género Streptococcus, que permite una rápida clasificación taxonómica de estos

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microorganismos. La detección de esta actividad constituye un método de selección de microorganismos potencialmente productores de tensioactivos, ya que estos compuestos tienen la propiedad de lisar los glóbulos rojos (Mulligan y cols., 1989). Por otra parte, aunque se ha comprobado que muchos microorganismos que producen tensioactivos no lisan los glóbulos rojos, esta técnica permite una rápida detección de estas sustancias (24 h), al compararse con tamizajes basados en vías fermentativas a partir de sustratos hidrófobos, que necesitarían largos períodos de incubación. A partir de 11 cepas hidrocarbonoclastas de la colección y de las 51 aisladas en Bahía de la Habana se realizó la evaluación de la degradación de petróleo en agua dulce. Los resultados de este ensayo demostraron que el 66.7 % de las cepas evaluadas degradan petróleo en esas condiciones. Estos estudios constituyen los primeros pasos en el desarrollo de bioproductos para el tratamiento de aguas dulces expuesta a contaminación por hidrocarburos. La búsqueda de productos, que faciliten la eliminación de hidrocarburos vertidos al medio ambiente, se ha intensificado en los últimos años. En particular, las aguas de consumo requieren especial atención por las implicaciones a la salud y otras esferas. Es necesario señalar que las evaluaciones realizadas por el método de réplica en placa, permitieron diagnosticar un mayor número de cepas simultáneamente (hasta 46, según la actividad a evaluar), que el método de difusión en placas. Esto permitió un ahorro considerable de recursos materiales y humanos. A partir de 71 cepas que pertenecen a la colección se detectó que el 61 % producen compuestos con actividad superficial exocelular a partir de sustratos hidrosolubles. Además, el 21 % es capaz de producir tensioactivos que disminuyen significativamente los valores de tensión superficial e interfacial.

Sin embargo, la obtención de estas moléculas se facilita debido a que los cuerpos de todos los organismos marinos vivos y muertos, sus conchas, caparazones, mudas, heces, etcétera tienen superficies sumergidas en el mar, las cuales tienden a atraer y retener una película donde se depositan moléculas orgánicas, constituyendo lugares de concentración de alimentos utilizables por las bacterias. Por lo tanto, estos microorganismos deben ser capaces de encontrar y fijarse a las superficies donde exista materia orgánica que represente su alimento.

Cuando las bacterias lo logran, pueden crecer y multiplicarse. Una ventaja adicional de la adhesión a las superficies de estos cuerpos sumergidos, es el hecho de que varias clases de bacterias pueden crecer juntas produciendo una mayor variedad de enzimas digestivas, de tal manera que aumenta también la diversidad de materiales orgánicos que pueden aprovechar, por lo que el proceso de alimentación sucede más aprisa y con mejores resultados para la vida bacteriana del océano. (Atlas R.M, 1984)

Cuando en las aguas del mar abundan los restos de organismos, la posibilidad de que las bacterias cuenten con el sustrato adecuado aumenta, lo que consecuentemente trae la presencia de cantidades significativas de ellas en un periodo muy corto de tiempo. Es de gran interés el fenómeno que experimenta cualquier muestra de agua guardada durante algunos días en una botella o frasco, donde se presenta un rápido y repentino aumento de bacterias, llegando, a veces, hasta centenares y millones de organismos por centímetro cúbico.

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Este aumento es el resultado de que las bacterias, al tener la sustancia orgánica concentrada en el frasco, la aprovechan en su metabolismo e incrementan su reproducción. Existen especies de bacterias que tienen tal velocidad de reproducción que cada 20 minutos se dividen, por lo que de una bacteria en 24 horas se pueden obtener miles de millones, siempre y cuando tengan la sustancia orgánica suficiente que desintegrar para que les sirva de alimento.

Las profundidades del océano son ricas en humus acuático, o sea, en sustancia orgánica en descomposición; esto permite la existencia, en esa zona del mar, de gran cantidad de bacterias sésiles que pueden aprovechar las partículas orgánicas suspendidas en los sedimentos, estableciéndose una microzona donde ocurre la acumulación y la transformación del humus acuático.

Esto explica que el fondo del mar sea el lugar donde existe el mayor número de poblaciones bacterianas. También se tiene que considerar que todas las que viven en el océano no deben utilizar materia orgánica, por lo que su número estará en relación directa con la cantidad de esta materia presente en el agua.

Se ha comprobado que la distribución de las bacterias en el medio marino es muy amplia, siendo extraordinariamente abundantes en la región litoral, en correspondencia a la gran cantidad de vida animal y vegetal que en ella existe. En cuanto a su distribución vertical, se les encuentra desde la misma superficie del mar hasta las grandes profundidades, localizándose más abundancia a los 5 000 metros, donde están preferentemente en el fondo, mezcladas con los detritos, aunque pueden encontrarse hasta los 11 000 metros. Sus cantidades llegan a ser fabulosas, y se han contado hasta 420 millones de bacterias por gramo de fango marino.

