11/PRPM

MÉTODO PARA LA EXTRACCIÓN DE

RNA BASADO EN EL USO

NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS

Dra. Capriotti Natalianataliacapriotti@conicet.gov.ar

Centro Regional de Estudios Genómicos

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Instituto de Física de La Plata

(IFLP)

Claudia Rodríguez Torres

(torres@fisica.unlp.edu.ar)

Fabiana Cabrera

Silvana Stewart

Pedro Mendoza Zeliz

Elisa De Sousa

Luciana Juncal

Odín Vázquez Robaina

Instituto de Investigaciones

Fisicoquímicas Teóricas y

Aplicadas (INIFTA)

Patricia Schilardi

Carolina Diaz

Diego E. Pissinis

Centro Regional de Estudios Genómicos

(CREG)

Sheila Ons

Lucila Traverso

Natalia Capriotti

Instituto De Biotecnología Y Biología

Molecular (IBBM)

Victor Romanowski

Matías Pidre

Leticia Ferrelli

Florencia López

Leslie Amorós

Laboratorio de Salud Pública

Instituto Biológico

Hospital Rossi

Convenio Agosto 2020 – PBA

- Ministerio de Producción,

Ciencia e Innovación

Tecnológica.

- Ministerio de Salud.

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Muestra

BiológicaExtracción de

RNA

Generación de

cDNA

Amplificación

por PCR

Detección

> cc. RNA < Ct

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Métodos de extracción de RNA

• Propensión a obstruirse

• Retención de ácidos nucleicos grandes como el ADNg

• Necesidad de equipamiento costoso (centrifugas)

• Difícil de automatizar

Solventes orgánicos Fase sólida (columnas Si02)

• Residuos

• Procesamiento laborioso y manual intensivo

• Difícil de automatizar

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El objetivo del trabajo es proporcionar un protocolo de extracción de RNA

basado en perlas magnéticas de sílice de bajo costo, independiente de

equipamiento sofisticado y de producción nacional.

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Antecedentes

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- Se obtuvieron nanopartículas de magnetita (NPM, Fe3O4) por el método de co-precipitación

(IFLP)

- Se recubrieron con sílice (SiO2) por hidrólisis detetraetilortosilicato (TEOS) obteniéndose así las

“perlas magnéticas” (PEM) (INIFTA)

Gentileza Y-TEC

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Desarrollo y optimización de un protocolo de extracción (CREG-IBBM)

Buffer de Lisis: GITC + Triton

LISIS DE

LA

MUESTRA

RNA LIGADO A LAS PEM LAVADOS ELUCIÓN

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Método de

extracción RNA

Dilución 1:2 Dilución 1:4 Dilución 1:8

Trizol Reagent 19,40 21,5 26,34

Protocolo PEM

+ centrifuga

17,80 20,01 21,22

Protocolo PEM 21,69 23,46 24,08

• Muestra biológica: tejido blando de Rhodnius prolixus (3 replicas)

• Síntesis de cDNA: protocolo MML-V (Promega)

• RT-qPCR: Sybr Green y gen de referencia Rhopr_Actina

(CREG)

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Resultados

• Muestra biológica: línea celular pulmón A549. Concentración 105

• Molde RNA - dilución 1/5

• RT-qPCR: Kit MGI

1 2 3

PEM 03720 15,03 15,97 16,28

PEM 23720 15,34 15,99 15,94

PEM 24720 14,95 16,2 16,44

Columnas GeneAid 14,72

1. 4M GITC, 2% TritónX100 y pH6,5

2. 4M GITC, 4% TritónX100 y pH6,5

3. 2M GITC, 4% TritónX100 y pH6,5

(IBBM-CREG)

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Resultados

• Muestra biológica: hisopado bucal del operador (X 2)

• Molde RNA

• RT-qPCR: Kit BGI

H 23 H 24

PEM 23720 21,96 -----

PEM 24720 ----- 21,65

Columnas GeneAid 21,53

Buffer 4M GITC, 2% TritónX100 y pH6,5

(CREG)

11/PRPMResultados

Laboratorio Salud Pública (Exactas-UNLP)

Número de muestras procesadas por ambos métodos: 46.

Número de muestras DETECTABLE según columnas: 15

Número de muestras DETECTABLE según PEM-UNLP: 13 (criterio Ct <35)

Coincidencia en muestras detectables: 86.7 %.

Coincidencia en muestras no detectables: 96.8 %.

Diferencia promedio de Ct para gen control (Ct PEM-UNLP - Ct columna)= 1,9

(+/-1.1 ).

Diferencia promedio de Ct para gen ORFab (Ct ORFab PEM-UNLP - Ct ORFab

columna)= 1.2 (+/-2.4 ).

• Muestra biológica: oro y naso faríngeo sospechados de COVID

• Molde RNA

• DETECTABLE una muestra si se detecta el gen ORFab

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Conclusiones

• Las PEM funcionalizadas con SiO2 son eficientes en la extracción de RNA. Se obtienen

resultados comparables con los obtenidos con los métodos comerciales disponibles.

• El protocolo resulta útil para la extracción de RNA en distintos tipos de muestras

biológicas.

• El protocolo depende en gran medida del buffer GITC/Tritón. Variaciones en las

concentraciones, pH podrían aumentar el rendimiento y eficiencia del método.

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Muchas gracias