Las bacterias marinas tienden a presentar características en su metabolismo diferentes de las bacterias terrestres y de agua dulce, por lo que muchas de ellas requieren agua del mar o un medio que la contenga para poder cultivarse y tener un buen crecimiento, mientras que la gran mayoría de las bacterias terrestres o dulceacuícolas no requieren de sus propios medios y pueden ser cultivadas en ausencia de ellos.

DISCUSIONLa recuperación de los microorganismos evidenció que para las cepas estudiadas se seleccionó un buen método de conservación (la liofilización). Las sustancias lioprotectoras (leche descremada y glicerol al 20 %) en ambos casos permitieron lograr una buena apariencia de la pastilla liofilizada y rehidratación instantánea. A pesar que de manera general está más extendido el empleo de mezclas de lioprotectores porque en la mayoría de los casos, se obtienen mejores resultados que cuando se emplean las sustancias puras. No obstante, en este trabajo se obtuvieron buenas características durante el proceso de lioflización. Las disoluciones lioprotectoras son sustancias que se añaden con el objetivo de mejorar las características del producto durante el proceso de lioflización o de almacenamiento de ambos, aunque en la mayoría de los casos, los mecanismos del efecto protector son poco conocidos.

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La observación microscópica de los cultivos demostró la presencia, de cultivos puros, en cada una de las especies estudiadas. Las colonias observadas coincidieron con la morfología típica de las cepas de referencia Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 morfología reportada en los certificados de calidad de estas cepas. La valoración de que los microorganismos están biológicamente puros es un aspecto crítico en la caracterización microbiológica, por lo que deben realizarse ensayos apropiados para la detección de contaminantes.

Se presentan los recuentos de UFC/mL de recobrado de las cepas bacterianas de referencia conservadas en leche descremada y glicerol al 20 % antes y después de la liofilización en los diferentes tiempos evaluados.

CONCLUSION

Se comprobó que con el empleo de la liofilización como método de conservación se mantienen inalteradas las características propias de las especies microbianas estudiadas con un alto grado de pureza. El empleo de leche descremada al 20 %, como sustancia lioprotectora contribuye a conservar la viabilidad de esas cepas en niveles adecuados. El glicerol al 20 % resulta una buena sustancia lioprotectora para las cepas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis al mantener la estabilidad de la viabilidad durante un periodo de cinco años. No así para la cepa Pseudomonas aeruginosa cuya viabilidad disminuye en su presencia a partir de los tres años de depositadas en la colección.Las bacterias que con mayor frecuencia se aíslan del medio marino son bacilos gram-negativos y casi un 90% de ellos corresponden a los géneros Vibrio, Pseudomonas, Flavobacterium y organismos relacionados. En el Plancton hay también muchas bacterias de pequeño tamaño (0.2-0.5 micrómetros) no identificadas que presentan su pared celular con estructura gram-negativa. Los sedimentos, por el contrario, contienen un porcentaje muy superior de gérmenes gram-positivos, sobre todo del género Bacillus.Los hongos son mucho menos abundantes proporcionalmente en el medio marino que en aguas dulces y prevalecen en zonas de descomposición reciente de residuos vegetales.En el ciclo de la materia, las sustancias minerales existentes en los océanos, son requeridas por los vegetales autótrofos que las transforman en sustancias orgánicas, que, son a su vez, aprovechadas por el reino animal, de nutrición o alimentación heterótrofa. Como consecuencia del metabolismo animal, parte de esas sustancias orgánicas son eliminadas en la forma de excretas formadas por otros compuestos minerales o inorgánicos que no serían utilizables por los vegetales en un nuevo proceso de síntesis, si no fuese por la acción de determinadas bacterias que los transforman en aquellas sales que directamente pueden utilizar los vegetales autótrofos. Además de los productos de excreción de los seres vivos, se depositan en el fondo del mar sus restos cuando mueren, y éstos no serían aprovechables de nuevo si las bacterias no los desintegraran, liberando los componentes minerales que los forman y reconstruyendo, con

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base en ellos, las sales nutritivas necesarias para la síntesis vegetal. Es tan importante la acción de estas bacterias que sería imposible, sin su intervención, el aprovechamiento del nitrógeno disuelto en el agua del mar para que los vegetales verdes puedan formar proteínas. (JimenezB., 2012)2

BIBIOGRAFIAAtlas R.M. (1984). Diversity of microbial communities. New York USA. : In: K.C. Marshall (ed.).

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Brock T.D. (2001). Biología de los microorganismos. Ed. Omega. Barcelona - España.

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R., Olembo. (1991). Importance of microorganisms and invertebrates as components o diversity. D.L Hawksworth (ed).

2 BACTERIASPágina

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